CN1558757A - 用于制备17-烯丙基氨基格尔德霉素(17-aag)以及其它袢霉素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于制备高收率、高纯度、和17－烯丙基氨基格尔德霉素(17－AAG)的不同多晶型物以及其它袢霉素的有效化学方法。

Description

用于制备17-烯丙基氨基格尔德霉素(17-AAG) 以及其它袢霉素的方法

相关申请

本申请要求Zhang等2001年9月21日提交的美国临时申请第60/331,893号、以及Zhang等2001年9月24日提交的美国临时申请第60/326,639号的优先权，这两篇申请的标题均为“用于制备17-烯丙基氨基格尔德霉素(17-AAG)以及其它袢霉素的方法”，将其包括所有图形和图表的全部内容结合于此作为参考。

技术领域

本发明涉及将化学制备方法应用于袢霉素化合物的制备，该化合物作为抗生素以及在治疗诸如癌症等各种增殖性疾病方面非常有用。

背景技术

以下描述中包括那些对于本发明理解会有所帮助的信息。这并不是认可在此提供的任何信息为已有技术或与目前所申请的发明相关，或者它所参考的明确或暗示的公开出版物为已有技术。

17-烯丙基氨基-格尔德霉素(17-AAG)是格尔德霉素(GDM)的合成类似物。这两种分子都属于广义上的抗生素分子，称为袢霉素(ansamycins)。作为首先从微生物吸水链霉菌素(Streptomyceshygroscopicus)分离出来的GDM，最初被确定为是某些激酶的有效抑制剂，后来表明它们起着促进激酶降解的作用，专门将目标指向“分子陪伴(molecular chaperones)”，例如，热休克蛋白质90s(HSP90s)。后来，各种其它袢霉素也显示出或多或少的活性，其中17-AAG最有希望，目前正由国家癌症协会(NCI)实施的集中临床研究已经将它作为研究对象。参见Federal Register，66(129)；35443-35444；Erlichman et al.，Proc.AACR(2001)，42，abstract 4474。

HSP90s是普遍存在的陪伴蛋白质，它涉及到较宽范围内蛋白质的折叠、激活、以及组合，它也包括涉及信号转导、细胞周期控制、和转录调节等关键蛋白质。据研究人员报道，HSP90陪伴蛋白质与重要的信号蛋白质有关，诸如类固醇激素受体和蛋白质激酶，包括Raf-1、EGFR、v-Src族激酶、Cdk4、和ErbB-2(Buchner J.，1999，TIBS，24：136-141；Stepanova，L.et al.，1996，Genes Dev.10：1491-502；Dai，K.et al.，1996，J.Biol.Chem.271：22030-4)。研究进一步表明某些联合陪伴蛋白，例如，Hsp70、p60/Hop/Sti1、Hip、Bag1、HSP40/Hdj2/Hsj1、亲免疫因子、p23、和p50会有助于HSP90功能的发挥(参见Caplan，A.，1999，Trends in Cell Biol.，9：262-68)。

人们认为袢霉素抗生素，例如，除莠霉素A(HA)、格尔德霉素(GM)、以及17-AAG可通过与HSP90的N-末端袋紧密结合产生抗癌效果(Stebbins，C.et al.，1997，Cell，89：239-250)。该袋(pocket囊)被高度地保存下来，并且与DNA促旋酶的ATP结合部位之间有着较弱的同源性(Stebbins，C.et al.，supra；Grenert，J.P.et al.，1997，J.Biol.Chem.，272：23843-50)。此外，已经有结果显示ATP和ADP均以较弱的亲和力与该袋相结合，同时二者都具有弱的ATP酶活性(Proromou，C.et al.，1997，Cell，90：65-75；Panaretou，B.et al.，1998，EMBO J.，17：4829-36)。在活体外和在活体内的研究表明，由于N-末端袋被袢霉素和其它HSP90抑制剂占有，因此改变了HSP90的功能并且抑制了蛋白质的折叠。同时表明在高浓度下，袢霉素和其它HSP90抑制剂可以阻止蛋白质底物与HSP90的结合(Scheibel，T.，H.et al.，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：1297-302；Schulte，T.W.etal.，1995，J.Biol.Chem.270：24585-8；Whitesell，L.，et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：8324-8328)。同时也已经表明袢霉素可抑制陪伴相关蛋白质底物中的ATP依赖物质的释放(Schneider，C.，L.et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：14536-41；Sepp-Lorenzino，et al.，1995，J.Biol.Chem.270：16580-16587)。无论何种情况，底物都被蛋白酶中存在的一种普遍独立的过程降解(Schneider，C.，L.supra；Sepp-Lorenzino，L.，et al.，1995，J.Biol.Chem.，270：16580-16587；Whitesell，L.，et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：8324-8328)。

该底物的不稳定性通常发生在瘤和非转移细胞等类似物中，同时已经证实它对以下物质特别有效，即信号调节物的亚群(subset)，例如，Raf(Schulte，T.W.et al.，1997，Biochem.Biophys.Res.Commun.239：655-9；Schulte，T.W.，et al.，1995，J.Biol.Chem.270：24585-8)、胞核甾体受体(nuclear steroid receptors)(Segnitz，B.，和U.Gehring.1997，J.Biol.Chem.，272：18694-18701；Smith，D.F.et al.，1995，Mol.Cell.Biol.15：6804-12)、v-src(Whitesell，L.，etal.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：8324-8328)、以及某些横跨膜的酪氨酸激酶(Sepp-Lorenzino，L.，et al.，1995，J.Biol.Chem.，270：16580-16587)，例如EGF受体(EGFR)和Her2/Neu(Hartmann，F.，et al.，1997，Int.J.Cancer 70：221-9；Miller，P.et al.，1994，CancerRes.54：2724-2730；Mimnaugh，E.G，et al.，1996，J.Biol.Chem.，271：22796-801；Schnur，R.et al.，1995，J.Med.Chem.38：3806-3812)、CDK4、和突变体p53。Erlichman et al.，Proc.AACR(2001)，42，abstract4474。这些蛋白质的诱导袢霉素损失导致某些调节路径遭到选择性破坏，并造成在细胞周期的特殊阶段停滞生长(Muise-Heimericks，R.C.et al.，1998，J.Biol.Chem.，273：29864-72)，以及凋亡、和/或导致被治疗细胞的分化(Vasilevskaya，A，et al.，1999，Cancer Res.，59：3935-40)。

因此，袢霉素极有希望用于治疗和/或预防多种类型的癌症和增殖性紊乱。但是，目前已知的制备袢霉素的各种方法表现出以下一种或多种问题，即低收率、低纯度、不稳定性、与卤化有机溶剂的使用相关的环境毒性以及额外的附带费用，如时间、开支、废物处理、和服用该药物的患者的健康风险等。已知方法的实例中包括转让给Kaken Chemical Co.，Ltd.，Sasaki等的美国专利第4,261,989号，该专利对各种袢霉素衍生物的合成做了报道，其中包括使用各种有机溶剂和单一萃取技术来合成17-AAG，同时示例中也包括转让给Pfizer Inc.，Schnur等的美国专利第5,932,566号和PCT/IB94/00160(WO95/01342)，该专利中有着相似的方法描述。

本发明的目的是改善现有技术中存在的一个或多个缺陷，例如，改进下述一个或多个问题，即，低收率、低纯度、不稳定性、与卤化有机溶剂的使用相关的环境毒性、以及额外的附带费用，如时间、开支、废物处理、和健康风险等。

发明内容

本发明的创造性体现在以下几个方面。首先，本发明的特征在于通过挥发性非质子溶剂和挥发性质子溶剂的使用来有效制备袢霉素的化学方法。和其它制备方法一样，该方法对于由苯醌格尔德霉素(GDM)制备诸如17-AAG或它的4，5-二氢类似物等苯醌格尔德霉素衍生物而言是有用的。在后者的一个实施例中，4，5-二氢格尔德霉素或格尔德霉素(或具有反应部分的其它苯醌格尔德霉素，如苯醌上具有甲氧基)与亲核体物质在挥发性非质子溶剂(诸如从表I中选出的组分)中化合生成一种粗产物，蒸发浓缩该产物，并向生成的产物中加入挥发性质子溶剂，加入溶剂的目的是用于洗涤或者使袢霉素产物在适宜的条件下从溶液中结晶或沉淀出来。无论何种情况，都可以通过采用诸如过滤、离心、滗析、和/或蒸发等方法方便地脱除这两种类型的溶剂。根据特定实施例的不同，其优点包括但不限于净化检查的减少、收率和/或纯度的提高、以及临床上可接受试剂的使用。

以下是本发明实施例中的一个示例反应方程式：

其中R¹和R²或者均为氢，在此情况下，C4和C5之间的键为单键，或者R¹和R²均不存在，在此情况下，C4和C5之间的键为双键。C4和C5之间的虚线表示两种可能都存在。Nu-H是亲核体，反应期间将取代位置17上的R³O基团。优选R³为1-4个碳原子，优选甲氧基。反应在挥发性非质子溶剂中进行，溶剂从下述溶剂中选取，即THF、乙醚、MTBE、THP、二噁烷、乙基仲丁基醚、甲基丁基醚、乙酸乙酯、或乙酸甲酯，最终生成一种可取代的粗产物。优选采用非卤化溶剂。在有些实施例中，亲核体慢慢地加入拟被取代的苯醌格尔德霉素衍生物中，从而生成以单取代为主的产物。对于该步骤的监测，也可通过使用诸如TLC、HPLC等色谱技术，或现有技术中为人熟知的其它步骤，例如，分光光度测定法、NMR等方法来测量反应的完成程度。该技术也可用于下述工艺后续步骤中。在优选实施例中，要使反应持续进行直至彻底完成为止，从而使全部的苯醌袢霉素反应物被充分地转化成相应的衍生物。

以下是关于在挥发性非质子溶剂中制备粗取代产物的描述，产物经蒸发浓缩后，在诸如异丙醇、乙醇、和/或水等挥发性质子溶剂中淤浆(slurried)或溶解。在此提到的术语“淤浆”是指固体悬浮在液体中，其中固体如袢霉素略微不溶。在此情况下，“洗涤”可能生效，尤其是当杂质溶解度比固体溶解度大时更为如此。以下实施例1具有一定的说明性。替代洗涤或与洗涤相关的步骤是结晶步骤，正如下述实施例2中的实施。

每一种挥发性非质子溶剂和质子溶剂都可以通过采用蒸发或蒸发与离心、加热和/或抽真空相结合等方法方便地除去。正如该领域技术人员所体会的，只要压力减小(提高真空度)就可以采用较低的温度。在有些实施例中可单独地进行加热或在标准室温下干燥。也可以采用一次或多次过滤步骤，方便地使用挥发性质子溶剂洗涤过滤物质从而减少杂质的含量。

在有些实施例中，所用亲核体选自由胺类、硫醇类、硫醇盐、硫醚、醇类、以及醇盐组成的组，每个构成、拥有、或可以经改性后拥有一个或多个官能团，官能团随后被添加额外的化学成分，例如生成的苯醌袢霉素被限定为另一种结构。在有些优选实施例中，亲核体具有以下结构的伯胺或仲胺：

其中R⁴和R⁵独立地代表氢、(C₁-C₁₂)烷基或被烯丙基、炔丙基、羟基、氨基、巯基、羧酸盐、或卤化官能团等可选取代的(C₁-C₁₂)烷基。一般而言，可以使用的胺类举不胜举，其中也包括Sasaki的美国专利第4,261,989号中表I所列的胺类。同时需要理解的是，还可以添加其它官能团如烯烃。例如，在有些实施例中，制备17-AAG或4，5-二氢类似物所使用的亲核体为烯丙基胺。可以使用的其它有用亲核体包括但不限于详细描述部分出现的那些亲核体。

有些实施例中，通过在方法的一个或多个步骤中使用减弱照明的方法来阻止或减小产物和/或反应物的光化降解，这是有益的。甚至在最后时，使最终产物存放在耐光容器中，从而保持或有助于产物的稳定性和保存期限。

本发明前述方法的一个方面，其特征在于所述的实施例可被结合起来加以应用，而这些实施例是相互一致的。从工艺方法更广的方面讲，本发明的特征在于浓缩和/或提纯袢霉素的方法。该方法利用挥发性非质子溶剂，优选非卤化溶剂作为溶剂，接着用以下实施例1和实施例2中使用的挥发性质子溶剂进行蒸发、洗涤、或结晶。本发明的另一个方面，其特征在于产物可由该方法制得，并且每种产物都可以按照前述的任一实施例进行制备。

另一方面，本发明的特征在于制备17-AAG的方法，其中包括：提供溶解在质子溶剂溶液中的17-AAG，从所述质子溶剂溶液中结晶17-AAG，所述质子溶剂溶液基本不含水，并且脱除该质子溶剂溶液。术语“制备”是指浓缩、提纯、或将现有的17-AAG多晶型物转化成另一种形式的17-AAG。当该术语后紧跟着过渡词“包括”时，它是指也包括其它的后续步骤，如溶解在溶液中，生成一种配方等等。术语“脱除”不一定就意味着彻底脱除，但优选基本脱除，从而使得在该步骤完成后，以固体17-AAG为主的产物被保留下来，而只残存极少量的溶剂。在一个实施例中，该质子溶剂为异丙醇，脱除异丙醇并结晶后的17-AAG，其熔点约为146℃至153℃，或者约为155℃或低于155℃。一个相关但不尽相同的方面使得所形成的多晶型物17-AAG的熔点更高，优选熔点在约200℃或200℃以上的范围。在有些优选实施例中，熔点约为206-212℃，该熔点的获得可通过在质子溶剂溶液中结晶加以实现，如乙醇，其中质子溶剂溶液可能含水也可能不含水。应用人员已经观察到溶剂中含水通常会提高所生成的17-AAG多晶型物的最终熔点温度。通过前述方法制得的化合物还要求，最终可混入也可不混入其它一种或多种试剂。可选地，将该组合物存放在耐光容器中以阻止、减小、或抑制降解的发生。可以预料，其它的亲脂化合物会同样产生不同熔点的多晶型物。这些多晶型物的特征或有可能产生的特征在于它具有不同的效用，例如，所形成化合物的熔点越低，越容易溶解和配制，所形成化合物的熔点越高，则稳定性会越持久。

另一方面，本发明的特征在于将第一多晶型物袢霉素转化成第二多晶型物袢霉素，其中包含在足以生成第二多晶型物袢霉素的条件下，将第一多晶型物袢霉素溶解在质子溶剂溶液中。高熔点类型的物质可以被转化成低熔点类型的物质，反之亦然。优选地，袢霉素为17-AAG，但可以预料该技术能够产生与其它的亲脂化合物一样的效用，这一点从实施例1至5中可以看出。有关这一方面的潜在实施例可参考前述相关实施例的特征而获得。

根据准确内容和具体实施例的不同，实施本发明可以带来以下一个或多个优点，即高收率、高纯度、稳定性、减少对环境和患者的毒性、以及额外附带费用的减少，如时间、开支、易于配置、废物存放和处理等。其它优点、体现内容和实施例可以从以下数据、详细说明和权利要求中显而易见。

附图说明

图1是制得的17-烯丙基氨基格尔德霉素的HPLC色谱图，其中用到Zorbax 300 SB-C8(250cm×4.6mm，5μ)色谱柱，流动相：乙腈(0.05％TFA)∶水(0.05％TFA)；30∶70；流速：在254nm处检测为1mL/min(毫升/分钟)；峰值处的保留时间为16.49分钟。

图2为¹H NMR(400MHz，CDCl₃)谱图。化学位移和多样性与所需要产品的生成相一致。

具体实施方式

本发明涉及用于制备袢霉素，如苯醌袢霉素，及其衍生物，如17-AGG和它的4，5-二氢类似物的改进方法。该方法在获得较好纯度和收率的同时，还可以避免与萃取和色谱分离准备相关所导致的时间耗费与昂贵的检查处理等工作。

在某些方面和实施例中，所用的技术包括：在反应物和产物都能溶解的条件下，亲核体攻击一种或多种挥发性非质子溶剂，例如，醚或乙酸盐，优选非卤化物。然后，将生成的产物蒸发浓缩，向浓缩产物中加入挥发性质子溶剂，如挥发性醇和/或水，其中挥发性质子溶剂起到洗涤作用或担当(再)结晶的介质。过滤、离心、滗析、和/或蒸发都有助于各个步骤的进行。生成的产物可直接或间接地用作与袢霉素相关的效用，例如作为抗生素或抗癌剂。就间接效用而言，产物也是有用的，例如用作袢霉素衍生物合成的中间体，正如给予Schnur等并转让给Pfizer Inc的美国专利第5,932,566号和PCT/IB94/00160(WO 95/01342)中所披露的。

在本发明前，DMF、DMSO、CH₂Cl₂、以及CHCl₃都是制备袢霉素并完成取代反应和亲核加成反应可供选择的介质。该类试剂和方法的应用需要涉及费事的检查(work-ups)处理工作和多次水洗与EtOAc萃取。在当今气候受控的时代，尤其不鼓励使用氯化了的溶剂。氯化了的溶剂有害于环境，其残留物质的存在对人体健康构成潜在的威胁。此外，申请者已经发现该类溶剂会促使产物降解，从而危及到产物的纯度和收率。本发明的方法更为直接，生成的产物通常有较高的收率和纯度，同时也避免了或者最大程度的减少了随之而来的环境和健康问题，因此可以很好地应用于工业化生产。

权利要求中使用到的术语“可选地”是指可以进行紧接着该术语后的步骤但并不一定必须要实施。

术语“脱除”和“浓缩”不一定意味着100％地除去溶剂，可以允许较少百分比的脱除或浓缩。

术语“非卤化”是指不含一个或多个卤素原子，例如F、Cl、Br、以及I。具有一定说明性的卤化溶剂包括CHCl₃(氯仿)。

“洗涤”表示质子溶剂在所采用的条件下略微不溶袢霉素。洗涤可能包括混合液的生成，并且，无论如何，对脱除杂质有一定效果。

“挥发性非质子溶剂”是指沸点在约35℃至102℃之间的溶剂。优选的非质子溶剂如下表I中所示。非质子溶剂被认为是“非结构化的”，也就是说，在纯液体状态下，缺乏广延的氢键网络。但是，某些非质子溶剂有能力溶解和稳定化合物，或溶解自身使其质子化，例如，醇或水本身。水和THF是易混合的。一般而言，在普通环境下非质子溶剂缺乏自分解成离子的能力。

“挥发性质子溶剂”包括异丙醇、乙醇、水、及其它们的混合物。水是传统的质子溶剂。液相水的特征在于它具有广延的氢键网络。在液相中，每个独立的水分子与相邻的水分子构成4个氢键。破坏这个广延的氢键网络需要提供大量的能量，这种能量的代价反映在低分子量化合物具有相对高的沸点(100℃)上。醇类，尤其是低分子量的醇类(少于12个碳原子的醇)显示出与水相似的特性。一个氢键网络在液体状态下建立起来。但是，由醇类分子建立的氢键网络，其氢键数目与水的有所不同：醇类溶剂分子之间只产生3个氢键，而液态水分子之间通常有4个这样的键。这就使得醇类溶剂分子之间具有更大的“不牢固性”，意味着它相对于水具有更低的沸点和冷凝温度。水/醇混合物的物理性质之一是形成共沸混合物。将醇加入到水中引起水沸点的降低。下表阐明了向水中加入10％的乙醇将会生成一种挥发性大于水本身的溶剂。

                    表I

Wt％乙醇	凝固点(℃)	沸点(℃)
			0102040506070809092.495.57100	0-4.5-10.7-27.0-37.045.053.064.5-109-123-119.3-114.5	10091.4587.1583.181.9081.080.2079.3578.578.2478.1578.3

表I进一步表明以乙醇为主所组成的混合物，如约95％的乙醇和5％的水，在与纯乙醇相同的温度下发生沸腾。因此基于这个原因，实际上不可能通过水/乙醇混合物的蒸馏得到纯乙醇，这是蒸馏技术领域为人熟知的事实。质子溶剂的另一个特点是它们会发生一定程度的自身电离。例如，按照以下方程式水被离解成带相反电荷的离子：

           

纯水本身离解度很小，但还是可以测得，这是众所周知的事实，即纯水在25℃下[H₃O⁺]＝10^-7(或PH值为7)。

“非氧化环境”不是指不可能或实际不发生氧化，只是简单的说明发生这种情况的可能性减小。该类例子包括但不限于减少照明和/或减少气态氧的应用。如果空气或氧气被氮气和/或氩气取代，则属于后一种情况。

袢霉素和苯醌袢霉素

术语“袢霉素”在文献中是众所周知的，它具有较宽类别的结构，其特征在于它是由不同长度的脂肪环、桥连芳香环结构相对端的组合物及其它们的还原等效物所构成。包含在该宽类别之内的还有它的子类-苯醌袢霉素。具有说明性的种类包括：

    格尔德霉素(GM)                 17-氨基格尔德霉素(17-AG)             17-烯丙基氨基格尔德霉素(17-AAG)

在此使用的“苯醌袢霉素”拥有苯醌成分，同时也包括该技术领域中已知的苯醌袢霉素。它在某些方面具有亲核加成的特征，优选地，分子的苯醌部分包括一个烷氧基，优选甲氧基，同时优选地，17的位置能够被亲核体取代。反应的结果是形成“苯醌袢霉素衍生物”。根据本发明，袢霉素和苯醌袢霉素可以是合成制得的，也可以是自然产生的或者是二者结合的产物，即“半合成”。它们也可以是单体或者二聚体。有关二聚体袢霉素的说明性示例包括但不限于在2000年4月7日提交并于2000年10月19日公布的Rosen等的国际申请专利PCT US00/09512(WO 00/61578)中提到的二聚体袢霉素。本发明方法中其它有用的示例性苯醌袢霉素及其制备方法包括但不限于美国专利第3,595,955号(描述了格尔德霉素的制备)、第4,261,989号、第5,387,584号、和第5,932,566中所述的内容。格尔德霉素也可在商业上获得，例如，可从CN Biosciences，一家德国Darmstadt的Merck KGaA分公司，总部设在美国加利福尼亚州圣地亚哥(cat.第345805号)获得。关于从吸水链霉菌培养基(ATCC 55256)中生化提纯4，5-二氢格尔德霉素及其氢醌衍生物的内容，在转让给Pfizer Inc.、国际申请编号为PCT/US92/10189的专利中有所披露，该专利于1993年7月22日作为WO 93/14215被公布，并将Cullen等列为发明人；另外一种通过采用格尔德霉素催化加氢制备4，5-二氢格尔德霉素的合成方法也为人所熟知。参见Progress in the Chemistry of Organic Natural Products，Chemistry ofthe Ansamycin Antibiotics，33 1976，p.278。

亲核体

目前有许多类型的亲核体都可用于此处所述的发明方法。优选地，它们可选自由硫醇类、硫醇盐、硫醚、醇类、以及醇盐组成的组，其每个构成、拥有、或经改性后拥有一个或多个官能团，官能团随后添加额外的化学成分，例如抗体。在有些优选实施例中，亲核体是具有以下结构的伯胺或仲胺：

其中R⁴和R⁵独立地代表氢、(C₁-C₁₂)烷基、或被烯丙基、炔丙基、羟基、氨基、巯基、羧酸盐、或卤化功能基等可选取代的(C₁-C₁₂)烷基。一般而言，可以使用的胺举不胜举，其中也包括给予Sasaki的美国专利第4,261,989号中表I所列的胺。同时需要理解的是，还可添加其它官能团如烯烃。例如，在有些实施例中，制备17-AAG或4，5-二氢类似物所使用的亲核体为烯丙胺。烯丙胺和在此所述的其它亲核体都是在商业上可获得的，如从Sigma-Aldrich获得。下表列举了一些优选的亲核体，这些亲核体可用于本发明的不同实施例中。

                          表II

挥发性非质子溶剂

表III列出了对本发明各种实施例有用的挥发性非质子溶剂的示例。

                          表III

以上列表只是示意性的，本领域技术人员将会认识到其它现有的挥发性非质子溶剂也可以使用。由于醚和乙酸盐是极性、非质子介质，因此特别有用；它们可溶解各种有机化合物，兼有水和烃的性质，同时具有烷基“部分”和带有孤电子对的氧原子。

反应容器

适于本发明的反应容器是商业上可获的、配备有磨砂玻璃接头的玻璃反应瓶。使用该类容器时，通常用到由特氟隆(teflon聚四氟乙烯)或其它惰性材料涂布的磁力搅棒，例如，涂布PTFE或其它惰性涂料。在工业放大合成时，许多金属反应容器是密封的，因此本身就耐光。也可以采用机械搅拌，其中搅拌轴和/或搅棒插至反应容器中。为了排除光照，使用简单黑暗的室内光即可。可选地，反应瓶以及具有光敏材料的反应部分可用铝箔包裹，或者采用现有技术中已知的另一种耐光容器装瓶或包装。

需要对加入速度进行控制的反应可以在多瓶颈的园底烧瓶中进行，烧瓶配有加入漏斗(滴加漏斗)。简单的加入漏斗类似于分离漏斗，出口有凸出的标准锥形接头，可以实现液体反应物或溶液被逐滴加入，其中旋塞阀用于控制滴加速度。用于加入漏斗的旋塞阀可以优选特氟隆旋塞阀，这样，就可以避免旋塞阀润滑脂的使用，以免其浸入有机溶剂中使所需要的产物受到污染。

许多小型反应采用注射器加入液体，这样做方便易行，它可以使每单位时间加入反应物的量得到精确控制。但是文献中众所周知的另一种加入液体反应物的方法是使用注射泵。当然也可以使用调速泵和其它设备。

反应监测

权利要求中的术语“使用色谱技术监测”是指用来确定是否存在所需要的产物及其/或量的多少，或者，是否不存在反应物或不需要的产物及其/或量的多少。现有技术中已知的方法有多种，以下仅就其中的几种予以讨论。

TLC

薄层色谱法(TLC)是吸附色谱的一种，其中载在平面上的薄层吸附剂充当固定相。TLC最常用的吸附剂是硅胶和氧化铝。硅藻土和纤维素最不常用。通过溶剂沿着吸附剂薄层作毛细管运动实现TLC色谱的洗脱或展开(development)。

TLC洗脱液的选择取决于吸附剂类型和吸附剂中有待分析化合物的亲和力。TLC对于监测反应进程、检测反应中间体、分析粗产物、或未知混合物，从而确定组分的数目以及检验提纯效率等诸多方面非常有用。对于无色有机化合物而言，可以通过现有技术中已知的许多技术显现吸附剂上的化合物。然而，本发明中起始原料和产物的颜色分别为肉眼可见的黄色和紫色。

HPLC

在高压液相色谱(HPLC)中，液相依靠压力强行通过固定相，从而提高了洗脱液通过吸附剂色谱柱的流量。可以应用现代化工业仪器检测溶剂混合物和溶剂梯度。通常采用可变波长紫外检测仪对起始原料和产物进行最佳检测，并且通过信号的适当校准，应用商业上可获得的软件定量地检测原料用量。

溶剂脱除

为了从反应混合物、萃取液、色谱组分、或(再)结晶的母液中得到需要的产物，常常有必要浓缩溶液或彻底地脱除溶剂。该过程可通过常压或减压下的简单蒸馏或分馏来完成。有时，采用常压蒸馏脱除大部分的溶剂，剩余少量溶剂在减压下进行脱除。但无论如何，必须考虑需要产物的稳定性和挥发性，也就是说必须注意避免因过热而造成的产物分解。

溶剂的脱除和低压升华干燥法可采用目前商业上可获得的旋转蒸发设备来实现。其它可采用的简单设备对于本领域技术人员而言是熟知的。在较高真空度、较低温度下的脱除溶剂的方法也为本领域技术人员所熟知。

过滤

过滤就是通过多孔阻挡层的使用，如过滤器，使不溶的固体从液体中分离出来；液体通过过滤器而固体被保留在过滤器上。依靠重力(重力过滤)和/或使用吸入(吸滤)使液体得以通过过滤器。过滤步骤用于澄清溶液和/或收集固体。有机化学中最常用的过滤器是滤纸和烧结玻璃料，二者都能够从商业上可获得的各种来源得到，这对于本领域技术人员来讲是熟悉的。吸滤通常使用Büchner、Hirsch、或烧结玻璃料。在吸滤操作时，通过采用吸气器或其它抽真空装置使得液体压力低于过滤器压力，然后由大气压迫使液体通过过滤器。

(再)结晶

结晶就是从溶液或给定材料的熔化物中沉积出晶体。晶体形成时，同类分子倾向于附着到由同类型分子组成的日益增长的晶体上，因为具有相同结构的分子比其它分子更符合晶格的构成。如果结晶过程在接近平衡的条件下发生，则分子沉积到由同类分子组成的表面这一倾向性将导致结晶物质纯度的提高。因此结晶过程是一种重要的提纯方法。将结晶归入更广泛的术语“沉淀”，其含义是溶解的化合物中止溶解，不论“结晶”与否均有效地在溶液外以固体的形式存在。沉淀或结晶可以在持续的时间内发生，例如从数秒钟到数小时直至数天。该过程也取决于下述实施例2中所示的温度，同时还取决于所用溶剂和溶质的性质，而且不同温度下物质的溶解度有一定差异。术语“再结晶”是指不论是否使用同样的溶剂和采用同样的条件，也不论是否足以达到形成相同或不同熔点的多晶型物，化合物已经发生了一次或多次结晶。

其实，本发明所体现的一个方面就在于它能够形成并采用不同的多晶型物结构。申请人已经确定出合成多种相对较纯的形态(多晶型物)17-AAG的可能性，它们当中有些具有约147至153℃相对低的熔点，例如，从基本上纯的异丙醇中结晶出来，有些具有约200-212℃的更高熔点，例如，从化合了部分水的乙醇中结晶出来。可以将水和乙醇预先混合好，或者事后把水加到乙醇溶液中，其中该乙醇溶液中已含有溶解的17-AAG。与高熔点形态的17-AAG相比，17-AAG的熔点越低，越容易在室温下溶解于各种溶剂和油中，同时用低熔点形态的17-AAG配制药物或药物组合物更是具潜在的优点。较高熔点形态所带来的好处在于，可在不同的条件下具备更高的化学稳定性，即在不同的存储温度下具有更长的保存期限。技术人员可以根据最终目的的不同，简单地采用在适宜溶剂中溶解和结晶的方法，很容易实现一种多晶型物向另一种多晶型物的转化。在使用17-氨基格尔德霉素(“17-AG”；参见实施例5、6)的过程中也观察到相似的现象，这就暗示我们对于其它袢霉素来说，可以获得不同的多晶型物，同时，对于其它不相关的化合物来说可能也这样。

实施例

                  实施例1

       17-烯丙基氨基格尔德霉素(17-AAG)的合成

将45.0g(80.4mmol)格尔德霉素置于装有1.45L干燥THF的2L干燥烧瓶中，向其中逐滴滴加36.0mL(470mmol)烯丙胺，滴加高于30分钟，其中烯丙胺置于50mL的干燥THF中。反应混合物在氮气保护下于室温搅拌4小时，直至TLC分析表明反应已经完成[(GDM：亮黄色：Rf＝0.40；(5％MeOH-95％CHCl₃)；17-AAG：紫色：Rf＝0.42(5％MeOH-95％CHCl₃)]。旋转蒸发脱除溶剂，粗产物在25℃下与420mL H₂O∶EtOH(90∶10)混合，然后过滤，并在45℃下干燥24小时，得到40.9g(66.4mmol)紫色晶体17-AAG(82.6％的收率，HPLC监测254nm处纯度＞98％)。MP 206-212℃。¹H NMR和HPLC得到的结果与需要产物的相一致。

                   实施例2

            17-AAG在异丙醇中结晶

提纯的可选方法不是在乙醇中结晶，而是在800mL 2-丙醇(异丙醇)中于80℃或在回流下(约82.2℃)溶解实施例1中的粗产物17-AAG，然后冷却至室温。过滤，然后在45℃下干燥24小时，得到44.6g(72.36mmol)紫色晶体17-AAG(90％的收率，HPLC监测254nm处纯度＞99％)。MP 147-153℃。¹H NMR和HPLC得到的结果与需要产物的相一致。

                     实施例3

      多晶型物的转化：17-AAG在乙醇中再结晶

提纯的可选方法是在400mL的H₂O∶EtOH(90∶10)中于25℃混合实施例2中的产物17-AAG，过滤，并在45℃下干燥24小时，得到42.4g(68.6mmol)紫色晶体17-AAG(95％的收率，HPLC监测254nm处纯度＞99％)。MP 147-153℃。¹H NMR和HPLC得到的结果与需要产物的相一致。

                    实施例4

       多晶型物的转化：17-AAG在乙醇中再结晶

提纯的可选方法是在300mL的EtOH中于回流下(约80℃)溶解实施2中的产物17-AAG，然后加入1200mL水并冷却至室温。过滤收集固体，然后在45℃下干燥24小时，得到41.0g(67mmol)紫色晶体17-AAG(93％的收率，HPLC监测254nm处纯度＞99％)。MP 206-212℃。¹H NMR和HPLC得到的结果与需要产物的相一致。

                   实施例5

         17-氨基格尔德霉素(17-AG)的合成

将2.0g(3.57mmol)格尔德霉素置于装有40ml干燥THF的干燥烧瓶中，烧瓶经火焰烘干。在氮气保护下向其中加入2.55ml(17.8mmol，甲醇溶液，ca 7N)氨水。反应混合物在室温下搅拌24小时，直至TLC分析表明反应已经完成。旋转蒸发脱除溶剂，将粗产物溶解在30mL的EtOH中并加入120mL水使其结晶，得到1.8g(3.30mmol)红色晶体17-AG(HPLC监测纯度为99％)。MP284-286℃。¹H NMR和HPLC得到的结果与需要产物的相一致。

                      实施例6

              17-AG在异丙醇中再结晶

提纯实施例5中17-AG的可选方法是将最终产物17-AG于80℃或在回流下(约82.2℃)溶解在30mL基本上纯的2-丙醇(异丙醇)中，然后冷却至室温。过滤，然后在45℃下干燥24小时，得到1.5g(2.7mmol)紫色晶体17-AAG(76％的收率，HPLC监测254nm处纯度＞99％)。MP 267-271℃。¹H NMR和HPLC得到的结果与需要产物的相一致。

                      ***

上述实施例并非是局限性的，它们只是体现本发明各个方面和实施例中有一定代表性的示例。在此引用的所有资料对于本发明的该领域技术人员而言具有一定的指导性。尽管披露的资料没有一篇被认为是已有的技术，但是每篇资料在此都以同样的程度一并作为参考，就好比每篇资料都被完全独立地并入作为参考。

本领域技术人员将会很容易地体会到本发明可以很好地达到以上所述的目标、结果、优点、及其包含的固有特点。用所述方法和组合物来阐明优选实施例，目的是为了示例而不是对本发明涵盖范围的限制。本领域技术人员可以对其进行某些改动并用作其它用途，只要这些改动和其它用途被包含在本发明权利要求书所定义的范围内。

显而易见，对于本领域技术人员来说，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种替换和更改。因此，这类额外的实施例均在本发明内容以及下述权利要求书的范围内。

在缺乏某一要素或多个要素的情况下，也可实施在此所述具有说明性的本发明，但此处并没有专门披露其限制或限定因素。例如，术语“包括”、“基本由...组成”、以及“由...组成”等过渡语，每个词语都有不同的含义，一个词语代替另一个词语的使用是为了便于说明本发明的不同方面及其具体实施方式。术语及表达式的使用是用术语加以描述而不是用其进行限定，这些术语及表达式的使用并不排除本发明所述和所示的等同特征或其部分内容。同时本领域技术人员可以认识到，在本发明权利要求的范围内进行各种改动是完全可能的。因此可以理解，虽然本发明是通过优选实施例和可选的特征被明确披露，但是本领域技术人员可对所披露的概念进行改动和变更，只要这些改动和变更在本发明所述和权利要求所定义的范围内就应被视作在本发明范畴内。

此外，本发明的特征或其内容是按照马库什(Markush)组或可替代的其它组加以描述的，因此本领域技术人员可以认识到本发明也可按照马库什(Markush)组或其它组的独立成分或成分的子组或其它组加以描述，个别成分被排除在外。

其它实施例均在下述权利要求的范围内。

Claims (45)

1.一种制备17-烯丙基氨基格尔德霉素(17-AAG)或其4，5-二氢17-AAG类似物的方法，包括以下步骤：

(a)在挥发性非质子溶剂中，烯丙胺与格尔德霉素或其4，5格尔德霉素二氢类似物化合，以生成粗产物17-AAG或4，5-二氢17-AAG；

(b)通过蒸发浓缩所述粗产物17-AAG或4，5-二氢17-AAG；

(c)将所述浓缩的17-AAG或4，5-二氢17-AAG加入挥发性质子溶剂中；以及

(d)在适宜条件下脱除所述挥发性质子溶剂，以提纯所述粗产物17-AAG或4，5-二氢17-AAG，所述脱除可选地采用过滤步骤完成。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述挥发性非质子溶剂选自由THF、乙醚、MTBE、THP、二噁烷、乙基仲丁基醚、甲基丁基醚、乙酸乙酯、以及乙酸甲酯组成的组中的一种或多种，其中所述挥发性质子溶剂包括选自由挥发性醇类、水、及其混合物组成的组中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述挥发性非质子溶剂包括THF。

4.根据权利要求1所述的方法，进一步包括色谱技术，以监测反应完成程度和/或纯度。

5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)和/或步骤(d)包括热、离心、滗析、和/或真空的施用。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述挥发性质子溶剂用于从溶液中结晶所述17-AAG或4，5-二氢17-AAG。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述挥发性质子溶剂用于洗涤所述17-AAG或4，5-二氢17-AAG。

8.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在非氧化环境下进行步骤(a)-(d)中的一个或多个步骤。

9.一种制备袢霉素的方法，包括以下步骤：

(a)提供挥发性非质子溶剂中的袢霉素；

(b)通过蒸发浓缩所述袢霉素；

(c)向步骤(b)的产物中加入挥发性质子溶剂；以及

(d)在适宜条件下脱除所述挥发性质子溶剂，提纯所述袢霉素，所述脱除可采用过滤步骤完成。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述挥发性非质子溶剂选自由THF、乙醚、MTBE、THP、二噁烷、乙基仲丁基醚、甲基丁基醚、乙酸乙酯、以及乙酸甲酯组成的组中的一种或多种，其中所述挥发性质子溶剂包括选自由挥发性醇类、水、及其混合物组成的组中的一种或多种成分。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述挥发性质子溶剂用于从溶液中结晶所述袢霉素。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述挥发性质子溶剂用于洗涤所述袢霉素。

13.根据权利要求9所述的方法，其中所述挥发性非质子溶剂包括THF。

14.根据权利要求9所述的方法，进一步包括色谱技术，以监测反应完成程度和/或纯度。

15.根据权利要求9所述的方法，其中步骤(b)和/或步骤(d)包括热、离心、滗析、和/或真空的施用。

16.根据权利要求9所述的方法，进一步包括在非氧化环境下进行(a)-(d)中的一个或多个步骤。

17.根据权利要求9所述的方法，其中所述袢霉素选自由17-AAG和4，5-二氢17-AAG组成的组。

18.根据权利要求1-16中任一权利要求所述的产物，均可选地包装在耐光容器中。

19.一种制备17-AAG的方法，包括以下步骤：

提供溶解在质子溶剂溶液中的17-AAG，所述质子溶剂溶液基本不含水；

从所述质子溶剂溶液中结晶所述17-AAG；以及脱除所述质子溶剂溶液。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述质子溶剂是异丙醇，其中脱除所述异丙醇并经过结晶的17-AAG，其熔点为146℃-153℃。

21.根据权利要求19所述的方法，其中所述质子溶剂是异丙醇，其中脱除所述异丙醇并经过结晶的17-AAG，其熔点约为155℃或低于155℃。

22.一种包括17-AAG的组合物，通过权利要求20或21所述的方法制成。

23.一种包括17-AAG的组合物，通过权利要求19所述的方法制成。

24.根据权利要求22所述的组合物，可选地包装在耐光容器中。

25.根据权利要求23所述的组合物，可选地包装在耐光容器中。

26.一种制备17-AAG的方法，包括以下步骤：

提供溶解在质子溶剂溶液中的17-AAG，所述质子溶剂溶液含有部分水；

从所述质子溶剂溶液中结晶所述17-AAG；以及脱除所述质子溶剂溶液。

27.根据权利要求26所述的方法，其中脱除所述质子溶剂溶液并经过结晶的17-AAG，其熔点高于200℃。

28.根据权利要求26所述的方法，其中脱除所述质子溶剂溶液并经过结晶的17-AAG，其熔点为206℃-212℃。

29.根据权利要求27或28所述的方法，其中所述质子溶剂溶液进一步包括乙醇。

30.一种包括17-AAG的组合物，通过权利要求29所述的方法制成，所述组合物可选地包装在耐光容器中。

31.一种将第一袢霉素多晶型物转化成第二袢霉素多晶型物的方法，包括在足以生成所述第二袢霉素多晶型物的条件下，将所述第一袢霉素多晶型物溶解在质子溶剂溶液中。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述第一多晶型物，其熔点高于所述第二多晶型物的熔点。

33.根据权利要求31所述的方法，其中所述第一多晶型物，其熔点低于所述第二多晶型物的熔点。

34.根据权利要求31-33中任一权利要求所述的方法，其中所述袢霉素为17-AAG。

35.根据权利要求32所述的方法，其中所述袢霉素为17-AAG，所述第二多晶型物由基本不含水的异丙醇溶液结晶形成。

36.根据权利要求33所述的方法，其中所述袢霉素为17-AAG，所述第二多晶型物由含水的乙醇溶液结晶形成。

37.一种组合物，包括熔点为147-153℃形态的17-AAG。

38.根据权利要求37所述的组合物，其中所述17-AAG是结晶态。

39.一种组合物，包括熔点为267-271℃形态的17-AG。

40.根据权利要求39所述的组合物，其中所述17-AG是结晶态。

41.一种将结晶化合物的一多晶型物转化成另一多晶型物的方法，包括以下步骤：

(a)提供第一结晶态化合物，所述第一结晶态化合物具有第一熔点，并且由第一溶剂结晶制得；

(b)在第二溶剂中再次结晶所述化合物，获得第二结晶态，所述第二结晶态化合物具有与所述第一熔点不同的第二熔点。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述第一结晶态，其熔点高于所述第二结晶态的熔点。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述第一结晶态，其熔点低于所述第二结晶态的熔点。

44.根据权利要求40-43中任一权利要求所述的方法，其中所述化合物为袢霉素。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述袢霉素选自由17-AAG和17-AG组成的组。

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