DE60210488T2

DE60210488T2 - Verwendung von hydroxyölsäure und ähnlicher verbindungen bei der herstellung von medikamenten

Info

Publication number: DE60210488T2
Application number: DE60210488T
Authority: DE
Inventors: Campus Universitario Pablo Vicente ESCRIBA RUIZ
Original assignee: Universitat de les Illes Balears
Current assignee: Universitat de les Illes Balears
Priority date: 2001-10-11
Filing date: 2002-10-09
Publication date: 2006-12-14
Anticipated expiration: 2022-10-10
Also published as: MXPA04003255A; BR0213165A; CA2463348C; US7851507B2; ES2261752T3; US20090082446A1; BRPI0213165B8; US8778995B2; CN100471492C; RU2004114229A; CN1688302A; EP1435235B1; CN101259121B; WO2003030891A1; CN101259122A; CN101259122B; ATE322261T1; RU2310445C2; ES2186576A1; JP2005527479A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Hydroxyolein-(2-hydroxyolein)säure und Molekülen ähnlicher Struktur als Antitumormittel, als Mittel mit hypertensiver Wirkung und als Mittel zur Induzierung von Reduzierungen des Körpergewichts.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von 2-Hydroxyoleinsäure und ähnlichen Verbindungen zum Kontrollieren der Membranstruktur, dem Kontrollieren der Aktivität und/oder Lokalisierung von G-Proteinen und dem Kontrollieren der Aktivität von Rezeptoren, die an G-Proteine gebunden sind, durch die Regulierung der Membranstruktur.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von 2-Hydroxyoleinsäure und ähnlichen Verbindungen zur Herstellung von Medikamenten, die für die Krebsbehandlung beabsichtigt sind, von Medikamenten zur Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen und von Medikamenten zur Behandlung von Problemen des Körpergewichts und Fettleibigkeit.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Fettsäuren sind Moleküle, die umfassend Verwendung finden, sowohl in Nahrungsmitteln als auch in der Industrie. 2-Hydroxyoleinsäure, dessen Synthese kürzlich beschrieben worden ist (Adam et al., 1998, Eur. J. Org. Chem. 9, 2013–2018), ist industriell als Emulgator für die Herstellung von Kosmetika verwendet worden.
Das Patent JP 10182338 betrifft beispielsweise einerseits eine Öl-in-Wasser-Emulgatorzusammensetzung, die eine niedrige Reizfähigkeit besitzt, und eine starke Kompatibilität mit Salzen, die enthält: [A] nichtionische Tenside, wie Polyoxyethylensorbitolmonolaurat, Polyoxyethylensorbitolmonooleat und Polyoxyethylensorbitolmonostearat, [B] 2-Hydroxy-C₁₀-C₂₂-Fettsäuren, wie 2-Hydroxystearinsäure, [C] Öle und [D] Wasser, in denen das A/B-Verhältnis zwischen 1:0,01 und 1:2 ist.
Das Patent JP 09110635 betrifft auch Verbindungen, die als pharmazeutische Produkte verwendet werden können, Kosmetika und Nahrungsmittel, und enthält: [A] Ester einer Polyglycerylfettsäure, [B] 2-Hydroxy-C₁₀-C₂₂-Fettsäuren, [C] Öle und [D] Wasser, wobei das Gewichtsverhältnis von A/C und B/C 2,0 bzw. 0,5 ist, und die durchschnittlichen Partikelgrößen zwischen 10 und 300 nm haben. Diese Verbindungen zeigen eine gute Stabilität, selbst unter sauren Bedingungen oder bei niedriger Viskosität oder in Gegenwart erhöhter Mengen an Salzen, und sind daher mit der Haut kompatibel.
Andererseits ist diese Fettsäure ebenfalls als Inhibitor der Oleamidhydrolase verwendet worden, einer Wirkung, die mit einer Schlaf auslösenden Wirkung dieser Substanz assoziiert ist (Patente US 6096784 und WO 9749667).
Das Patent US 6096784 betrifft beispielsweise das Design und die Synthese von Oleamidhydrolaseinhibitoren, die für die Hydrolyse eines Schlaf induzierenden Lipids verantwortlich sind (cis-9-Octadecenamid). Die stärksten Inhibitoren haben eine elektrophile Carbonylgruppe, die in der Lage ist, reversibel ein (Thio)hemiacetal oder ein (Thio)hemiacetal zum Imitieren des Übergangszustands einer Reaktion zu bilden, welche durch eine Protease vom Cystein- oder Serin-Typ katalysiert wird. Zusätzlich zu der inhibitorischen Wirkung wiesen einige der Inhibitoren agonistische Wirkung auf, die Schlaf bei Labortieren induziert.
Die hexagonalen Membranstrukturen.
Die Membranlipide sind in der Lage, sich in einer größeren Anzahl von Sekundärstrukturen als Proteine und Nukleinsäuren anzuordnen. Die typische Lipiddoppelschicht biologischer Membranen ist nur eine dieser sekundären Konfigurationen. Es ist wenig über die Häufigkeit und die Rollen anderer Sekundärstrukturen in lebenden Zellen bekannt. Eine Funktion dieser Strukturen wurde in einer vorhergehenden Arbeit der Erfinder beschrieben: Um die Bindungsaffinität von G-Proteinen an Membranen zu erhöhen (Escribá PV, Ozaita A, Ribas C, Miralles A, Fodor E, Farkas und Garcia-Sevilla JA; 1997 Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 94, 11375–11380).
Das Konzept der Membranstruktur reicht weit über das in einigen Patenten des Standes der Technik beschriebene hinaus (WO 87/04926 und WO 80/11286), in denen nur die Membranfluidität erwähnt wird, und das Konzept wird auf ein viel breiteres Gebiet ausgeweitet: die Membranstruktur. Die Moleküle, die durch unser Patent abgedeckt werden, wirken auf den Übergang oder die Passage von einer lamellär zu einer hexagonalen Struktur (1). Bei der Untersuchung des zitierten Standes der Technik gibt es im Stand der Technik keine weiteren Anmeldungen, die mit 2-Hydroxyoleinsäure oder ähnlichen Verbindungen verbunden sind, die von besonderem Interesse im Bereich der Krebsbehandlung, kardiovaskulärer Erkrankungen und/oder Kontrolle des Körpergewichts wären.
Es gibt nur Beschreibungen von dietärischen Produkten (GB 2140668, EP 0611568 und WO 02/0042) oder Extrakten aus Kulturen von M. cryophilus (WO 89/11286), welche aus komplexen Mischungen verschiedener Verbindungen bestehen, die einige der in der Erfindung beschriebenen einschließen, wie zum Beispiel Fettsäuren, insbesondere beispielsweise Olein- und Palmitoleinsäuren, und die Verwendung dieser Gemische bei der Behandlung von arteriellem Hochdruck, zur Kontrolle der Fettleibigkeit oder als Antitumormittel, aber ohne irgendeinem dieser Bestandteile des Gemischs, die in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen werden, eine spezifische Rolle bei der therapeutischen Wirkung zuzuschreiben. Nur WO 02/051406 und WO 94/01100 beschreiben die Verwendung einiger Fettsäuren (C₁₄-C₂₀) bei der Behandlung von Prostatakrebs, welches nicht Ziel der vorliegenden Erfindung ist, und ausschließlich wenn diese Fettsäuren, die im Stand der Technik beschrieben werden, verwendet werden.
ZIEL DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung hat das Ziel des Auffindens neuer Anwendungen von 2-Hydroxyoleinsäure und ähnlicher Verbindungen, die mit denen im Stand der Technik nicht verbunden sind.
Ein erstes Ziel der vorliegenden Erfindung liegt darin zu zeigen, dass 2-Hydroxyoleinsäure und dessen Analoga Wirkung als Antitumormittel besitzen.
Ein zweites Ziel der vorliegenden Erfindung liegt darin zu zeigen, dass 2-Hydroxyoleinsäure und dessen Analoga Wirkung als hypertensive Mittel besitzen.
Ein drittes Ziel der vorliegenden Erfindung liegt darin zu zeigen, dass 2-Hydroxyoleinsäure und dessen Analoga Wirkung als Mittel haben, die eine Reduzierung des Körpergewichts auslösen.
Ein viertes Ziel der vorliegenden Erfindung liegt darin zu zeigen, dass 2-Hydroxyoleinsäure und dessen Analoga eine Anwendung als Mittel zum Kontrollieren des Übergangs von der lamellär in eine hexagonale Struktur von Zellmembranen finden. Diese Regulierung der Membranstruktur hat einen Einfluss auf die Aktivität von G-Proteinen, wie auch auf die molekularen Einheiten ihres Transduktionsweges, d.h. ihrer Signalweiterleitungsroute. Eine große Anzahl an Medikamenten wirkt auf die Rezeptoren ein, die an G-Proteine gebunden sind, durch direkte Interaktion mit Molekülen dieser Art oder mit den Mechanismen, die mit den Zellsignalen verbunden sind, die aus ihrer Aktivität herrühren. 2-Hydroxyoleinsäure und deren Analoga wirken jedoch auf die Membranstruktur ein.
Die Anwendungen, die unten für 2-Hydroxyoleinsäure und deren Analoga beschrieben worden sind, sind zuvor von niemandem zitiert worden und ihre Verwendung kann sich als günstig für die Behandlung bestimmter Pathologien herausstellen. Insbesondere ist gefunden worden, dass 2-Hydroxyoleinsäure und deren Analoga Antitumorwirkung aufweist, hypertensive (oder antihypertensive) Aktivität hat und eine Reduzierung des Körpergewichts auslöst.
In der vorliegenden Erfindung werden neue Anwendungen von 2-Hydroxyoleinsäure und deren Analoga durch die Verwendung experimenteller Modelle substantiiert, insbesondere von Systemen der in-vitro-Analyse, Zellkultursystemen und lebende Organismen. Alle diese Analysemodelle zeigen zweifelsfrei, dass 2-Hydroxyoleinsäure und deren Analoga Moleküle sind, die zum Herstellen von Medikamenten für die Krebsbehandlung, zur Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen oder zur Behandlung von Individuen mit Problemen des Körpergewichts und Fettleibigkeit verwendet werden können, wie auch andere Erkrankungen oder defizitärer Bedingungen, die auf der Kontrolle von Signalen beruhen, die mit G-Proteinen in Verbindung stehen, und welche durch den lamellären in den hexagonalen Übergang der Membranstruktur vermittelt werden.
Beschreibung dar Erfindung
In der vorliegenden Erfindung bedeutet "2-Hydroxyoleinsäure" α-Hydroxyoleinsäure, Octadecenoinsäure C18:1 cis Δ9 oder cis-2-Hydroxy-9-octadecenoinsäure. "Analoga" bedeutet solche Fettsäuren, die die Doppelbindung ein oder zwei Positionen von der zentralen Zone verschoben haben und/oder die die Doppelbindung von einer bis zu vier Positionen des Zentralbereichs verschoben haben, und/oder ein bis sechs Kohlenstoffatome (CH₂-Gruppen) mehr oder weniger an jeder Seite der Doppelbindung und/oder die einen Rest (R) an der Position 2 haben, der von OH verschieden ist, mit einer geringen Atommasse (Molekulargewicht weniger als oder gleich 200 Da). Es ist egal, ob das Stereoisomer, das der Projektion der R-Gruppe entspricht, R oder S ist. Im Zusammenhang mit den zahlreichen getesteten Molekülen ist beobachtet worden, dass solche, mit den allgemeinen Formeln, die unten gezeigt sind, einige ähnliche Wirkungen wie Hydroxyoleinsäure aufweisen und daher als Analoga davon kategorisiert werden können.
Allgemeine Formel I: COOH-CHR-(CH₂)_m-CH=CH-(CH₂)_n-CH₃, wobei m und n unabhängig voneinander einen Wert von 0–15 haben und R OH oder NH₂ sein kann.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet "G-Proteine" Proteine, Guanidinnukleotid bindende Proteine sind, die aus drei Untereinheiten gebildet sind (eine α, eine β und eine γ), welche Signale von Rezeptoren, die an G-Proteine gebunden sind, an Effektoren (Adenylylcyclase, Guanylylcyclase, Phospholipase C, Ionenkanäle, etc.) übermitteln.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet "Membranstruktur" die Sekundärstruktur oder Anordnung von Lipiden in natürlichen oder synthetischen Membranen (Liposomen).
In der vorliegenden Erfindung bedeutet "akute Wirkung" die Wirkung, die in einem Zeitraum zwischen Minuten und einigen Stunden nach einer einzelnen Verabreichung eines Medikaments hervorgerufen wird.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet "chronische Wirkung" die Wirkung, die in einem Zeitraum zwischen einigen Tagen und mehreren Wochen einer kontinuierlichen Verabreichung eines Medikaments erreicht wird.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet "pharmazeutisch annehmbare Formen" solche, die routinegemäß im Bereich verwendet werden, einschließlich, aber nicht begrenzend: Ester, insbesondere Ethylester aufgrund ihrer Eigenschaften als Lösungsmittel für Fettsäuren, Ether, Amide, Salze etc.
• Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Anwendung von 2-Hydroxyoleinsäure und deren Analoga beim Kontrollieren des Übergangs von der lamellären in die hexagonale Struktur der Zellmembranen. Die molekulare Grundlage dieses Phänomens liegt in der Interaktion von 2-Hydroxyoleinsäure und deren Analoga mit Membranen und in der Modulierung der Membranzusammensetzung und/oder Struktur (Tabellen 1 und 2).
Tabelle 1 Wirkung der Bindung von 2-Hydroxyoleinsäure auf die Temperatur der Umwandlung von der lamellären in die hexagonale Struktur (HII).

^a T_H gibt die Umwandlungstemperatur von der lamellären in die hexagonale Struktur an.

Tabelle 1 zeigt die Umwandlungstemperaturwerte der lamellären in die hexagonalen Strukturen bei Membranen aus Dielaidoylphosphatidylethanolamin (DEPE). Der Kontrollwert (in Abwesenheit von 2-Hydroxyolein) ist 63°C. Die Abnahme (konzentrationsabhängig), die durch 2-Hydroxyoleinsäure (20HOA) induziert wird, zeigt, dass dieses Molekül die Gegenwart nicht-lamellärer Strukturen stabilisiert. Diese bedeutende Modifizierung der Zellmembran hat wichtige Konsequenzen für die molekulare und zelluläre Funktion. Alle Analoga von 2-Hydroxyolein, die getestet wurden, die eine therapeutische Wirkung haben, induzieren auch Wirkungen auf die Membranstruktur (Tabelle 2).
Tabelle 2 Wirkung zahlreicher Analoga der Hydroxyoleinsäure (Phospholipid:Analogon 20:1 mol:mol) auf den lamellären-hexagonalen Übergang des Phospholipids Dielaidoylphosphatidylethanolamin (DEPE)
Modulierung des lamellären in den nicht-lamellären Übergang reguliert die Aktivität von G-Proteinen.
Hydroxyoleinsäure und verwandte Verbindungen sind in der Lage, die Aktivität von G-Proteinen zu modulieren, gemessen durch die Bindung von [³⁵S] GTPγS (5).
Dies liegt daran, dass diese Moleküle einen Einfluss auf die Interaktion von G-Proteinen mit Membranen haben und daher auf ihre zelluläre Lokalisierung, wie in den Fotografien der konfokalen Mikroskopie (2) gezeigt wird. Die Wirkung von Hydroxyoleinsäure und deren Analoga auf die Lokalisierung und Aktivität von G-Proteinen besteht nicht aufgrund einer direkten Interaktion mit ihnen. 6 zeigt die Wirkung, die diese Moleküle auf die Aktivität von gereinigten G-Proteinen in Abwesenheit von Membranen haben. Im Gegensatz zu dem, was auftritt, wenn die G-Proteine an Membranen gebunden sind, hatten Daunomycin (DNM) und Hydroxyolein (2OHOA), wie auch die Analoga des letztgenannten keinen Einfluss auf die Aktivität dieser Proteine (welche nur aktiviert werden, wenn sie in Membranen in Kontakt mit Rezeptoren vorliegen, die an G-Proteine gebunden sind).
Rezeptoren, die an G-Proteine gebunden sind, sind ubiquitär und machen 80 % der Membranrezeptoren aus, die Signale übermitteln, welche durch Neurotransmitter, Hormone, Neuromodulatoren, Cytokine, Wachstumsfaktoren etc. ausgelöst werden. Neben anderen physiologischen Abläufen regulieren sie den Blutdruck, Zellwachstum und -proliferation und das Körpergewicht.
Dementsprechend können die in dieser Erfindung beschriebenen Moleküle die zuvor erwähnten physiologischen Abläufe regulieren.
– Tests der Membranstruktur –
Die wirksamste und beste Technik zur Untersuchung der Membranstruktur ist Röntgendiffraktion/-streuung. Unter Verwendung dieser Technik haben wir herausgefunden, dass die Struktur der Membran durch 2-Hydroxyoleinsäure und deren Analoga verändert wird. Die Verringerung der Übergangstemperatur von der lamellären in die hexagonale Struktur zeigt eine bedeutende Wirkung auf die Rearrangierung von Lipidmolekülen in die Membran an. Diese Regulierung der Rearrangierung bildet die Grundlage des durch 2-Hydroxyoleinsäure und deren Analoga ausgeübten Effekts. Alle untersuchten Analoga, die mit der allgemeinen Formel übereinstimmen, besitzen die Wirkung einer Membranmodulierung und Kontrolle der Zellproliferation (Wirksamkeit bei Krebs), des Blutdrucks (Wirksamkeit in kardiovaskulären Abläufen) und auf das Körpergewicht (Wirksamkeit bei Fettleibigkeit).
• Ein Ziel der vorliegenden Erfindung liegt darin nachzuweisen, dass 2-Hydroxyoleinsäure und deren Analoga eine Wirkung als Antitumormittel aufweisen.
Zum Ersten wird der Zellzyklus durch Wachstumsfaktoren kontrolliert, die an spezifische Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden. Die Bindung dieser Wachstumsfaktoren an die Rezeptoren führt zu einer Kaskade an Reaktionen, die darauf abzielen, mitogene Kinasen (cdk) zu aktivieren, die dimere Komplexe mit den Proteinen bilden, die mit dem Zellzyklus assoziiert sind, sogenannte Cycline. Die cdk/Cyclinkomplexe regulieren die Phasen des Zellzyklus und dessen Voranschreiten, um Mitose und Zellteilung zu induzieren.
Viele spezifische Rezeptoren auf der Zelloberfläche sind an G-Proteine gebunden, so dass, wenn ein Wachstumsfaktor mit dem Rezeptor interagiert, das G-Protein aktiviert ist, was die Reaktionskaskade, die oben erwähnt wurde, auslöst.
Daher macht es die Modulierung der Lokalisierung und Aktivität von G-Proteinen möglich, das Zellwachstum und die Zellteilung zu kontrollieren. Der Mechanismus, der mit den Antitumorwirkungen der 2-Hydroxyoleinsäure und deren Analoga assoziiert ist, beruht auf der Tatsache, dass sie die Modulierung der Lokalisierung und Aktivität von G-Proteinen und anderer peripherer Proteine, wie Proteinkinase C oder kleiner G-Proteine (vom Typ Ras, Raf, etc.) induzieren. Diese Modulierung ist mit der Regulierung der Struktur der Membranlipide assoziiert.
Es ist herausgefunden worden, dass 2-Hydroxyoleinsäure als Inhibitor der Translokation der G-Proteine in den Kern wirkt (2). Auf diese Weise wird eine Inhibierung der Zellproliferation erreicht, wie durch die wahrnehmbaren und signifikanten Anstiege der Konzentration des Proteins p21 und der Abnahme der Zellzyklusproteine cdk2 und der Cycline B und D3 bestätigt wurde (3A und B). Außerdem ist beobachtet worden, dass bei Zellen in Kultur 2-Hydroxyoleinsäure und deren Analoga signifikante Anstiege der Proteinkinase C induziert (Anstieg von zwischen 40 % und 120 %).
Diese Veränderung der zellulären Lokalisierung der G-Proteine erzeugt Modulierungen ihrer Funktion, die stärker sind als jene, die durch das Medikament Daunomycin verursacht werden, welches bei der Behandlung von Krebs weit verbreitet verwendet wird. Diese Änderungen haben wichtige inhibitorische Wirkungen auf die Proliferation und das Überleben von Tumorzellen (4).
Ein wichtiger Regulator des Zellzyklus ist das Protein p53, das eine Art negativer Kontrolle durch Verlangsamung der Zellteilung auf dem Niveau von G1 ausübt (dem Stadion vor der Mitose). Dieses Protein wird durch die Zelle selbst als Reaktion auf das Auftreten von Veränderungen der DNA synthetisiert. Wenn die replizierte DNA einen negativen Einfluss auf die Tochterzellen haben kann, wird das p53-Protein aktiviert, was Apoptose (programmierter Zelltod) verursacht. Die Aktivierung dieses Proteins p53 bedeutet, dass andere Gene exprimiert werden, die für regulatorische Proteine codieren, wie p21, p27, p16, etc., die die Aktivität/Expression der Cycline und cdks inhibieren (beteiligt am Ablauf des Zellzyklus).
In vielen Arten von Tumorzellen scheint das p53-Protein mutiert und/oder inaktiv zu sein, und die Proliferation transformierter (kanzeröser) Zellen tritt auf. Die Gegenwart von 2-Hydroxyoleinsäure und/oder deren Analoga in den Zellen induziert die Aktivierung des Signalwegs, der mit p53 assoziiert ist, welcher den Beginn der Apoptose oder das Stoppen des Zellzyklus in verschiedenen Arten von Tumorzellen auslöst. In der Absicht, das erste Ziel der vorliegenden Erfindung durchzuführen, wurden in vitro- und in vivo-Modelle verwendet. In diesem Zusammenhang wurde gezeigt, dass 2-Hydroxyoleinsäure und alle strukturellen Analoga, die mit der allgemeinen Formel I, die zuvor beschrieben worden ist, übereinstimmen, beträchtliche Antitumorfähigkeit aufweisen. Die getesteten Moleküle, die Analoga von 2-Hydroxyolein- (2-Hydroxy-cis-9-octadecenoin)säure sind, sind: 2-Methylolein-(2-methyl-cis-9-octadecenoin)säure, 2-Amino-olein-(2-amino-cis-9-octadecenoin)säure, Olein-(cis-9-octadecenoin)säure, Palmitolein-(cis-9- hexadecenoin)säure, cis-Vaccen-(cis-11-octadecenoin)säure und Nervon-(cis-15-tetracosenoin)säure. Diese Moleküle haben sich als die Zellproliferation stoppend erwiesen, oder sie induzieren den Tod zahlreicher Arten von Tumorzellen (z.B. menschliche Lungenkrebszellen A549, Jurkat-T-Lymphozyten, etc.) (4). Diese Ergebnisse zeigen die Antitumorwirkung der beschriebenen Fettsäuren auf, und zeigen, dass die Grundstruktur der 2-Hydroxyoleinsäure kleine Variation haben kann, ohne deren Antitumorwirkung zu ändern.
Andere molekulare Modelle ermöglichen uns zu bestätigen, dass 2-Hydroxyoleinsäure und deren Analoga Antitumoraktivität aufweisen, die höher ist, als die, welche durch andere Antitumormedikamente aufgewiesen wird, z.B. die Anthracycline, und sie sind deswegen Verbindungen von höchstem therapeutischem Interesse. Mit Membranen von 3T3-Fibroblasten ist es uns gelungen, zu beweisen, dass das Vorliegen von 200 μM 2-Hydroxyoleinsäure und/oder Oleinsäure (eine der Analoga der 2-Hydroxyoleinsäure) eine Inhibition von 75–84 % der Aktivität von G-Proteinen in NIH 3T3-Zellen induziert, während 200 μM Daunomycin eine Inhibierung von 46 % dieser Aktivität induzierte (5).
Die Antitumorwirkung von 2-Hydroxyoleinsäure und dessen Analogon Oleinsäure wird in 8 gezeigt, in der wir, nach Behandlung mit 2-Hydroxyoleinsäure, das Verschwinden einiger cerebraler Tumormetastasen sehen können, die sich durch ein Lungenadenokarzinom gebildet haben. Die Behandlung mit dieser 2-Hydroxyoleinsäure und Oleinsäure verursachte ein vollständiges Verschwinden des Krebses. Diese Ergebnisse zeigen, dass (a) 2-Hydroxyoleinsäure und deren Analoga Moleküle sind, die verwendet werden können, um Medikamente herzustellen, die für die Behandlung von Krebs beabsichtigt sind; (b) dass sie ein breites Wirkspektrum haben (sie sind in verschiedenen Arten von Tumorzellen in Kulturen und lebenden Organismen wirksam gewesen) und (c) dass sie anderen Molekülen, die für die Behandlung von Krebs verwendet werden, in ihrer Antitumorfähigkeit, in ihrer Abwesenheit von Nebenwirkungen überlegen sind, und dadurch, dass sie oral verabreicht werden, obwohl eine intravenöse oder subkutane Verabreichung ebenfalls möglich ist.
– Antitumortests –
Die antiproliferative Wirkung von Hydroxyoleinsäure ist in den human Lungenkrebszellen A549 und in humanen Leukämiezellen (Jurkat) nachgewiesen worden. 3 zeigt die Induzierung des antiproliferativen Proteins p21, welches durch eine Abnahme der Proteine cdk2, Cyclin B und Cyclin D3 be gleitet wird, die für die Tumorzellen notwendig sind, damit sie in der Lage sind, sich zu teilen. Ähnliche Wirkungen wurden durch alle getesteten Analoga hervorgerufen, die mit der allgemeinen Strukturformel übereinstimmen, die früher angegeben worden ist. Diese antiproliferative Wirkung von 2-Hydroxyoleinsäure und deren Analoga wurde durch die Reduzierung der Zelldichte der Tumorzellen in Kultur (4) bewiesen. Diese antiproliferative Wirkung wurde ebenfalls unter Verwendung anderer Techniken und anderer Zelltypen beobachtet: in primären Ratten-Astrocyten haben diese Fettsäuren eine antiproliferative Wirkung, welche ich durch Inkorporieren von Tritiumthymidin untersucht habe. Außerdem sind Hydroxyoleinsäure und deren Analoga in der Lage, Apoptose oder programmierten Zelltod in menschlichen Krebszellen zu induzieren. Einerseits zeigt der Abbau von PARP (3C) und andererseits die Veränderung der Zellmorphologie und das Vorhandensein von Zellresten (4) die Wirkung von 2-Hydroxyoleinsäure und von deren Analoga als Induktoren von Zelltod auf. Unter Verwendung von Durchflusszytometrie-Experimenten wurde herausgefunden, dass in Gegenwart von 2-Hydroxyoleinsäure die Anzahl lebender menschlicher Leukämiezellen (Jurkat) nur 10 % derer betrug, die mit Etoposid, einem bekannten Antitumormittel, überlebten.
Schließlich hat eine Untersuchung der Wirkung in Menschen gezeigt, dass 2-Hydroxyoleinsäure und deren Analoga eine Familie an Antitumormitteln von großer Bedeutung bilden kann. 8 zeigt die Wirkung der Behandlung mit 2-Hydroxyoleinsäure und Oleinsäure auf Tumoren in Menschen. Der gezeigte Fall entspricht einem weiblichen Patienten, in dem eine vorhergehende Chemotherapie und Radiotherapie keine Reduzierungen der Hirntumore hervorrief.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung liegt darin, zu zeigen, dass 2-Hydroxyoleinsäure und deren Analoga Mittel mit hypertensiver Wirkung sind.
Regulierung der Aktivität von G-Proteinen kontrolliert den Blutdruck.
Es gibt einen Zusammenhang zwischen den Medikamenten der Erfindung und der Aktivität der G-Proteine sowie dem Blutdruck. Als Ergebnis, das bestätigt, was früher beschrieben worden ist, wird eine Studie an Menschen durchgeführt, in der erkannt wurde, dass hypertensive Individuen Veränderungen der Konzentration der Membranlipide haben (Tabelle 3). Die Membranlipide haben einen Einfluss auf dem lamellär-hexagonalen Übergang, welcher wiederum die Lokalisierung und Funktionalität der G-Proteine bestimmt. So beobachten wir bei Patienten mit Hypertension tatsächlich eine Änderung der Konzentration an G-Proteinen, die an die Membran gebunden sind, was auf die zuvor erwähnte Veränderung der Membranlipide zurückzuführen ist, und auf die Leichtigkeit der Bildung hexagonaler Phasen. Falls die Modulierung nicht-lamellärer Membranstrukturen und die darauffolgende Relokalisierung der G-Proteine Hypertension hervorruft, ist es durch Regulieren des lamellär-hexagonalen Übergangs der Membranlipide möglich, eine Regulierung der Lokalisierung der Membranproteine, und schließlich des Blutdrucks zu erreichen (7).
Tabelle 3 Zusammensetzung der Fettsäuren von Phospholipiden und Estern von Cholesterin in Erythrozytenmembranen bei normotensiven (Kontrolle) und hypertensiven Individuen (mg/100 mg).
Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung (n = 28).
SFA gesättigte Fettsäuren; MUFA, einfach gesättigte Fettsäuren; PUFA mehrfach ungesättigte Fettsäuren. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. n.d.: nicht nachgewiesen.
Es wurde bewiesen, dass 2-Hydroxyoleinsäure und deren Analoga auch einen auffälligen hypertensiven Effekt haben, da sie Reduzierungen des systolischen und diastolischen Blutdrucks induzieren, ohne die Herzrate zu ändern (9a, 9b und 10). Die hypertensive Wirkung, die durch 2-Hydroxyoleinsäure hervorgerufen wird und durch deren Analoga liegt darin, dass sie eine Reduzierung des Blutdrucks der akuten Form induziert (was 2 Stunden nach Behandlung klar wird) und chronisch (welche für Tage und Wochen bewahrt wird, während die Behandlung fortgesetzt wird). Aminoleinsäure reduziert z.B. den Blutdruck um 15 mmHg bei chronischen Behandlungen, die eine Woche dauern.
Der Blutdruck wird durch zahlreiche Systeme an Rezeptoren kontrolliert, die an G-Proteine gebunden sind, wie Vasopressin-Rezeptoren, adrenerge Rezeptoren etc.
Die Interaktion zwischen den Hormonen, die an der Kontrolle des Blutdrucks beteiligt sind, mit den Rezeptoren, die an stimulierende G-Proteine gebunden sind, wird durch die Wirkung von 2-Hydroxyoleinsäure und ähnliche Moleküle moduliert.
Diese Fettsäuren regulieren die Kommunikation zwischen Rezeptor, G-Protein und Effektor. Das Ergebnis ist eine Modulierung der Signale aus cyclischem AMP, Phospholipase C und Stickstoffoxid, was zu einer Reduzierung des Blutdrucks führt. Diese Wirkung ist ebenfalls mit der Regulierung der Membranstruktur verbunden. Der hauptsächliche pharmakologische Vorteil der 2-Hydroxyoleinsäure und deren Analoga liegt darin, dass sie im Gegensatz zu anderen Hypertensions-Medikamenten keine Wirkung auf die Herzrate haben (d.h. sie erhöhen oder senken die Herzrate nicht signifikant). Ein zusätzlicher Vorteil dieser Verbindungen liegt darin, dass sie andere kardiovaskuläre Risikofaktoren kontrollieren: das Serumlipid-/Lipoproteinprofil und Körpergewicht (siehe unten). Da die Kontrolle des Blutdrucks selbst nicht ausreichend ist, um das Leben eines Patienten zu verlängern, und da es notwendig ist, andere kardiovaskuläre Risikofaktoren zu kontrollieren, sind diese Fettsäuren anderen Molekülen überlegen, die bei Patienten mit kardiovaskulären Erkrankungen benutzt werden.
– Hypertensive Tests –
2-Hydroxyoleinsäure induzierte signifikante Reduzierungen des Blutdrucks bei Ratten (9). Diese Reduktionen waren von akuter Form (2 Stunden nach Behandlung, 19 ± 6 mmHg, P < 0,01, n = 6) und chronischer Form (1 Woche, 26 ± mmHg, P < 0,001, n = 6). Außerdem bewirkten akute und chronische Behandlungen mit 1 mg/kg bis 10 mg/kg ebenfalls signifikante, konzentrationsabhängige Abnahmen des Blutdrucks.
Bei Menschen erzeugte 2-Hydroxyoleinsäure auch signifikante, starke Abnahmen des Blutdrucks, siehe 9.
Außerdem hatten die Analoga der 2-Hydroxyoleinsäure, die mit der allgemeinen Formel, die oben angegeben ist, hypertensive Wirkung (10). In allen Fällen waren die Abnahmen des Blutdrucks signifikant im Vergleich mit den Kontrollen (*P < 0,05, **P < 0,01).
Diese Ergebnisse zeigen klar, dass 2-Hydroxyoleinsäure und deren Analoga wirksame Mittel für klinische/pharmakologische Behandlung von hohem Blutdruck sind.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist zu zeigen, dass 2-Hydroxyoleinsäure und deren Analoga Wirkung als Mittel haben, die Reduzierungen des Körpergewichts verursachen (11).
Zusätzlich zur Antitumor- und hypertensiven Wirkung von 2-Hydroxyoleinsäure und deren Analoga induzieren sie Reduzierungen des Körpergewichts.
Körpergewicht wird neben anderen Dingen durch Faktoren, wie die individuelle metabolische Leistungsfähigkeit und Kontrolle der Nahrungsmittelzufuhr reguliert.
Die Kontrolle der Nahrungsmittelzufuhr wird durch das Sättigungsgefühl bestimmt, welches wiederum auf hormonalem Niveau reguliert wird. Mängel an Nährstoffen stimulieren beispielsweise die Sekretion von Hormonen, die einem Appetitgefühl zugrunde liegen. Nach dem Essen, sobald die Nährstoffniveaus wieder aufgefüllt worden sind, gibt es eine Stimulierung der Sekretion von Hormonen, die zu einem Sättigungsgefühl führen.
Es ist gefunden worden, dass 2-Hydroxyoleinsäure und deren Analoga Wirkungen auf die Sattheit ausübt, einschließlich Reduzierungen der Nahrungsmittelzufuhr. Diese Kontrolle wird auch durch Rezeptoren von Zytokinen, Leptinen, Adrenozeptoren und anderen Rezeptoren, die an G-Proteine gebunden sind vermittelt, deren Aktivität durch diese Fettsäuren moduliert wird.
Bei den behandelten Tieren bedeutete diese Wirkung eine zwischen 15 % und 30 % geringere Aufnahme von Nahrung als bei Kontrolltieren.
– Tests zur Kontrolle des Körpergewichts –
Ratten, die mit diesen Molekülen behandelt wurden, verlieren bei chronischer Behandlungen Körpergewicht (von 5 bis 17 Tagen). In diesen Experimenten wurden Ratten mit 2-Hydroxyoleinsäure oder deren Analoga behandelt, insbesondere mit Aminooleinsäure, und hatten freien Zugang zu Nahrung und Wasser, in gleicher Weise wie die Kontrollgruppe der behandelten Ratten (11). Unter diesen Bedingungen gab es eine zunehmende Körpergewichtsabnahme bei den Ratten, ausgehend vom ersten Behandlungstag, bis zu 17 g am siebten Tag der Behandlung (5 % des normalen Körpergewichts einer 2–3 Monate alten Sprague-Dawley-Ratte). Das diesen Tieren zugeführte Futter wurde gewogen, und der Konsum stellte sich als während der Behandlungsdauer niedriger heraus, was bestätigt, dass die Behandlungen mit den Molekülen, die diese Erfindung betreffen, einen Sättigungseffekt im Tier hervorrufen. Ähnliche Experimente, die an erwachsenen Mäusen durchgeführt wurden, für Zeiträume bis zu 28 Tagen mit 2-Hydroxyoleinsäure, zeigten Reduzierungen des Körpergewichts von 15 % bis 25 %, bezogen auf Kontrollmäuse (behandelt mit Träger).
Beschreibung der Diagramme
1: Einige der vielen Strukturen, zusätzlich zur lamellären, die Membranen annehmen können.
2 zeigt die zelluläre Lokalisierung von Gαi₂-Protein, markiert mit Fluorescein in primären Astrozyten des Rattenhirns. In Kontrollzellen zeigt die Markierung das Vorhandensein dieses Proteins in der Zelle an, insbesondere im Nucleus (Pfeil). In Zellen, die mit 2-Hydroxyolein (2OHOA) behandelt wurden, tritt die Markierung in der Membran und dem Cytosol auf, aber nicht im Nucleus (Pfeil).
3 zeigt die Wirkung von 2-Hydroxyoleinsäure in molekularen Markern der Zellproliferation und des Zelltods. Teil A zeigt die Wirkung von 2-Hydroxyoleinsäure (2OHOA) auf die Zellzyklusproteine cdk2, Cyclin B und Cyclin D3 in den menschlichen Lungenkrebszellen A549. Die Abnahme dieser Proteine zeigt, dass diese Fettsäure einen Stop des Zellzyklus induziert, d.h. einen Stop der Zellteilung. Teil B zeigt die Wirkung von 2-Hydroxyoleinsäure (2OHOA) auf p21-Protein in A549-Zellen nach Inkubation für 24 bzw. 48 Stunden. Protein p21 inhibiert den Zellzyklus, d.h„ dass es ein antiproliferatives Protein ist. Die großen Zunahmen, die 2-Hydroxyoleinsäure auf dieses Protein induziert, erklären den Stop des Zyklus und er Proliferation der Tumorzellen. Teil C zeigt den Abbau von poly-ADP-Ribosepolymerase (PARP) in menschlichen Leukämiezellen (Jurkat) (Etoposid: 25 [E1] und 250 μM [E2]; 2-Hydroxyoleinsäure: 10 [O1], 100 [O2] und 1.000 μM [O3]). Die Abnahme der Konzentration dieses Enzyms oder der Beweis seines Abbaus weist auf den Beginn der Apoptose oder programmierten Zelltod hin. In diesen Experimenten wurde Etoposid als Positivkontrolle verwendet, da dieses Molekül dafür bekannt, dass es ein Induktor der Apoptose und ein Antitumormittel ist.
4 zeigt die Wirkung von 2-Hydroxyoleinsäure und deren Analoga auf die Proliferation menschlicher A549-Lungenkrebszellen (A) und Jurkat-Zellen einer menschlichen Leukämie (B). Sowohl 2-Hydroxyoleinsäure (2OHOA) und deren Analoga, von denen alle mit der vorher angegebenen Formel übereinstimmen, induzieren einen Stop der Teilung und des Tods von Tumorzellen (OA: Oleinsäure; VA: cis-Vaccensäure; POA: Palmitoleimsäure; NA: Nervonsäure; 2MOA: 2-Methyloleinsäure; 2NOA: 2-Aminooleinsäure.
5 zeigt die Bindung von [³⁵S]GTPγS an Membranen von NIH 3T3-Zellen, die mit dem Ratten-Adenozeptor α_2A/D transfiziert sind. Dieser Parameter misst die Aktivität von G-Proteinen. Das Vorliegen von 2-Hydroxyolein induziert eine Abnahme der Funktion der G-Proteine, die sogar größer ist als beim Anthracyclin-Daunomycin (DNM). Die Anthracycline sind potente Antitumormedikamente, und deswegen ist 2-Hydroxyolein potenziell wirksamer gegen Tumore. Die Analoga von 2-Hydroxyolein rufen eine ähnliche Wirkung wie 2-Hydroxyoleinsäure hervor.
6: Hydroxyoleinsäure und deren Analoga hatten keine Wirkung auf reine G-Proteine (in Abwesenheit von Membran). Das zeigt, dass deren Wirkung auf die Aktivität von G-Proteinen durch die Regulierung der nicht-lamellären Membranstrukturen vermittelt wird. Daunomycin (DNM) hatte ein ähnliches Verhalten wie die Kontrolle.
7: Die Konzentration der G-Proteine in Membranen von Erythrozyten von normotensiven Individuen (leere Balken) und hypertensiven Individuen (gefüllte Balken). Die Konzentration der Proteine Gαi_1/2(Gi), Gαo (Go), Gαs (Gs) und G Gβ (Gb) sind in hypertensiven Individuen signifikant niedriger. Die Werte der Balken sind Mittelwerte ± Standardabweichung *P < 0,05, **P < 0,01.
8 zeigt Hirnmetastasen (Tumore), die sich aus einem Lungenadenokarzinom gebildet haben. Das Bild auf der linken Seite (8a) entspricht den Tumoren vor der Behandlung, das auf der rechten Seite (8b, 8c und 8d) entspricht den Tumoren nach Behandlung mit 2-Hydroxyolein zu verschiedenen Zeitpunkten. Wie erkannt werden kann, verschwand einer der Tumoren schneller und der andere langsamer.
9a zeigt die akute Wirkung (2 Stunden, schwarze Balken) und die chronische Wirkung (3 tägliche Injektionen über 7 Tage, weiße Balken) von Hydroxyoleinsäure (30 mg/kg) auf den systolischen arteriellen Druck in Sprague-Dawley-Ratten. Niedrigere Dosen dieses Moleküls (1–10 mg/kg) riefen ähnliche Wirkungen hervor, waren aber weniger ausgeprägt. *P < 0,01.
9b zeigt die Wirkung von 2-Hydroxyoleinsäure (30 mg/kg) auf den Blutdruck bei Menschen. Dieses Diagramm zeigt den systolischen arteriellen Druck als Funktion des Tags der Behandlung. Die Tage vor der Behandlung werden mit negativen Werten angezeigt. *P < 0,05, **P < 0,01.
10 zeigt die Wirkung akuter 'Behandlungen mit 2-Hydroxyoleinsäure (2OHOA) und deren Analoga 2-Methyloleinsäure (2MOA), Oleinsäure (OA), Palmitoleinsäure (POA), cis-Vaccensäure (VA) und Nervonsäure (NA). Alle Behandlungen, die mit 2-Hydroxyoleinsäure durchgeführt wurden und mit Analoga, die mit der allgemeinen Formel, die oben angegeben worden ist, übereinstimmen, induzierten siginifikante Abnahmen (*P < 0,05, **P < 0,001) des systolischen arteriellen Drucks in Sprague-Dawley-Ratten.
11 zeigt die Wirkung von 2-Hydroxyoleinsäure (OHOA) und deren Analoga, Oleinsäure (OA) und Palmitoleinsäure (POA), auf das Körpergewicht (3 tägliche Injektionen von 30 mg/kg). Die Tiere (Sprague-Dawley-Ratten) hatten zu jedem Zeitpunkt freien Zugang zu Nahrung und Wasser.

Claims

Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I): COOH-CHR-(CH₂)_m-CH=CH-(CH₂)_n-CH₃ worin R OH oder NH₂ ist und m und n unabhängig voneinander einen wert zwischen 0 und 15 haben, zur Herstellung von Medikamenten und pharmazeutisch annehmbaren Formen, die bei der Behandlung von Krebs verwendet werden können.
Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) vorzugsweise zwischen 12 und 28 Kohlenstoffatome haben.
Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) vorzugsweise 2-Hydroxyoleinsäure und 2-Aminoleinsäure sind.
Verwendung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I): COOH-CHR-(CH₂)_m-CH=CH-(CH₂)_n-CH₃ worin R irgendeine Gruppe mit einem Molekulargewicht unter 200 Da sein kann und m und n unabhängig voneinander einen Wert zwischen 0 und 15 haben, zur Herstellung von Medikamenten und pharmazeutisch annehmbaren Formen, die zur Behandlung von Hypertension verwendet werden können, mit der Ausnahme der Verwendung von Palmitoleinsäure, wenn sie zur Herstellung von Medikamenten verwendet werden, die zur Behandlung von Hirnschlägen verwendet werden können.
Verwendung gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß R vorzugsweise H, OH, NH₂ oder CH₃ ist.
Verwendung gemäß Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) vorzugsweise zwischen 12 und 28 Kohlenstoffatome haben.
Verwendung gemäß Ansprüchen 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) vorzugsweise 2-Hydroxyoleinsäure, 2-Methyloleinsäure, Vaccensäure, Nervonsäure, Oleinsäure, Palmitoleinsäure oder Aminoleinsäure sind.
Verwendung von Derivaten der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) COOH-CHR-(CH₂)_m-CH=CH-(CH₂)_n-CH₃ worin R irgendeine Gruppe mit einem Molekulargewicht unter 200 Da sein kann und m und n unabhängig voneinander einen Wert zwischen 0 und 15 haben, zur Herstellung von Medikamenten und pharmazeutisch annehmbaren Formen, die bei der Behandlung von Fettleibigkeit verwendet werden können.
Verwendung gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß R vorzugsweise H, OH, NH₂ oder CH₃ ist.
Verwendung gemäß Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) vorzugsweise zwischen 12 und 28 Kohlenstoffatome haben.
Verwendung gemäß den Ansprüchen 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung der allgemeinen Formel (I) vorzugsweise 2-Hydroxyoleinsäure oder Aminoleinsäure ist.