BRPI0213165B1

BRPI0213165B1 - Uso de ácido hidroxioléico e compostos relacionados na manufatura de drogas

Info

Publication number: BRPI0213165B1
Application number: BRPI0213165-0A
Authority: BR
Inventors: Vicente Escriba Ruiz Pablo
Original assignee: Universitat De Les Illes Balears
Priority date: 2001-10-11
Filing date: 2002-10-09
Publication date: 2018-01-23
Also published as: RU2310445C2; CN1688302A; JP2005527479A; CN101259121B; MXPA04003255A; EP1435235B1; CN101259122A; BRPI0213165B8; US7851507B2; US20050014831A1; EP1435235A1; CN101259121A; RU2004114229A; US20090082446A1; CN101259122B; PT1435235E; ES2186576B1; CA2463348C; CN100471492C; ES2186576A1

Abstract

"uso de ácido hidroxioléico e compostos relacionados na manufatura de drogas". a presente invenção refere-se a uso do ácido hidroxioléico e de seus compostos análogos na manufatura de drogas. descreve o uso do ácido hidroxioléico e de seus análogos de fórmula geral i: cooh-chr-(ch~ 2~)~ m~ch=ch-(ch~ 2~)~ n~-ch~ 3~, em que m e n têm, independentemente, um valor de 015 e r pode ser qualquer resíduo com peso molecular abaixo de 200 da, na manufatura de drogas que podem ser usadas no tratamento de câncer, hipertensão, obesidade ou doenças mediadas por alteração da estrutura da membrana e a regulação conseqüente das proteínas g ou dos receptores ligados a elas.

Description

(54) Título: USO DE ÁCIDO HIDROXIOLÉICO E COMPOSTOS RELACIONADOS NA MANUFATURA DE DROGAS (51) Int.CI.: A61K 31/20; A61P 35/00; A61P 9/10; A61P 9/12; A61P 3/04 (30) Prioridade Unionista: 11/10/2001 ES P200102269 (73) Titular(es): UNIVERSITAT DE LES ILLES BALEARS (72) Inventor(es): PABLO VICENTE ESCRIBA RUIZ

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para USO DE ÁCIDO HIDROXIOLÉICO E COMPOSTOS RELACIONADOS NA MANUFATURA DE DROGAS.

Campo da Invenção

A presente invenção relaciona-se ao uso de ácido hidroxioléico (2-hidroxioléico) e moléculas de estrutura similar como agentes antitumor, como agentes com atividade hipotensiva e como agentes para induzir as reduções no peso do corpo.

A presente invenção também se relaciona ao uso de ácido 2hidroxioléico e compostos similares para controlar a estrutura da membrana, controlar a atividade e/ou a localização de proteínas G e controlar a atividade de receptores ligados às proteínas G através da regulação da estrutura da membrana.

A presente invenção também se relaciona ao uso de ácido 2hidroxioléico e compostos similares para a manufatura de drogas pretendidas para o tratamento de câncer, de drogas para tratar doenças cardiovasculares e de drogas para tratar problemas de peso do corpo e obesidade. Fundamento para a Invenção

Os ácidos graxos são moléculas de ampla aplicação, tanto nos gêneros alimentícios quanto na indústria. O ácido 2-hidroxioléico, cuja síntese foi descrita anteriormente (Adam et al., 1998, Eur. J. Org. Chem. 9, 20132018), tem sido usado industrialmente como um emulsificante para preparações de cosméticos.

Por exemplo, por um lado, a patente JP 10182338 relaciona-se a uma composição emulsificante de óleo em água que exibe baixa irritabilidade e alta compatibilidade com os sais, que contém: [A] tensoativos não-iônicos, tais como o monolaurato de polioxietileno sorbitol, o monooleato de polioxietileno sorbitol e o monoestearato de polioxietileno sorbitol, [B] ácidos 2hidróxi C10-C22 graxos, tais como o ácido 2-hidroxiesteárico, [C] óleos e [D] água, em que a razão de A/B é entre 1:0,01 e 1:2.

A patente JP 09110635 também se relaciona a composições que podem ser usadas como produtos farmacêuticos, cosméticos e gêneros ali2 mentícios e contêm: [A] ésteres de ácido poligliceril graxo, [B] ácidos 2hidróxi C10-C22 graxos, [C] óleos e [D] água, onde a razão em peso de A/C e B/C é 2,0 e 0,5, respectivamente, e têm tamanhos médios de partículas entre 10 e 300 nm. Estas composições mostram boa estabilidade, mesmo em condições ácidas ou em baixa viscosidade ou na presença de quantidades elevadas de sais, e, portanto, são compatíveis com a pele.

Por outro lado, este ácido graxo tem também sido empregado como um inibidor de oleamida hidrolase, uma ação que está associada com o efeito indutor de sono desta substância (patentes US 6096784 e WO 9749667).

Por exemplo, a patente US 6096784 relaciona-se ao projeto e à síntese de inibidores da oleamida hidrolase, responsável pela hidrólise de um lipídio indutor de sono (cis-9-octadecenamida). Os inibidores mais potentes possuem um grupo carbonila eletrofílico capaz de formar, de modo reversível, um (tio)hemiacetal ou um (tio)hemiacetal para imitar o estado de transição de uma reação catalisada por uma protease do tipo cisteína ou serina. Além da atividade inibitória, alguns dos inibidores mostraram atividade agonística que induz o sono em animais de laboratório.

Estruturas das Membranas Hexagonais

Os lipídios das membranas são capazes de se organizar em um número maior de estruturas secundárias do que as proteínas e os ácidos nucléicos. A bicamada lipídica típica das membranas biológicas é exatamente uma destas configurações secundárias. Pouco é conhecido sobre a abundância e as funções das outras estruturas secundárias nas células vivas. Uma função destas estruturas foi descrita em um trabalho anterior dos inventores: aumentar a afinidade de ligação das proteínas G às membranas (Escribá PV, Ozaita A, Ribas C, Miralles A, Fodor E, Farkas e García-Sevilla JA; 1997 Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 94, 11375-11380).

O conceito de estrutura da membrana vai longe, além daquele descrito em algumas das patentes do estado da técnica (WO 87/04926 e WO 80/11286), em que somente a fluidez da membrana é mencionada, e o conceito é estendido para um campo muito mais amplo: a estrutura da membrana. As moléculas cobertas pela nossa patente atuam sobre a transição ou a passagem de estrutura lamelar para hexagonal (Figura 1).

Examinando a técnica anterior citada, no estado da técnica não existe nenhuma outra aplicação ligada com o ácido 2-hidroxioléico ou compostos similares que seria de interesse particular na área de tratamento do câncer, doenças cardiovasculares e/ou controle do peso do corpo.

Há somente descrições de produtos dietéticos (GB 2140668, EP 0611568 e WO 02/0042) ou extratos de culturas de M. Cryophilus (WO 89/11286), que consistem em misturas complexas de diversos compostos que incluem alguns daqueles descritos na invenção, tais como os ácidos graxos, em particular os ácidos oléicos e palmioléicos, por exemplo, e do uso destas misturas no tratamento de hipertensão arterial, para o controle de obesidade ou como agentes antitumor, porém sem atribuição a quaisquer dos componentes da mistura considerada na presente invenção, uma função específica no dito efeito terapêutico. Somente o WO 02/051406 e o WO 94/01100 descrevem o uso de certos ácidos graxos ( Cu - C₂o) no tratamento de câncer da próstata, que não é um objetivo da presente invenção, exclusivamente quando usando os ácidos graxos descritos no estado da técnica.

Objetivo da Invenção

A presente invenção tem o objetivo de encontrar novas aplicações do ácido 2-hidroxioléico e de compostos similares que não estejam relacionadas com aquelas descritas no estado da técnica.

Um primeiro objetivo da presente invenção é mostrar que o ácido 2-hidroxioléico e os seus análogos possuem atividade como agentes antitumor.

Um segundo objetivo da presente invenção é mostrar que o ácido 2-hidroxioléico e os seus análogos possuem atividade como agentes hipotensivos.

Um terceiro objetivo da presente invenção é mostrar que o ácido 2-hidroxioléico e os seus análogos possuem atividade como agentes que induzem uma redução no peso do corpo.

Um quarto objetivo da presente invenção é mostrar que o ácido 2-hidroxioléico e os seus análogos têm aplicação como agentes para controlar a transição de estrutura lamelar para hexagonal das membranas celulares. Esta regulação da estrutura da membrana tem uma influência sobre a atividade das proteínas G, bem como das entidades moleculares de seu caminho de transdução, isto é, da sua rota de propagação de sinal. Um grande número de drogas atua sobre os receptores ligados às proteínas G por interação direta com as moléculas deste tipo ou com os mecanismos relacionados com os sinais celulares derivados de sua atividade. O ácido 2hidroxioléico e os seus análogos, entretanto, atuam sobre a estrutura da membrana.

As aplicações descritas abaixo para o ácido 2-hidroxioléico e os seus análogos não tinham sido citadas por ninguém anteriormente e o seu uso pode provar ser benéfico para o tratamento de certas patologias. Em particular, foi verificado que o ácido 2-hidroxioléico e os seus análogos mostram atividade antitumor, atividade hipotensiva (ou anti-hipertensiva) e induzem a redução de peso do corpo.

Na presente invenção, as novas aplicações do ácido 2hidroxioléico e de seus análogos são substanciadas por utilização de modelos experimentais, em particular sistemas de análise in vitro, sistemas de cultura de células e organismos vivos. Todos estes modelos de análises mostram, sem dúvida, que o ácido 2-hidroxioléico e os seus análogos são moléculas que podem ser usadas para preparar drogas para o tratamento de câncer, para o tratamento de doenças cardiovasculares e para tratar pacientes com problemas de peso do corpo e obesidade, bem como outras doenças ou condições de deficiências com base no controle de sinais associados com as proteínas G, mediados pela transição de lamelar para hexagonal da estrutura da membrana.

Descrição da Invenção

Na presente invenção, o “ácido 2-hidroxioléico” significa o ácido α-hidroxioléico, o ácido octadecenóico C18:1 cis Δ9 ou o ácido cis-2-hidroxi5

9-octadecenóico. Os “análogos” significam aqueles ácidos graxos que têm a ligação dupla deslocada uma ou duas posições da zona central e/ou que têm a ligação dupla deslocada de uma a cinco posições da zona central e/ou têm de um a seis átomos de carbono (grupos CH₂) mais ou menos sobre cada lado da ligação dupla e/ou que têm um resíduo (R) na posição 2 diferente a partir de OH, com uma pequena massa atômica (Mw menor do que, ou igual a, 200 Da). Não importa se o estereoisômero correspondendo à projeção do grupo R seja R ou S. Em relação às diversas moléculas testadas, foi observado que aquelas tendo as fórmulas gerais mostradas abaixo mostram alguns efeitos similares ao ácido hidroxioléico e podem, portanto, ser categorizadas como seus análogos.

Fórmula geral I: COOH-CHR-(CH₂)_rn-CH=CH-(CH₂)n-CH₃, em que m e n têm, independentemente, um valor de 0-15 e R pode ser H, OH, NH₂, CH_3i ou algum outro resíduo com peso molecular abaixo de 200 Da.

Na presente invenção, as “proteínas G” significam as proteínas que são proteínas de ligação com o nucleotídeo de guanina, formadas a partir de três subunidades (uma alfa, uma beta e uma gama), que transmitem sinais a partir de receptores ligados a proteínas G, a efetores (adenilil ciclase, guanilil ciclase, fosfolipase C, canais iônicos, etc.).

Na presente invenção, a estrutura da membrana significa a estrutura secundária ou o arranjo dos lipídios em membranas naturais ou sintéticas (lipossomas).

Na presente invenção, o efeito agudo significa o efeito que é produzido em um espaço de tempo entre minutos e algumas horas após uma única administração de uma droga.

Na presente invenção, o “efeito crônico” significa o efeito que é produzido em um espaço de tempo entre alguns dias e diversas semanas de administração contínua de uma droga.

Na presente invenção, as “formas farmaceuticamente aceitáveis” significam quaisquer daquelas usadas rotineiramente no setor, incluindo, de modo não-limitativo: os ésteres, especialmente os ésteres de etila por suas propriedades como solubilizadores de ácidos graxos, os éteres, as amidas, os sais, etc.

• Um objetivo da presente invenção é a aplicação do ácido 2hidroxioléico e de seus análogos no controle da transição de estrutura lamelar para hexagonal das membranas celulares. A base molecular deste fenômeno situa-se na interação do ácido 2-hidroxioléico e de seus análogos com as membranas e na modulação da composição e/ou da estrutura da membrana (Tabelas 1 e 2).

Tabela 1.

Efeito da ligação do ácido 2-hidroxioléico sobre a temperatura de transição de estrutura laminar para hexagonal (Hu).

DEPE:2OHOA (mokmol)	T_H ^a (°C)
1:0 (DEPE pura)	63
40:1	54
20:1	48
10:1	41

^aTn indica a temperatura de transição de estrutura lamelar para hexagonal.

A Tabela 1 mostra os valores da temperatura de transição de estruturas lamelares para hexagonais em membranas de dielaídoil fosfatidiletanolamina (DEPE). O valor de controle (na ausência de 2-hidroxioléico) é

63°C. A diminuição (dependente da concentração) induzida pelo ácido 2hidroxioléico (20HOA) mostra que esta molécula estabiliza a presença de estruturas não-lamelares. Esta modificação importante da membrana celular tem conseqüências importantes para a função molecular e celular. Todos os análogos de 2-hidroxioléico testados, que têm atividade terapêutica, também induzem os efeitos sobre a estrutura da membrana (Tabela 2).

Tabela 2

Efeito de diversos análogos de ácido hidroxioléico (fosfolipídio:análogo 20:1 mokmol) sobre a transição de lamelar-hexagonal de fosfolipídio dielaídoil fosfatidiletanolamina (DEPE)

	Th (°C)
Controle (DEPE somente)	61
Ácido oléico	45
Ácido aminoléico	49
Ácido metiloléico	50
Ácido cis-vacênico	53
Ácido nervônico	55

A modulação da transição de lamelar para não-lamelar regula a atividade das proteínas G.

O ácido hidroxioléico e os compostos relacionados são capazes de modular a atividade das proteínas G, medida pela ligação de [³⁵S] GTPyS (Figura 5).

Isto é porque estas moléculas têm uma influência sobre a interação das proteínas G com as membranas e, portanto, sobre a sua localização celular, como é mostrado nas fotografias de microscopia confocal (Figura 2). O efeito do ácido hidroxioléico e de seus análogos sobre a localização e a atividade das proteínas G não é devido a uma interação direta sobre elas. A Figura 6 mostra o efeito que estas moléculas têm sobre a atividade das proteínas G purificadas, na ausência de membrana. Em contraste com o que ocorre quando as proteínas G estão ligadas às membranas, a daunomicina (DNM) e o hidroxioléico (2OHOA), bem como os análogos deste, não tiveram uma influência sobre a atividade destas proteínas (que são ativadas somente quando elas estão nas membranas em contato com receptores ligados às proteínas G).

Os receptores ligados às proteínas G são ubíquos, constituindo 80% dos receptores de membranas que transmitem sinais iniciados por neurotransmissores, hormônios, neuromoduladores, citocinas, fatores do crescimento, etc. Entre outros processos fisiológicos, eles regulam a pressão sanguínea, o crescimento e a proliferação das células, e o peso do corpo. Desse modo, as moléculas descritas nesta invenção podem regular os processos fisiológicos antes mencionados.

Testes sobre a estrutura da membrana

A técnica mais efetiva e eficaz para investigar a estrutura da membrana é difração de raios X/difusão. Usando esta técnica, estabeleceuse que a estrutura da membrana é alterada pelo ácido 2-hidroxioléico e seus análogos. A diminuição da temperatura de transição de estrutura lamelar para hexagonal indica um efeito importante sobre o rearranjo das moléculas lipídicas na membrana. Esta regulação do rearranjo forma a base do efeito exercido pelo ácido 2-hidroxioléico e seus análogos. Todos os análogos estudados, que concordam com a fórmula geral, possuem atividade de modulação de membrana e controle de proliferação de células (eficácia em câncer), de pressão sanguínea (eficácia em processos cardiovasculares) e de peso do corpo (eficácia em obesidade).

• Um objetivo da presente invenção é demonstrar que o ácido 2hidroxioléico e os seus análogos possuem atividade como agentes antitumor.

Primeiramente, o ciclo das células é controlado por fatores do crescimento que se ligam a receptores específicos sobre a superfície celular. A ligação dos ditos fatores do crescimento aos receptores dá surgimento a uma cascata de reações, que são pretendidas para ativar as cinases mitogênicas (cdk), que formam complexos diméricos com as proteínas associadas com o ciclo celular, chamadas ciclinas. Os complexos de cdk/ciclina regulam as fases do ciclo das células e a sua progressão até produzir a mitose e a divisão das células.

Muitos receptores específicos sobre a superfície da célula estão ligados às proteínas G, de modo que, quando o fator do crescimento interage com o receptor, a proteína G é ativada, iniciando a cascata de reações mencionada antes.

Desse modo, a modulação da localização e da atividade das proteínas G tornará possível controlar o crescimento das células e a divisão celular.

O mecanismo associado com os efeitos antitumor do ácido 2hidroxioléico e de seus análogos é baseado no fato que eles induzem a mo9 dulação da localização e da atividade das proteínas G e de outras proteínas periféricas, tais como a proteína cinase C ou as proteínas G pequenas (do tipo Ras, Raf, etc.). Esta modulação está associada com a regulação da estrutura dos lipídios da membrana.

Foi verificado que o ácido 2-hidroxioléico atua como um inibidor da translocação de proteínas G para o núcleo (Figura 2). Neste modo, a inibição da proliferação de células é atingida, conforme foi confirmada pelos aumentos apreciáveis e significativos nos níveis da proteína p21 e pelas diminuições nas proteínas cdk2 e ciclinas B e D3 do ciclo celular (Figura 3 A e B). Além disso, foi observado que nas células em cultura, o ácido 2hidroxioléico e os seus análogos induzem aumentos significativos na proteína cinase C (aumento de entre 40% e 120%).

Esta mudança na localização celular das proteínas G produz modulações na sua função, maiores do que aquelas produzidas pela droga daunomicina, amplamente usada no tratamento de câncer. Estas mudanças têm efeitos inibitórios importantes sobre a proliferação e a sobrevivência de células de tumor (Figura 4).

Um regulador importante do ciclo celular é a proteína p53, que exerce um tipo negativo de controle abrandando a divisão celular no nível de G1 (o estágio antes da mitose). Esta proteína é sintetizada pela célula propriamente dita em resposta ao aparecimento de alterações do DNA. Se o DNA replicado puder ter uma influência negativa sobre as células-filha, a proteína p53 é ativada, dando surgimento à apoptose (morte celular programada). A ativação da dita proteína p53 significa que outros genes são expressos, que codificam proteínas reguladoras, tais como p21, p27, p16, etc., que inibem a atividade/expressão das ciclinas e cdks (envolvidas no processo do ciclo das células).

Em muitos tipos de células de tumor, a proteína p53 parece estar mutada e/ou inativa, e ocorre a proliferação de células transformadas (cancerosas). A presença de ácido 2-hidroxioléico e/ou de seus análogos nas células induz a ativação do caminho do sinal associado com a p53, que induz o início da apoptose ou a interrupção do ciclo celular em diversos tipos de células de tumor. Com o objetivo de realizar o primeiro objetivo da presente invenção, foram usados modelos in vitro” e in vivo. Com relação a isto, o ácido 2-hidroxioléico e todos os análogos estruturais, que cumprem com a fórmula geral I descrita antes, mostraram possuir capacidade antitumor considerável. As moléculas que são análogas do ácido 2-hidroxioléico (2-hidróxi-cis-9-octadecenóico) testado foram: o ácido 2-metil-oléico (2-metilcis-9-octadecenóico), o ácido 2-amino-oléico (2-amino-cis-9-octadecenóico), o ácido oléico (cis-9-octadecenóico), o ácido palmitoléico (cis-9-hexadecenóico), o ácido cis-vacênico (cis-11-octadecenóico) e o ácido nervônico (cis-15-tetracosenóico). Estas moléculas mostraram parar a proliferação celular ou induzir a morte de diversos tipos de células de tumor (por exemplo, as células de câncer de pulmão humano A549, os linfócitos T de Jurkat, etc.) (Figura 4). Estes resultados demonstram a atividade antitumor dos ácidos graxos descritos e mostram que a estrutura básica do ácido 2-hidroxioléico pode ter pequenas variações, sem alterar a sua atividade antitumor.

Outros modelos moleculares tornaram possível capacitaram de confirmar que o ácido 2-hidroxioléico e os seus análogos possuem atividade antitumor, que é maior do que aquela apresentada por outras drogas antitumor, por exemplo as antraciclinas, e eles são, portanto, compostos de alto interesse terapêutico. Nas membranas de fibroblastos 3T3, tem-se êxito em provar que a presença de 200 μΜ de ácido 2-hidroxioléico e/ou ácido oléico (um dos análogos do ácido 2-hidroxioléico) induz a inibição de 75-84% na atividade das proteínas G nas células de 3T3 NIH, ao passo que 200 μΜ de daunomicina induzem uma inibição de 46% na dita atividade (Figura 5).

A eficácia antitumor do ácido 2-hidroxioléico e de seu análogo ácido oléico é mostrada na Figura 8, em que pode-se ver o desaparecimento de algumas metástases de tumor cerebral, formadas a partir de um adenocarcinoma de pulmão, após tratamento com o ácido 2-hidroxioléico. O tratamento com este ácido 2-hidroxioléico e o ácido oléico causou o desaparecimento completo do câncer. Estes resultados demonstram que (a) o ácido 2hidroxioléico e os seus análogos são moléculas que podem ser usadas para preparar drogas pretendidas para tratar o câncer; (b) que eles têm um es11 pectro amplo de ação (eles têm sido efetivos em diversos tipos de células de tumor em cultura e em organismos vivos) e (c) que eles são superiores a outras moléculas usadas para o tratamento de câncer em sua potência antitumor, na sua ausência de efeitos colaterais e pelo fato que eles são administrados oralmente, embora a administração intravenosa ou subcutânea seja também possível.

Testes Antitumor

A eficácia antiproliferativa do ácido hidroxioléico foi demonstrada nas células de câncer de pulmão humano A549 e em células de leucemia humana (Jurkat). A Figura 3 mostra a indução da proteína antiproliferativa p21, que é acompanhada por uma diminuição nas proteínas cdk2, ciclina B e ciclina D3, necessárias para as células de tumor serem capazes de dividirem-se. Foram produzidos efeitos similares por todos os análogos testados que concordam com a fórmula estrutural geral dada antes. Este efeito antiproliferativo do ácido 2-hidroxioléico e de seus análogos foi demonstrado pela redução na densidade celular em células de tumor em cultura (Figura

4). Este efeito antiproliferativo foi também observado usando outras técnicas e outros tipos de células: em astrócitos primários de ratos, estes ácidos graxos têm um efeito antiproliferativo, que estudou-se incorporando timidina tritiada. Além disso, o ácido hidroxioléico e os seus análogos são capazes de induzir a apoptose ou a morte celular programada em células de câncer humano. Por um lado, a degradação da PARP (Figura 3c), e por outro lado a mudança na morfologia celular e a presença de resíduos de células (Figura 4) demonstram o efeito do ácido 2-hidroxioléico e de seus análogos como indutores da morte celular. Usando experiências de citometria de fluxo, foi estabelecido que, na presença de ácido 2-hidroxioléico, o número de células vivas de leucemia humana (Jurkat) era somente 10% daquelas que permaneceram vivas com a Etoposida, um agente antitumor conhecido.

Finalmente, a investigação do efeito em seres humanos revelou que o ácido 2-hidroxioléico e os seus análogos podem constituir uma família de drogas antitumor de grande importância. A Figura 8 mostra o efeito do tratamento com o ácido 2-hidroxioléico e o ácido oléico sobre os tumores em seres humanos. O caso mostrado corresponde a uma paciente em que a quimioterapia e a radioterapia anteriores não produziram reduções dos tumores do cérebro.

• Um objetivo da presente invenção é demonstrar que o ácido 2hidroxioléico e os seus análogos são agentes com atividade hipotensiva.

A regulação da atividade das proteínas G controla a pressão sanguínea.

Há uma relação entre as drogas da invenção e a atividade das proteínas G e a pressão sanguínea. Um resultado que confirma o que foi descrito antes é um estudo realizado em seres humanos, onde foi visto que os indivíduos hipertensivos têm mudanças nos níveis de lipídios da membrana (Tabela 3). Os lipídios da membrana têm uma influência sobre a transição de lamelar-hexagonal, que, por sua vez, determina a localização e a funcionalidade das proteínas G. Na realidade, em pacientes com hipertensão, observou-se uma mudança nos níveis de proteínas G ligadas à membrana, que é devido à mudança antes mencionada nos lipídios da membrana e à facilidade de formar fases hexagonais. Se a modulação das estruturas das membranas não-lamelares e a relocalização conseqüente das proteínas G produz hipertensão, por regulação da transição de lamelar-hexagonal dos lipídios da membrana é possível atingir a regulação da localização das proteínas da membrana e, finalmente, da pressão sanguínea (Figura 7).

Tabela 3

Composição de ácidos graxos de fosfolipídios e ésteres de colesterol em membranas de eritrócitos, em pacientes normotensos (controle) e hipertensivos (mg/100 mg).

Fosfolipídios	Ésteres	Colesterol
Ácido graxo	Pacientes com hipertensão	Controles	Pacientes com hipertensão	Controles
C14:0	0,4 ±0,1	0,2 ±0,1	0,9 ±0,3	1,0 ±0,2
C14:1n-5	1,7 ±0,2	2,2 ±0,3	0,7 ±0,2	n.d.***
C16:0	23,7 ± 0,6		5,1 ±0,6	14,3 ±0,5
C16:1n-9	0,4 ±0,0	23,1 ±0,5	3,1 ±0,6	*

Fosfolipídios	Ésteres	Colesterol
Ácido graxo	Pacientes com hipertensão	Controles	Pacientes com hipertensão	Controles
C16:1n-7	0,5 ±0,0	0,3 ±0,0	2,4 ±0,4	2,5 ±0,3
C16:4n-3	2,6 ±0,3	0,5 ±0,1	n.d.	**
		2,5 ±0,5		1,7 ±0,1
C18:0	16,6 ±0,3		3,2 ± 0,5	4.4-4.
C18:1n-9t	0,9 ±0,1	17,1 ±0,6 0,6 ±0,0	n.d.	n.d.
C18:1n-9	16,3 ±0,6	***	18,4 ±1,2	2,9 ±0,5
C18:1n-7	1,8 ±0,1		1,5 ± 0,1	n.d.
C18:2n-6	12,5 ±0,7	16,0 ±0,8	45,8 ±2,8
C18:3n-6	0,4 ± 0,0	2,0 ±0,2 **	0,9 ± 0,2	16,7 ±0,6 **
C18:3n-3	0,3 ± 0,0	13,4 ±	n.d.	1,7±
		0,7*		0,2 **
C20:2n-6	2,1 ±0,1	n.d.***	0,9 ±0,1	51,1 ± 1,6
C20:4n-6	17,0 ±0,4		7,0 ± 0,6	★**
C22:4n-6	0,7 ±0,3	0,4 ±0,1	n.d.	0,8 ±0,1 **
C22:6n-3	0,7 ±0,1	2,1 ±0,2 16,5 ±0,4	n.d.	n.d.
C24:1n-9	1,5 ±0,1	0,6 ±0,1	n.d.
Total SFA	41,2 ± 1,1		19,3±1,2	0,9 ±0,1
Total MUFA	22,6 ± 0,6	0,8 ± 0,2	25,9 ± 1,6	6,4 ± 0,9
Total PUFA	36,2 ±1,2		54,8 ± 2,4	★
PUFA:SFA	0,8 ± 0,04	1,6 ±0,1	2,7 ±0,3	n.d.
PU- FA:MUFA	1,6 ± 0,1	41,1 ±0,7	2,2 ± 0,2
		21,7 ±0,7 ★		n.d.
		38,2 ± 0,9		n.d.
		**		18,2 ± 1,1
		0,9 ±0,03		*

Fosfolipídios	Ésteres	Colesterol
Ácido graxo	Pacientes com hipertensão	Controles	Pacientes com hipertensão	Controles
		1,7 ±0,1		22,7 ± 0,8 * 59,1 ±1,6 * 3,4 ±0,3 2,6 ±0,2 ★★★

Os valores são valores médios ± erro-padrão da média (n = 28)

SFA, ácidos graxos saturados; MUFA, ácidos graxos mono-insaturados; PUFA, ácidos graxos poliinsaturados. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. n.d.: não detectado.

Foi demonstrado que o ácido 2-hidroxioléico e os seus análogos também têm um efeito hipotensivo acentuado, visto que eles induzem reduções na pressão sanguínea sistólica e diastólica, sem alterar a freqüência cardíaca (Figs. 9a, 9b e 10). O efeito hipotensivo produzido pelo ácido 2hidroxioléico e seus análogos é que ele induz uma redução na pressão sanguínea de uma forma aguda (que é evidente a partir de 2 horas de tratamento) e crônica (que é mantida por dias e semanas, enquanto o tratamento é mantido). O ácido aminoléico, por exemplo, reduz a pressão sanguínea em 15 mm de Hg em tratamentos crônicos que duram uma semana.

A pressão sanguínea é controlada por diversos sistemas de receptores ligados às proteínas G, tais como os receptores de vasopressina, os receptores adrenérgicos, etc.

A interação entre os hormônios envolvidos no controle da pressão sanguínea com os receptores ligados às proteínas G estimuladoras é modulada pela ação do ácido 2-hidroxioléico e moléculas similares.

Estes ácidos graxos regulam a comunicação entre o receptor, a proteína G e o efetor. O resultado é uma modulação dos sinais de AMP cíclico, fosfolipase C e óxido nítrico, que dá surgimento a uma redução na pres15 são sanguínea. Este efeito está também relacionado com a regulação da estrutura da membrana. A vantagem farmacológica principal do ácido 2hidroxioléico e de seus análogos é que, em contraste com outras drogas hipotensivas, eles não têm efeitos sobre a freqüência cardíaca (isto é, eles não aumentam ou diminuem significativamente a freqüência cardíaca). Uma vantagem adicional destes compostos é que eles controlam outros fatores de risco cardiovasculares: o perfil de lipídio/lipoproteína no soro e o peso do corpo (ver abaixo). Visto que o controle da pressão sanguínea não é suficiente por si só para prolongar a vida de um paciente e que é necessário controlar outros fatores de risco cardiovasculares, estes ácidos graxos são superiores às outras moléculas empregadas em pacientes com doenças cardiovasculares.

Testes Hipotensivos

O ácido 2-hidroxioléico induziu reduções significativas da pressão sanguínea em ratos (Figura 9). Estas reduções foram de uma forma aguda (em 2 horas de tratamento, 19±6 mm de Hg, P<0,01, n = 6) e de uma forma crônica (1 semana, 26±7 mm de Hg, P<0,001, n = 6). Além disso, os tratamentos agudos e crônicos de 1 mg/kg a 10 mg/kg também produziram reduções significativas na pressão sanguínea que eram dependentes da concentração.

Nos seres humanos, o ácido 2-hidroxioléico também produziu grandes diminuições significativas na pressão sanguínea, ver a Figura 9.

Além disso, os análogos do ácido 2-hidroxioléico, que concordam com a fórmula geral dada acima, tiveram um efeito hipotensivo (Figura 10). Em todos os casos, as diminuições na pressão sanguínea eram significativas, em comparação com os controles (*P<0,05, **P<0,01).

Estes resultados claramente mostram que o ácido 2hidroxioléico e os seus análogos são agentes efetivos para o tratamento clínico/farmacológico de pressão sanguínea alta.

• Um objetivo da presente invenção é demonstrar que o ácido 2hidroxioléico e os seus análogos possuem atividade como agentes que induzem reduções no peso do corpo (Figura 11).

Além da atividade antitumor e hipotensiva do ácido 2hidroxioléico e de seus análogos, eles induzem reduções no peso do corpo.

O peso do corpo é regulado por, entre outras coisas, fatores tais como a capacidade metabólica e o controle de consumo de alimento do indivíduo.

O controle do consumo de alimento é determinado pela sensação de saciedade, que, por sua vez, é regulada no nível hormonal. Por exemplo, a deficiência de nutrientes estimula a secreção de hormônios que dão surgimento a uma sensação de apetite. Após comer, assim que os níveis de nutrientes tiverem sido restaurados, há estimulação da secreção de hormônios que dão surgimento a uma sensação de saciedade.

Foi verificado que o ácido 2-hidroxioléico e os seus análogos produzem efeitos de saciedade, induzindo reduções no consumo de alimentos. Este controle é também mediado por receptores de citocinas, leptinas, adrenoceptores, e outros receptores ligados às proteínas G, cuja atividade é modulada por estes ácidos graxos.

Nos animais tratados, este efeito sobre a saciedade significava um consumo de alimento entre 15% e 30% menos do que os animais de controle.

Testes de controle do peso do corpo

Os ratos tratados com estas moléculas perderam peso do corpo durante tratamentos crônicos (de 5 a 17 dias). Nestas experiências, os ratos tratados com o ácido 2-hidroxioléico ou os seus análogos, em particular o ácido aminoléico, tiveram acesso livre ao alimento e à água, do mesmo modo como o grupo de controle de ratos tratados (Figura 11). Nestas condições, houve uma diminuição progressiva no peso do corpo dos ratos, iniciando a partir do primeiro dia de tratamento, até 17 gramas no sétimo dia de tratamento (5% do peso do corpo normal de um rato Sprague-Dowley de 2-3 meses de idade). O alimento fornecido a estes animais foi pesado e o consumo foi verificado ser menor durante o tempo de tratamento, confirmando que os tratamentos com as moléculas que se relacionam a esta invenção produzem um efeito de saciedade no animal. Experiências similares realiza17 das em camundongos adultos, por períodos de até 28 dias com o ácido 2hidroxioléico, mostram reduções no peso do corpo de 15% a 25%, em relação aos camundongos de controle (tratados com veículo).

Descrição dos Diagramas

Figura 1: Algumas das muitas estruturas, além da lamelar, que as membranas noriem adotar.

Figura 2 mostra a localização celular da proteína Gai₂ marcada com fluoresceína, em astrócitos primários do cérebro de rato. Nas células de controle, a marcação indica a presença desta proteína por toda a célula, especialmente no núcleo (seta). Nas células tratadas com o 2-hidroxioléico (2OHOA), a marcação aparece na membrana e no citossol, porém não no núcleo (seta).

Figura 3 mostra o efeito do ácido 2-hidroxioléico em marcadores moleculares de proliferação de células e morte de células. A parte A mostra o efeito do ácido 2-hidroxioléico (2OHOA) sobre as proteínas do ciclo celular cdk2, ciclina B e ciclina D3 nas células de câncer de pulmão humano A549. A diminuição nestas proteínas mostra que este ácido graxo induz a interrupção do ciclo celular, isto é a interrupção da divisão das células. A parte B mostra o efeito do ácido 2-hidroxioléico (2OHOA) sobre a proteína p21 nas células A549, após a incubação por 24 e 48 horas. A proteína p21 inibe o ciclo das células, de modo que ela é uma proteína antiproliferativa. O grande aumento que o ácido 2-hidroxioléico induz sobre esta proteína explica a interrupção do ciclo e da proliferação de células de tumor. A parte C mostra a degradação da poli-ADP ribose polimerase (PARP) em células de leucemia humana (Jurkat) (Etoposida: 25 [E1] e 250 μΜ [E2]; ácido 2-hidroxioléico: 10 [01], 100 [02] e 1000 μΜ [03]). A diminuição nos níveis desta enzima, ou a evidência de sua degradação, indica o início de apoptose ou morte programada da célula. Nestas experiências, a Etoposida foi usada como o controle positivo, visto que esta molécula é conhecida ser uma indutora de apoptose e um agente antitumor.

Figura 4 mostra o efeito do ácido 2-hidroxioléico e de seus análogos sobre a proliferação das células de câncer de pulmão humano A549 (A) e das células Jurkat de leucemia humana (B). Tanto o ácido 2hidroxioléico (2OHOA) quanto os seus análogos, todos os quais concordam com a fórmula dada anteriormente, induzem a interrupção da divisão e a morte das células de tumor (OA: ácido oléico; VA: ácido cis-vacênico; POA: ácido palmitoléico; NA: ácido nervônico; 2MOA: ácido 2-metil oléico; 2NOA: ácido 2-amino oléico).

Figura 5 mostra a ligação de [³⁵S]GTPyS às membranas das células de 3T3 NIH transfectadas com o adrenoceptor de rato cí2a/d· Este parâmetro mede a atividade das proteínas G. A presença de 2-hidroxioléico induz uma diminuição na função das proteínas G ainda maior do que a antraciclina daunomicina (DNM). As antraciclinas são drogas antitumor potentes, portanto o 2-hidroxioléico é potencialmente mais efetivo contra os tumores. Os análogos de 2-hidroxioléico produzem um efeito similar àquele do ácido 2-hidroxioléico.

Figura 6: O ácido hidroxioléico e os seus análogos não tiveram nenhum efeito sobre as proteínas G puras (na ausência de membrana). Isto mostra que o seu efeito sobre a atividade das proteínas G é mediado pela regulação das estruturas das membranas não-lamelares. A daunomicina (DNM) teve um comportamento similar ao controle.

Figura 7: Níveis de proteínas G em membranas de eritrócitos de pacientes normotensos (barras vazias) e pacientes hipertensivos (barras enchidas). Os níveis de proteínas Gaii/₂ (Gi), Goto (Go), Gas (Gs) e G ΰβ (Gb) são significativamente menores em pacientes hipertensivos. Os valores das barras são os valores médios ± erro-padrão da média *P < 0,05, **P < 0,01.

Figura 8 mostra as metástases no cérebro (tumores) formadas a partir de um adenocarcinoma de pulmão. A imagem na esquerda (8a) corresponde aos tumores antes do tratamento e aquelas na direita (8b, 8c e 8d) correspondem aos tumores após o tratamento com o 2-hidroxioléico em diversas datas. Conforme pode ser visto, um dos tumores desapareceu mais rapidamente e o outro mais lentamente.

A Figura 9a mostra o efeito agudo (2 horas, barras pretas) e o efeito crônico (3 injeções diárias por 7 dias, barras brancas) do ácido hidroxioléico (30 mg/kg) sobre a pressão arterial sistólica em ratos SpragueDowley. As doses menores desta molécula (1-10 mg/kg) produziram efeitos similares, porém menos marcados. *P < 0,01.

A Figura 9b mostra o efeito do ácido 2-hidroxioléico (30 mg/kg) sobre a pressão sanguínea em seres humanos. Este diagrama mostra a pressão arterial sistólica como uma função do dia de tratamento. Os dias antes do tratamento são mostrados com valores negativos. *P < 0,05, **P < 0,01.

A Figura 10 mostra o efeito dos tratamentos agudos com o ácido 2-hidroxioléico (2OHOA) e os seus análogos, o ácido 2-metil oléico (2MOA), o ácido oléico (OA), o ácido palmitoléico (POA), o ácido cis-vacênico (VA) e o ácido nervônico (NA). Todos os tratamentos realizados com o ácido 2hidroxioléico e os análogos, que concordam com a fórmula geral dada acima, induziram diminuições significativas (*P < 0,05, **P < 0,001) na pressão arterial sistólica em ratos Sprague-Dowley.

A Figura 11 mostra o efeito do ácido 2-hidroxioléico (OHOA) e de seus análogos, o ácido oléico (OA) e o ácido palmitoléico (POA), sobre o peso do corpo (3 injeções diárias de 30 mg/kg). Os animais (ratos SpragueDowley) tiveram acesso livre ao alimento e à água em qualquer tempo.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uso dos compostos de fórmula geral I: COOH-CHR-(CH₂)_mCH=CH-(CH₂)_n-CH3, onde R é OH ou NH₂, m e n têm, independentemente, um valor entre 0 e 15; ou de sais farmaceuticamente aceitáveis dos mes5 mos; caracterizado pelo fato de ser na manufatura de drogas e formas farmaceuticamente aceitáveis, para o tratamento de câncer.
2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os compostos de fórmula geral I têm entre 12 e 28 átomos de carbono.

10 3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que os compostos de fórmula geral I são o ácido 2-hidroxioléico, e o ácido 2-amino-oléico.

1/10

Fosfolipídeo

Fosfodidipcolina

Lisofosfatidilcolina

Fasdatidiletanomina

Forma Organização i

i

I

Lamelar (L)

Hexagonai (H,)

Hexagonal (H„)