JP6644433B2 - 眼疾患治療用及び予防用徐放性医薬組成物 - Google Patents
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Description
(1) 下記式(I):
1)物質の性状: 無色粉末状物質2)分子式: C32H43NO5
3)分子量:521(ESIマススペクトル法により測定)
4)高分解能LC−ESIマススペクトル法により測定した精密質量、[M+H]+は次に示す通りである。
実測値:522.32062
計算値:522.32140
5)1H−核磁気共鳴スペクトル:重クロロホルム中でTMSのシグナルを0.00ppmとして測定した1H−核磁気共鳴スペクトル(500MHz)は、以下に示す通りである。
σ:0.98(3H,s),0.99(3H,s),1.00(3H,s),1.17(3H,s),1.18−1.22(1H,m),1.25(3H,s),1.28−1.30(1H,m),1.33(3H,s),1.49(3H,s),1.51−1.55(1H,m),1.62−1.66(1H,m),1.68−1.71(1H,m),1.69−1.72(1H,m),1.70−1.80(2H,m),1.77−1.79(1H,m),1.76−1.82(2H,m),1.85−1.89(2H,m),2.96(1H,d,J=5.0Hz),3.04(1H,ddd,J=4.0Hz,4.0Hz,14.0Hz),3.49(1H,dd,J=5.0Hz,11.5Hz),3.71(3H,s),5.97(1H,s),8.03(1H,s)ppm
6)13C−核磁気共鳴スペクトル:重クロロホルム中でTMSのシグナルを0.00ppmとして測定した13C−核磁気共鳴スペクトル(125MHz)は、以下に示す通りである。
σ:16.4(q),18.2(t),21.4(q),21.5(q),23.9(t),24.6(q),26.6(q),27.0(q),28.1(t),29.1(q),31.1(d),31.6(t),35.8(t),35.9(s),40.1(t),42.0(s),42.5(s),45.0(s),45.7(s),47.7(d),48.9(s),49.0(d),52.1(q),73.7(d),114.3(s),114.6(s),124.0(d),165.5(d),168.5(s),176.6(s),196.5(s),198.7(s)ppm
7)高速液体クロマトグラフィー:
カラム:Unison UK−C18
(直径4.6mm×長さ75mm:インタクト(株)製)
溶 媒:A:0.01%ギ酸含有10mMギ酸アンモニウム水溶液
B:0.01%ギ酸含有アセトニトリル
A/B=5/5で平衡化したのちA/B=1/9まで7分間の直線グラジエント
流 速:1.0ml/分
温 度:40℃
検 出:紫外部吸収 λ230nm
保持時間:4.3分。
1)物質の性状: 無色粉末状物質
2)分子式: C32H43NO6
3)分子量:537(ESIマススペクトル法により測定)
4)高分解能LC−ESIマススペクトル法により測定した精密質量、[M+H]+は次に示す通りである。
実測値:538.31496
計算値:538.31631
5)1H−核磁気共鳴スペクトル:重クロロホルム中でTMSのシグナルを0.00ppmとして測定した1H−核磁気共鳴スペクトル(500MHz)は、以下に示す通りである。
σ:0.96(3H,s),1.06(3H,s),1.11(3H,s),1.12(3H,s),1.19(3H,s),1.27(3H,s),1.28(3H,s),1.46(1H,d,J=13.0Hz),1.47(1H,d,J=13.0Hz),1.52−1.59(2H,m),1.61−1.65(2H,m),1.66−1.69(1H,m),1.68−1.75(1H,m),1.75(1H,dd,J=3.5Hz,14.5Hz),1.88(1H,brd,J=14.5Hz),1.98(1H,dd,J=5.5Hz,9.5Hz),2.03(1H,dd,J=3.5Hz,14.5Hz),2.38(1H,ddd,J=3.5Hz,14.0Hz,14.0Hz),2.99(1H,d,J=4.5Hz),3.10(1H,brd,J=13.5Hz),3.53(1H,brs),3.69(3H,s),4.34(1H,s),6.09(1H,s)ppm
6)13C−核磁気共鳴スペクトル:重クロロホルム中でTMSのシグナルを0.00ppmとして測定した13C−核磁気共鳴スペクトル(125MHz)は、以下に示す通りである。
σ:18.3(t),21.0(q),21.3(q),22.8(q),23.9(q),24.0(q),25.7(t),27.4(q),28.0(q),28.7(t),30.0(t),31.4(t),31.5(d),35.2(s),38.9(t),40.9(s),42.1(s),42.6(d),45.1(s),45.5(s),47.0(s),49.5(d),52.0(q),53.2(s),69.1(d),74.8(d),113.6(s),124.8(d),168.8(s),177.6(s),198.8(s),202.4(s)ppm
7)高速液体クロマトグラフィー:
カラム:Unison UK−C18
(直径4.6mm×長さ75mm:インタクト(株)製)
溶 媒:A:0.01%ギ酸含有10mMギ酸アンモニウム水溶液
B:0.01%ギ酸含有アセトニトリル
A/B=5/5で平衡化したのちA/B=1/9まで7分間の直線グラジエント
流 速:1.0ml/分
温 度:40℃
検 出:紫外部吸収 λ230nm
保持時間:5.4分。
(7) 変換菌がケトミウム属に属するケトミウム・エスピー(Chaetomium sp.) SANK 11867株(受託番号 NITE BP−01916)である、上記(5)に記載の化合物の製造方法。
次いで、式(2)で表される化合物を基質とし、このものを上記(3)若しくは(4)に記載の化合物、又は上記式(III)で表されるテルペノイド誘導体に変換しうる変換菌と共に培地中で培養し、その培養物より上記(3)若しくは(4)に記載の化合物、又は上記式(III)で表されるテルペノイド誘導体を採取することを特徴とする、上記(3)若しくは(4)に記載の化合物、又は上記式(III)で表されるテルペノイド誘導体の製造方法。
(11) 変換菌が、バチルス属に属するバチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium) SANK 70314株(受託番号NITE BP−01915)である、上記(9)に記載の製造方法。 (12) 変換菌が、宿主に(a)、(b)、(c)、又は(d)のタンパク質をコードする遺伝子を導入することにより得られる形質転換体である、上記(9)に記載の製造方法、
(a)配列番号5(図11)のアミノ酸配列を有するタンパク質、
(b)配列番号6(図12)のアミノ酸配列を有するタンパク質、
(c)(a)又は(b)のタンパク質のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質、
(d)(a)又は(b)のタンパク質のアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質、
(e)(a)又は(b)のタンパク質をコードする塩基配列からなるDNAにストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質、
(13)上記宿主が大腸菌又はバクテリアである、上記(12)に記載の製造方法、
(14)上記バクテリアがバチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)である、上記(13)に記載の製造方法。
(f)配列番号3(図9)に記載の塩基配列、
(g)配列番号4(図10)に記載の塩基配列、
(h)(f)または(g)の塩基配列において定義されたいずれかの塩基配列の相補配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAが有する塩基配列、
(i)(f)または(g)の塩基配列において定義されたいずれかの塩基配列との同一性が90%以上である塩基配列;
(j) 遺伝暗号の縮重のため、(f)または(g)の塩基配列において定義された塩基配列の相補配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないが、(f)項から(h)項までのいずれかの項で定義された塩基配列と同じアミノ酸配列をコードする塩基配列、
(16) 下記(k)〜(n)の何れかのアミノ酸配列を有し、式(2)で表される基質化合物の水酸化酵素活性を有するタンパク質、
(k)配列番号5(図11)に記載のアミノ酸配列、
(l)配列番号6(図12)に記載のアミノ酸配列、
(m)(k)または(l)のアミノ酸配列において定義されたアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列、
(n)(k)または(l)のアミノ酸配列において定義されたアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列、
(17) 上記(15)記載の塩基配列を担持する自立複製性または組み込み複製性の組み換えプラスミド、
(18) 上記(17)に記載の組み換えプラスミドで宿主を形質転換した形質転換体、
(19) 上記(17)に記載の組み換えプラスミドをバチルス・サチルスに形質転換した形質転換体バチルス・サチルス(Bacillus subtilis)SANK 70214T株、
(20) 上記(17)に記載の組み換えプラスミドをバチルス・サチルスに形質転換した形質転換体バチルス・サチルス(Bacillus subtilis)SANK 70314T株。
(22) バチルス属に属するバチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)SANK 70314株(受託番号NITE BP−01915)。
眼疾患(当該眼疾患は、アレルギー性結膜疾患、ウィルス性結膜炎、翼状片、角膜感染症、ドライアイ、角膜障害(角膜上皮障害、及び/又は、角膜内皮障害である)、ぶどう膜炎、ベーチェット病、糖尿病網膜症、網膜剥離、網膜静脈閉塞、中心性漿液性脈絡網膜症、加齢黄斑変性、糖尿病黄斑浮腫、黄斑疾患、網膜色素変性、緑内障、若しくは、白内障である)、
腎疾患(当該腎疾患は、急性腎炎、慢性腎炎、急性腎不全、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、IgA腎症、糖尿病腎症、痛風腎、腎硬化症、水腎症、尿細管間質性腎炎、冠動脈バイパス手術後の腎機能低下、若しくは、腎尿路感染症である)、
呼吸器疾患(当該呼吸器疾患は、気管支炎、肺炎、胸膜炎、慢性閉塞性肺疾患、急性肺障害(acute lung injury: ALI)、びまん性汎細気管支炎、肺気、若しくは、喘息である)、
肝疾患(当該肝疾患は、アルコール性脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝線維症、肝硬変、若しくは、肝移植に伴う肝機能障害である)、
脳疾患(当該脳疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis: ALS)、脳梗塞、若しくは、多発性硬化症(multiple sclerosis)である)、又は
心臓疾患(当該心臓疾患は、心筋梗塞である)
の予防用または治療用医薬。
(27) 基材がポリ乳酸、又は、乳酸グリコール酸共重合体であることを特徴とする上記(24)又は(25)に記載の、眼疾患治療用または予防用の徐放性医薬組成物。
(29) 形態がロッドであることを特徴とする上記(24)乃至(27)のいずれか1項に記載の、眼疾患治療用または予防用の徐放性医薬組成物。
(31) 有効成分の含有率が20重量%乃至60重量%であることを特徴とする上記(242)乃至(29)のいずれか1項に記載の、眼疾患治療用または予防用の徐放性医薬組成物、
(32) 有効成分の含有率が20重量%乃至60重量%であり、生理的条件下、有効成分を持続的に放出することにより、1週間以上、薬理作用を持続し、基材がポリ乳酸又は乳酸グリコール酸であり、形状がマイクロスフェア又はまたはロッドであることを特徴とする上記(24)又は(25)に記載の、眼疾患治療用または予防用の徐放性医薬組成物。
(34) 後部眼疾患が糖尿病黄斑浮腫、及び/又は、網膜静脈閉塞である上記(24)乃至(32)のいずれか1項に記載の眼疾患治療用または予防用の徐放性医薬組成物
である。
(1) 本発明の式(I)で示されるテルペノイド誘導体(以下、テルペノイド誘導体(I)と記す)と式(III)で示されるテルペノイド誘導体(以下、テルペノイド誘導体(III)と記す)を製造する際の基質として、下記式(1)により表される化合物を用いることができる。
Methyl 2−cyano−3,12−dioxooleana−1,9−dien−28−oate(CDDO−Me)とも記される。以下、上記基質化合物を、CDDO−Meとも記す。
(1)<SANK 10312株>
基質化合物(1)から本発明のテルペノイド誘導体(I)又はテルペノイド誘導体(III)を製造するために使用する変換菌としては、特に限定されないが、好適には真菌であり、例えば、ケトミウム(Chaetomium)属に属する真菌を挙げることができる。
<PDA培地 {ポテト デキストロース寒天(Potato Dextrose Agar))培地}>
ニッスイ ポテト デキストロース寒天培地(日水製薬(株)製) 39g
蒸留水 1000ml
<OA培地{オートミール寒天(Oatmeal agar)培地}>
オートミール抽出液* 1000ml
寒天 20g
*30gのオートミールに蒸留水を加えて2時間ほど煮出し、布でろ過して1000mlにフィルアップし作成した。
<MEA培地{麦芽エキス寒天(Malt extract agar)培地}>
バクト マルトエキストラクト(Becton, Dickinson and Company製) 30g
バクト ソイトン(Becton,Dickinson and Company製) 3g
寒天 15g
蒸留水 1000ml。
<CMA培地{コーンミール寒天(Corn Meal Agar)培地}>
コーンミールアガール「ニッスイ」(日水製薬(株)製) 17g
蒸留水 1000ml。
基質化合物(1)から本発明のテルペノイド誘導体(I)又はテルペノイド誘導体(III)を製造するために使用する変換菌としては、特に限定されないが、好適には真菌であり、例えば、ケトミウム(Chaetomium)属に属する真菌を挙げることができる。
OA培地での20℃、10日のコロニーは、直径80mm以上である。コロニーは薄く、短い綿毛状の白色の菌糸からなり、灰黄色となる。コロニーの中心部の表面に小粒状の子のう果を形成し暗緑色となる。裏面は表面と同色となる。
基質化合物(2)から本発明のテルペノイド誘導体(II)又はテルペノイド誘導体(III)を製造するために使用する変換菌としては、特に限定されないが、好適には、水酸化酵素活性を有する細菌であり、例えば、バチルス(Bacillus)属に属する細菌を挙げることができる。
<TSB(PEARLCORE TRYPTO−SOY BROTH)寒天培地>
PEARLCORE TRYPTO−SOY BROTH(栄研化学株式会社) 30g
寒天 15g
蒸留水 1000ml
(オートクレーブ前にpH8.0に調製)。
[1]形態学的性状
TSB培地(pH8.0)で28℃、24時間培養後の観察では、細胞が幅1μm、長さが4−5μmの桿菌であり、運動をしない。
[2]培養学的性状
TSB培地(pH8.0)で28℃ 、24時間培養後のコロニーの色調は半透明なクリームがかった白色で、鈍光を有する。コロニーの形状は円形で、中央に向けて凸レンズ状に隆起し、表面は平滑で、周辺は全縁である。
[3]生理学的性状
(1)カタラーゼ:+
(2)生育温度 :14−39℃
(3)グラム染色:陽性
(4)酸の生成(アピ 50 CHを使用)
エリスリトール:−
D−アラビノース:−
L−アラビノース:−
D−リボース:+
L−キシロース:+
メチル−β−D−キシロピラノシド:−
D−ガラクトース:−
D−マンノース:+
L−ラムノース:+
ズルシトール:−
イノシトール:−
D−ソルビトール:−
メチルα−D−マンノピラノシド:−
メチルα−D−グルコピラノシド:−
N−アセチル グルコサミン:−
アミグダリン:+
サリシン:+
D−ラクトース:−
D−メリビオース:−
D−メレジトース:−
D−ラフィノース:−
スターチ:−
グリコーゲン:−
キシリトール:−
ゲンチオビオース:+
D−ツラノース:−
D−リキソース:−
D−タガトース:−
D−アラビトール:−
グルコン酸:−
2−ケト−グルコン酸:−
(5)生育pH
pH6:+
pH7:+
pH8:+
pH9:+
pH10:+
(6)N a C l 含有培地での生育
0%:+
2%:+
4%:+
6%:+
8%:+
10%:−
[4]遺伝学的性状
(1)G+C 含量:40.8%
(2)16S rDNA解析:解読した塩基配列(1478 bp:配列表の配列番号1)をRibosomal Database Project(RDP)(Release 11、(March 7, 2014にアップデート))に登録されている細菌の各種の基準株のデータと比較したところ、B.gibsonii DSM 8722と相同性が最も高く、相同値は99.5%であった。さらに、サイトウおよびネイらの近接結合法(SaitouN.,and M. Nei, Molecular Biology and Evolution, 4, p406−425(1987))により系統解析し、図13に示す結果を得た。
基質化合物(2)から本発明のテルペノイド誘導体(II)又はテルペノイド誘導体(III)を製造するために使用する変換菌として例示されるバチルス(Bacillus)属に属する細菌として、好適には、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)SANK 70314株(受託番号NITE BP−01915)(以下、SANK 70314株と記す)を例示することもできる。
<NA(PEARLCORE NUTRIENT AGAR)培地>
PEARLCORE NUTRIENT AGAR(栄研化学株式会社) 35g
蒸留水 1000ml。
[1]形態学的性状
普通寒天培地(栄研化学製)で28℃、24時間培養後の観察では、細胞が幅1μm、長さが4−5μmの桿菌であり、運動をしない。
[2]培養学的性状
普通寒天培地で28℃、24時間培養後のコロニーの色調は不透明なクリームがかった白色で、鈍光を有する。コロニーの形状は円形で、中央に向けて凸レンズ状に隆起し、表面は平滑で、周辺は全縁である。
[3]生理学的性状
(1)カタラーゼ:+
(2)生育温度 :13−46℃
(3)グラム染色:陽性
(4)炭素源の利用性(アピ 50 CHを使用)
グリセロール:+
エリスリトール:−
D−アラビノース:−
D−リボース:+
L−キシロース:−
D−アドニトール:−
メチル−β−D−キシロピラノシド:−
D−ガラクトース:+
D−フルクトース:+
L−ソルボース:−
L−ラムノース:−
ズルシトール:−
イノシトール:−
D−ソルビトール:−
メチルα−D−マンノピラノシド:−
N−アセチル グルコサミン:+
アミグダリン:+
アルブチン:+
D−セロビオース:+
D−マルトース:+
D−ラクトース:−
D−メリビオース:+
D−スクロース:+
D−トレハロース:+
イヌリン:−
D−メレジトース:+
D−ラフィノース:+
キシリトール:−
ゲンチオビオース:+
D−ツラノース:+
D−リキソース:−
D−タガトース:−
D−フコース:−
L−フコース:−
D−アラビトール:−
L−アラビトール:−
グルコン酸:−
2−ケト−グルコン酸:−
5−ケト−グルコン酸:−
(5)生育pH
pH6:+
pH7:+
pH8:+
pH9:−
[4]遺伝学的性状
(1)G+C含量:38.0%
(2)16S rDNA解析:解読した塩基配列(1383bp:配列表の配列番号2)をRibosomal Database Project(RDP)(Release 11、(March 7, 2014にアップデート))に登録されている細菌の各種の基準株のデータと比較したところ、Bacillus megaterium IAM 13418と最も高く、相同値は99.9%であった。さらに、サイトウおよびネイらの近接結合法(Saitou N., and M. Nei, Molecular Biology and Evolution, 4, p406−425(1987))により系統解析し、図13に示す結果を得た。
基質化合物(2)から本発明のテルペノイド誘導体(III)を製造するためには、上記微生物から基質化合物(2)の水酸化に関与すタンパク質をコードする塩基配列を決定し、本発明のタンパク質を発現した微生物を利用することができる。具体的には、SANK 70214株およびSANK 70314株から基質化合物(2)を選択的に水酸化し、テルペノイド誘導体(III)に変換するタンパク質を決定し、該タンパク質を発現する微生物を基質化合物(2)に作用させることで、テルペノイド誘導体(III)を製造することができる。
本発明のタンパク質は、該タンパク質をコードする遺伝子を取得し、利用することによって作成することができる。以下に本発明の遺伝子の取得方法、本発明のタンパク質の作成方法を具体的に記載する。
SANK 70214株およびSANK 70314株より常法によりゲノムDNAを抽出し、ゲノムシークエンサーを用いて、全ゲノムを解析し、水酸化能を有するタンパク質を同定することで、本発明の遺伝子を取得することができる。
(f)配列番号3(図9)に記載のSANK 70214の水酸化活性を有するタンパク質の塩基配列
(g)配列番号4(図10)に記載のSANK 70314の水酸化活性を有するタンパク質の塩基配列
(h)(f)または(g)で示されるDNAの改変体であって、(f)または(g)に示されるいずれかのDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、基質化合物(2)の水酸化活性を有するタンパク質をコードするDNA、
(i)遺伝子暗号の縮重のため、(f)または(g)に示されるいずれのDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないが、(f)または(g)で示されるDNAによりコードされる、タンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA、
(j)(f)で示されるDNAの塩基配列において1から数個の塩基の欠失、置換及び/又は付加を有する塩基配列を有し、かつ基質化合物(2)の水酸化活性を有するタンパク質をコードするDNA。
・配列番号5(図11)のアミノ酸配列を有するタンパク質
・配列番号5のタンパク質のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質、
・配列番号5のタンパク質のアミノ酸配列と90%配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質、
・配列番号5のタンパク質をコードする塩基配列からなるDNAにストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質。
・配列番号6(図12)のアミノ酸配列を有するタンパク質、
・配列番号6のタンパク質のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質、
・配列番号6のタンパク質のアミノ酸配列と90%配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質、
・配列番号6のタンパク質をコードする塩基配列からなるDNAにストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質。
本発明の形質転換体は、宿主に前記(f)、(g)、(h)、(i)又は(j)のタンパク質をコードする遺伝子を、通常の遺伝子工学的方法によって宿主に導入することによって得られる。具体的には、本発明の形質転換体をコードする遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる発現ベクターを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。
上述の変換菌の培養は、一般に微生物の二次代謝産物の製造に使用されるような培地を用いて行なうことができる。そのような培地は、微生物が資化出来る炭素源、窒素源、無機塩、微量の生育因子、微量金属等を含有する。
変換菌の培養は、通常、変換菌を生やしたスラントを少量の培地に接種した種培養から始まり、必要に応じより大きな規模で種培養を再度行なった後、最終段階としてより大きな規模での本培養を行なうことによりなされる。
上述の様にして精製された本発明のテルペノイド誘導体は、Keap1/Nrf2/AREシグナル伝達経路を活性化する作用を有し、抗炎症作用、細胞保護作用を有する。
眼疾患として、ドライアイ、角膜障害(角膜上皮障害、及び/又は、角膜内皮障害である)、ぶどう膜炎、糖尿病網膜症、網膜静脈閉塞、加齢黄斑変性、糖尿病黄斑浮腫、緑内障、
腎疾患として、糖尿病腎症が、
呼吸器疾患として、慢性閉塞性肺疾患、急性肺障害、
肝疾患として、非アルコール性脂肪性肝炎、肝移植に伴う肝機能障害、
脳疾患として、脳梗塞、多発性硬化症
の予防剤もしくは治療剤として有用である。
本発明のテルペノイド誘導体を有効成分とする眼疾患治療用及び/又は予防用徐放性医薬組成物(以下、本発明の徐放性医薬組成物とも記す)は、硝子体に投与可能な基材および硝子体に投与可能な形態を有し、眼内に直接投与される。
有機溶媒を使用せずに、本発明の徐放性医薬組成物の内部コアを加工する場合には、本発明のテルペノイド誘導体が、基材である生分解性ポリマーの全体又はポリマーの特定の部位だけにしっかりと混ぜ合わされ分散又は溶解するような条件下で行うことができる。
本発明のテルペノイド誘導体の投与量は、症状、年齢などにより異なるが、局所投与の場合は、0.0001μg/site乃至100μg/siteが好ましい。全身投与の場合の投与量は、0.00001mg/kg乃至10mg/kgが好ましい。
100ml容の三角フラスコ4本に下記表1に示す組成の種培養培地を各々20mlずつ入れ、121℃にて20分間滅菌した後、室温まで冷却し、SANK 10312株の胞子懸濁液を1ml接種し、回転振とう培養機で23℃、210rpmの条件下で2日間培養した。得られた培養液を、以下、「種培養液」という。
表1.SANK 10312株の種培養培地の培地組成
グリセリン 30g
グルコース 30g
可溶性澱粉 20g
大豆粉 10g
ゼラチン 2.5g
イーストエキス(Difco) 2.5g
NH4NO3 2.5g
寒天 3g
消泡剤 *1 0.1ml
水道水 1000ml
*1 ニッサン・ディスフォームCB−442(日本油脂(株)製)
*2 pHは無修正。
表2.本培養培地の培地組成
グリセリン 30g
グルコース 30g
可溶性澱粉 20g
大豆粉 10g
ゼラチン 2.5g
イーストエキス(Difco) 2.5g
NH4NO3 2.5g
消泡剤 *1 0.1ml
水道水 1000ml
*1 ニッサン・ディスフォームCB−442(日本油脂(株)製)
*2 pHは無修正。
本実施例におけるテルペノイド誘導体(I)、テルペノイド誘導体(III)の挙動は、以下に示す条件のHPLCでモニターした。
(直径4.6mm×長さ75mm:インタクト(株)製)
溶 媒:A:0.01%ギ酸を含む10mMギ酸アンモニウム水溶液
B:0.01%ギ酸を含むアセトニトリル
A/B=5/5で平衡化したのちA/B=1/9まで7分間の直線グラジエント
流 速:1.0ml/分
検 出:紫外部吸収 λ230nm
保持時間:4.3分(テルペノイド誘導体(I))
4.9分(テルペノイド誘導体(III))。
1)物質の性状:無色粉末状物質
2)分子式: C32H43NO5
3)分子量:521(ESIマススペクトル法により測定)
4)高分解能LC−ESIマススペクトル法により測定した精密質量、[M+H]+は次に示す通りである。
実測値:522.32062
計算値:522.32140
5)1H−核磁気共鳴スペクトル:重クロロホルム中でTMSのシグナルを0.00ppmとして測定した1H−核磁気共鳴スペクトル(500MHz)は、以下に示す通りである。
σ:0.98(3H,s),0.99(3H,s),1.00(3H,s),1.17(3H,s),1.18−1.22(1H,m),1.25(3H,s),1.28−1.30(1H,m),1.33(3H,s),1.49(3H,s),1.51−1.55(1H,m),1.62−1.66(1H,m),1.68−1.71(1H,m),1.69−1.72(1H,m),1.70−1.80(2H,m),1.77−1.79(1H,m),1.76−1.82(2H,m),1.85−1.89(2H,m),2.96(1H,d,J=5.0Hz),3.04(1H,ddd,J=4.0Hz,4.0Hz,14.0Hz),3.49(1H,dd,J=5.0Hz,11.5Hz),3.71(3H,s),5.97(1H,s),8.03(1H,s)ppm
6)13C−核磁気共鳴スペクトル:重クロロホルム中でTMSのシグナルを0.00ppmとして測定した13C−核磁気共鳴スペクトル(125MHz)は、以下に示す通りである。
σ:16.4(q),18.2(t),21.4(q),21.5(q),23.9(t),24.6(q),26.6(q),27.0(q),28.1(t),29.1(q),31.1(d),31.6(t),35.8(t),35.9(s),40.1(t),42.0(s),42.5(s),45.0(s),45.7(s),47.7(d),48.9(s),49.0(d),52.1(q),73.7(d),114.3(s),114.6(s),124.0(d),165.5(d),168.5(s),176.6(s),196.5(s),198.7(s)ppm
7)高速液体クロマトグラフィー:
カラム:Unison UK−C18
(直径4.6mm×長さ75mm:インタクト(株)製)
溶 媒:A:0.01%ギ酸含有10mMギ酸アンモニウム水溶液
B:0.01%ギ酸含有アセトニトリル
A/B=5/5で平衡化したのちA/B=1/9まで7分間の直線グラジエント
流 速:1.0ml/分
温 度:40℃
検 出:紫外部吸収 λ230nm
保持時間:4.3分。
21位のβ−プロトン:3.49ppm(メチン)
9)テルペノイド誘導体(I)の二次元核磁気共鳴スペクトル(1H−1H NOESYスペクトル)を図3に示す。図3において、19位のβ−プロトンと21位のβ−プロトンに相関が認められることから、立体構造を(I)のように決定した。
(1)ケトミウム属変換菌の培養
100ml容の三角フラスコ176本に実施例1の表1に示す組成の種培養培地を各々20mlずつ入れ、121℃にて20分間滅菌した後、室温まで冷却し、SANK 11867株の胞子懸濁液を1ml接種し、回転振とう培養機で23℃、210rpmの条件下で2日間培養した。得られた培養液を、以下、「種培養液」という。
本実施例におけるテルペノイド誘導体(I)、テルペノイド誘導体(III)の挙動は、以下に示す条件のHPLCでモニターした。
(直径4.6mm×長さ75mm:インタクト(株)製)
溶 媒:A:0.01%ギ酸を含む10mMギ酸アンモニウム水溶液
B:0.01%ギ酸を含むアセトニトリル
A/B=5/5で平衡化したのちA/B=1/9まで7分間の直線グラジエント
流 速:1.0ml/分
検 出:紫外部吸収 λ230nm
保持時間:4.3分(テルペノイド誘導体(I))
4.9分(テルペノイド誘導体(III))。
1H−NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.91(3H,s),1.01(3H,s),1.08(3H,s),1.12(3H,s),1.19(3H,s),1.27(3H,s),1.55(3H,s),1.18−2.00(15H,m),2.94(1H,d,J=4.9Hz),3.05(1H,dt,J=13.8,3.7Hz),3.70(3H,s),4.34(1H,s),6.07(1H,s).
高速液体クロマトグラフィー:
純 度:99.0%
カラム:コスモシール 5C18−MS−II
(直径6.0mm×長さ150mm:ナカライテスク(株)製)
溶 媒:A:10mM酢酸アンモニウム水溶液
B:アセトニトリル
A/B=15/85のアイソクラティック
流 速:1.0ml/分
温 度:40℃
検 出:紫外部吸収 λ254nm
保持時間:9.6分。
100ml容の三角フラスコ20本に下記表3に示す組成の種培養培地を各々20mlずつ入れ、121℃にて30分間滅菌した後、室温まで冷却し、SANK 70214株のコロニーを1白金耳接種して、回転振とう培養機で28℃、210rpmの条件下で24時間培養した。得られた培養液を、以下、「種培養液」という。
表3.SANK 70214株の種培養培地の培地組成
グルコース 50g
大豆粉 10g
肉エキス 4g
ポリペプトン 4g
イーストエキス(Difco) 1g
CaCO3 5g
NaCl 2.5g
消泡剤 *1 0.5ml
イオン交換水 1000ml
*1 ニッサン・ディスフォームCB−442(日本油脂(株)製)
*2 pHは滅菌前に、NaOHまたはHClで7.2に調整。
本実施例におけるテルペノイド誘導体(II)、テルペノイド誘導体(III)の挙動は、以下に示す条件のHPLCでモニターした。
(直径4.6mm×長さ75mm:インタクト(株)製)
溶 媒:A:0.01%ギ酸を含む10mMギ酸アンモニウム水溶液
B:0.01%ギ酸を含むアセトニトリル
A/B=5/5で平衡化したのちA/B=1/9まで7分間の直線グラジエント
流 速:1.0ml/分
検 出:紫外部吸収 λ230nm
保持時間:5.4分(テルペノイド誘導体(II))
4.9分(テルペノイド誘導体(III))。
1)物質の性状:無色粉末状物質
2)分子式: C32H43NO6
3)分子量:537(ESIマススペクトル法により測定)
4)高分解能LC−ESIマススペクトル法により測定した精密質量、[M+H]+は次に
示す通りである。
実測値:538.31496
計算値:538.31631
5)1H−核磁気共鳴スペクトル:重クロロホルム中でTMSのシグナルを0.00ppmとして測定した1H−核磁気共鳴スペクトル(500MHz)は、以下に示す通りである。
σ:0.96(3H,s),1.06(3H,s),1.11(3H,s),1.12(3H,s),1.19(3H,s),1.27(3H,s),1.28(3H,s),1.46(1H,d,J=13.0Hz),1.47(1H,d,J=13.0Hz),1.52−1.59(2H,m),1.61−1.65(2H,m),1.66−1.69(1H,m),1.68−1.75(1H,m),1.75(1H,dd,J=3.5Hz,14.5Hz),1.88(1H,brd,J=14.5Hz),1.98(1H,dd,J=5.5Hz,9.5Hz),2.03(1H,dd,J=3.5Hz,14.5Hz),2.38(1H,ddd,J=3.5Hz,14.0Hz,14.0Hz),2.99(1H,d,J=4.5Hz),3.10(1H,brd,J=13.5Hz),3.53(1H,brs),3.69(3H,s),4.34(1H,s),6.09(1H,s)ppm
6)13C−核磁気共鳴スペクトル:重クロロホルム中でTMSのシグナルを0.00ppmとして測定した13C−核磁気共鳴スペクトル(125MHz)は、以下に示す通りである。
σ:18.3(t),21.0(q),21.3(q),22.8(q),23.9(q),24.0(q),25.7(t),27.4(q),28.0(q),28.7(t),30.0(t),31.4(t),31.5(d),35.2(s),38.9(t),40.9(s),42.1(s),42.6(d),45.1(s),45.5(s),47.0(s),49.5(d),52.0(q),53.2(s),69.1(d),74.8(d),113.6(s),124.8(d),168.8(s),177.6(s),198.8(s),202.4(s)ppm
7)高速液体クロマトグラフィー:
カラム:Unison UK−C18
(直径4.6mm×長さ75mm:インタクト(株)製)
溶 媒:A:0.01%ギ酸含有10mMギ酸アンモニウム水溶液
B:0.01%ギ酸含有アセトニトリル
A/B=5/5で平衡化したのちA/B=1/9まで7分間の直線グラジエント
流 速:1.0ml/分
温 度:40℃
検 出:紫外部吸収 λ230nm
保持時間:5.4分。
21位のα−プロトン:3.53ppm(メチン)
9)テルペノイド誘導体(II)の二次元核磁気共鳴スペクトル(1H−1H NOESYスペクトル)を図6に示す。図6において、19位のα−プロトンと21位のα−プロトンに相関が認められることから、立体構造を(II)のように決定した。
(1)バチルス属変換菌の培養
100ml容の三角フラスコに種培養培地として以下に示すトリプト ソイ ブイヨン培地(以下、TSB培地とする)を20ml入れ、121℃にて15分間滅菌した後、室温まで冷却し、SANK 70314株のコロニーを1白金耳接種して、回転振とう培養機で28℃、210rpmの条件下で24時間培養した。得られた培養液を、以下、「種培養液」という。
<TSB培地(トリプト ソイ ブイヨン 培地)>
パールコア トリプトソイブイヨン培地 栄研(栄研化学(株)製) 30g
蒸留水 1000ml。
本実施例におけるテルペノイド誘導体(III)の挙動は、以下に示す条件のHPLCでモニターした。
(直径4.6mm×長さ75mm:インタクト(株)製)
溶 媒:A:0.01%ギ酸を含む10mMギ酸アンモニウム水溶液
B:0.01%ギ酸を含むアセトニトリル
A/B=5/5で平衡化したのちA/B=1/9まで7分間の直線グラジエント
流 速:1.0ml/分
検 出:紫外部吸収 λ230nm
保持時間:4.9分(テルペノイド誘導体(III))。
(1)Bacillus sp. SANK 70214株のゲノムDNAサンプルの調製
500ml容の三角フラスコに3% PEARLCORE TRYPTO−SOY BROTH(栄研化学株式会社製)(オートクレーブ前にpH8.0に調製)(以下、TSB培地(pH8.0)と示す)からなる培地を100ml入れ、121℃にて15分間滅菌した後、室温まで冷却し、SANK 70214株を1白金耳接種し、28℃、210rpmの条件で15.5時間培養した。得られた培養液を種培養とした。500ml容の三角フラスコに100mlのTSB培地(pH8.0)を100ml入れ、121℃にて15分間滅菌した後、室温まで冷却し、上述のSANK 70214株の種培養液を無菌的に1ml接種し、28℃、210rpmの条件で8時間培養を行なった。得られた培養液40mlを50mlコニカルチューブに分注し、6,000rpm、10分間遠心して菌体を回収し、ゲノムDNAを調整した。
ゲノムシークエンスはPacBio RSII(Pacific biosciences社製)およびMiseq(Illumina社製)を用いて次世代天然物化学技術研究組合でおこなった。得られた配列は4.0Mbp、GC含量は40.8%であった。得られたゲノム配列はBacillus halodurans を参照配列として、BASys Server 2(https://www.basys.ca/server2/basys/cgi/text_search.pl)を用いてアノテーション付けを行い、1個のP450と推測される塩基配列(SANK 70214株の水酸化活性を有するタンパク質の塩基配列)を得た(配列番号3、図9)。得られた塩基配列は、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2012 1; 22(1): 606−609に記載されている3種類のmotifを保持していた。そこで、基質化合物(2)を本発明のテルペノイド誘導体(III)に水酸化する活性を持つタンパク質(配列番号5、図11)の遺伝子をクローニングした。
SANK 70214株のP450の塩基配列をPCRで増幅するために、プライマーセットF1(GAAGGAGATATACATATGAGTCATGCTGCGAACG)とR1(TGTCGACGGAGCTCTTTAGAATGAAACGGGCAATG)を作製した。このプライマーセットを用いてSANK 70214を鋳型として、PCR反応を行なった。PCR反応はPrimeSTAR Max(タカラバイオ社製)とPCR装置(タカラバイオ社製、TP350)を用い、変性を98℃、10秒間、アニーリングを55℃、5秒間、伸長を72℃、10秒間行う3段階の反応を30回繰り返した。その結果、約1.2kbの長さのDNA断片が増幅された。得られたSANK 70214株の約1.2kbのDNA断片はIn−Fusion cloning反応に備えて、Cloning Enhancer (Clontech社製)で処理した。クローニング用および発現用のベクターpET21b(Novagen社製)をPCRで増幅するために、プライマーセットF2(ATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC)とR2(AGAGCTCCGTCGACAAGC)を作製した。このプライマーセットを用いてpET21bを鋳型として、PCR反応を行なった。PCR反応はPrimestar max(タカラバイオ社製)とPCR装置(タカラバイオ社製、TP600)を用い、変性を98℃、10秒間、アニーリングを55℃、5秒間、伸長を72℃、60秒間行う3段階の反応を30回繰り返した。その結果、約5kbの長さのDNA断片が増幅された。このPCR反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、約5kbのDNA断片を切り出して、Monofas DNA 精製キットI(ジーエルサイエンス社製)によって回収した。回収したpET21bの約5kbのDNA断片とあらかじめCloning Enhancer処理した約1.2kbの長さのDNA断片はIn−Fusion HD Cloning kit(Clontech社製)を用いて連結し、大腸菌DH5α(TOYOBO社製)に形質転換した。その後、100μg/ml カルベニシリンを含むLB寒天培地で大腸菌を選択した。得られた形質転換大腸菌のコロニーを100μg/ml カルベニシリンを含むLB液体培地で培養した。増殖した大腸菌を回収し、QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN社製)を用いてプラスミドDNAの精製を行いSANK 70214株の水酸化活性を有するタンパク質の塩基配列を保持したプラスミド(pET−SANK70214−01)を得た。
Bacillus subtilis 168株へSANK 70214の水酸化活性を有するタンパク質の塩基配列を導入するために、Bacillus subtilisと大腸菌とのシャトルベクターであるpHT01(MoBiTec社製)へのリクローニングを行なった。
(1)Bacillus megaterium SANK70314株のゲノムDNAサンプルの調製
SANK 70214株の代わりにSANK 70314株を用い、SANK 70314株の種培養液の培養時間を6時間とした以外は、実施例5と同じ方法で、SANK70314株のゲノムDNAサンプルの調製を調整した。
ゲノムシークエンスはPacBio RSII(Pacific biosciences社製)およびMiseq(illumina社製)を用いて行なった。得られた配列は5.4Mbp、GC含量は38.0%であった。得られたゲノム配列はB.megateriumを参照配列として、BASys Server 2(https://www.basys.ca/server2/basys/cgi/text_search.pl)を用いてアノテーション付けを行い、6個のP450と推定される塩基配列(SANK 70314の水酸化活性を有するタンパク質の塩基配列)を得た。得られたP450の塩基配列は、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2012 1; 22(1): 606−609に記載されている3種類のmotifを保持していた。この中から基質化合物(2)を本発明のテルペノイド誘導体(III)に水酸化する活性を持つタンパク質(配列番号6、図12)の遺伝子をクローニングした(配列番号4、図10)。
SANK 70314株のP450の塩基配列をPCRで増幅するために、プライマーセットF5(GAAGGAGATATACATATGAAAACCGAAAGAGAAAAC)とR5(TGTCGACGGAGCTCTTATACATGTTTACGAATCA)を作製した。このプライマーセットを用いてSANK 70314株を鋳型として、PCR反応を行なった。
Bacillus subtilis 168株へSANK 70314の水酸化活性を有するタンパク質の塩基配列を導入するために、B.subtilisと大腸菌とのシャトルベクターであるpHT01(MoBiTec社製)へのリクローニングを行なった。
(1)SANK 70214T株の培養
100ml容の三角フラスコに下記表4に示す組成の種培養培地を20ml入れ、121℃にて15分間滅菌した後、室温まで冷却し、SANK 70214T株のコロニーを1白金耳接種して、回転振とう培養機で37℃、210rpmの条件下で24時間培養した。得られた培養液を、以下、「種培養液」という。
表6.本培養培地の培地組成−2
100mM 硫酸第一鉄 1ml
80mg/ml 5−アミノレブリン酸 1ml
2mg/ml チミン 10ml
100mg/ml クロラムフェニコール 1ml
。
本実施例におけるテルペノイド誘導体(III)の挙動は、以下に示す条件のHPLCでモニターした。
(直径4.6mm×長さ75mm:インタクト(株)製)
溶 媒:A:0.01%ギ酸を含む10mMギ酸アンモニウム水溶液
B:0.01%ギ酸を含むアセトニトリル
A/B=5/5で平衡化したのちA/B=1/9まで7分間の直線グラジエント
流 速:1.0ml/分
検 出:紫外部吸収 λ230nm
保持時間:4.9分(テルペノイド誘導体(III))。
(1)SANK 70314T株の培養
100ml容の三角フラスコに実施例7の表4に示す組成の種培養培地を20ml入れ、121℃にて15分間滅菌した後、室温まで冷却し、SANK 70314T株のコロニーを1白金耳接種して、回転振とう培養機で37℃、210rpmの条件下で10時間培養した。得られた培養液を、以下、「種培養液」という。
本実施例におけるテルペノイド誘導体(III)の挙動は、以下に示す条件のHPLCでモニターした。
(直径4.6mm×長さ75mm:インタクト(株)製)
溶 媒:A:0.01%ギ酸を含む10mMギ酸アンモニウム水溶液
B:0.01%ギ酸を含むアセトニトリル
A/B=5/5で平衡化したのちA/B=1/9まで7分間の直線グラジエント
流 速:1.0ml/分
検 出:紫外部吸収 λ230nm
保持時間:4.9分(テルペノイド誘導体(III))。
徐放性医薬組成物の有効成分として、本発明のテルペノイド誘導体(III)を使用した。基材としては、表7に示すポリ乳酸、及び、乳酸−グリコール酸共重合体(和光純薬工業(株)製)を用いた。
<HPLC条件>
装置:クロマトグラフ(Acquity,Waters)、UV検出器(Acquity,Waters)、データ解析機器(Empower,Waters)
HPLCカラム: ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 μm
(2.1mm I.D. x 50mm, Waters)
分析時間:14分
移動相A:水:アセトニトリル:リン酸(95 : 5 : 0.1)
移動相B:アセトニトリル:水:リン酸(95 : 5 : 0.1)
流速:0.75 mL/分 (表9にグラジエント条件を示す。)
カラム温度:40℃付近一定温度
サンプル温度:25℃付近一定温度
検出波長:UV−245 nm。
基材がPLA−0020で、本発明のテルペノイド誘導体(III)を10重量%含有するマイクロスフェアを用いて、ロッド状インプラントを製造した。このマイクロスフェアは、約200℃に加温することにより完全に融解することができた。融解したマイクロスフェアを金属筒内に満たし、放冷後に取り出して完全に冷却し、目的のロッド状インプラント(直径約1mm)を得た。
Hepa1c1c7細胞(マウス肝細胞株、ATCC社、カタログ番号CRL−2026)を培養した(5%CO2、37度)。非働化FBSを10%含むDMEM(ライフテクノロジー社、カタログ番号11965−092)の培地を用いた。また、培地は終濃度でペニシリンを100単位/mL、ストレプトマイシンを100ug/mg含む。NQO1アッセイは既報(Anal Biochem 1998; 169: 328−、Methods Enzymol 2004; 382: 243−)に従って、実施した。
Hepa1c1c7細胞を10000cells/ウェルとなるように96ウェルプレートに播種した。培地量は100uLである。約24時間後にテルペノイド誘導体(III)、テルペノイド誘導体(I)あるいはテルペノイド誘導体(II)を含む培地に交換して、更に約48時間培養した。溶解液(EDTAを2mM、ジギトニンを0.8%含む溶液)、反応溶液(トリス塩酸を0.025M、アルブミンを0.067%、Tween−20を0.01%、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼを2U/mL、フラビンアデニンジヌクレオチドを5μM、グルコース−6−リン酸を1μM、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を30μM、3−(4、5−ジメチル−2−チアゾリル)−2、5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)を0.03%、メナジオンを50μM含む溶液)、停止液(ジクマロールを0.3mM、リン酸2水素カリウムを5mM含む溶液、pHは7.4)を調製した。培地を除去後、溶解液を50μL添加して、37度で10分間静置した。さらに、室温で10分間振盪させた。
実施例7に記載の方法で、本発明のテルペノイド誘導体(III)を10重量%含有するマイクロスフェアを製造した。眼内灌流用液(オペガードMA、千寿製薬社製)に界面活性剤(Tween80)を1w/v%となるように含有させ、このものに、本発明のテルペノイド誘導体(III)の濃度が50μg/mLになるようにマイクロスフェアを加え、37℃に設定したインキュベーター中で攪拌した。インキュベーション開始後1、2、3および7日に、この混和溶液を遠心分離(3,750rpm、10分間)し、得られた上清200μLを50%アセトニトリル800μLと混和して、本発明のテルペノイド誘導体(III)の溶出量をHPLCで測定した。HPLCの条件は、実施例4に示した条件と同じである。
実施例8に記載の製造方法でロッド状インプラントを製造した。眼内灌流用液(オペガードMA、千寿製薬社製)に界面活性剤(Tween80)を1w/v%となるように含有させ、このものに、本発明のテルペノイド誘導体(III)の濃度が50μg/mLになるようにロッド状インプラントを加え、37℃に設定したインキュベーター中で攪拌した。インキュベーション開始後1、2、3、7、14、21および28日にこの混和溶液を遠心分離(3,750rpm、10分間)し、得られた上清200μLを50%アセトニトリル800μLと混和して本発明のテルペノイド誘導体(III)の溶出量をHPLCで測定した。HPLCの条件は、実施例7に示した条件と同じである。溶出率の計算方法は、試験例2と同様である。
表11. ロッド状インプラントからの本発明のテルペノイド誘導体(III)の累積溶出率(%)(テルペノイド誘導体(III)の含有率は10重量%)
日数 PLGA−5020
1 0
2 0
3 0
7 4
15 30
21 61
30 84 。
本発明のテルペノイド誘導体(III)、本発明のテルペノイド誘導体(III)・PLA−0005[基材としてPLA−0005を使用し、本発明のテルペノイド誘導体(III)とPLA−0005の混合比を1:9として調整した]、本発明のテルペノイド誘導体(III)・PLA−0020[基材としてPLA−0020を使用し、テルペノイド誘導体(III)とPLA−0020の混合比を1:9として調整した。]、それぞれを用いて、溶媒は生食とし、テルペノイド誘導体(III)として3mMとなるように懸濁液を調製した。
LC/MS/MS条件は次の通りである。
<UPLC条件>:Waters Acquity UPLC
分析カラム:ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 μm
カラム温度:50℃
移動相A:95%アセトニトリル(5mM酢酸アンモニウム)
移動相B:5%アセトニトリル(5mM酢酸アンモニウム)。
表12.グラジエント表
時間(分) 移動相A(%) 移動相B(%)
0 5 95
0.2 50 50
0.6 95 50
0.9 95 5
1 5 95
流速:0.8mL/min。
Ionization mode:ESI
Ion polarity mode:Positive
Monitor ion
テルペノイド誘導体(III)(Purecursor ion(m/z):538.5、Product ion(m/z):460)
IS(Precursor ion(m/z):283.2、Product ion(m/z):265)。
表14. 本発明のテルペノイド誘導体(III)の網膜内濃度(ug/g組織)
日数 PLA−0020
0.25 0.84±0.11
1 2.66±2.89
7 0.03±0.02
17 0.25±0.15
24 0.13±0.11
28 0.04±0.02 。
本発明のテルペノイド誘導体(III)・PLGA−5020[基材としてPLGA−5020を使用し、本発明のテルペノイド誘導体(III)とPLGA−5020の混合比を1:9として調整した]からなるマイクロスフェアを製造し、このマイクロスフェアを用いて、溶媒は生食とし、テルペノイド誘導体(III)として3mMとなるように懸濁液を調製した。
表15.本発明のテルペノイド誘導体(III)の硝子体内濃度(nM)
日数 マイクロスフェア ロッド状インプラント
3 9.4 3.7
7 0.0 7.9
21 0.0 8.6
28 0.0 2.5 。
Nrf2標的遺伝子としてNqo1遺伝子の網膜中での変動を検証した。
表16.Nqo1遺伝子の網膜内変動
日数 PLA−0005 PLA−0020
0.25 2.01 2.05
1 4.39 2.47
7 2.08 1.89
17 1.29 1.58
24 1.47 1.91
28 1.52 2.04
試験例3で、テルペノイド誘導体(III)の含有率が高く維持されることが確認されたPLA−0020を基材とするほうが、PLA−0005を基材とするよりも、Nrf2標的遺伝子が強く誘導されることがわかった。
マイクロスフェアに含有される化合物の割合を変化させて、Nrf2標的遺伝子としてNqo1遺伝子の網膜中での変動を検証した。本発明のテルペノイド誘導体(III)・PLGA−5020[基材としてPLGA−5020を使用し、本発明のテルペノイド誘導体(III)とPLA−0005の混合比を1:9(10重量%)あるいは3:7(30重量%)として製造]を製造した。それぞれを用いて、溶媒は生理食塩液とし、テルペノイド誘導体(III)として3mMとなるように懸濁液を調製した。この懸濁液50uL中には、テルペノイド誘導体(III)が81ug含まれることになる。
表17. Nqo1遺伝子の網膜内変動
時間 10重量% 30重量%
0 1.0±0.0 1.0±0.0
3 1.3±0.6 1.5±0.6
6 1.8±0.4 2.9±0.1
24 2.1±0.4 1.4±0.3
テルペノイド誘導体(III)の含有率が高い医薬組成物でもNrf2標的遺伝子が誘導されることがわかった。
表18.本発明のテルペノイド誘導体(III)の硝子体内濃度(nM)
時間 10重量% 30重量%
0 0±0 0±0
3 213±156 152±111
6 220±163 440±438
24 57±27 37±41 。
本発明のテルペノイド誘導体(III)を有効成分とする徐放性医薬組成物を硝子体に局所投与した際、薬効発現に必要な薬効濃度について検討を行った。Nrf2の標的遺伝子であるNqo1は、その活性を2倍に誘導する濃度が指標として用いられている(AnalBiochem1988;169:328−)。これに倣い、in vivo網膜内でNrf2の標的遺伝子Hmox1を2倍に誘導するテルペノイド誘導体(III)の濃度を指標として、ヒトでの薬物動態を検討した。
表19.PLA−0020を基材するテルペノイド(III)組成物(マイクロスフェア)硝子体内投与時のNqo1遺伝子の網膜内変動推移
日数 PLA−0020
0.25 6.89
1 11.2
7 2.08
17 1.87
24 2.35
28 1.95 。
表20.テルペノイド誘導体(III)の網膜内濃度(nM)
日数 PLA−0020
0.25 1.56
1 9.48
17 0.46
24 0.24
28 0.07 。
NITE BP−01915
NITE BP−01916
配列番号2:SANK 70314の16S rDNAの部分塩基配列
配列番号3:SANK 70214の水酸化活性を有するタンパク質のDNA配列
配列番号4:SANK 70314の水酸化活性を有するタンパク質のDNA配列
配列番号5:SANK 70214株の水酸化活性を有するタンパク質のアミノ酸配列
配列番号6:SANK 70314株の水酸化活性を有するタンパク質のアミノ酸配列
Claims (18)
- 下記式(I):
- 下記式(1):
- 変換菌がケトミウム属に属するケトミウム・グロボーサム(Chaetomium globosum) SANK 10312株(受託番号NITE BP−1486)である、請求項2に記載の化合物の製造方法。
- 変換菌がケトミウム属に属するケトミウム・エスピー(Chaetomium sp.) SANK 11867株(受託番号 NITE BP−01916)である、請求項2に記載の化合物の製造方法。
- 上記式(1)で表される化合物を基質とし、このものを下記式(III):
- 上記式(1)の化合物から、有機過酸化物によるエポキシ化反応により、下記式(2):
次いで、式(2)で表される化合物を基質とし、このものを上記式(III)で表されるテルペノイド誘導体に変換しうる変換菌と共に培地中で培養し、その培養物より上記式(III)で表されるテルペノイド誘導体を採取することを特徴とし、当該変換菌が、バチルス属に属するバチルス・エスピー(Bacillus sp.) SANK 70214 株(受託番号NITE BP−01914)又はバチルス属に属するバチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium) SANK70314株(受託番号NITE BP−01915)である、上記式(III)で表されるテルペノイド誘導体の製造方法。 - 上記式(1)の化合物から、有機過酸化物によるエポキシ化反応により、下記式(2):
次いで、式(2)で表される化合物を基質とし、このものを上記式(III)で表されるテルペノイド誘導体に変換しうる変換菌と共に培地中で培養し、その培養物より上記式(III)で表されるテルペノイド誘導体を採取することを特徴とし、当該変換菌が、宿主に(a)、(b)、(c)、(d)又は(e)のタンパク質をコードする遺伝子を導入することにより得られる形質転換体である、上記式(III)で表されるテルペノイド誘導体の製造方法;
(a)配列番号5のアミノ酸配列を有するタンパク質、
(b)配列番号6のアミノ酸配列を有するタンパク質、
(c)(a)又は(b)のタンパク質のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質、
(d)(a)又は(b)のタンパク質のアミノ酸配列と90%以上配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質、
(e)(a)又は(b)のタンパク質をコードする塩基配列からなるDNAにストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質。 - 宿主が大腸菌又はバクテリアである、請求項7に記載の製造方法。
- バクテリアがバチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)である、請求項8に記載の製造方法。
- 下記(f)〜(j)の何れかに記載の塩基配列を有し、上記式(2)で表される基質化合物の水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるDNA、
(f)配列番号3に記載の塩基配列からなるDNA、
(g)配列番号4に記載の塩基配列からなるDNA、
(h)(f)の塩基配列からなるDNAにおいて定義されたいずれかの塩基配列の相補配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、
(i)(f)の塩基配列からなるDNAにおいて定義されたいずれかの塩基配列との同一性が90%以上である塩基配列からなるDNA;
(j)遺伝暗号の縮重のため、(f)または(g)の塩基配列からなるDNAにおいて定義された塩基配列の相補配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないが、(f)項から(h)項で定義された塩基配列と同じアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるDNA。 - 下記(k)〜(n)の何れかのアミノ酸配列を有し、上記式(2)で表される基質化合物の水酸化酵素活性を有するタンパク質、
(k)配列番号5に記載のアミノ酸配列、
(l)配列番号6に記載のアミノ酸配列、
(m)(k)または(l)のアミノ酸配列において定義されたアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列、
(n)(k)のアミノ酸配列において定義されたアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列。 - 請求項10に記載の塩基配列を担持する自立複製性または組み込み複製性の組み換えプラスミド。
- 請求項12に記載の組み換えプラスミドで宿主を形質転換した形質転換体。
- 請求項12に記載の組み換えプラスミドをバチルス・サチルスに形質転換した形質転換体バチルス・サチルス(Bacillus subtilis)SANK 70214T株。
- 請求項12に記載の組み換えプラスミドをバチルス・サチルスに形質転換した形質転換体バチルス・サチルス(Bacillus subtilis)SANK 70314T株。
- バチルス属に属するバチルス・エスピー(Bacillus sp.)SANK70214株(受託番号NITE BP−01914)。
- バチルス属に属するバチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)SANK 70314株(受託番号NITE BP−01915)。
- 請求項1に記載されたテルペノイド誘導体を有効成分として含有する、
眼疾患(当該眼疾患は、アレルギー性結膜疾患、ウィルス性結膜炎、翼状片、角膜感染症、ドライアイ、角膜障害(角膜上皮障害、及び/又は、角膜内皮障害である)、ぶどう膜炎、ベーチェット病、糖尿病網膜症、網膜剥離、網膜静脈閉塞、中心性漿液性脈絡網膜症、加齢黄斑変性、糖尿病黄斑浮腫、黄斑疾患、網膜色素変性、緑内障、若しくは、白内障である)、
腎疾患(当該腎疾患は、急性腎炎、慢性腎炎、急性腎不全、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、IgA腎症、糖尿病腎症、痛風腎、腎硬化症、水腎症、尿細管間質性腎炎、冠動脈バイパス手術後の腎機能低下、若しくは、腎尿路感染症である)、
呼吸器疾患(当該呼吸器疾患は、気管支炎、肺炎、胸膜炎、慢性閉塞性肺疾患、急性肺障害(acute lung injury: ALI)、びまん性汎細気管支炎、肺気、若しくは、喘息である)、
肝疾患(当該肝疾患は、アルコール性脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、肝線維症、肝硬変、若しくは、肝移植に伴う肝機能障害である)、
脳疾患(当該脳疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis: ALS)、脳梗塞、若しくは、多発性硬化症(multiple sclerosis)である)、又は
心臓疾患(当該心臓疾患は、心筋梗塞である)
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