JP2000513361A - オレアミドヒドロラーゼ阻害剤 - Google Patents

オレアミドヒドロラーゼ阻害剤

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Abstract

(57)【要約】 内在性睡眠誘発脂質(1、シス-9-オクタデセンアミド)の加水分解に関与するオレアミドヒドロラーゼ阻害剤を設計及び合成した。最も強力な阻害剤は、セリン又はシステインプロテアーゼ触媒反応の遷移状態を擬態する(チオ)ヘミアセタール又は(チオ)ヘミケタールを可逆的に形成することが可能な求電子カルボニル基をもっている。特に、強固な結合のα-ケトエチルエステル阻害剤8(1.4nM)及びトリフルオロメチルケトン阻害剤12(1.2nM)は、例外的な阻害活性を有することがわかった。阻害活性のほかに、本阻害剤のいくつかは実験動物において睡眠誘発を引き起こすアゴニスト活性を示した。

Description

【発明の詳細な説明】 オレアミドヒドロラーゼ阻害剤発明の分野 : 本発明は、オレアミドヒドロラーゼ阻害剤及びオレアミド誘発睡眠に対するア ゴニストに関する。更に詳細には、本発明は、オレアミドヒドロラーゼに対する 阻害活性及び/又はオレアミド誘発睡眠に対するアゴニスト活性を示す遷移状態 擬態やメカニズムに基づくオレアミド誘導体に関する。発明の背景 : オレアミド(1、シス-9-オクタデセンアミド)は、睡眠奪取と睡眠回復の状態に よって各々蓄積及び消失することがわかった天然に存在する脳成分である(Crava tら，Science 1995，268，1506-1509;Lernerら，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A 1994，91，9505-9508;Cravattら，J．Am．Chem．Soc．1996，118，580-590)。 構造的に特定の方法で、１は動物においては血管内に投与した場合にナノモル量 で生理的睡眠を誘発することがわかった(Cravatら，Science 1995，268，1506-1 509)。細胞膜内に存在する酵素(オレアミド加水分解酵素)による１の加水分解は 、オレアミドをオレイン酸(シス-9-オクタデセン酸)に急速に分解する。１の内 在性濃度の制御に関与する調節物質を単離しようと努力して、内在性膜タンパク 質、オレアミドヒドロラーゼがオレアミドの加水分解による分解を触媒し、いず れも催眠活性を示さないオレイン酸(シス-9-オクタデセン酸)とアンモニアを生 じる(図３)ことがわかった(Cravatら，Science 1995，268，1506-1509)。 オレアミドヒドロラーゼは、フェニルメチルスルホニルフルオリド、4,4'-ジ チオジピリジンジスルフィド(強力なジスルフィド形成試薬)及びHgCl2(IC50=700 nM，Ki,app=37nM)で阻害されるが1mM EDTAで阻害されないことがわかった。これ により、チオールが触媒過程に密接に関係していること及びその酵素が活性部位 のシステイン残基を含むシステインアミダーゼか恐らくはセリンアミダーゼであ ることが示される。 セリン及びシステインプロテアーゼの種々の強固な結合阻害剤又は不可逆阻害 剤が記載されている。不可逆的阻害剤、例えば、ハロメチルケトン(Kettnerら， Biochemistry 1978，17，4778-4784;Kettnerら，Thromb．Res．1979，14，969-9 73;C.Giordanoら，Eur．J．Med．Chem．1992，27，865-873;Rauberら，Biochem ．J．1986，239，633-640;Anglikerら，Biochem．J．1987，241，871-875)、ミ ハエルアクセプター(Hanzlikら，J．Med．Chem．1984，27，711-712)、エポキシ ド(C．Parkesら，Biochem．J．1985，230，509-516)、O-ア ゾメチルケトン(Greenら，J．Biol．Chem．1981，256，1923-1928)並びに可逆的 遷移状態擬似阻害剤、例えば、ケトン(Mehdi，S．Bioorg．Chem．1993，21，249 -259)、アルデヒド(Westerikら，J．Biol．Chem．1972，247，8195-8197)、シク ロプロペノン(Andoら，J．Am．Chem．Soc．1993，115，1174-1175)及び電子欠損 カルボニル化合物、例えば、トリフルオロメチルケトン(Wolfendenら，Annu．Re v．Biophys．Bioeng．1976，5，271;Gelbら，Biochemistry 1985，24，1813-181 7;Imperialiら，Biochemistry 1986，25，3760-376;Koutekら，J．Biol．Chem． 1994，269，22937-22940)、α-ケト酸誘導体(Li，Z.ら，J．Med．Chem．1993，3 6，3472-3480;Harbesonら，J．Med．Chem．1994，37，2918-2929;Peetら，J．Me d．Chem．1990，33，394-407;Angelastroら，J．Med．Chem．1990，33，11-13) 及びトリカルボニル化合物(Wassermanら，J．Org．Chem．1993，58，4785-4787) が含まれる。 一方、いままでにオレアミドヒドロラーゼの唯一の恐らくは特異的阻害剤が報 告され(IC50=3μＭ，[S]=0.26Km)(Maurelliら，FEBS Lett．1995，377，82-86) 、関連脂肪酸アミダーゼの阻害剤の唯一の研究報告が開示されている(Koutekら ，J．Biol．Chem．1994，269，22937-22940)。 オレアミド加水分解を阻害するオレアミドヒドロラーゼの非常に強力な阻害剤 やオレアミド誘発睡眠アゴニストが求められている。発明の要約 : 本発明の態様は、オレアミドヒドロラーゼ阻害剤に関する。本阻害剤は、オレ アミドヒドロラーゼ内の活性部位のシステイン残基と相互作用するように設計さ れる。本阻害剤は、急速であり，選択的であり、非常に強力である(Ki=13μＭ〜 1nM)。本阻害剤は、オレアミド、睡眠誘発因子の加水分解を阻害するのに有効で ある。本阻害剤は、また、オレアミドの生物学的役割を確認する有効な手段であ る。 本阻害剤は、先端基と炭化水素末端基を含む種類を有する。先端基は、炭化水 素末端基に共有結合され、求電子カルボニルが含まれる。好ましい先端基は、下 記構造で表される基からなる群より選ばれる。 好ましい炭化水素末端基は、下記基の構造で表される基からなる群より選ばれ る。 好ましい阻害剤としては下記の化合物が含まれる。 本発明の他の態様は、オレアミド加水分解に対するオレアミドヒドロラーゼを 阻害する方法に関する。本方法は、オレアミドヒドロラーゼと阻害剤とを接触又 は結合するという作用を用いる。本阻害剤は、共有結合した先端基と炭化水素末 端基をもっている種類である。先端基としては求電子カルボニル基が含まれる。 好ましい先端基は、下記構造で表される基からなる群より選ばれる。 好ましい炭化水素末端基は、下記構造で表される基からなる群より選ばれる。 上記の方法に用いられる好ましい阻害剤としては、上記の阻害剤と更に下記の 阻害剤が含まれる。 本発明の他の態様は、オレアミド感受性動物体内で睡眠を誘発する方法に関す る。更に詳細には、本発明のその態様は、オレアミドヒドロラーゼアゴニストの 有効量をオレアミド感受性動物に投与する方法に関する。好ましいアゴニストは 、 下記構造で表される。 図面の簡単な説明: 図１は、22個のオレアミドヒドロラーゼ阻害剤を各阻害定数(Ki,app(μＭ))と 共に示す表である;オレアミドのKm=5±2μＭ。 図２は、CD3OD又はアセトン-d6中CD3OD又はD2Oの求電子カルボニルへの付加を 決定及び定量する1H NMR及び13C NMRデータを示す表である。データから阻害剤 のカルボニルの水和の程度や相対的求電子特性がわかる。予想した傾向は、11 セタールへ完全に変換され、残りの薬剤はヘミアセタール形成の減少を示し、予 想した求電子特性:11(100%)、12(100%)、8(75%)、6(48%)、及び4(47%)と一致し た。 図３は、オレアミドをオレアミドヒドロラーゼで加水分解により分解してオレ イン酸(シス-9-オクタデセン酸)とアンモニアを生じることを示す式である。 図４は、オレアミド１のオレアミドヒドロラーゼ触媒分解に対する化合物6(Mo lar)の活性のディクソンプロットを示すグラフである(1/速度(分/μＭ))。 図５は、オレアミドヒドロラーゼに対する化合物11(Molar)の影響を示すグラ フである(速度(μＭ/分/100μＬ))。 図６は、化合物12によるオレアミドヒドロラーゼ競合阻害(1/ν(分/μＭ)のラ インウィーバー・バークプロットを示す図である。 図７は、pHに対する相対速度の化合物１プロットのオレアミドヒドロラーゼ切 断のpH-速度依存性を示すグラフであり、フィットから見掛け上の活性部位pKa5. 4，9.7及び10.3が示される。最高速度はpH10.0で生じる。 図８は、a)パパイン及び他のシステイン又はセリンプロテアーゼに見られる共 通の中間体(O'Learyら，Biochemistry 1974，13，2077-2081);b)阻害剤3-15の可 能な作用様式を示す図式である。 図９は中間体と阻害剤3、6、7、8、10、24、及び26の化学合成を示す図式で ある。 図10は、α-ヒドロキシ酸18から化合物27の化学合成と図１に示されるトリフ ルオロメチルケトン阻害剤12、13、14及び15（R=C16H32-モノ不飽和炭化水素） を示す図式である。 図11は、水和した飽和化合物11の化学合成を示す図式である。 図12は、pH-速度依存性を求めるために用いられる式を示す図である。標準最 小自乗法を用いてあてはめた曲線の直線部分から速度を得た。その速度をpHに対 してプロットし、加重非直線最小自乗法により図示した式にあてはめた。発明の詳細な説明 一連の強力な遷移状態擬態やメカニズムによるオレアミドヒドロラーゼ阻害剤 2-22(図1〜図2;図9、図10及び図11)が本明細書において開示及び確認される。こ れらの阻害剤は、新しい種類の生物学的シグナリング剤の原型部分としての1(図 1)及びその調節において潜在的に重要な因子であるオレアミドヒドロラーゼの役 割を探究及び特定するのに用いうるものである。 本阻害剤の効力は、オレアミドヒドロラーゼの膜結合標品による100μＭオレ アミド(〜20Km)の加水分解の結果としてアンモニアの発生を測定するイオン選択 性電極を用いて求めた。オレアミドのKmは5±2μＭであることがわかった。阻害 定数は、ディクソン法(図4〜図6)により求めた。溶解度の制限を受けると、試験 した阻害剤全てが高濃度で100%阻害を達成することができ、阻害剤はKisの異な る２以上の別個の活性部位に特有の多様な阻害挙動を示さなかった。ほぼ同じ親 和性を有する22個の別個の阻害剤を結合する２種類以上の異なる酵素の可能性が ないので、これにより標品中の単一の酵素が観察されたオレアミドヒドロラーゼ 活性が90%より大きく関与することが強く示される。 最も強力な阻害剤(図1)は、(チオ)ヘミアセタール又は(チオ)ヘミケタールを 可逆的に形成することが可能な求電子カルボニル基をもち、セリン又はシステイ ンプロテアーゼ触媒反応の遷移状態を擬態する(図8)。本阻害剤の相対効力は、 強固な結合のα-ケトエチルエステル8(1.4nM)とトリフルオロメチルケトン12(1. 2nM)に累積している反応性カルボニルの予想した求電子特性に従うことがわかっ た。カルボニル求電子性と結合定数間の同様の相関が昆虫幼若ホルモンエ ステラーゼ(Lindermanら，Rev．Pestic．Toxicol．1991，1，261-9)やアナンダ ミナーゼ(Koutekら，J．Biol．Chem．1994，269，22937-22940)の阻害剤にも見 られた。しかしながら、そのセットの最も求電子性阻害剤であるトリカルボニル 阻害剤11は150nMで結合が相対的に不十分であった。この挙動は、かさ高いtert- ブチルエステルと酵素間のステアリン酸相互作用を脱安定化する結果であるか又 は一部には天然基質に特有でないC-3のsp2特性によるものである。 本阻害剤のカルボニルの水和と相対求電子特性の程度は、NMR分析で容易にか つ正確に評価され、予想した傾向に従うことがわかった(例えば、11>12>8> に水和された。反応性トリフルオロメチルケトンを含む残りの薬剤は、水和せず にカルボニル構造として単離された。1H NMRと13C NMRを用いてCD3OD及びアセト ン-d6中求電子カルボニルへのCD3OD又はD2Oの付加を各々決定及び定量した(図2) 。その傾向の代表例、11と12はCD3OD中でそのヘミアセタールに完全に変換され 、残りの薬剤はヘミアセタール形成の減少を示し予想した求電子特性:11(100%) 、12(100%)、8(75%)、6(48%)及び4(47%)と一致した。 トリフルオロメチルケトン12、13、14及び15は水溶液中でほとんど全部水和物 として存在し、それらの化合物は可逆的な酵素-阻害剤ヘミケタール共有結合複 合体として酵素に結合すると考えられ、エラスターゼ(Takahasiら，J．Mol．Bio l．1988，201，423-428)及びα-キモトリプシン(Liangら，Biochemistry 1987， 26，7603-7608)の構造的研究及びペチジルトリフルオロメチルケトンに結合した 一連のセリンプロテアーゼ(Imperialiら，Biochemistry 1986，25，3760-3767) の速度論的研究に示された。また、α-ケトアミド６と７は少なくとも一部には 溶液中sp2ケト化合物として存在すると思われるが、α-ケトアミドはプロテアー ゼ活性部位では完全にsp3であることが認められた。同様に、システインプロテ アーゼパパインの活性部位のアルデヒドはチオヘミアセタールとして結合する(M ackenzieら，Biochemistry 1986，25，2293-2298;Schultzら，FEBS Lett．1975 ，50，47-49)。これらの阻害剤がgem-ジオール(水和したケトン)よりむしろ(チ オ)-ヘミケタールとして結合するという仮説は、gem-ジオールに構造的類似性が あるにもかかわらず16、17及び18によるオレアミドヒドロラ ーゼの不十分な阻害により支持される。反応性カルボニルの求電子性はこれらの 阻害剤がオレアミドヒドロラーゼに結合する親和性を必要とするのに大きな役割 を果たすと思われるが、オレアミドヒドロラーゼに対するこれらの化合物の親和 性に影響を及ぼす他の要因もあるらしいことは留意される。アルデヒド４とα- ケトアミド７は等しく求電子性であると思われるが、α-ケトアミドの方が強固 に結合し、更に酵素とアミド官能基間で行われる好ましい相互作用、恐らくは水 素結合があることが示される。同様に、α-ケトエステル８とトリフルオロメチ ルケトン12はトリフルオロメチルケトンの求電子性が高いにもかかわらず等しく 強固に結合する。 おもしろいことに、オレアミドのC-2に似た位置にカルボニルを取り込むアル デヒド５はオレアミドのC-1に似た位置にアルデヒドカルボニルを組み込む４よ り５倍強固に結合することがわかった。これはα-ケトエステル系の阻害剤にお いても認められ、オレアミドのC-1に比べてC-2(9に比べて８）での求電子カルボ ニルの取り込みにより結合親和性が６倍高められた。この相違は、α-ケトアミ ド又はトリフルオロメチルケトンには見られなかった。これらの阻害剤の種類に おいては、オレアミド位置のC-1に比べてC-2で求電子カルボニルを置換すると等 しく有効な阻害剤が得られた。これにより、オレアミドのC-2に対するC-1のカル ボニル位置類縁体の微妙に異なる結合様式の可能性が示される。 これらの研究により、オレアミドヒドロラーゼが天然基質と同じ９位にシス二 重結合の立体化学を含む脂肪酸阻害剤を約10倍選択することがわかる。この傾向 はトリフルオロメチルケトン系で最も明らかであり、シス二重結合含有12はトラ ンス二重結合含有14又は飽和誘導体15よりほぼ１桁強固に結合する。 ほとんどの潜在的不可逆的阻害剤(3、19-21)は、その溶解度限度までの濃度に おいてインキュベーションの最初の15分間は測定可能な時間依存性阻害活性を示 さなかった。クロロメチルケトン３は、時間依存性を示したが中程度の阻害(Ki= 0.7μＭ)であり、推定活性部位システインとケトン間の可逆的(チオ)ヘミケター ル(Bellら，Advan．Phys．Org．Chem．1966，4，1-29及びその中の参考文献)又 は可逆的かつ非共有結合の酵素-阻害剤複合体の形成と一致する。隣接のクロロ 置換基の存在はカルボニルの求電子性を増加し、求核攻撃を容易にする。2-ク ロロオレイン酸(20、Ki=0.3μＭ)は、オレイン酸(Ki=6μＭ)に恐らくは似た結合 様式で可逆的に結合した。ジアゾメチルケトン21は結合が更に弱かった(Ki=18μ Ｍ)。 かかる所見から、１が脂肪酸第一アミド生物学的シグナリング分子の種類の原 型部分を構成し、機能の多様性又は選択性がアルカン鎖の長さ、及び不飽和の位 置、立体化学及び程度から誘導されることが示される。 酵素触媒オレアミド加水分解の速度は、見掛け上の活性部位pKa5.4、9.7及び1 0.3によりpH依存性であることがわかった(図7)。PMSFの珍しいpH-速度依存性プ ロファイル、オレアミドKm及び阻害結果はマウレリによる結果と一致し(Maurell iら，FEBS Lett．1995，377，82-86;Mackenziら，Biochemistry 1986，25，2293 -2298)、ここに示されたオレアミドヒドロラーゼ(ラット肝膜画分由来)とアナン ダミドアミドヒドロラーゼ(マウス神経芽腫細胞膜画分由来)が種間変動を条件と して同じ酵素であることが示される。しかしながら、配列データ又は精製した酵 素がないときには後者は内在性膜タンパク質で達成されることが難しいことがよ くあり、それはまだ証明されていない。しかしながら、我々の結果は、生体内脂 肪酸アミド加水分解の多酵素モデルを支持することが証明されるようにpH６と８ で最大速度を示すアナンダミドアミドヒドロラーゼの他の報告(Desarnaudら，J ．Biol．Chem．1995，270，6030-6035)と全く異なる。本阻害剤はpH10.0で分析 され、そのpHでのオレアミドヒドロラーゼ活性は我々の分析条件下で最大である 。アゴニスト活性 本発明の他の態様は、オレアミドヒドロラーゼアゴニスト有効量を投与するこ とによりオレアミド感受性動物体内で睡眠を誘発する方法に関する。好ましいア ゴニストは化合物６である。化合物６を鉱油に溶解し、腹内注射によりラットの 腹膜に有効量を注入した。次の４時間睡眠をモニターした。標準電気生理学的方 法により全睡眠時間を求めた。歩行時間の減少と共に深部徐波睡眠(SWS)の増加 が認められた。約30%のSWSの増加と同様の%の歩行時間の減少が認められた。阻害剤の合成 阻害剤の多くを、オレイン酸から既知の手順又は既知の手順の修正によって調 製した(図9)。オレイン酸から誘導した酸塩化物(3当量(COCl)2、CH2Cl2、25℃、 ３時間)とヒドロキシルアミン又はジアゾメタンとを反応させると２と21が得ら れ、オレイン酸とヒドラジン(1.1当量、2.2当量のEDCI、0.2当量のDMAP、CH2Cl2 、25℃、19時間)とを直接縮合すると22が得られた。21をと無水1N HCl-EtOAc(25 ℃、10分、92%)で処理すると手際よく３が得られた。アルデヒド4(Hancusoら，J ．Org．Chem．1978，43，2480-2482)はジメチルアセタール16(Marxら，J．Med． Chem．1989，32，1319-1322)と共に記載されたようにオレイン酸から直接調製さ れる。オレイン酸から誘導したエノレート(LDA、THF)をCCl4又はO2で捕捉すると 各々20(Sniderら，J．Org．Chem．1987，52，307-310)と18(Konenら，J．Org．C hem．1975，40，3253-3258)が得られ、酸塩化物の生成(3当量(COCl)2、CH2Cl2、 25℃、3時間)と水性NH4OHによる縮合によって対応する第一アミド19と17に変換 した。 C-1よりむしろC-2に類似の位置に求電子カルボニルをもつC-18オレイン酸に基 づくα-ケトアミド６とα-ケトエステル８を、α-ヒドロキシアミド17(PDC)とα -ヒドロキシ酸18(デス-マルチン)の酸化に続いてエチルエステルを形成すること により調製した(図9)。オレアミドのC-1に類似の位置に求電子カルボニルをもつ 対応するα-ケトエステル９と10を、対応する18Cカルボン酸、オレイン酸とステ アリン酸からデーキン・ウェスト反応を変更して直接調製した(Buchananら，Che m．Soc．Rev．1988，17，91-109)(図9)。同様の長さを有するa-ケトアミド７を 、21のウォルフ転移によって得られるオレイン酸の1C伸長により調製(触媒AgOBz 、CH3OH、25℃、2.5時間、82%)してメチルエステル23を得た。メチルエステルの 加水分解に続いてC-19カルボン酸24をα-ケトアミドに変換する方法は、６につ いて詳述した方法に従った(図9)。 9-シスオレフィンを含むC-18脂質のC-2位に求電子カルボニルを取り込む13を 含むトリフルオロメチルケトン阻害剤12、13、14及び15を、対応するカルボン酸 を各酸塩化物に変換し、引き続きTFAA-ピリジンで処理することにより１操作で 調製した(Boivinら，Tetrahedron Lett．1992，33，1285-1288)(6当量/8当量、E t2O、0.75〜2時間、54〜79%)(図10)。a-ヒドロキシ酸18の酸化的分解(Pb(OAc)4 、1.1当量、25℃、ベンゼン、50m.)によりアルデヒド５が得られた。これを更に 酸化(NaClO2)して酸27を得、これを用いて13を調製した。 トリカルボニル阻害剤11を、ワッセルマンによって詳述された手順に従って調 製した(Wassermanら，Tetrahedron Lett．1992，33，6003-6006)。パルミチン酸 から誘導された酸塩化物をビス(トリメチルシリル)アセトアミド(BSA)の存在下 にtert-ブチル(トリフェニルホスホラニリデン)アセテート(29)で処理し、続い てオキソン酸化することにより11が得られた(図11)。 内在性睡眠誘発脂質(1、シス-9-オクタデセンアミド)の加水分解に関与する酵 素オレアミドヒドロラーゼの強力な阻害剤が開発され、該酵素のメカニズム及び 睡眠の制御と調節のための薬剤の開発の基本的な根拠が洞察された。 合成プロトコール 概説 旋光をパーキン・エルマー241分光光度計で測定した。UVと可視スペクトルを ベックマンDU-70分光計で記録した。1Hと13C NMRスペクトルをブルカーAMX-400 とAMX500分光計により400MHZと500MHZで記録した。高分解能質量スペクトル(HRM S)を高速原子衝撃(FAB)条件下でVG ZAB-ZSE質量分析計により記録した。カラム クロマトグラフィーを70-230メッシュのシリカゲルを用いて行った。分取用TLC をメルクArt．5744(0.5mm)を用いて行った。 化合物１の合成 化合物１をCravattら，Science 1995，268，1506-1509からの手順によって調 製した。 化合物４の合成 化合物４をMancuso，A．J.ら，J．Org．Chem．1978，43，2480-2482からの手 順によって調製した。 化合物15の合成 化合15をKoutek，B.ら，J．Biol．Chem．1994，269，22937-22940からの手順 によって調製した。 化合物16の合成 化合物16をMarx，M．H.ら，J．Med．Chem．1989，32，1319-1322からの手順に よって調製した。 化合物18の合成 化合物18をKonenら，J．Org．Chem．1975，40，3253-3258からの手順によって調 製した。 化合物20の合成 化合物20をSniderら，J.Org.Chem．1987，52，307-310からの手順によって調 製した。 化合物29の合成 化合物29をCookeら，J．Org.Chem．1982，47,4955-4963からの手順によって調 製した。 N-ヒドロキシ-9Z-オクタデセンアミド(2)の合成 オレイン酸(250μｌ、 0.79ミリモル、1当量)を無水CH2Cl2(4ml)に溶解し、N2 下で0℃まで冷却した。塩化オキサリル(CH2Cl2中2M、1.2ml、2.4ミリモル、3当 量)を徐々に加えた。その溶液を25℃に温め、暗所で３時間撹拌した。溶媒を減 圧下で除去し、そのフラスコを0℃に冷却した。EtOAc中過剰量のヒドロキシルア ミン(その塩酸塩を使用前に50%NaOH溶液からEtOAcへ抽出した)を徐々に加えた。 溶媒を減圧下で除去し、クロマトグラフィー(SiO2、1.5×13cm、33−66%EtOAc- ヘキサン勾配溶離)してN-ヒドロキシ-9Z-オクタデセンアミド２を白1-クロロ-10Z-ノナデセン-2-オン(3)の合成 21(347mg、1.13ミリモル、1当量)の試料をEtOAc中1M HCl(4.0・l)4.0ミリモル 、3.5当量)で25℃において10分間処理した後、混合液を減圧下で濃縮した。クロ マトグラフィー(SiO2、3×13cm、5%EtOAc-ヘキサン)処理して3(328mg、 8Z-ヘプタデセナール(5)の合成 N2下25℃において無水ベンゼン(1.6ｍl)中18(120mg、0.40ミリモル、１当量） をPb(OAc)4(197mg、0.44ミリモル、1.1当量)で処理し、反応混合液を50分間撹拌 した。水(2ml)を加え、水層をEtOAc(6×2ml)で抽出した。有機層を乾燥(Na2SO4) し、ろ過し、減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO2、2×13cm、1-5%EtOA c-ヘキサン勾配溶離)処理して5(68mg、67%)を透明な油状物として得た。スペク トル特性は文献に記載されたものと一致する(Doleshallら，Tetrahedron Lett ．1977，381-382;Kempら，J．Am．Oil Chem．Soc．1975，52，300-302)。 2-オキソ-9Z-オクタデセンアミド(6)の合成 Ar下で無水DMF(0.13ml)中17(8mg、0.027ミリモル、1当量)の溶液をPDC(51mg、 0.13ミリモル、5当量)で処理し、反応混合液を25℃で１時間撹拌した。粗反応液 をH2O(2ml)で処理し、水層をEt2O(4×2ml)で抽出した。有機層を乾燥(Na2SO4)し 、ろ過し、減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO2、1×3cm)20-66%EtOAc- ヘキサン勾配溶離)処理して6(6mg、70%)を白色固形物として得、 2-オキソ-10Z-ノナデセンアミド(7)の合成 25℃において無水CH2Cl2(2.8ml)中26(42mg、0.14ミリモル、1当量)溶液をo-Ph (CO2)I(OAc)3(174mg、0.41ミリモル、3当量)で処理し、反応混合液を1.5 時間撹拌した。混合液を10%NaOH水溶液(30ml)で処理し、水層をEtOAc(3×30ml) で抽出した。有機層を乾燥(Na2S04)し、ろ過し、減圧下で濃縮した。クロマトグ ラフィー(SiO2、1.5×13cm、10-20%EtOAc-ヘキサン勾配溶離)処理して7(24mg、 エチル2-オキソ-9Z-オクタデセノエート(8)の合成 N2下25℃において無水CH2Cl2(1.1ml)中18(102mg、0.34ミリモル、1当量)の溶 液をo-Ph(CO2)I(OAc)3(287mg、0.68ミリモル、2当量)で処理し、１時間撹拌した 。反応混合液を10%NaOH水溶液(20ml)で処理し、EtOAC(3×2ml)で抽出した。有機 層を乾燥(No2SO4)し、ろ過し、減圧下で濃縮した。残留物を無水CH2Cl2(1.5ml) に溶解し、N2下で0℃まで冷却した。塩化オキサリル(CH2Cl2中2M、0.5ml、1.0ミ リモル、3当量)を徐々に加えた。反応混合液を25℃に温め、暗所で３時間撹拌し た後、溶媒を減圧下で除去し、無水EtOH(5ml)を加えた。クロマトグラフィー(Si O2、2×10cm)1-5%EtOAc-ヘキサン)処理して8(36mg、33%)を透 エチル2-オキソ-10Z-ノナデセノエート(9)の合成 Ar下25℃において無水THF(0.2ml)中オレイン酸(100μl、0.32ミリモル、1当量 )の溶液をDMAP(4mg、0.03ミリモル、0.1当量)、無水ピリジン(77μl、 0.95ミリモル、3当量)及び塩化エチルオキサリル(71)μｌ、0.64ミリモル、2当 量)で処理した。反応混合液を24時間撹拌した後、更にDMAP(46mg、0.37ミリモル 、1.1当量)、ピリジン(80μｌ、0.95ミリモル、3当量)、塩化エチルオキサリル( 80μｌ、0.64ミリモル、2当量)及びTHF(0.5ml)を加えた。反応混合液を25℃で更 に24時間撹拌してから40℃まで48時間温めた後、溶媒を減圧下で濃縮した。クロ マトグラフィー(SiO2、2×13cm、0-10%EtOAc-ヘキサン)処理して9(46mg、 エチル2-オキソ-ノナデカノエート(10)の合成 Ar下25℃において無水THF(0.2ml)中ステアリン酸(101mg、0.36ミリモル、1当 量)の溶液をDMAP(4mg、0.03ミリモル、0.1当量)、無水ピリジン(85μｌ、1.1ミ リモル、3当量)及び塩化エチルオキサリル(79μｌ、0.71ミリモル、2当量)で処 理した。反応混合液を24時間撹拌した後に溶媒を減圧下で濃縮した。クロマトグ ラフィー(SiO2、2×13cm、5-10%EtOAc-ヘキサン)処理して10(35mg、30%)を tert-ブチル3-オキソ-2,2-ジヒドロキシオクタデカノエート(11)の合成 THF-H2O(2:1;3ml)中28(161g，0.26ミリモル、1当量)の溶液をオキソン(249mg 、0.41ミリモル、1.6当量)で処理し、反応混合液を25℃で７時間撹拌した。水(3 0ml)を加え、水層をEtOAc(3×30ml)で抽出した。有機層を合わせ、乾燥 (Na2SO4)し、ろ過し、減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO2、2×15cm、 10-20%EtOAc-ヘキサン勾配溶離)して11(65mg、64%)を白色固形物として得た： 1,1,1-トリフルオロ-10Z-ノナデセン-2-オン(12)の合成 オレイン酸(100μｌ、0.32ミリモル、1当量)を無水CH2Cl2(1.5ml)に溶解し、N2 下で0℃に冷却した。塩化オキサリル(CH2Cl2中2M、0.47ml、0.94ミリモル、3当 量)を徐々に加えた。反応混合液を25℃に温め、暗所で３時間撹拌した後に溶媒 を減圧下で除去した。無水Et2O(2.2ml)、トリフルオロ酢酸無水物(270μｌ、1.9 ミリモル、６当量)とピリジン(0.2ml)2.5ミリモル、８当量)を25℃で加え、その 溶液を45分間撹拌した後に0℃に冷却した。H2O(30ml)を添加して反応液を冷却し 、水層をCH2Cl2(3×30ml)で抽出した。有機層を乾燥(Na2SO4)し、ろ過し、減圧 下で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO2、1.5×13cm、5%EtOAc-ヘキサン中 1,1,1-トリフルオロ-9Z-オクタデセン-2-オン(13)の合成 無水CH2Cl2(1.8ml)中27(101mg、0.38ミリモル、1当量)の溶液をN2下で0℃に冷 却し、塩化オキサリル(CH2Cl2中2M、0.56ml、1.1ミリモル、3当量)で滴下処理し た。反応混合液を25℃に温め、3時間撹拌した後に溶媒を減圧下で除去した。無 水Et2O(2.5ml)、トリフルオロ酢酸無水物(0.32ml、2.3ミリモル、6当 量)と無水ピリジン(0.12ml、1.5ミリモル、4当量)を25℃で加え、その溶液を2時 間撹拌した後に0℃まで冷却した。その反応混合液をH2O(30ml)で処理し、水層を EtOAc(3×30ml)で抽出した。有機層を乾燥(Na2SO4)し、ろ過し、減圧下で濃縮し た。クロマトグラフィー(SiO2、2×15cm、10%EtOAc-ヘキサン中1%Et3N)処 1,1,1-トリフルオロ-10E-ノナデセン-2-オン(14)の合成 無水CH2Cl2(3.5ml)中エライジン酸(204mg、0.72ミリモル、1当量)をN2下で0℃ まで冷却し、塩化オキサリル(CH2Cl2中2M、1.1ml、2.2ミリモル、3当量)で処理 した。その反応混合液を25℃に温め、3時間撹拌した後に溶媒を減圧下で除去し た。無水Et2O(5ml)、トリフルオロ酢酸無水物(0.6ml、4.3ミリモル、6当量)と無 水ピリジン(0.23ml、2.8ミリモル、4当量)を25℃で加え、その溶液を１時間撹拌 した後に0℃に冷却した。その混合液をH2O(30ml)で処理し、水層をEtOAc(3×30m l)で抽出した。有機層を乾燥(Na2SO4)し、ろ過し、減圧下で濃縮した。クロマト グラフィー(SiO2、2×13cm、5-10%EtOAc-ヘキサン中1%Et3N勾配 2-ヒドロキシ-9Z-オクタデセンアミド(17)の合成 N2下0℃に冷却した無水CH2Cl2(0.7ml)中18(52mg，0.18ミリモル、1当量)の溶 液を塩化オキサリル(CH2Cl2中2M、0.22ml)0.44ミリモル、3当量)で処理した。 その溶液を25℃に温め、暗所で３時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、酸塩化 物を0℃に冷却した。その試料を過度に濃縮したNH4OH水溶液で処理した。クロマ トグラフィー(SiO2、1.5×10cm、66-100%EtOAc-ヘキサン勾配溶離)処理して 2-クロロ-9Z-オクタデセンアミド(19)の合成 N2下0℃に冷却した無水CH2Cl2(0.7ml)中20(48mg、0.15ミリモル、1当量)を塩 化オキサリル(CH2Cl2中2M、0.23ml)0.46ミリモル、3当量)で処理した。その溶液 を25℃に温め、暗所で３時間撹拌した後に溶媒を減圧下で除去した。粗酸塩化物 を0℃に冷却し、過剰量のNH4OH水溶液で処理した。クロマトグラフィー(SiO2、1 .5×10cm、20-33%EtOAc-ヘキサン勾配溶離)処理して19(37mg、78%)を黄 1-ジアゾ-10Z-ノナデセン-2-オン(21)の合成 N2下でオレイン酸(1.0ml、3.2ミリモル、1当量)を無水CH2Cl2(15ml)に溶解し た。その溶液を0℃まで冷却し、塩化オキサリル(CH2Cl2中2M、4.8ml、9.6ミリモ ル、3当量)を加えた。反応混合液を25℃に温め、暗所で３時間撹拌した。溶媒を 減圧下で除去した後、酸塩化物をすりガラスジョイントのないフラスコに移 し、0℃に冷却した。Et2O中過剰量のジアゾメタン(50%KOH水溶液中N-ニトロソメ チルウレアから調製、KOHペレットで乾燥)を加えた。反応液を0℃で１時間撹拌 した後、25℃で一晩温めた。その溶液をEtOAc(60ml)で希釈し、NaHCO3飽和水溶 液(60ml)及びNaCl飽和水溶液(60ml)で洗浄した。有機層を乾燥(Na2SO4)し、ろ過 し、減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO2、4.0×16cm、5-10%EtOAc-ヘ キサン勾配溶離)処理して21(0.89g、92%)を黄色油状物として得た：N-アミノ-9Z-オクタデセンアミド(22)の合成 N2下0℃において無水CH2Cl2(12ml)中オレイン酸(250μｌ、0.79ミリモル、1当 量)とヒドラジン１水和物(42μｌ、0.87ミリモル、1.1当量)をEDCI(267mg、0.90 ミリモル、1.1当量)及びDMAP(20mg、0.16ミリモル、0.21当量)で処理した後、反 応混合液を25℃で７時間撹拌した。別のEDCI(269mg、0.91ミリモル、1.1当量)を 加え、反応液を25℃で更に12時間撹拌した後に溶媒を減圧下で除去した。クロマ トグラフィー(SiO2、3×18cm、20-100%EtOAc-ヘキサン勾配溶離) メチル10Z-ノナデセノエート(23)の合成 安息香酸銀(21.8mg、0.095ミリモル、0.1当量)と無水Et3N(0.19ml、1.36ミリ モル、1.4当量)を無水CH3OH(1.5ml)中1-ジアゾ-10Z-ノナデセン-2-オン(21、 298mg、0.97ミリモル、1当量)の溶液にN2下で滴下し、反応液を25℃で2.5時間撹 拌した。反応混合液をEtOAc(30ml)で希釈し、1NHCl水溶液(30ml)及びNaHCO3飽和 水溶液(30ml)で洗浄した。有機層を乾燥(Na2SO4)し、ろ過し、減圧下で濃縮した 。クロマトグラフィー(SiO2、3×15cm、1-5%EtOAc-ヘキサン勾配溶10Z-ノナデセン酸(24)の合成 25℃においてTHF-CH3OH-H2O(3:1:1;7ml)中23(620mg、2.0ミリモル、1当量）を LiOH・H2O(250mg、5.96ミリモル、3当量)で処理し、反応混合液を３時間撹拌した 。1N HCl水溶液(60ml)を加えて反応混合液を酸性にし、水層をEtOAc(2×60ml)で 抽出した。有機層を乾燥(Na2SO4)し、ろ過し、減圧下で濃縮した。クロマトグラ フィー(SiO2、4×15cm、10-100%EtOAc-ヘキサン勾配溶離)処理 Tetrahedron Lett．1980，21，4183-4186の方法によっても調製した。 2-ヒドロキシ-10Z-ノナデセン酸(25)の合成 Ar下-55℃において無水THF(2ml)中ジイソプロピルアミン(0.4ml、2.9ミリモル 、4.5当量)とn-BuLi(2.3M、1.1ml、2.5ミリモル、４当量)からLDAの新しい溶液 を調製した。そのLDA溶液にTHF(0.5ml)中10Z-ノナデセン酸(24、188mg、 0.63ミリモル、1当量)と無水HMPA(0.11ml、0.63ミリモル、1当量)の溶液を-55℃ において滴下した。反応混合液を25℃まで徐々に温め、50℃で30分間加温した。 反応混合液を再び25℃に冷却し、その溶液にO2を20分間吹き込んだ。混合液を1N HCl水溶液(30ml)で処理し、水層をEtOAc(3×30ml)で抽出した。有機層を乾燥(N a2SO4)し、ろ過し、減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO2、2×13cm、50 -100%EtOAc-ヘキサン勾配溶離)処理して25(96mg、49%)を白色固形物 2-ヒドロキシ-10Z-ノナデセンアミド(26)の合成 N2下で無水CH2Cl2(1.5ml)中25(71mg、0.23ミリモル、1当量)の溶液を0℃に冷 却し、塩化オキサリル(CH2Cl2中2M、0.34ml、0.68ミリモル、３当量)で滴下処理 した。反応混合液を25℃に温め、暗所で３時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し 、残留物を0℃に冷却し、過剰量の濃NH4OH水溶液(2ml)を加えた。クロマトグラ フィー(SiO2、1.5×13cm、50-66%EtOAc-ヘキサン勾配溶離)処理して 8Z-ヘプタデセン酸(27)の合成 N2下25℃においてtBuOH(6.5ml)中5(66mg、0.26ミリモル、1当量)と2-メチル-2 -ブテン(1.6ml、15.1ミリモル、58当量)の溶液を脱イオンH2O(2.5ml)中 NaClO2(80%、208mg、2.3ミリモル、9当量)とNaH2PO4・H2O(250mg、1.8ミリモル、 7当量)の溶液で滴下処理した。反応混合液を更に15分間撹拌した後、減圧下で濃 縮した。残留物を水(30ml)で処理し、水層をEtOAc(3×30ml)で抽出した。有機層 を乾燥(Na2SO4)し、ろ過し、減圧下で濃縮した。クロマトグラフィー(SiO2、2× 13cm、10-20%EtOAc-ヘキサン勾配溶離)処理して27(66mg、95%)を透明な油状物と して得た。スペクトル特性は、文献のMirallesら，Lipids 1995，30，459-466;C oudercら，Lipids 1995，30，691-699に記載されたものと一致する。 3-オキソ-2-(トリフェニルホスホラニリデン)オクタデカノエート(28)の合成 N2下で無水CH2Cl2(2ml)中パルミチン酸(103mg、0.40ミリモル、1当量)を0℃に 冷却し、塩化オキサリル(CH2Cl2中2M、0.6ml、1.2ミリモル、3当量)で処理した 。その溶液を25℃で３時間撹拌した後、溶媒を減圧下で除去した。5℃において 無水ベンゼン(3ml)中tert-ブチル(トリフエニルホスホラニリデン)アセテート(C ookeら，J．Org．Chem．1982，47，4955-4963)29、167mg、0.44ミリモル、1.1当 量)とビス(トリメチルシリル)アセトアミド(195μｌ、0.79ミリモル、2当量)の 溶液をベンゼン(3ml)中粗酸塩化物の溶液で滴下処理した。反応混合液を25℃に 温め、1.5時間撹拌した後に溶媒を減圧下で除去した。クロマトグラフィー(SiO2 、2×15cm、10-20%EtOAc-ヘキサン勾配溶離)処理して28(193mg、 結合定数の測定 オレアミド加水分解に対する化合物の効力を、反応生成物としてのアンモニア を直接測定するイオン選択性アンモニア電極(ATI/Orion)を用いて評価した。オ レイン酸以外のKiは全てディクソン法によって求めた。(一定基質濃度での1/速 度プロットに対する[I]の加重直線フィットのX切片を式Ki=-Xint/[1＋[S]/Km]を 用いてKiに変換した。)基質と阻害剤の濃度に対する速度の非直線加重最小自乗 法からオレイン酸のKiを得た。酵素的に触媒したオレアミド加水分解の速度が最 大であるpH10.0に調整した10mlの50mM CAPS緩衝液(Sigma)中で絶えず撹拌しなが ら分析を行った。ディクソン分析に関係する全ての例において、基質濃度は100 μＭとした。10〜100μＭの基質濃度範囲でオレイン酸のKiを求めた。基質と阻 害剤をDMSOに溶解した後に50mM CAPS緩衝液に加え、最終DMSO分析濃度1.67%を生 成した。20%までの濃度のDHSOは、速度に対する影響がわずかであった。阻害剤 の存在しないときに約0.2μＭ/分の速度を生じるように酵素濃度を調節し、7〜1 0分間にわたってアンモニアの生成速度を観測した。 酵素をラット肝由来の膜含有未精製不均一標品として用いた。5分間煮沸した 酵素は活性を示さなかった。溶解度限度内で阻害剤は全て100Kiより大きい濃度 で活性阻害100%を達成した。付加したオレアミドの存在しないときに検出可能な 活性は見られなかった。同様に、このpHで酵素の存在しないときの100μＭオレ アミドからのアンモニア生成は極めて少量しか検出されなかった。これにより、 この未精製酵素標品において観測されたオレアミド加水分解触媒活性は単一タン パク質によることが示される。 オレアミドのKmは、４回の独立した分析から得た平均Kmとして求めた。ライン ウィーバー・バークプロットにおけるでデータの加重直線フィットから各々独立 したKmを得た。非直線法によるオレイン酸阻害測定の結果として一致している５ 番目のKmを得た。速度データは、標準ミカエリス・メンテン速度論の式と一致し た。（ピンポンBi Bi速度論の速度式は、第２基質、この場合水の濃度が一定で ある場合には簡単なミカエリス・メンテンのような式になる。）30〜100μＭの 範囲では、反応速度は実質的に基質濃度に全く依存しない。 我々は酵素試料中に存在するオレアミドヒドロラーゼ量をいまだ求めることが できないことから、ここではVmax値を提示していない。我々の阻害データから酵 素濃度が2nMより小さいことが示される。高い酵素濃度は溶液中の阻害剤の著し い不足を引き起こし、[E]≫Kiの極限の場合に[E]/2として測定される見掛け上 のKiを生じるからである。1nMが測定した最低阻害定数であったことから、[E]＜ 2nMである。 Kiと共に提示された誤差値は、データの誤差処理が伝わることから誘導された グッドネス・オブ・フィット推定値とみなさなければならない。必ずしも再現性 を意味しない。しかしながら、実験を繰り返す場合においてはここに示された見 掛け上の誤差によって予想したように結果は統計的に一致した。pH- 速度依存性 5%DMSOを含有する適切なpHの20ml緩衝液中200μMオレアミド(ほぼ溶解限度)の 溶液に未精製酵素を加えた。(20%までのDMSO濃度は酵素速度に対する影響は最小 であった。)pH4〜9範囲のデータについては50μＭクエン酸ナトリウム/ビス-ト リス緩衝液を用いた。pH8〜11範囲のデータについては50mMビス-トリス/CAPSを 用いた。pH12における溶液は自己緩衝液になるとした。周期的間隔で1mlの分割 量を取り出し、9mlのpH14緩衝液で希釈した。アンモニア濃度を720Aメーター(Or ion)に接続したイオン選択性アンモニア電極(Orion)を用いて測定し、既知の標 準に対して検定した。標準最小自乗法を用いて適合した曲線の直線部分から速度 を得た。その速度をpHに対してプロットし、加重非直線最小自乗法(Connors，K ．A.，Binding Constants;Wiley:ニューヨーク，1987，pp385-395)による図12の 式(Fersht，A.，Enzyme Structure and Mechanism;W．H．Freeman and Co.:ニュ ーヨーク，1985，pp 157 Connors，K．A.，Binding Constants;Wiley:ニューヨ ーク，1987，pp 385-395)をあてはめた。 ２つのpKaが共に近接(1単位未満)する場合には、実質的に様々な種の酵素の混 合が溶液中に存在する。そのような条件下では最も活性な種の酵素が高度の存在 量に決して達しないので、その種の最大速度理論値が現れることは実際には決し て見られない。pKa測定の簡単なグラフ的方法がここに提示されたpH単位の9.7と 10.3値と一致しないことはこのためである。大量の肝原形質膜標品、（12〜14ラット肝） 12〜14のラット肝の切片をつくり、300mlの1mM NaHCO3に入れた。さいの目に 刻んだ肝臓の溶液を精製し、更に300mlの1mM NaHCO3で洗浄した。はっきり見え る結合組織を切除した。その肝臓を新鮮な800mlの1mM NaHCO3に移し、撹 拌してから、400mlの分割量でブレンダーに移した。ブレンドした肝分割量を合 わせ、８層のチーズクロスでろ過した。これを1mM NaHCO3で1.0リットルに希釈 し、6000rpm、4℃で20分間遠心分離した(BeckmanJA-17ローター)。上清を傾瀉し 、沈降物を1mM NaHCO3に懸濁し、合わせ、ダウンスホモジェナイズした。遠心 分離、傾瀉及び懸濁/均質化を繰り返して最終容量約90mlを得た。ホモジェネー トを２容量当量の67%スクロースに加え、十分に混合し、超遠心用コンパチブル チューブに移した。その上部を30%スクロースでおおい、27,000で２時間遠心し た(SW-28ローター)。中間の黄色バンドをスクロース勾配から取り出し、合わせ 、1mM NaHCO3に懸濁し、ダウンスホモジェナイズした。試料を17,000rpm、4℃で 45分間遠心分離した(JA-17ローター)。上清を除去し、沈降物を100mM Na2CO3に 懸濁し、ダウンスホモジェナイズし、30分間氷上で放置した。その溶液を27,000 rpmで１時間遠心分離(SW-28ローター)し、上清を傾瀉し、沈降物を15mlの50mMト リスHCl、pH7.4と1mM EDTAに懸濁し、ダウンスホモジェナイザーでホモジェナイ ズした。この物質を多数の分割量に分け、使用まで-78℃に冷凍した。各酵素試 料を１回だけ冷凍した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ウォン チ ヒュイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92067 ランチョー サンタ フェ ピー オーボックス 8154 (72)発明者 ボガー デイル エル アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92037 ラ ジョラ ヴィア ポサダ 2819 (72)発明者 ヘンリクセン スティーヴン ジェイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92037 ソラナ ビーチ グレンクレスト ドライヴ 410

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．先端基及び前記先端基に共有結合した炭化水素末端基を含むオレアミドヒド ロラーゼ阻害剤であって、前記先端基が求電子カルボニルを含みかつ下記構造 : で表される基からなる群より選ばれ、前記炭化水素末端基が下記構造: で表される基からなる群より選ばれる、前記オレアミドヒドロラーゼ阻害剤。 ２．下記構造で表される、請求項１記載のオレアミドヒドロラーゼ阻害剤。 ３．下記構造で表される、請求項１記載のオレアミドヒドロラーゼ阻害剤。４．下記構造で表される、請求項１記載のオレアミドヒドロラーゼ阻害剤。 ５．下記構造で表される、請求項１記載のオレアミドヒドロラーゼ阻害剤。 ６．下記構造で表される、請求項１記載のオレアミドヒドロラーゼ阻害剤。 ７．下記構造で表される、請求項１記載のオレアミドヒドロラーゼ阻害剤。 ８．下記構造で表される、請求項１記載のオレアミドヒドロラーゼ阻害剤。 ９．下記構造で表される、請求項１記載のオレアミドヒドロラーゼ阻害剤。10．下記構造で表される、請求項１記載のオレアミドヒドロラーゼ阻害剤。 11．下記構造で表される、請求項１記載のオレアミドヒドロラーゼ阻害剤。 12．下記構造で表される、請求項１記載のオレアミドヒドロラーゼ阻害剤。 12．下記構造で表される、請求項１記載のオレアミドヒドロラーゼ阻害剤。 13．下記構造で表される、請求項１記載のオレアミドヒドロラーゼ阻害剤。 14．下記構造で表される、請求項１記載のオレアミドヒドロラーゼ阻害剤。15．下記構造で表される、請求項１記載のオレアミドヒドロラーゼ阻害剤。 16．先端基及び前記先端基に共有結合した炭化水素末端基を含む阻害剤と接触さ せることによるオレアミドヒドロラーゼの阻害方法であって、前記先端基が求 電子カルボニルを含みかつ下記構造: で表される基からなる群より選ばれ、前記炭化水素末端基が下記構造: で表される基からなる群より選ばれる、前記オレアミドヒドロラーゼの阻害方 法。 17．前記阻害剤が下記構造で表される、請求項16記載のオレアミドヒドロラー ゼの阻害方法。 18．前記阻害剤が下記構造で表される、請求項16記載のオレアミドヒドロラー ゼの阻害方法。 19．前記阻害剤が下記構造で表される、請求項16記載のオレアミドヒドロラーゼ の阻害方法。 20．前記阻害剤が下記構造で表される、請求項16記載のオレアミドヒドロラーゼ の阻害方法。21．前記阻害剤が下記構造で表される、請求項16記載のオレアミドヒドロラーゼ の阻害方法。 22．前記阻害剤が下記構造で表される、請求項16記載のオレアミドヒドロラーゼ の阻害方法。 23．前記阻害剤が下記構造で表される、請求項16記載のオレアミドヒドロラーゼ の阻害方法。 24．前記阻害剤が下記構造で表される、請求項16記載のオレアミドヒドロラーゼ の阻害方法。 25．前記阻害剤が下記構造で表される、請求項16記載のオレアミドヒドロラーゼ の阻害方法。 26．前記阻害剤が下記構造で表される、請求項16記載のオレアミドヒドロラーゼ の阻害方法。 27．前記阻害剤が下記構造で表される、請求項16記載のオレアミドヒドロラーゼ の阻害方法。 28．前記阻害剤が下記構造で表される、請求項16記載のオレアミドヒドロラーゼ の阻害方法。 29．前記阻害剤が下記構造で表される、請求項16記載のオレアミドヒドロラーゼ の阻害方法。 30．前記阻害剤が下記構造で表される、請求項16記載のオレアミドヒドロラーゼ の阻害方法。31．前記阻害剤が下記構造で表される、請求項16記載のオレアミドヒドロラーゼ の阻害方法。 32．前記阻害剤が下記構造で表される、請求項16記載のオレアミドヒドロラーゼ の阻害方法。 33．前記阻害剤が下記構造で表される、請求項16記載のオレアミドヒドロラーゼ の阻害方法。 34．前記阻害剤が下記構造で表される、請求項16記載のオレアミドヒドロラーゼ の阻害方法。 35．前記阻害剤が下記構造で表される、請求項16記載のオレアミドヒドロラーゼ の阻害方法。 36．前記阻害剤が下記構造で表される、請求項16記載のオレアミドヒドロラーゼ の阻害方法。 37．オレアミド感受性動物体内で睡眠を誘発する方法であって、下記構造で表さ れるオレアミドヒドロラーゼアゴニストを該オレアミド感受性動物に投与する 、前記方法。
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