KR100861697B1

KR100861697B1 - Ａｈｂａ 생합성 유전자 변이주를 이용한 안사마이신유도체의 생산 방법 및 신규한 안사마이신 유도체

Info

Publication number: KR100861697B1
Application number: KR20070009444A
Authority: KR
Inventors: 홍영수; 이정준; 이경; 김원철; 싱후 카이; 이동호
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2007-01-30
Filing date: 2007-01-30
Publication date: 2008-10-07
Also published as: WO2008093912A1; KR20080071338A

Abstract

본 발명은 3-아미노-5-하이드록시벤조산(3-amino-5- hydroxylbenzoic acid; AHBA) 생합성 유전자 변이주를 이용한 안사마이신 유도체의 생산 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 AHBA 생합성 유전자 변이주의 성장 배지에 여러 종류의 AHBA 유사체를 첨가하여 신규한 안사마이신 유도체를 생산하는 방법에 관한 것이며, 상기의 방법으로 생산된 안사마이신 유도체들은 안사마이신과 유사하게 Hsp90 억제 작용을 나타내어 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 면역억제제, 항염증제 또는 항암제 등으로 유용하게 이용될 수 있다.

안사마이신, 젤다나마이신, 생합성, 스트렙토마이세스, 3-아미노-5-하이드록시벤조산

Description

ＡＨＢＡ 생합성 유전자 변이주를 이용한 안사마이신 유도체의 생산 방법 및 신규한 안사마이신 유도체{Novel ansamycin derivatives and the method for mutational biosynthesis thereof}

도 1은 다양한 균주에서 AHBA를 전구체로 생합성 되는 안사마이신들을 도시한 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus) 게놈 코스미드 DNA를 염기서열 결정함에 의해 얻어진 젤다나마이신 생합성에 관여 하는 AHBA 생합성 유전자 클러스터 55.6 kb 분획의 생합성 유전자 배열 맵이다.

도 3은 AHBA를 전구체로 하는 젤다나마이신 생합성 과정을 도시한 것이다.

도 4는 안사마이신계의 대표적인 항생제인 리파마이신 생합성 과정에 밝혀진 안사마이신계 항생제의 공통 전구체인 AHBA 생합성 경로와 각 단계에 관여 하는 효소를 도시한 것이다.

도 5는 pCR2.1-TOPO의 백터 맵(vector map)이다.

도 6은 pKC1139의 백터 맵(vector map)이다.

도 7은 이들 AHBA 전구체 생합성 유전자 중 AHBA 신타아제 유전자 napK의 제 거 실험을 개략적으로 표현한 것이다.

도 8은 AHBA 신타아제 유전자 제거 균주인 AC2 염색체 내 napK 유전자에 카나마이신 유전자가 삽입 된 것을 도시한 그림 및 여러 가지 프라이머 쌍을 통해 변이주 AC2의 생성을 확인한 PCR 반응 결과 사진이다.

도 9는 AC2 균주 배양 시 합성한 AHBA 첨가로 젤다나미이신 생산이 회복됨을 확인한 HPLC 그래프이다.

도 10은 본 발명에서 확인한 젤다나마이신 및 안사마이신 유도체의 구조 및 그 생산 방법에 대해 도식화한 것이다.

도 11은 본 발명에 따른 안사마이신 생산 균주의 AHBA 신타아제(synthase) 유전자 제거 균주에 AHBA 유도체들의 첨가에 의한 안사마이신 유도체의 생산 방법을 도식화한 그림이다.

본 발명은 안사마이신 생산 균주의 AHBA 생합성 유전자 제거 균주를 활용한 안사마이신 유도체의 새로운 생산 방법에 관한 것이다.

안사마이신(ansamycin)계 항생제에는 젤다나마이신(geldanamycin), 허비마이신(herbimycin), 멕벡신(macbecin), 레브라스타틴(reblastatin), 리파마이 신(rifamycin) 및 안사마이토신(ansamitocin) 등이 있는데 이들은 3-아미노-5-하이드록시벤조산(AHBA)을 최초 전구체로 이용하여 생합성 되는 폴리케타이드(polyketide) 골격을 가진 핸들 모양의 화학 구조를 포함한 화합물이다. 이런 부류의 화합물들의 생합성은 상기와 같이 AHBA를 출발 단위로 하여, 아세테이트, 프로피오네이트 및 글리콜레이트와 같은 골격연장 전구체의 연속적 부가에 의해 폴리케타이드 기본 골격을 형성한 후에, 기본골격을 수식하는 부가적인 반응을 거쳐서 생합성된다. 상기 화합물들은 1970년에서 2000년 사이에 항생제(Takahashi A. et al . (2003) PNAS 100(20) 11777-11782; Agbessi S. et al . (2003) Appl . Microbiol. Biotechnol 62, 233-238), 항진균제(Cardenas M. E. et al . (1999) Clinical Microbiology Review 12(4) 583-611), 항바이러스제(Li Y. et al . (2004) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 48(3) 867-872), 면역억제제(Owens-Grillo J. et al . (1995) J. Biological Chemistry 270(35) 20479-20484), 퇴행성 신경질환제(Sittler A. et al . (2001) Human Molecular Genetics 10(12) 1307-1315; Waza M. et al . (2005) Nature medicine 11(10) 1088-1095), 항염증제(Pittet J. et al . (2005) The Journal of Immunology 174, 384-394; Hsu H. et al . (2006) Molecular Pharmacology, Web pub. Jul 25) 및 항암제로서 그 기능이 확인되었다(DeBoer C. et al . J. Antibiotic ., 23(9) 442-447, 1970; Omura, S. et al., J. Antibiotic . 32, 255-261, 1979; Muroi, M. et . al ., J. Antibiotic . 33, 205-212, 1980; Neckers L. et al ., Invest . New Drugs 17, 361-373, 1999; Piper P.W., Curr . Opin . Investing Drugs 2(11) 1606-1610, 2001).

이러한 안사마이신계 화합물 중에서 벤조키논(benzoquinone) 구조의 허비마이신, 멕벡신, 레브라스타틴 및 젤다나마이신은 샤페론단백질(protein chaperone) 활성을 가진 열충격 단백질 90(Heat shock protein 90; Hsp90)을 억제하는 것으로 알려져 있고, 특히 젤다나마이신은 Hsp90 단백질의 아미노 말단의 ATP(adenosine triphosphate) 결합자리에 결합하여, 상기 Hsp 90이 안정화에 기여하는 여러 가지 암 발생 단백질의 기능을 억제함으로서 항암 활성을 나타내는 것이 보고되어 있다(Whitesell L. et . al . Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 91, 8324-8328, 1994; Prodromou C. et . al. Cell , 90, 65-75, 1997; Walter S. and Buchner J., Angew . Chem . Int . Ed . 41, 1098-1113, 2002; Piper P. W., Current opinion in Investigational Drugs 2, 1606~1610, 2001).

이러한 Hsp90의 생리적 중요성 때문에 안사마이신계 화합물 중 하나인 젤다나마이신의 화학합성 유도체인 17-알릴 아미노 젤다나마이신(17-AAG) 및 17-DMAG과 같은 HSP90 저해제 활성에 의한 항암제가 개발되고 있다.

따라서, 젤다나마이신의 생합성 경로는 이를 생산하는 미생물로부터 클로닝한 생합성 관련 유전자의 염기서열의 유사성 분석에 의한 예측과 방사성동위원소 ¹⁴C나 ³H로 표지된 전구체로 실험한 결과에 의하여, 초기 폴리케타이드 골격이 만들어진 후에 이에 O-카르바모일화, 하이드록실화, O-메틸화 및 산화반응을 거쳐 완성될 것이라고 제안되었다. 그러나 염기서열을 결정하고, 염기서열의 유사성 분석으로부터 유전자의 기능을 추정하는 것 외에, 초기 폴리케타이드의 생합성 과정과 이 과정에 관련된 유전자나 효소의 기능을 실험적으로 증명한 예는 소수에 불과하다. 이중 초기 폴리케타이드를 젤다나마이신으로 변환시키는 O-카르바모일화 과정을 이용한 젤다나마이신 유도체 개발에 대하여 PCT/KR2005/002601호에서 개시하고 있다. 또한 젤다나마이신의 전구체인 AHBA를 생산하는 유전자 군의 염기서열은 리파마이신의 AHBA 생합성 효소들과 높은 동일성을 보여 줌으로서 AHBA에 생산에 관여할 것으로 예측되었다(Hong Y.S et . al., GenBank DQ249342; Rascher, A. et al ., FEMS. Microbiol . Lett . 218 223-230, 2003). 그리고 허비마이신 생합성 유전자도 젤다나마이신의 생합성 유전자와 높은 상동성을 가지고 있음이 확인되었다(Rascher, A. et al . Appl . Environ . Microbiol. 71(8) 4862-4871, 2005). 리파마이신의 경우, 이들 AHBA 생합성에 관여 하는 유전자 중 AHBA 신타아제(AHBA synthase, rifK) 유전자가 제거된 균주에서 리파마이신이 생산되지 않는 것과 외부에서 합성된 AHBA를 첨가할 경우 리파마이신 생산이 재생되는 것은 보고되어 있다(Yu. T. W. et . al ., J. Biol . Chem . 276(16) 12546-12555, 2001). 그러나 AHBA 유사전구체를 이용하여 폴리키타이드 형성이 완벽하게 일어나지 않고 반응 중간에 폴리키타이드 신타아제에서 떨어져 나온 구조만을 확인하였다(Admiraal, S. J. et . al., Biochemistry 41(16), 5313-5324. 2002 & Biochemistry 40(20) 6116-6123, 2001; Hunziker, D. et al ., J. Am . Chem . Soc ., 120(5) 1092-1093 1998).

따라서 본 발명은 상기 리파마이신의 결과를 토대로, 젤다나마이신 생산 균주인 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스 (Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus) 균주의 AHBA 생합성 유전자 군을 확인하고, 이 유전자 중 rifK와 높은 상동성을 가진 napK 유전자가 제거된 균주(AC2)를 제작하였다. 이 균주의 성장 배지에 합성한 AHBA를 농도별로 첨가한 결과, 농도 의존적으로 젤다나마이신 생산이 회복되는 것을 확인하였다. 이 사실을 이용하여, AHBA와 유사한 구조를 가진 화합물을 첨가하고 예상되는 새로운 유도체를 LC/MS(액상 질량 분석기)를 이용하여 확인하고, 이들 데이터를 이용하여 새로운 유도체를 분리 정제할 수 있다는 것을 증명하였다.

이에, 본 발명자들은 안사마이신의 전구체로 이용되는 AHBA의 유전자를 제거한 변이주(AC2)를 개발하고, 이 균주가 자라는 배지에 AHBA와 유사한 기능을 할 것으로 생각되는 화합물을 첨가하는 방법을 통해 안사마이신의 새로운 생산 방법을 제시하고, 또한 이러한 방법으로 생산한 신규한 안사마이신 유도체를 제시함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 안사마이신의 전구체로 이용되는 AHBA 유전자를 제거한 균주(AC2)를 제조하여, 상기 변이주가 자라는 배지에 AHBA 유사체의 첨가를 통해 안사마이신 유도체 생산 방법 및 신규한 안사마이신 유도체를 제공하기 위한 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(1) AHBA 생합성 유전자 비활성 컨스트럭트를 제조하는 단계;

(2) 상기 단계 1)의 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;

(3) 상기 단계 2)의 재조합 벡터를 숙주 세포에 형질전환시켜 재조합된 변이주를 제조하는 단계; 및

(4) 상기 단계 3)의 변이주의 배양 중에 3-아미노-5-하이드록시벤조산(3-amino-5- hydroxylbenzoic acid; AHBA) 또는 그 유사체를 첨가하여 배양하고, 배양액으로부터 안사마이신 유도체를 수득하는 단계를 포함하는 안사마이신 유도체 생합성 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 안사마이신 유도체 생합성 방법에 의해 제조되는 안사마이신 유도체를 제공한다.

또한, 본 발명은 신규 안사마이신 유도체를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 7로 기재되는 napK 유전자가 변이되어 불활성화된 napK 유전자 비활성 컨스트럭트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 유전자 비활성 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus)를 상기 벡터로 형질전환시킨 후 재조합된 스트렙토마이세스 하이그로프코피쿠스 변이주를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 안사마이신 유도체, 재조합 벡터, 변이주 또는 그의 배양액 또는 변이주가 생산하는 안사마이신 유도체를 유효성분을 함유하는 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 항염증제, 퇴행성 신경질환치료제 또는 항암제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

이미 공지된 안사마이신 계열(도 1 참조) 중 젤다나마이신의 생합성에 관련되는 AHBA 생합성 관련 유전자 클러스터(Hong Y.S et . al., GenBank DQ249342; Rascher, A. et al ., Appl . Environ . Microbiol. 71(8) 4862-4871, 2005)는 6개의 AHBA 생합성 유전자와 알려지지 않은 기능의 폴리케타이드 신타아제(polyketide synthase) 유전자를 포함한다(도 2 및 표 1 참조). 본 발명자들은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus)의 안사마이신의 생합성 유전자 클러스터의 염기서열 분석으로 추정되는 젤다나마이신 폴리케타이드(polyketide) 신타아제(synthase) 유전자와 함께 전구체인 AHBA 생합성 유전자군을 밝혔다(도 3 참조).

젤다나마이신 AHBA 생합성 관련 유전자의 코딩 아미노산 서열은 리파마이신(rifamycin) 및 안사미토신(ansamitosin)의 AHBA 생합성 관련 유전자의 코딩 아미노산 서열과 유의성있는 상동성을 나타내므로, 각각의 유전자들이 리파마이신에서 알려진 것과 같이 AHBA 생합성에 직접적인 연관성이 있을 것으로 사료된다(도 4 및 표 2 참조). 리파마이신의 AHBA 생합성 유전자들은 유전자 변이 실험을 통해 AHBA 합성에 결정적 역할을 하는 것으로 이미 확인된 바 있으므로 본 발명자들은 이 중 리파마이신의 AHBA 신타아제 유전자인 rifK 유전자와 유의성 있게 상동성을 보이는 napK 유전자에 카나마이신 유전자를 삽입하여 그 기능을 제거한 AC2 균주를 하기의 방법으로 제작하였다.

젤다나마이신의 전구체인 AHBA 생합성 유전자군 중에서 AHBA 신타아제를 코드할 것으로 추정되는 napK 유전자의 클로닝을 위하여 TA 클로닝 벡터(도 5 참조)를 이용하였으며 클로닝된 napK 유전자의 내에 카나마이신(kanamycin)과 같은 항생제 내성 유전자를 삽입하여 비활성 컨스트럭트를 제작하였고, 상기 napK 유전자 비활성 컨스트럭트를 pKC1139 벡터(도 6 참조)에 삽입하여 pKC-AHBA 재조합 벡터를 제작하였다. 또한, 상기 napK 유전자 비활성 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스에 삽입하여 형질전환된 변이주를 제작하여 이를 “스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 AC2”(Streptomyces hygriscopicus AC2; 기탁번호: KCTC 10676BP)라 명명하였다(도 7 참조). 상기 AHBA 신타아제 변이주(AC2 균주)는 pKC-AHBA 재조합 벡터가 형질전환된 균주를 이용하여 napK의 야생형 유전자와의 염기서열 유사성에 의한 재조합(homologous recombination)에 의하여 야생형을 비활성 변이형으로 대체하여 제조하였다. 상기와 같이 제조된 변이주 AC2는 PCR을 이용하여 다시 한 번 더 napK 유전자 비활성 컨스트럭트가 삽입되었음을 확인하였다(도 8 참조). 변이주 AC2는 야생형(Wild type) 균주와 같은 조건으로 배양할 경우 젤다나마이신을 생산하지 못하지만 성장 배지에 합성된 AHBA 및 그의 유사체를 첨가해 줄 경우, 첨가한 AHBA 농도에 따른 젤다나마이신 생산 능력이 회복되는 것을 확인하였다(도 9 및 10 참조). 그러므로 변이주 AC2는 자체적으로는 AHBA 및 안사마이신을 생산하지는 못하지만, 외부에서 AHBA 및 그의 유사체를 첨가할 경우, 안사마이신 유도체를 생산할 수 있는 균주이다(도 11 참조).

본 발명은

(1) AHBA 생합성 유전자 비활성 컨스트럭트를 제조하는 단계;

상기 단계 1)의 AHBA 생합성 유전자는 서열번호 7로 기재되는 napK 유전자이나 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 유전자 서열과 70% 이상 상동하며 napK 단백질의 생물학적 기능과 동일한 기능을 부여하는 유전자라면 본 발명에서 이용 가능하다. 비활성 컨스트럭트는 napK 유전자내에 항생제 내성 유전자를 삽입하여 제작하는 것이 바람직하며, 카나마이신(kanamycin)과 같은 항생제 내성 유전자의 삽입이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당해업계의 당업자에게 공지되어 유용하게 조작할 수 있는 항생제 내성 유전자 중 어느 것이든 이용 가능하다.

상기 단계 2)의 재조합 벡터는 상기 비활성 컨스트럭트를 미리 제한효소(restriction enzyme) EcoRI/HindIII으로 잘려진 벡터 pKC1139(Bierman, M. et . al ., (1992) Gene 116, 43-49, 도 6 참조)에 접합시켜 제조한 재조합 벡터 pKC-AHBA인 것이 바람직하나 이에 한정된 것이 아니다. 골격 벡터로는 pKC1139인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며 당업계의 당업자에게 공지된 다른 벡터를 이용하여도 무방하다.

상기 단계 3)의 숙주세포는 napK 유전자 또는 이와 70% 이상의 상동성을 가지며 AHBA 신타아제 활성을 갖는 유전자를 포함한 AHBA 생합성에 결정적 역할을 하는 유전자군을 포함하는 공지의 안사마이신 생산 균주가 사용될 수 있으며, 본 발명의 경우 napK를 제거하여 AHBA 생산을 저해한 균주를 만들었지만 다른 AHBA 생합성 유전자를 제거해서 AHBA 생산 저해 균주 제작이 가능하다(도 4참조). 젤다나마이신 유도체를 생산하는 경우, 스트렙토마이세스 하이그로프코피쿠스 변이종 젤다누스 NRRL 3602(Streptomyces hygroscopicus var. geldanus NRRL 3602) 또는 스트렙토마이세스 멜라노스포로파시엔스(Streptomyces melanosporofaciens)인 것이 바람직하며, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus), 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 17997(Streptomyces hygroscopicus 17997), 스트렙토마이세스 하이그로프코피쿠스 변이종 젤다누스 NRRL 3602(Streptomyces hygroscopicus var. geldanus NRRL 3602) 또는 스트렙토마이세스 멜라노스포로파시엔스 EF-76(Streptomyces melanosporofaciens EF-76)인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 다른 젤다마나이신 생산 균주로는 스트렙토마이세스 바이올라세우스나이거(Streptomyces violaceusniger)등이 있으며, 허비마이신의 생산 균주로는 스트렙토마이세스 하이그로피쿠스 AM-3672(Streptomyces hygroscopicus AM-3672) 등이 다수 보고되어 있고, 레브라스타틴의 생산 균주로는 스트렙토마이세스 sp. S6699(Streptomyces sp. S6699) 등이 있으며, 멕벡신의 생산 균주로는 노카디아 sp. C-14919(Nocardia sp. C-14919), 안사마이토신 생산 균주로는 액티노시네마 프레티오섬 ATCC 31565(Actinosynnema pretiosum ATCC 31565), 리파마이신 생산 균주로는 아미콜라톱시스 메디테라네이 S699(Amycolatopsis mediterranei S699) 등이 있으며 당업자에게 공지된 생산 균주라면 본 발명에서 모두 이용 가능하다. 상기에서 제작된 재조합 벡터를 상기와 같은 숙주세포에 형질전환시켜서 변이주를 만들었으며, 이를 "스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 에이씨2"(Streptomyces hygroscopicus AC2)라 명명하고 KCTC에 2004년 8월 9일에 기탁하였다(기탁번호: 10676BP).

상기 단계 4)의 “AHBA 또는 그의 유사체”는 안사마이신의 전구체로 기능할 수 있는 AHBA 또는 그의 유사체를 모두 지칭하며, 하기의 화학식 1로 예시될 수 있고 처리 농도는 0.1 ㎎/㎖ ~ 20 ㎎/㎖인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

<화학식 1>

상기 화학식 1에서 R₁은 H, OH, NH₂, 할로겐족 또는 알릴기(ally group), R₂는 H, OH, NH₂, 할로겐족 또는 알릴기(ally group), R₃는 H, OH, NH₂, 할로겐족 또는 알릴기(ally group), R₄는 H, NH₂, 할로겐족 또는 알릴기(ally group)인 것이 바람직하며, 할로겐족으로는 F, Cl, Br 또는 I인 것이 바람직하다.

또한, 안사마이신 유도체는 미생물 배양액을 유기용매로 추출한 후 크로마토그래피 과정을 수행하여 분리, 정제하였으며, 당업계에 알려진 다양한 분리, 정제법을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 안사마이신 유도체 생합성 방법으로 제조된 안사마이신 유도체를 제공한다. 본 발명의 “안사마이신 유도체”는 상기의 생합성 방법으로 제조되며, 상기 안사나마이신 유도체는 벤젠(benzen) 구조를 기본 골격으로 하는 링을 가진 핸들 모양을 가진 폴리키타이드 화합물을 안사마이신 유도체로 정의된다.

본 발명의 방법에 따라 변이주 AC2 성장 배지에 AHBA 또는 그의 유사체를 첨가할 경우, 젤다나마이신은 물론 하기 화학식 2와 같은 선형 폴리키타드계 화합물과 화학식 3과 같은 완벽한 거대 락탐 환(macrolactam ring)을 형성한 안사마이신 유도체를 생산할 수 있음을 확인하였다(도 10 참조). 따라서 첨가하는 AHBA 유사체에 따라 다양한 종류의 안사마이신 유도체가 생산될 수 있다. 다시 말해, 리파마이신의 경우, AHBA 유사전구체를 이용하여 폴리키타이드 형성이 완벽하게 일어나지 않고 반응 중간에 폴키타이드 신타아제에서 떨어져 나온 구조만을 확인하였으나 본 발명의 경우에는 완벽한 폴리키타이드 반응이 진행된 후 아마이드 신타아제(amide synthase)의 반응에 의해 환을 형성한 구조를 형성하였다. 이는 리파마이신 같은 나프토벤조키논(naphthobenzoquinone)계 화합물인 경우 나프토밴조키논 형성이 폴리키타이드 반응 중에 일어남으로서 계속적인 폴리키타이드 진행 반응이 불가능한 것으로 판단되고(Yu. T. W. et . al., Proc . Natl . Acad . Sci . 96, 9051-9056, 1999), 젤다나마이신을 비롯한 벤조키논계 안사마이신인 경우, 이러한 폴리키타이드 반응 중의 벤조키논 환의 변형이 일어나지 않을 것으로 판단됨으로 최종적인 폴리키타이드 반응이 진행된 것으로 추정된다. 따라서 이러한 AHBA 유사 전구체를 이용한 폴리키타이드 형성은 벤조키논계 안사마이신인 경우 보편적으로 가능할 것으로 사료된다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 2 또는 3으로 표시되는 신규 안사마이신 유도체를 제공한다.

<화학식 2>

<화학식 3>

R은 H 또는 OH임.

또한, 본 발명은 서열번호 7로 기재되는 napK가 변이되어 불활성화된 napK 유전자 비활성 컨스트럭트를 제공한다.

상기 napK 유전자 비활성 컨스트럭트는 표적 유전자 사이에 항생제 내성 유전자를 삽입한 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 상기 항생제 내성 유전자로는 카나마이신을 이용하였으나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 유전자 비활성 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

상기 재조합 벡터의 골격 벡터로는 pKC1139 벡터인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스를 상기 재조합 벡터로 형질전환시킨 후 재조합된 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 변이주를 제공한다.

상기 형질전환 방법은 당업계의 당업자에게 공지된 방법으로 수행하는 것이 바람직하다. 본 발명자들은 제조된 변이주를 "스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 에이씨2"(Streptomyces hygroscopicus AC2)라 명명하고 KCTC에 2004년 8월 9일에 기탁하였다(기탁번호: 10676BP).

안사마이신계 항암제인 젤다나마이신은 샤페론단백질(protein chaperone) 활성을 가진 열충격 단백질 90(Heat shock protein 90; Hsp90)의 ATP(adenosine triphosphate) 결합자리에 결합하는 것이 확인되었다(Whitesell L. et . al ., Proc . Natl . Acad . Sci . 91, 8324-8328, 1994; Prodromou C. et . al ., Cell 90, 65-75, 1997, USA). 이러한 발견으로 인하여 기존의 젤다나마이신이 암 발생단백질(oncogenic protein) 기능을 갖는 타이로신 키나아제(tyrosin kinase)의 효소활성을 억제하여 항암활성을 나타내는 것이 아니라, 타이로신 키나아제를 포함한 다양한 종류의 Hsp90의 대상단백질(client protein)의 구조적 안전성에 중요한 Hsp90의 기능을 저해함으로서 이러한 대상 단백질들의 안정성이 저해되어 나타나는 약리효능인 것으로 확인되었다. 이로 인해 젤다나마이신을 포함하는 안사마이신은 항생, 항진균, 항 바이러스, 면역억제, 퇴행성 신경질환 및 항염증의 치료제로 이용될 수 있다.

본 발명의 치료제는 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 주사액제, 환약, 캡슐, 과립, 산제 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당해 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 치료제는 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용) 할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일회 투여량은 0.1 내지 500 ㎎/㎏이며, 1일 1회 또는 수회 투여될 수 있는 것이 더욱 바람직하다.

이하 본 발명을 실시예 및 제제예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 제제예는 본 발명을 상세히 설명하는 것일 뿐, 본 발명을 한정하지는 않는다.

< 실시예 1> AC2 변이주의 제조

AC2 변이주의 제작을 위하여 서열번호 1과 2 및 3과 4로 기재되는 프라이머를 이용하여 하기와 같은 조건으로 PCR을 실시하였다(표 3). 주형은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus) 균주의 염색체 DNA를 분리하여 사용하였다. PCR 증폭 조건은 DNA 중합효소(Ex Taq polymerase, Takara)를 사용하여 상기 기재된 프라이머(25 pmol), 주형, dNTP 혼합액을 혼합하고, 반응 완충용액을 최종 50 ㎕로 맞춘 후, 97℃에서 5분 동안 변성시키고, 95℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분간 30회 반응시키고, 72℃에서 10분간 연장시켜 반응을 종결하였다. 서열번호 1과 2로 기재되는 프라이머를 이용하여 수득한 PCR 산물을 TA 클로닝 벡터(pCR2.1-TOPO, InvitrogenTM life technologies, USA, 도 5)에 클로닝하여 재조합 벡터 pTA-AHBA-N(AHBA 생합성 유전자를 포함한 앞 부분)을 제조하였으며, 서열번호 3과 4로 기재되는 프라이머를 이용하여 수득한 PCR 산물을 TA 클로닝 벡터에 클로닝하여 재조합 pTA-AHBA-C(AHBA 생합성 유전자를 포함한 뒷 부분)를 제조하였다.

카나마이신 내성 유전자인 aphII 유전자를 포함하는 pFD-neoS (Denis, F.& Brzezinski, R. (1991) FEMS Microbiol . Lett . 81, 261-264)를 제한효소(restriction enzyme) KpnI 및 PstI으로 절단하여 수득한 1.1-kb DNA 분획을 선택 마커 및 유전자-파괴 컨스트럭트를 구성하기 위하여 사용하였다.

유전자 비활성화 실험을 위하여, pTA-AHBA-N의 EcoRI/KpnI 분획, pTA-AHBA-C의 PstI/HindIII 분획 및 pFD-neoS의 1.1-kb PstI/KpnI 분획(aphII 유전자)을 미리 EcoRI/HindIII으로 잘려진 pKC1139(Bierman, M. et . al ., (1992) Gene 116, 43-49, 도 6)에 접합시켜 재조합 벡터 pKC-AHBA을 제조하였다.

상기 재조합 벡터 pKC-AHBA를 E. coli ET12567/pUZ8002(Allen, I. W. & D. A. Ritchie. (1994) Mol. Gen . Genet . 243:593-599)균주에 도입하고 얻어진 균주를 Flett, F. 등의 켄쥬게이션 방법(Flett, F. et . al ., (1997). FEMS Microbiol . Lett . 155, 223-229)대로 S. hygroscopicus JCM4427에 형질전환하였다(도 7).

pKC-AHBA의 유전자를 S. hygroscopicus JCM4427의 염색체에 삽입시키기 위하여(chromosomal integration) 카나마이신이 첨가된 YEME(yeast extract-malt extract agar) 액체 배지에서 37℃에서 4일간 형질전환체를 배양하였다. 이때 상기 pKC1139 벡터의 유전적 특징으로 인해 37℃에서 벡터의 복제는 정지하고 자연적으로 카나마이신 내성 유전자가 염색체에 삽입된 균주만이 생존한다(Bierman, M. et . al ., (1992) Gene 116, 43-49). 이들 생존균주를 카나마이신과 아프라마이신이 각각 첨가된 고체 배지에 배양하여 카나마이신에 대해서는 내성을 갖지만 아프라마이신에 대해서는 감수성인 재조합변이주를 선별하였다. 상기 재조합변이주는 이들의 총 게놈의 DNA의 PCR에 의해 확인되었다(도 8). 이때 사용한 프라이머는 서열번호 1, 4, 5 및 6(표 3)으로 기재되는 프라이머를 이용하여 상기와 같은 조건으로 PCR을 실시하였다. 상기 균주를 “스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 AC2”이라 명명한 후 2004년 8월 9일자로 KCTC에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 10676BP).

유전자 비활성 실험에 사용한 DNA 단편의 PCR 프라이머 및 그 방법

표적	PCR 프라이머 (5'-3')		서열 번호	카세트 디자인
표적	이름	서열	서열 번호	카세트 디자인
*napK*	NK -1	tgaattccagcgacctcgcggtcaacgcgac	1	*EcoR* Ⅰ- LF - *Kpn* Ⅰ- *aph* Ⅱ- *pst* Ⅰ- RF - *Hind* Ⅲ
	NK -2	cggtaccgcaggaacgcggcctcgtaggtct	2
	NK -3	cgtaccgaccgccgatacatgcaccagaccg	3
	NK -4	gaagcttaggacgtcgagaaggtgccagccg	4
*napH*	NH -1	caaactggacgcactcgtcggccggct	5
*aph* Ⅱ	Neo -L	caatccatcttgttcaatcatgcgaaa	6

< 실시예 2> 변이주 AC2 를 이용한 안사마이신 유도체의 생산 방법

상기 실시예 1에서 만들어진 변이주 AC2 및 야생형(Wild type) 균주를 28℃에서 7일 동안 25 ㎖의 고체 YEME 배지에서 배양하였다. 또한 변이주 AC2의 배양 과정 중 3일 배양한 배양 배지에 합성한 AHBA를 1 ㎎/25 ㎖ 및 10 ㎎/25 ㎖ 농도로 증류수 1 ㎖에 녹여 각각의 성장 배지에 첨가한 후 28℃에서 5일간 더 배양하였다. 각 배양배지를 EtOAc로 2회 추출하고 이들 추출물을 여과하여 불용물을 제거하고, 농축한 후에 EtOAc와 H₂O로 분획하여 유기상 추출물을 얻었다. 각각의 배양 추출물의 분획화는 이동상으로 CHCl₃-MeOH를 사용하여 실리카 겔 크로마토그라피로 얻었고, 얻어진 분획은 Waters Delta Prep 3000 system(Waters사, 미국)을 이용한 HPLC[YMC J'sphere ODS-H80, 150 x 4.6 mm i.d., MeOH-H₂O(0.05% acetic acid) gradient, 1 ㎖/min]의 수행으로 분석하였다. AHBA가 첨가되지 않은 배지에서 배양된 야생형 균주는 안사마이신계 항암제인 젤다나마이신을 생산한 반면, 변이주 AC2는 젤다나마이신을 생산하지 못하였으나 AHBA가 첨가된 배지에서의 변이주 AC2 젤다나마이신의 생산력은 회복되었다(도 9).

상기한 화학식 1에 표기한 화합물들도 상기의 방법으로 변이주 AC2 배양 배지에 10 ㎎/㎖ 농도로 첨가하여 배양한 후, 각각의 배지를 추출하고 분석하였다. 이때 분석 방법으로는 LC/MS로 Finnigan LCQ Advantage Max 매스 스펙트로포토메터(Thermo사, 미국)을 사용하였다. 이 LC/MS 분석에서 AHBA 유사 화합물이 첨가된 예상 화합물의 메스 피크가 관찰되는지를 Xcalibur software(version 1.3 SP2, Thermo Electron)프로그램을 이용하여 기본적으로 생산되는 백그라운드(back ground) 피크를 Metabolite ID 2.0 software(Thermo Electron Co., USA) 프로그램으로 제거한 후 확인하였다. 그 결과 표 4에서와 같이 각각의 AHBA 유사체를 첨가한 배양액에서 예상된 안사마이신계 화합물의 메스를 확인할 수 있었다. 이들 예상 화합물들은 안사마이신의 특징적인 메스 프레그멘데이션(Mass fragmentation), 즉 MS²에서 카바모일 잔기(CONH₂= M.W. 43)가 줄어든 메스값을 보였다.

< 실시예 3> 변이주 AC2 를 이용한 새로운 안사마이신계 화합물의 구조 동정

상기 실시예 2의 방법으로 생성된 새로운 화합물들의 구조를 동정하기 위하여 상기 변이주 AC2를 28℃에서 3일 동안 100 ㎖의 액체 YEME 배지에서 배양하였다. 이 배양액을 각각 2 L의 고체 YEME 배지, 즉 75 ㎖ 배지를 포함하는 페트리 접시(petri dish)에 골고루 분주한다. 이들을 28℃에서 1일 더 배양하여 AC2 균주들의 골고루 자라게 한 후, 각 배양배지에 최종적으로 700 ㎎의 3-하이드록실벤조익산(3-hydroxylbenzoic acid) 및 3-아미노벤조익산(3-aminobenzoic acid)을 각각 첨가한 후 28℃에서 7일 더 배양한다. 이들을 상기한 방법으로 추출하고 분획하여 유기상 추출물을 얻었다. 추출물의 분획하는 이동상으로 CHCl3-MeOH를 사용하여 실리카 겔 크로마토그라피로 수득하였고, 얻어진 분획은 ESIMS 분석하였다.

하기와 같이 생산되어 축적된 화합물을 동정하기 위해, 용융점은 이렉트로더말(Electrothermal) 9100 장비(Electrothermal사, 영국)로 보정없이 측정하였고, 비회전(Specific rotation)([α]D²⁵)과 UV는 JASCO DIP-370 폴러리메터(JASCO, 일본)와 Shimadzu UV-1601 스펙트로포토메터(Shimadzu, 일본)로 각각 측정하였다. 또한, 모든 NMR 시험은 CDCl₃에서 Bruker DMX 600 NMR 스펙트로포토메터(Bruker사, 미국)로 시험하였다. ESIMS 및 HRFABMS는 Finnigan LCQ Advantage Max 매스 스펙트로포토메터(Thermo사, 미국)와 JEOL JMS-HX110A/HX110A Tandem 매스 스펙트로포토메(Jeol사, 일본)로 각각 수행하여 얻었다. HPLC는 Waters Delta Prep 3000 system(Waters사, 미국)을 사용하여 수행하였다. 동정된 화합물은 하기와 같다(도 10).

젤다나마이신; ¹H 및 ¹³C NMR 데이타, 표 5 및 표6; ESIMS m/z 561 [M + H]+, 559 [M - H]-

화합물 1; ¹H 및 ¹³C NMR 데이타, 표 5 및 표 6.

화합물 2; ¹H 및 ¹³C NMR 데이타, 표 5 및 표 6; ESIMS m/z 501 [M - H]- 503 [M+H]+ HRFABMS m/z 503.31156, C₂₈H₄₃O₆N₂H 계산치, 503.31156.

화합물 3; ¹H 및 ¹³C NMR 데이타, 표 5 및 표 6; ESIMS m/z 517 [M- H]- 519 [M+H]+. HRFABMS m/z 519.30664, C₂₈H₄₃O₇N₂H 계산치, 519.30648.

화합물 1, 2 및 3의 H NMR 스펙트럼 값을 젤다나마이신과 비교

	화합물 1	화합물 2	화합물 3	젤다나마이신
1
2
3	6.76 m	5.72 (1H, brs)	6.19 (1H, brs)	6.94 brd (9.9)
4	2.32 m	2.27, 2.08 (2H, m)	2.39, 2.26 (2H, m)	6.57 brt (10.2, 10.8)
5	1.57 m	1.24, 1.15 (2H, m)	1.53 (2H, m)	5.88 brt (9.0, 10.2)
6	3.37 m	3.19 (1H, m)	3.57 (1H, m)	4.31 d (9.0)
7	4.95 d (6.0)	5.01 (1H, d, J = 6.0 Hz)	5.62 (1H, d, J = 6.4 Hz)	5.19 s
8				-
9	5.16 d (9.6)	5.22 (1H, d, J = 9.2 Hz)	5.60 (1H, m)	5.82 d (7.8)
10	2.62 m	2.42 (1H, m)	2.86 (1H, m)	2.79 m
11	4.91 overlap	3.65 (1H, m)	3.92 (1H, m)	3.53 d (6.6)
12	3.32 overlap	3.05 (1H, d, J = 9.2 Hz)	3.46 (1H, m)	3.39 d (7.2)
13	1.73 m, 1.18 m	1.58, 1.03 (2H, m)	2.41 (2H, m)	1.74 m
14	?	1.93 (1H, m)	2.37 (1H, m)	1.68 brs
15	2.60 m, 2.33 m	2.74, 2.47 (2H, m)	3.25, 2.83 (2H, m)	2.47 m
16				-
17	6.61 brs	6.91 (1H, d, J = 7.2 Hz)		-
18		7.19 (1H, d, J = 7.2 Hz)	7.14 (1H, d, J = 8.4 Hz)	-
19	6.60 m	7.01 (1H, brs)	7.14 (1H, d, J = 8.4 Hz)	7.29 s
20	7.07 m			-
21	6.63 d (7.5)	6.74 (1H, s)	5.51 (1H, brs)	-
22	1.85 s	1.83 (3H,s)	2.03 (3H,s)	2.03 s
23	1.68 s	1.34 (3H, s)	1.72 (3H, s)	1.80 s
24	0.98 d (6.5)	1.05 (3H, d, J = 6.4 Hz)	1.30 (3H, d, J = 6.4 Hz)	0.98 overlap
25	0.79 d (6.5)	0.72 (3H, d, J = 6.4 Hz)	1.11 (3H, d, J = 6.4 Hz)	0.98 overlap
6- OCH3	3.46 s	3.37 (3H,s)	3.52 (3H,s)	3.30 s
12- OCH3	3.35 s	3.33 (3H, s)	3.41 (3H, s)	3.36 s
17- OCH3				4.13 s
NH				8.72 s
7- OCONH2	-			-
11- OCONH2	-
1- COOCH3	3.71 s

화합물 1, 2 및 3의 C ¹³ NMR 스펙트럼 값을 젤다나마이신과 비교

	화합물 1	화합물 2	화합물 3	젤다나마이신
1	168.62	173.5s	171.5s	168.19
2	127.59	131.2s	133.4s	134.83
3	141.86	135.3d	135.1d	127.26
4	24.24	23.8t	24.8t	126.28
5	29.71	29.4t	31.1t	136.46
6	80.75	79.7d	81.2d	81.28
7	79.37	81.8d	82.2d	81.72
8	132.22	130.2s	131.2s	133.29
9	129.81	132.2d	134.2d	133.15
10	33.57	34.5d	35.8d	32.33
11	79.38	73.5d	74.8d	72.70
12	79.75	80.8d	82.6d	81.02
13	35.58	32.3t	32.0t	34.69
14	30.85	30.5d	33.4d	27.93
15	44.14	42.8t	37.1t	32.74
16	142.44	138.5s	132.3s	127.61
17	115.67	127.4d	154.4s	157.00
18	156.80	128.8d	116.2d	184.13
19	112.24	119.9d	116.1d	111.74
20	128.64	140.8s	132.4s	138.08
21	120.25	125.7d	128.5d	184.97
22	11.17	13.7q	14.5q	12.51
23	12.95	12.2q	12.9q	12.86
24	16.09	17.7q	18.0q	12.40
25	17.84	17.7q	19.8q	22.93
6- OCH3	58.25	59.1q	59.3q	57.26
12- OCH3	55.97	56.9q	57.3q	56.72
17- OCH3				61.66
NH				-
7- OCONH2	157.49	156.6s	158.1s	156.03
11- OCONH2	158.61
1- COOCH3	50.88

하기에 본 발명을 위한 제제예를 예시하나 이에 한정되는 것은 아니다.

< 제제예 1> 약학적 제제의 제조

<1-1> 산제의 제조

안사마이신 유도체 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<1-2> 정제의 제조

안사마이신 유도체 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<1-3> 캡슐제의 제조

안사마이신 유도체 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<1-4> 환의 제조

안사마이신 유도체 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

<1-5> 과립의 제조

안사마이신 유도체 150 ㎎

대두추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

<1-6> 주사액제의 제조

안사마이신 유도체 10 ㎍/㎖

묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지

주입용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖

적당한 용적의 주입용 염화나트륨 BP 중에 안사마이신 유도체를 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 이용하여 pH 3.5로 조절하고, 주입용 염화나트륨 BP를 이용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120℃에서 15분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.

상기한 바와 같이 본 발명은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 두아마이세티쿠스 균주의 젤다나마이신 생합성 유전자를 조작한 변이주로부터 젤다나마이신 유도체를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 제조 방법은AHBA 및 그의 유사체의 첨가에 따라 신규한 안사마이신 유도체를 제조할 수 있다. 상기 제조 방법에 의해 제조된 안사마이신 유도체들은 젤다나마이신과 유사하게 Hsp90 억제 작용을 나타내어 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 면역억제제, 항염증제, 퇴행성 신경질환치료제, 항암제 등으로 유용하게 이용될 수 있다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Novel ansamycin derivatives and the method for mutational biosynthesis thereof <130> 6p-12-06 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NK-1 <400> 1 tgaattccag cgacctcgcg gtcaacgcga c 31 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NK-2 <400> 2 cggtaccgca ggaacgcggc ctcgtaggtc t 31 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NK-3 <400> 3 cgtaccgacc gccgatacat gcaccagacc g 31 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NK-4 <400> 4 gaagcttagg acgtcgagaa ggtgccagcc g 31 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NH-1 <400> 5 caaactggac gcactcgtcg gccggct 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Neo-L <400> 6 caatccatct tgttcaatca tgcgaaa 27 <210> 7 <211> 1161 <212> DNA <213> napK <400> 7 atgaacgcgc gaccgacacc agagttcccc acctggccgc agtacgacga cggcgagcgc 60 accggcctga tccgggccct ggagcagggc cagtggtggc gcatgggagg gtcggaggtg 120 gactccttcg agagtgagtt cgcggacttc cacggcgccc cacacgcttt ggccgtcacc 180 aacggcaccc acgccctgga gttggcgttg cagtgtctgg gcgtcgggcc gggcaccgag 240 gtcatcgtgc cggccttcac cttcatctcc tcctcccagg ccgctcagcg gctgggagcg 300 gttgccgtcc ccgtcgacgt cgatctcgat acctacaaca tcgacgtggc tgccgcggct 360 tccgccgtca cccccctcac caaggtgatc atgcctgtgc acatggcggg gctcatcgcc 420 gacatggacg cgctcggcga actctccgct gacaccggtg tgcctcttct ccaggacgcc 480 gcccacgcac acggtgcccg ctggcagggc aaacgggtgg gcgagttggg tacggtcgcc 540 tcgttcagct tccagaacgg caagctgatg accgccggcg agggcggtgc gctgctcctg 600 cccgacgagg agacctacga ggccgcgttc ctgcggcaca gttgtggccg gccacgtacc 660 gaccgccgat acatgcacca gaccgccggc accaacatgc ggctcaacga gttctccgcg 720 gccgtgctcc gcgcccagct gggccgcctc gacgcccaga tcacgctccg cgatcagcgc 780 tggacgctgc tgtcccggct gctcggtgag atcgacggcg tcgtacccca gggcagcgac 840 ccgcgcgccg accggaactc tcactacatg gcgatgttcc ggatccccgg catatccgag 900 gaggcccgca acgccctcgt cgacacgctc gtcgaggccg gcctgcccgc cttcgccgcc 960 ttccgggcga tctaccgcac caacgcgttc tgggagacag ccgcgcccga caccaccgtc 1020 gacaagctcg ccgaaagctg cccgcacacc gaggcgatca gcaccgactg catctggctg 1080 caccatcgag cgctgctcgc ctcagaggaa gccctctatg ccacagccga gatcatcgcc 1140 gacgccttgg ccgcacggtg a 1161

Claims

(1) 서열번호 7로 기재되는 napK 유전자인 것을 특징으로 하는 AHBA 생합성 유전자 비활성 컨스트럭트를 제조하는 단계;

(2) 상기 단계 1)의 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;

(3) 상기 단계 2)의 재조합 벡터를 벤조퀴논(benzoquinone)계 안사마이신 생성 균주에 형질전환시켜 재조합된 변이주를 제조하는 단계; 및

(4) 상기 단계 3)의 변이주의 배양 중에 3-아미노-5-하이드록시벤조산(3-amino-5- hydroxylbenzoic acid; AHBA) 또는 그 유사체를 첨가하여 배양하고, 배양액으로부터 안사마이신 유도체를 수득하는 단계를 포함하는 벤조퀴논계 안사마이신 유도체 생합성 방법.
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제 1항에 있어서, 단계 1)의 AHBA 생합성 유전자는 서열번호 7과 70% 이상의 상동성을 가지는 유전자인 것을 특징으로 하는 벤조퀴논계 안사마이신 유도체 생합성 방법.
제 1항에 있어서, 단계 1)의 napK 유전자 비활성 컨스트럭트는 항생제 내성 유전자가 삽입된 것을 특징으로 하는 벤조퀴논계 안사마이신 유도체 생합성 방법.
제 1항에 있어서, 단계 3)의 벤조퀴논계 안사마이신 생성 균주는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 변이종 젤다누스 NRRL 3602(Streptomyces hygroscopicus var. geldanus NRRL 3602) 또는 스트렙토마이세스 멜라노스포로파시엔스(Streptomyces melanosporofaciens)인 것을 특징으로 하는 벤조퀴논계 안사마이신 유도체 생합성 방법.
제 5항에 있어서, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus) 또는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 17997(Streptomyces hygroscopicus 17997)인 것을 특징으로 하는 벤조퀴논계 안사마이신 유도체 생합성 방법.
제 5항에 있어서, 젤다누스 NRRL은 젤다누스 NRRL 3602(geldanus NRRL 3602)인 것을 특징으로 하는 벤조퀴논계 안사마이신 유도체 생합성 방법.
제 5항에 있어서, 스트렙토마이세스 멜라노스포로파시엔스는 스트렙토마이세스 멜라노스포로파시엔스 EF-76(Streptomyces melanosporofaciens EF-76)인 것을 특징으로 하는 벤조퀴논계 안사마이신 유도체 생합성 방법.
제 1항에 있어서, 단계 3)의 변이주는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 에이씨2(Streptomyces hygroscopicus AC2) KCTC 10676BP인 것을 특징으로 하는 벤조퀴논계 안사마이신 유도체 생합성 방법.
제 1항에 있어서, 단계 4)의 변이주 배양시 첨가되는 AHBA 또는 그의 유사체는 하기 화학식의 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 벤조퀴논계 안사마이신 유도체 생합성 방법.

R₁= H, OH, NH₂, 할로겐족 또는 알릴기(ally group),

R₂= H, OH, NH₂, 할로겐족 또는 알릴기(ally group),

R₃= H, OH, NH₂, 할로겐족 또는 알릴기(ally group),

R₄= H, NH₂, 할로겐족 또는 알릴기(ally group),

할로겐족= F, Cl, Br 또는 I.
제 1항에 있어서, 단계 4)의 AHBA 또는 그의 유사체의 처리 농도는 0.1 ㎎/㎖ ~ 20 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 벤조퀴논계 안사마이신 유도체 생합성 방법.
제 1항에 있어서, 단계 4)의 안사마이신은 젤다나마이신, 허비마이신, 멕벡신, 레브라스타틴 또는 안사마이토신인 것을 특징으로 하는 벤조퀴논계 안사마이신 유도체 생합성 방법.
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하기 화학식으로 표시되는 안사마이신 유도체:
하기 화학식으로 표시되는 안사마이신 유도체:

R= H 또는 OH
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스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus)를 상기 서열번호 7로 기재되는 napK 유전자가 변이되어 불활성화된 유전자 비활성 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환시킨 후 재조합된 스트렙토마이세스 하이그로프코피쿠스 변이주.
제 19항에 있어서, 변이주는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 에이씨2(Streptomyces hygroscopicus AC2) KCTC 10676BP인 것을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 변이주.
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