JP4737931B2 - 医薬品の製造におけるヒドロキシオレイン酸及び類似化合物の使用 - Google Patents

Description

本発明は、抗腫瘍剤としての、血圧低下活性のある薬剤としての、及び体重の減少を引き起こすための薬剤としての、ヒドロキシオレイン酸（２−ヒドロキシオレイン酸）及び類似構造の分子の使用に関する。

また、本発明は、膜構造を制御し、Ｇタンパク質の活性及び／又は局在化を制御し、膜構造の調節を介してＧタンパク質に結合している受容体の活性を制御するための、２−ヒドロキシオレイン酸及び類似化合物の使用に関する。

また、本発明は、癌治療を対象とした薬物、心血管疾患を治療するための薬物並びに体重及び肥満の問題を治療するための薬物を製造するための、２−ヒドロキシオレイン酸及び類似化合物の使用に関する。

脂肪酸は、食品と工業の双方において応用範囲の広い分子である。２−ヒドロキシオレイン酸は、すでにその合成が報告されており（Ａｄａｍ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、９巻、２０１３〜２０１８ページ、１９９８年）、化粧品を調製するための乳化剤として工業的に用いられている。

例えば、一方では、特許ＪＰ１０１８２３３８は、低い被刺激性及び塩との高い相容性を示し、［Ａ］ポリオキシエチレンソルビトールモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート及びポリオキシエチレンソルビトールモノステアレートなどの非イオン性界面活性剤、［Ｂ］２−ヒドロキシステアリン酸などの２−ヒドロキシＣ１０〜Ｃ２２脂肪酸、［Ｃ］油及び［Ｄ］水を含有し、比Ａ／Ｂが１：０．０１〜１：２である水中油乳化組成物に関する。

また、特許ＪＰ０９１１０６３５は、薬剤製品、化粧品及び食品として使用することが可能であり、［Ａ］ポリグリセリル脂肪酸のエステル、［Ｂ］２−ヒドロキシＣ１０〜Ｃ２２脂肪酸、［Ｃ］油及び［Ｄ］水を含有し、重量比Ａ／Ｃ及びＢ／Ｃがそれぞれ２．０及び０．５であり、１０〜３００ｎｍの平均粒径を有する組成物に関する。これらの組成物は、たとえ酸性条件もしくは低粘度であっても、又は多量の塩が存在しても良好な安定性を示すため、皮膚に適合する。

一方、この脂肪酸は、オレアミド加水分解酵素の阻害剤としても用いられ、その作用は、この物質の睡眠誘導効果に伴うものである（特許ＵＳ６０９６７８４及びＷＯ９７４９６６７）。

例えば、特許ＵＳ６０９６７８４は、睡眠誘導脂質（ｃｉｓ−９−オクタデセナミド）の加水分解を担うオレアミド加水分解酵素阻害剤の設計及び合成に関する。最も強力な阻害剤は、（チオ）ヘミアセタール又はシステイン型もしくはセリン型のプロテアーゼによって触媒される反応の遷移状態を模倣するための（チオ）ヘミアセタールを可逆的に形成することができる求電子性カルボニル基を有する。阻害活性に加え、一部の阻害剤は、実験動物で睡眠を誘導するアゴニスト活性を示した。

六方晶膜構造
膜脂質は、タンパク質及び核酸に比べてより多くの二次構造をとることができる。生体膜の典型的な脂質二重層は、これらの二次的立体配置の一つに過ぎない。生細胞におけるその他の二次構造の存在度及び役割についてはほとんど知られていない。これらの構造の一機能、すなわち膜に対するＧタンパク質の結合親和性を増加させる機能は、発明者他による以前の研究に記載されている（Ｅｓｃｒｉｂａ ＰＶ、Ｏｚａｉｔａ Ａ、Ｒｉｂａｓ Ｃ、Ｍｉｒａｌｌｅｓ Ａ、Ｆｏｄｏｒ Ｅ、Ｆａｒｋａｓ及びＧａｒｃｉａ−Ｓｅｖｉｌｌａ ＪＡ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＵＳＡ、９４巻、１１３７５〜１１３８０ページ、１９９７年）。

膜構造という概念は、膜の流動性のみが記述されている現況技術についての一部の特許（ＷＯ８７／０４９２６及びＷＯ８０／１１２８６）に記載されている概念をはるかに超え、その概念は、もっと広い分野、すなわち膜構造に広がっている。我々の特許に包含される分子は、層状構造から六方晶構造への遷移又は経過に対して作用する（図１）。

引用した従来技術を調べてみても、現況技術には、癌治療、心血管疾患及び／又は体重の管理の領域に特に関心を向けていると思われる２−ヒドロキシオレイン酸又は類似の化合物と結びつく他の応用例は存在しない。

脂肪酸、特にオレイン酸及びパルミオレイン（ｐａｌｍｉｏｌｅｉｃ）酸などの本発明に記載の一部の脂肪酸が含まれる様々な化合物の複雑な混合物からなる食品（ＧＢ２１４０６６８、ＥＰ０６１１５６８及びＷＯ０２／００４２）又はＭ．ｃｒｙｏｐｈｉｌｕｓの培養液からの抽出物（ＷＯ８９／１１２８６）、及び動脈性高血圧の治療における、肥満を管理するための、又は抗腫瘍剤としてのこれらの混合物の使用についての記載があるに過ぎず、前記治療効果における具体的役割を、本発明で考慮に入れられた混合物の成分のいずれかによるものとは見ていない。ＷＯ０２／０５１４０６及びＷＯ９４／０１１００のみが、現況技術に記載の前記脂肪酸を用いる場合に限って、本発明の目的ではない前立腺癌の治療における特定の脂肪酸（Ｃ_１４〜Ｃ_２０）の使用について記載している。

本発明は、現況技術に記載の化合物とは無関係の２−ヒドロキシオレイン酸及び類似化合物の新たな用途を見いだすという目的を有する。

本発明の第一の目的は、２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体が、抗腫瘍剤としての活性を有することを示すことである。

本発明の第二の目的は、２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体が、血圧低下剤としての活性を有することを示すことである。

本発明の第三の目的は、２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体が、体重の減少を引き起こす薬剤としての活性を有することを示すことである。

本発明の第四の目的は、２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体が、細胞膜の層状構造から六方晶構造への遷移を制御するための薬剤としての用途を有することを示すことである。この膜構造の調節は、Ｇタンパク質、並びにそれらの伝達経路、すなわちシグナル伝搬経路の分子成分の活性に影響する。多数の薬物が、このタイプの分子、又はそれらの活性に由来する細胞シグナルに結びつく機構との直接相互作用により、Ｇタンパク質に結合している受容体に作用する。しかしながら、２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体は、膜構造に作用する。

２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体について後述する用途は、これまで誰によっても言及されたことはなく、それらの使用は、特定の病状の治療に有効であると立証される可能性がある。特に、２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体は、抗腫瘍活性、血圧低下（すなわち抗高血圧）活性を示し、体重の減少を引き起こすことが見いだされた。

本発明では、２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体の新たな用途を、実験モデル、特にｉｎ ｖｉｔｒｏ分析の系、細胞培養系及び生体を用いて実証する。これらの分析モデルはすべて、２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体が、Ｇタンパク質に関係するシグナルの制御に基づき、癌治療のため、心血管疾患の治療のため、及び体重と肥満の問題、並びに膜構造の層状から六方晶への遷移によって媒介される他の疾患又は欠乏状態にある対象を治療するための薬物を製造するために使用することができる分子であることを示すことは間違いない。

発明を実施するための形態

本発明では、「２−ヒドロキシオレイン酸」とは、α−ヒドロキシオレイン酸、オクタデセン酸Ｃ１８：１ｃｉｓΔ９すなわちｃｉｓ−２−ヒドロキシ−９−オクタデセン酸を意味する。「類似体」とは、中心帯から１又は２位シフトした二重結合を有し、かつ／又は中心帯から１〜５位シフトした二重結合を有し、かつ／又は二重結合の両側に１から約６個までの炭素原子（ＣＨ_２基）を有し、かつ／又はＯＨと異なる小さな原子質量（２００Ｄａ以下のＭｗ）の残基（Ｒ）を２位に有する脂肪酸を意味する。Ｒ基の投影に対応する立体異性体は、ＲとＳのどちらであってもよい。様々な被験分子に関して、以下に示す一般式を有する分子が、ヒドロキシオレイン酸に類似するいくつかの効果を示し、したがってその類似体として分類できることが観察された。

一般式Ｉ：ＣＯＯＨ−ＣＨＲ−（ＣＨ_２）_ｍ−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＨ_３（式中、ｍ及びｎは独立して０〜１５の値を有し、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、ＣＨ_３又は分子量が２００Ｄａ以下である他の残基であってもよい）。

本発明では、「Ｇタンパク質」とは、３個のサブユニット（１個のアルファ、１個のベータ及び１個のガンマ）から形成されるグアニンヌクレオチド結合タンパク質であり、Ｇタンパク質に結合している受容体からのシグナルをエフェクター（アデニリルシクラーゼ、グアニリルシクラーゼ、ホスホリパーゼＣ、イオンチャネルなど）に送るタンパク質を意味する。

本発明では、「膜構造」とは、天然膜又は合成膜（リポソーム）における脂質の二次構造又は配置を意味する。

本発明では、「急性効果」とは、薬物の単回投与後数分から数時間の間にもたらされる効果を意味する。

本発明では、「慢性効果」とは、薬物を数日から数週間連続投与する間にもたらされる効果を意味する。

本発明では、「薬剤として許容可能な形態」とは、本分野で日常的に使用される任意の形態を意味し、エステル、特に脂肪酸の可溶化剤としての特性からエチルエステル、エーテル、アミド、塩などが含まれるが、これらに限定されるものではない。

本発明の一目的は、細胞膜の層状構造から六方晶構造への遷移を制御する際の２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体の用途である。この現象の分子的機序は、２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体の膜との相互作用並びに膜組成及び／又は膜構造の変調にある（表１及び２）。

表１は、ジエライドイル（ｄｉｅｌａｉｄｏｙｌ）ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）の膜における層状構造から六方晶構造への遷移温度を示している。対照値（２−ヒドロキシオレイン酸がない場合）は６３℃である。２−ヒドロキシオレイン酸（２ＯＨＯＡ）によって引き起こされる低下（濃度依存的）は、この分子が非層状構造の存在を安定化することを示している。この細胞膜の重要な改変は、分子及び細胞機能にとって重要な結果を有している。治療活性を有する２−ヒドロキシオレイン酸の被験類似体もすべて、膜構造に対する効果を引き起こす（表２）。

層状非層状遷移の変調は、Ｇタンパク質の活性を調節する。
ヒドロキシオレイン酸及び関連化合物は、［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳの結合によって測定されるＧタンパク質の活性を変調することができる（図５）。

これは、共焦点顕微鏡の写真に示されるように、これらの分子が、Ｇタンパク質の膜との相互作用及びＧタンパク質の細胞局在化に影響するためである（図２）。Ｇタンパク質の局在化及び活性に対する２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体の効果は、Ｇタンパク質に対する直接相互作用のためではない。図６は、膜の非存在下、精製されたＧタンパク質の活性に対するこれらの分子が効果を示している。Ｇタンパク質が膜と結合している場合に起きることとは対照的に、ダウノマイシン（ＤＮＭ）及びヒドロキシオレイン酸（２ＯＨＯＡ）、並びにヒドロキシオレイン酸の類似体は、これらのタンパク質（Ｇタンパク質に結合している受容体と膜内で接触した場合にのみ活性化される）の活性に影響しない。

Ｇタンパク質に結合している受容体は、至る所に存在し、膜受容体の８０％を占め、神経伝達物質、ホルモン、神経調節物質、サイトカイン、増殖因子などによって惹起されるシグナルを伝達する。他の生理学的プロセスの中でも、Ｇタンパク質は、血圧、細胞の成長及び増殖、並びに体重を調節する。したがって、本発明に記載の分子は、前述の生理学的プロセスを調節することができる。

−膜構造に対する試験−
膜構造を研究するのに最も効果的かつ強力な技法は、Ｘ線回折／散乱である。この技法を用い、我々は、２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体により膜の構造が変化することを立証した。層状構造から六方晶構造への遷移温度の低下は、膜における脂質分子の配置に対する重要な効果を示している。この配置の調節は、２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体によって発揮される効果の根幹を成している。一般式を満たす被験類似体はすべて、細胞増殖（癌における有効性）、血圧（心血管プロセスにおける有効性）及び体重（肥満における有効性）の膜変調及び制御の活性を有している。

本発明の目的は、２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体が抗腫瘍剤としての活性を有することを立証することである。

初めに、細胞周期は、細胞表面上の特異的受容体に結合する増殖因子によって制御される。前記増殖因子の受容体との結合は、サイクリンと呼ばれ、細胞周期に関係するタンパク質と二量体複合体を形成する有糸分裂キナーゼ（ｃｄｋ）を活性化することを目的とする反応のカスケードを引き起こす。ｃｄｋ／サイクリン複合体は、細胞周期及びその進行の段階を調節し、有糸分裂及び細胞分裂を引き起こす。

細胞表面上の多くの特異的受容体がＧタンパク質と結合しているため、増殖因子が受容体と相互作用した場合、Ｇタンパク質が活性化され、前述の反応カスケードの引き金となる。

したがって、Ｇタンパク質の局在化及び活性の変調は、細胞増殖及び細胞分裂を制御することを可能にするはずである。

２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体の抗腫瘍効果に関係する機序は、それらの化合物が、Ｇタンパク質及びプロテインキナーゼＣ又は小さなＧタンパク質（Ｒａｓ型、Ｒａｆ型などの）などの他の末梢性タンパク質の局在化及び活性の変調を引き起こすという事実に基づいている。この変調は、膜脂質の構造の調節に関係がある。

２−ヒドロキシオレイン酸が、Ｇタンパク質の核への転位の阻害剤として作用することを見いだした（図２）。このように、タンパク質ｐ２１のレベルの明らかでかつ顕著な増加並びに細胞周期タンパク質ｃｄｋ２及びサイクリンＢ及びＤ３の減少によって裏付けられたように、細胞増殖の阻害が行われる（図３Ａ及びＢ）。さらに、培養中の細胞において、２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体が、プロテインキナーゼＣの顕著な増加（４０％から１２０％の増加）を引き起こすことが観察された。

Ｇタンパク質の細胞内局在化のこの変化は、癌の治療に広く使用されている薬物ダウノマイシンによってもたらされる変調よりも大きな変調をＧタンパク質の機能にもたらす。これらの変化は、腫瘍細胞の増殖及び生存に対する重要な阻害効果を有している（図４）。

細胞周期の重要な制御因子は、タンパク質ｐ５３であり、Ｇ１（有糸分裂前の段階）のレベルで細胞分裂を減速することにより負の制御を行っている。このタンパク質は、ＤＮＡの変化が現れるのに反応して細胞自身により合成される。複製されたＤＮＡが娘細胞に対して負に影響する可能性がある場合、ｐ５３は活性化され、アポトーシス（プログラム細胞死）を引き起こす。前記タンパク質ｐ５３の活性化は、ｐ２１、ｐ２７、ｐ１６などの、サイクリン及びｃｄｋ（細胞周期のプロセスに関与している）の活性／発現を阻害する調節タンパク質をコードする他の遺伝子が発現されることを意味する。

多くのタイプの腫瘍細胞において、ｐ５３タンパク質は、変異を受けかつ／又は不活性であるように見え、形質転換（癌性）細胞の増殖が起きる。細胞における２−ヒドロキシオレイン酸及び／又はその類似体の存在は、ｐ５３に関係するシグナル経路の活性化を引き起こし、様々なタイプの腫瘍細胞においてアポトーシスの開始又は細胞周期の停止を引き起こす。本発明の第一の目的を行うため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのモデルを用いた。この点について、２−ヒドロキシオレイン酸及び前述の式Ｉを満たす構造類似体はすべて、かなりの抗腫瘍能力を有することが判明した。２−ヒドロキシオレイン（２−ヒドロキシ−ｃｉｓ−９−オクタデセン）酸の類似体である被験分子は、２−メチル−オレイン（２−メチル−ｃｉｓ−９−オクタデセン）酸、２−アミノ−オレイン（２−アミノ−ｃｉｓ−９−オクタデセン）酸、オレイン（ｃｉｓ−９−オクタデセン）酸、パルミトレイン（ｃｉｓ−９−ヘキサデセン）酸、ｃｉｓ−バクセン（ｃｉｓ−１１−オクタデセン）酸及びネルボン（ｃｉｓ−１５−テトラコセン）酸とした。これらの分子は、細胞増殖を停止させ、又は様々なタイプの腫瘍細胞（例えば、ヒト肺癌細胞Ａ５４９、ジャーカットＴリンパ球など）の死を引き起こすことが分かった（図４）。これらの結果は、記載した脂肪酸の抗腫瘍活性を立証し、２−ヒドロキシオレイン酸の基本構造に小さな変形があっても、その抗腫瘍活性は変化しないことを示している。

他の分子モデルにより、我々は、２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体が、他の抗腫瘍薬、例えばアントラサイクリンが示す活性よりも高い抗腫瘍活性を有し、したがって治療上極めて興味のある化合物であることを裏付けることができた。３Ｔ３線維芽細胞の膜において、我々は、２−ヒドロキシオレイン酸及び／又はオレイン酸（２−ヒドロキシオレイン酸の類似体の一つ）２００μＭの存在が、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞におけるＧタンパク質の活性に７５〜８４％の阻害をもたらすのに対して、ダウノマイシン２００μＭは、前記活性に４６％の阻害を引き起こすことを証明することに成功した（図５）。

２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体オレイン酸の抗腫瘍効果を図８に示すが、この図において、我々は、２−ヒドロキシオレイン酸による処理後に、肺腺癌から形成される一部の脳腫瘍転移の消失を認めることができる。この２−ヒドロキシオレイン酸及びオレイン酸による処理は、癌の完全な消失を引き起こした。これらの結果は、（ａ）２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体は、癌を治療することを目的とする薬物を製造するために用いることができる分子であること；（ｂ）それらは広範囲な作用を有していること（それらは、培養及び生体において様々タイプの腫瘍細胞に対して有効であった）及び（ｃ）それらは、抗腫瘍効力の点、副作用が存在しない点、及び経口投与されるが、静脈内又は皮下投与も可能である点において、癌を治療するために用いられる他の分子より優れていることを証明している。

−抗腫瘍試験−
ヒドロキシオレイン酸の抗増殖効果をヒト肺癌細胞Ａ５４９及びヒト白血病細胞（ジャーカット）において証明した。図３は、腫瘍細胞が分裂するために必要なタンパク質ｃｄｋ２、サイクリンＢ及びサイクリンＤ３の減少に伴う抗増殖性タンパク質ｐ２１の誘導を示している。同様の効果が、前述の一般構造式を満たす被験類似体すべてによって生じた。２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体のこの抗増殖効果は、培養液における腫瘍細胞の細胞密度の低下によって立証された（図４）。また、この抗増殖効果は、他の技法及び他の細胞タイプを用いても観察され、ラット一次星状細胞において、これらの脂肪酸は抗増殖効果を有し、トリチウム化チミジンの取り込みによって試験した。さらに、ヒドロキシオレイン酸及びその類似体は、ヒト癌細胞においてアポトーシスすなわちプログラム細胞死を引き起こすことができる。一方ではＰＡＲＰの分解が（図３Ｃ）、他方では細胞形態の変化及び細胞残渣の存在が（図４）、細胞死の誘導物質としての２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体の効果を証明している。フローサイトメトリー実験を用いることにより、２−ヒドロキシオレイン酸の存在下で生きているヒト白血病細胞（ジャーカット）の数は、知られている抗腫瘍剤エトポシドにより生存し続ける細胞の１０％に過ぎないことが立証された。

最後に、ヒトにおける効果の検討により、２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体が、極めて重要な抗腫瘍剤のファミリーを構成する可能性が明らかにされた。図８は、ヒトにおける腫瘍に対する２−ヒドロキシオレイン酸及びオレイン酸による治療の効果を示している。示した症例は、これまでに行われた化学療法及び放射線療法が脳腫瘍の減少を生じなかった女性患者に該当する。

本発明の目的は、２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体が、血圧低下活性を持つ薬剤であることを証明することである。

Ｇタンパク質の活性の調節は、血圧を制御する
本発明の薬物とＧタンパク質の活性と血圧の間には関連性がある。以前に記載したことを裏付ける結果は、ヒトで行われた研究であるが、高血圧患者に膜脂質のレベルに変化があることが認められた（表３）。膜脂質は層状−六方晶遷移に影響し、さらにＧタンパク質の局在化及び機能を決定する。実際、高血圧患者において、我々は、膜に結合しているＧタンパク質のレベルに、前述した膜脂質の変化及び六方晶相形成のしやすさに起因する変化を観察している。非層状膜構造の変調及び結果として生じるＧタンパク質の再局在化が高血圧を引き起こすのであれば、膜脂質の層状−六方晶遷移を調節することにより、膜タンパク質の局在化及び、最終的には血圧の調節を行うことが可能である（図７）。

２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体が、心拍数を変化させることなく収縮期及び拡張期血圧の低下を引き起こすことから、それらが顕著な血圧低下作用も有していることが立証された（図９ａ、９ｂ及び１０）。２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体によって生じる血圧低下作用は、急性型（治療の２時間から明瞭に認められる）及び慢性（治療を持続する間、数日間及び数週間維持される）の血圧低下を引き起こすことである。例えば、アミノオレイン酸は、１週間続く慢性治療において血圧を１５ｍｍＨｇ低下させる。

血圧は、バソプレッシン受容体、アドレナリン受容体などの、Ｇタンパク質と結合している受容体の様々な系によって制御されている。

血圧の制御に関与しているホルモンと刺激性のＧタンパク質に結合している受容体との相互作用は、２−ヒドロキシオレイン酸及び類似の分子によって変調される。

これらの脂肪酸は、受容体、Ｇタンパク質とエフェクター間の連絡を調節する。その結果は、サイクリックＡＭＰ、ホスホリパーゼＣ及び一酸化窒素のシグナルの変調であり、血圧の低下を引き起こす。また、この効果は、膜構造の調節とつながりがある。２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体の主な薬理学的利点は、他の血圧降下薬とは対照的に、心拍に影響を持たない（すなわち、心拍数を著しく減少又は増加させない）ことである。これらの化合物のさらなる利点は、他の心血管系危険因子、すなわち血清脂質／リポタンパク質プロフィール及び体重（下記参照）を制御することである。血圧の管理は、それだけで患者の寿命を延ばすには不十分であり、他の心血管系危険因子を制御することが必要であることから、これらの脂肪酸は、心血管疾患のある患者で用いられる他の分子よりも優れている。

−血圧降下試験−
２−ヒドロキシオレイン酸は、ラットにおいて血圧の有意な低下を引き起こした（図９）。これらの低下は、急性型（治療２時間で１９±６ｍｍＨｇ、Ｐ＜０．０１、ｎ＝６）及び慢性型（１週間、２６±７ｍｍＨｇ、Ｐ＜０．００１、ｎ＝６）であった。さらに、１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇまでの急性及び慢性治療も、濃度依存性である血圧の有意な低下を引き起こした。

ヒトにおいても、２−ヒドロキシオレイン酸は、血圧の有意かつ大きな低下を引き起こした。図９を参照。

さらに、前述の一般式を満たす２−ヒドロキシオレイン酸の類似体は、血圧低下作用を有していた（図１０）。すべての場合において、血圧の低下は対照に比較して有意であった（^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１）。

これらの結果は、２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体が高血圧の臨床／薬理学的治療に有効な薬剤であることを明確に示している。

本発明の目的は、２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体が、体重の減少を引き起こす薬剤としての活性を有することを立証することである（図１１）。

２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体の抗腫瘍及び血圧低下活性の他に、それらは、体重の減少を引き起こす。

体重は、とりわけ個々の代謝能及び食物摂取量の制御などの因子によって調節される。

食物摂取量の制御は、ホルモンレベルで調節される満腹感によって決定される。例えば、栄養素の欠乏は、ホルモンの分泌を刺激し、食欲感を引き起こす。摂食後に栄養素が回復すると、満腹感を引き起こすホルモンの分泌が刺激される。

２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体は、満腹の効果を生じ、食物摂取量の減少を引き起こすことが見いだされた。また、この制御は、サイトカイン、レプチン、アドレナリン受容体、及びこれらの脂肪酸によって活性が変調されるＧタンパク質と結合している他の受容体によって媒介される。

処置動物では、満腹に対するこの効果は、対照動物に比べて１５％から３０％飼料の消費が少ないことを意味した。

−体重制御の試験−
これらの分子で処置したラットは、慢性治療中（５〜１７日）に体重が減った。これらの実験では、２−ヒドロキシオレイン酸又はその類似体、特にアミノオレイン酸で処置したラットには、処置ラットの対照群と同様、飼料と水を自由に与えた（図１１）。これらの条件で、処置の初日から始まり、処置の７日目には１７グラム（２〜３月齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄｏｗｌｅｙラットの正常体重の５％）までラットの体重に漸進的減少が認められた。これらの動物に供給した飼料の重さを量ると、処置期間中は消費が低いことが判明し、本発明に関連する分子による処置は、動物に満腹の効果を生じることを裏付けた。２−ヒドロキシオレイン酸を用い、成体マウスに対して２８日までの期間行った同様の実験は、対照マウス（溶媒で処置）に比べ、１５％から２５％の体重の減少を示す。

層状の他に、膜がとり得る多くの構造の一部を示す図である。 ラット脳の一次星状細胞におけるフルオレセインで標識したＧαｉ_２タンパク質の細胞局在化を示す図である。対照細胞では、標識化が、このタンパク質が細胞全体、特に核（矢印）内に存在していることを示す。２−ヒドロキシオレイン酸（２ＯＨＯＡ）で処理した細胞では、標識化が、膜及びサイトゾル中に見られるが、核（矢印）内には見られない。 細胞増殖及び細胞死の分子マーカーにおける２−ヒドロキシオレイン酸の効果を示す図である。パートＡは、ヒト肺癌細胞Ａ５４９における細胞周期タンパク質ｃｄｋ２、サイクリンＢ及びサイクリンＤ３に対する２−ヒドロキシオレイン酸（２ＯＨＯＡ）の効果を示している。これらのタンパク質の減少は、この脂肪酸が細胞周期の停止、すなわち細胞分裂の停止を引き起こすことを示している。パートＢは、２４及び４８時間インキュベートした後のＡ５４９細胞におけるｐ２１タンパク質に対する２−ヒドロキシオレイン酸（２ＯＨＯＡ）の効果を示している。タンパク質ｐ２１は細胞周期を阻害するため、抗増殖性タンパク質である。このタンパク質に対して２−ヒドロキシオレイン酸が引き起こす大きな増加は、周期及び腫瘍細胞の増殖の停止を説明している。パートＣは、ヒト白血病細胞（ジャーカット）におけるポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の分解を示している（エトポシド：２５［Ｅ１］及び２５０μＭ［Ｅ２］；２−ヒドロキシオレイン酸：１０［Ｏ１］、１００［Ｏ２］及び１０００μＭ［Ｏ３］）。この酵素のレベルの低下、すなわちその分解の跡は、アポトーシスすなわちプログラム細胞死の開始を示している。これらの実験で陽性対照としてエトポシドを使用したのは、この分子がアポトーシスの誘導物質及び抗腫瘍剤として知られているためである。 ヒト肺癌細胞Ａ５４９（Ａ）及びヒト白血病のジャーカット細胞（Ｂ）の増殖に対する２−ヒドロキシオレイン酸及びその類似体の効果を示す図である。２−ヒドロキシオレイン酸（２ＯＨＯＡ）と、すべてが前述の式を満たしているその類似体は共に、腫瘍細胞の分裂停止及び死を引き起こす（ＯＡ：オレイン酸；ＶＡ：ｃｉｓ−バクセン酸；ＰＯＡ：パルミトレイン酸；ＮＡ：ネルボン酸；２ＭＯＡ：２−メチルオレイン酸；２ＮＯＡ：２−アミノオレイン酸）。 ラットアドレナリン受容体α_２Ａ／Ｄが形質移入されたＮＩＨ ３Ｔ３細胞の膜に対する［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳの結合を示す図である。このパラメータは、Ｇタンパク質の活性を測定している。２−ヒドロキシオレイン酸の存在は、アントラサイクリンであるダウノマイシン（ＤＮＭ）に比べ、より大きなＧタンパク質の機能の低下を引き起こす。アントラサイクリン類は、強力な抗腫瘍薬であることから、２−ヒドロキシオレイン酸は、腫瘍に対しより有効な可能性がある。２−ヒドロキシオレイン酸の類似体は、２−ヒドロキシオレイン酸の効果と類似の効果を生じる。 ヒドロキシオレイン酸及びその類似体は、純粋なＧタンパク質（膜の非存在下）に対して影響しないことを示す図である。このことは、Ｇタンパク質の活性に対する効果が非層状膜構造の調節によって媒介されていることを示している。ダウノマイシン（ＤＮＭ）は、対照に類似した挙動をした。 正常血圧の被験者（空棒（ｅｍｐｔｙ ｂａｒ））及び高血圧被験者（充満棒（ｆｉｌｌｅｄ ｂａｒ））の赤血球の膜におけるＧタンパク質のレベルを示す図である。タンパク質Ｇαｉ_１／２（Ｇｉ）、Ｇαｏ（Ｇｏ）、Ｇαｓ（Ｇｓ）及びＧ Ｇβ（Ｇｂ）のレベルは、高血圧被験者において有意に低かった。棒の数値は、平均値±平均値の標準誤差である^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。 肺腺腫から形成される脳転移（腫瘍）を示す図である。左の画像（８ａ）は治療前の腫瘍に相当し、右の画像（８ｂ、８ｃ及び８ｄ）は、２−ヒドロキシオレイン酸による治療後の様々な日付における腫瘍に相当する。図に示すように、腫瘍のうち一つはより速やかに消失し、他の一つはゆっくりと消失した。 Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄｏｗｌｅｙラットにおける収縮期動脈圧に対するヒドロキシオレイン酸（３０ｍｇ／ｋｇ）の急性効果（２時間、黒棒）及び慢性効果（１日３回７日間の注入、白棒）を示す図である。より低用量のこの分子（１〜１０ｍｇ／ｋｇ）は、同様の効果を生じたが、顕著ではなかった。^＊Ｐ＜０．０１。 ヒトにおける血圧に対する２−ヒドロキシオレイン酸（３０ｍｇ／ｋｇ）の効果を示す図である。この図は、収縮期動脈圧を治療日数の関数として示している。治療前の日数は負の数値で示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。 ２−ヒドロキシオレイン酸（２ＯＨＯＡ）及びその類似体２−メチルオレイン酸（２ＭＯＡ）、オレイン酸（ＯＡ）、パルミトレイン酸（ＰＯＡ）、ｃｉｓ−バクセン酸（ＶＡ）及びネルボン酸（ＮＡ）による急性治療の効果を示す図である。２−ヒドロキシオレイン酸及び前述の一般式を満たす類似体を用いて行われた治療はすべて、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄｏｗｌｅｙラットにおける収縮期動脈圧に有意な低下（^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００１）を引き起こした。 体重に対する２−ヒドロキシオレイン酸（２ＯＨＯＡ）並びにその類似体、オレイン酸（ＯＡ）及びパルミトレイン酸（ＰＯＡ）（３０ｍｇ／ｋｇを１日３回注入）の効果を示す図である。動物（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄｏｗｌｅｙラット）にはいつでも食餌と水を自由に与えた。

Claims (3)

1. ２−ヒドロキシオレイン酸、２−メチル−オレイン酸又は２−アミノオレイン酸を含む、癌の治療のための、薬学的組成物。
2. ２−ヒドロキシオレイン酸又は２−メチル−オレイン酸を含む、高血圧の治療のための、薬学的組成物。
3. ２−ヒドロキシオレイン酸を含む、肥満の治療のための、薬学的組成物。

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