DE69728537T2

DE69728537T2 - Oleamid-hydrolase-inhibitoren

Info

Publication number: DE69728537T2
Application number: DE69728537T
Authority: DE
Inventors: A. Richard LERNER; Chi-Huey Wong; L. Dale BOGER; J. Steven HENRIKSEN
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1996-06-26
Filing date: 1997-06-26
Publication date: 2005-03-24
Anticipated expiration: 2017-06-27
Also published as: US5856537A; CN100369887C; EP0910561B1; AU734477B2; US6096784A; ATE263751T1; CN1228764A; AU3508297A; DE69728537D1; CN101156840A; EP0910561A1; JP2000513361A; WO1997049667A1; EP0910561A4; JP4184435B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf Oleamid-Hydrolase-Inhibitoren und auf Agonisten bezüglich oleamidinduzierten Schlafs. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf Übergangszustandsimitationen und auf mechanismusbasierte Oleamidderivate, die eine hemmende Wirkung auf die Oleamidhydrolase und/oder eine agonistische Wirkung bezüglich oleamidinduzierten Schlafs haben.
Hintergrund der Erfindung
Oleamid (1, cis-Octadec-9-amid) ist ein natürlich vorkommender Gehirnbestandteil, bei dem gezeigt wurde, dass er unter Bedingungen des Schlafentzugs akkumuliert und bei nachgeholtem Schlaf abgebaut wird (Cravat et al., Science 1995, 268, 1506–1509; Lerner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1994, 91, 9505–9508; Cravatt et al., J Am. Chem. Soc. 1996, 118, 580–590). In einer strukturspezifischen Weise wurde bei 1 gezeigt, dass es in nanomolaren Mengen physiologischen Schlaf bei Tieren induziert, wenn es intravaskulär injiziert wird (Cravat et al., Science 1945, 268, 1506–1509). Eine Hydrolyse von 1 durch ein Enzym (Oleamid-Hydrolase), das in der Zellmembran vorhanden ist, baut das Oleamid schnell in Ölsäure (cis-9-Octadecensäure) ab. Bei dem Versuch, ein regulatorisches Agens zu isolieren, das für die Steuerung endogener Konzentrationen von 1 verantwortlich ist, stellte sich bei einem integralen Membranprotein, der Oleamid-Hydrolase, heraus, dass es den hydrolytischen Abbau von Oleamid katalysiert, wobei Ölsäure (cis-9-Octadecensäure) und Ammoniak entsteht (3), von denen keines schlaffördernde Eigenschaften hat (Cravat et al., Science 1995, 268, 1506–1509).
Es hat sich herausgestellt, dass die Oleamid-Hydrolase durch Phenylmethylsulfonylfluorid, 4,4'-Dithiodipryridindisulfid (ein potentes Disulfid bildendes Reagenz), und HgCl₂ (IC₅₀ = 700 nM, K_{i, app} = 37 nM), jedoch nicht durch 1mM EDTA gehemmt werden kann. Dies lässt vermuten, dass ein Thiol eng am katalytischen Vorgang beteiligt ist und dass das Enzym möglicherweise eine Cysteinamidase oder möglicherweise eine Serinamidase mit einem Cysteinrest im aktiven Zentrum ist.
Eine Vielzahl stark bindender oder irreversibler Inhibitoren von Serin- und Cysteinproteasen wurden beschrieben. Darunter irreversible Inhibitoren, wie zum Beispiel Halogenmetylketone (Kettner et al., Biochemistry 1978, 17, 4778–4784; Kettner et al. Thromb. Res. 1979, 14, 969–973; C. Giordano, et al., Eur. J Med. Chem. 1992, 27, 865–873; Rauher et al., Biochem. J. 1986, 239, 633–640; Angliker et al., Biochem J. 1987, 241, 871–875), Michael-Akzeptoren (Hanzlik et al., J. Med. Chem. 1984, 27, 711–712), Epoxide (C. Parkes, et al., Biochem. J. 1985, 230, 509–516), O-Azyl-Hydroxylamine (Brömme et al., Biochem. J. 1989, 263, 861-866) und Diazomethylketone (Green et al., J. Biol. Chem. 1981, 256, 1923–1928) sowie reversible Übergangszustandsimitations-inhibitoren, wie zum Beispiel Ketone (Mehdi, S. Bioorg. Chem. 1993, 21, 249–259), Aldehyde (Westerik et al., J. Biol. Chem. 1972, 247, 8195–8197), Cyklopropenone (Ando et al., J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 1174–1175) und elektronendefiziente Carbonylverbindungen, wie zum Beispiel Trifluormethylketone (Wolfenden et al., Annu. Rev. Biophys. Bioeng. 1976, 5, 271; Gelb et al., Biochemistry 1985, 24, 1813–1817; Imperiali et al., Biochemistry 1986, 25, 3760–376; Koutek et al., J. Biol. Chem. 1994, 269, 22937-22940), α-Keto-Säure-Derivate (Li, Z. et al., J Med. Chem. 1993, 36, 3472–3480; Harbeson et al., J Med. Chem. 1994, 37, 2918–2929; Peet et al., J Med. Chem. 1990, 33, 394–407; Angelastro et al., J. Med. Chem. 1990, 33, 11–13) und Tricarbonylverbindungen (Wassermann et al., J. Org. Chem. 1993, 58, 4785–4787).
Auf der anderen Seite wurde von nur einem möglichen spezifischen Inhibitor der Oleamidhydrolase berichtet (IC₅₀ = 3 μM bei [S] = 0,26 K_m) (Maurelli et al., FEBS Lett. 1995, 377, 82–86), und bisher wurde nur ein Bericht einer Untersuchung von Inhibitoren verwandter Fettsäureamidasen offenbart (Koutek et al., J. Biol. Chem. 1994, 269, 22937–22940).
J. Am. Chem. Soc. 1984, 106, S. 4531–4536 (Holden et al.) offenbart 1-diazo-2-Oxononadecan und cis-1-diazo-2-oxo-10-Nonadecen in Verbindung mit lichtempfindlichen Monoschichten.
Biotechnology Letters, 1990, 12(9), S. 689–692 (Servat et al.) offenbart Oleylhydroxamsäure, die durch Acylierung neutralisierten Hydroxylamins mit Ölsäure unter der Verwendung eines Enzyms erzeugt wurde.
Phytochemistry, 1991, 30(6), S. 1805–1807 (Kajiwara et al.) offenbart Pentadecanal und (Z)-8-Heptadecenal, das aus den reifen Thalli japanischer Meeresalgen isoliert wurde.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Ein Aspekt der Erfindung ist auf Inhibitoren der Oleamid-Hydrolase gerichtet. Die Inhibitoren sind so beschaffen, dass sie mit Cystein-Resten mit aktivem Zentrum in der Oleamid-Hydrolase in Wechselwirkung treten. Die Inhibitoren wirken schnell, selektiv und höchst potent (K_i = 13 μM bis 1 nM). Die Inhibitoren sind für die Hemmung der Hydrolyse von Oleamid, einem Schlafmittel, geeignet. Die Inhibitoren sind auch nützliche Werkzeuge zur weiteren Charakterisierung der biologischen Rolle von Oleamiden.
Die vorliegende Erfindung sieht Inhibitoren vor, wie sie in den beiliegenden Ansprüchen 1 und 2 angegeben sind, einschließlich der Verwendung als Therapeutikum und der Verwendung der Verbindungen zur Herstellung eines Schlafmittels.
Die Inhibitoren weisen vom Typ her eine Kopfgruppe und eine Kohlenwasserstoffkette auf. Die Kopfgruppe ist covalent an die Kohlenwasserstoffkette gebunden und enthält eine elektrophile Carbonylgruppe.
Bevorzugte Kopfgruppen können aus einer Gruppe ausgewählt werden, die aus Radikalen besteht, die durch folgende Strukturen repräsentiert sind:
Bevorzugte Kohlenwasserstoffketten können aus einer Gruppe ausgewählt werden, die aus Radikalen besteht, die durch die folgenden Strukturen repräsentiert werden:
Bevorzugte Inhibitoren sind unter anderem die folgenden:
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist auf die Verwendung eines Inhibitors bei der Herstellung eines Schlafmittels gerichtet, wie in den Ansprüchen 3 und 4 angeführt. Der Inhibitor weist vom Typ her eine Kopfgruppe und eine covalent an diese gebundene Kohlenwasserstoffkette auf. Die Kopfgruppe schließt eine elektrophile Carbonlygruppe ein, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Radikalen besteht, die durch die folgenden Strukturen repräsentiert wird:
Die Kohlenwasserstoffketten werden aus einer Gruppe ausgewählt, die aus Radikalen besteht, die durch die folgenden Strukturen repräsentiert wird:
Bevorzugte im oben angegebenen Verfahren eingesetzte Inhibitoren schließen die oben aufgezählten Inhibitoren und die folgenden zusätzlichen Inhibitoren ein:
Kurzbeschreibung der Zeichnungen:
1 zeigt 22 Inhibitoren der Oleamid-Hydrolase bezüglich der Hemmungskonstanten (K_{i, app} (μM)); K_m = 5 ± 2 μM für Oleamid.
2 zeigt ¹H NMR und ¹³C NMR-Daten zur Durchführung und quantitiven Bestimmung der Addition von CD₃OD oder D₂O zur elektrophilen Carbonylgruppe in CD₃OD oder Aceton-d₆. Die Daten zeigen den Hydrationsgrad und den relativen elektrophilen Charakter der Inhibitor-Carbonylgruppen. Erwartete Trends folgen 11 > 12 > 8 > 6 > 4. Repräsentanten für diese Trends, 11 und 12, wurden vollständig in ihre Halbacetale in CD₃OD umgewandelt, und die verbleibenden Wirkstoffe zeigten eine verminderte Halbacetalbildung, die mit ihrem erwarteten elektrophilen Charakter übereinstimmte: 11(100%), 12(100%), 8(75%), 6(48%) und 4(47%).
3 zeigt den hydrolytischen Abbau von Oleamid durch die Oleamid-Hydrolase, wobei Ölsäure (cis-9-Octadecensäure) und Ammoniak entsteht.
4 zeigt einen Dixon-Plot der Aktivität der Verbindung 6 (Molar) im Verhältnis zu einem durch die Oleamid-Hydrolase katalysierten Abbau von Oleamid 1 (1/Rate (min/μM)).
5 zeigt den Effekt von Verbindung 11(Molar) auf die Oleamid-Hydrolase (Rate (μM/min/100μl).
6 zeigt einen Lineweaver-Burke-Plot einer kompetitiven Oleamid-Hydrolase-Hemmung (1/v (min/μM) durch die Verbindung 12
7 zeigt einen Plot der pH-Wertabhängigkeit einer Oleamid-Hydrolase-Spaltung von Verbindung 1 einer relativen Rate in Abhängigkeit vom pH-Wert, wobei die Kurve ersichtliche pKa's von 5,4, 9,7 und 10,3 des aktiven Zentrums zeigt. Die maximale Rate tritt beim pH-Wert 10,0 auf.
8 zeigt bei a) eine in Papain und anderen Cystein- oder Serinproteasen auftretendes Intermediat (O'Leary et al., Biochemistry 1974, 13, 2077–2081); bei b) den möglichen Wirkmodus für die Inhibitoren 3-15.
9 zeigt die chemische Synthese von Zwischenprodukten und Inhibitoren 3, 6, 7, 8, 1024 und 26.
10 zeigt die chemische Synthese von Verbindung 27 aus α-Hydroxycarbonsäure 18.
11 zeigt die chemische Synthese der Hydriert-saturierten Verbindung 11.
12 zeigt die zum Bestimmen der pH-Wertabhängigkeit verwendeten Gleichungen. Die Rate wurde aus dem linearen Teil der Kurve erhalten, die unter der Verwendung eines standardmäßigen Verfahrens mit kleinsten Quadraten erstellt wurde. Diese Raten wurden erneut in Abhängigkeit des pH angetragen und unter Verwendung der gezeigten Gleichung durch ein gewichtetes nichtlineares Verfahren der kleinsten Quadrate erstellt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Eine Reihe potenter Ubergangszustandsimitations- und Mechanismus-basierter Oleamid-Hydrolase-Inhibitoren 2–22 (1–2; 9, 10 und 11) sind hier offenbart und charakterisiert. Diese Inhibitoren sind zur Erforschung und Definition der Funktionen von 1 (1) als ein prototypisches Element einer neuen Klasse biologischer Signalstoffe und der Oleamid-Hydrolase als ein potentiell wichtiger Faktor bei ihrer Regulierung verwendbar.
Die Potenz der Inhibitoren wurde unter der Verwendung einer ionenselektiven Elektrode durch Messung der Ammoniakproduktion als Ergebnis der Hydrolyse von 100 μM Oleamid (⁓20 K_m) durch eine membrangebundene Präparation der Oleamid-Hydrolase bestimmt. Das K_m von Oleamid stellte sich als 5 ± 2 μM heraus. Inhibitionskonstanten wurden durch das Dixon-Verfahren bestimmt (4-6). Abhängig von Einschränkungen der Löslichkeit konnten alle getesteten Inhibitoren eine 100%-igen Hemmung bei hohen Konzentrationen erzielen, und kein Inhibitor zeigte eine polymodale Hemmungscharakteristik von zwei oder mehreren getrennten aktiven Zentren mit unterschiedlichen K_i. Da die Wahrscheinlichkeit, dass zwei oder mehr unterschiedliche Enzyme zweiundzwanzig verschiedene Inhibitoren mit annähernd gleicher Affinität binden, verschwindend gering ist, legt dies stark die Vermutung nahe, dass ein einziges Enzym in der Zubereitung für mehr als 90% der beobachteten Oleamid-Hydrolase-Aktivität verantwortlich ist.
Die potentesten Inhibitoren (1) besitzen eine elektrophile Carbonylgruppe, die zur reversiblen Bildung eines (thio) Halbacetals oder (thio) Halbketals zur Nachahmung des Übergangszustands einer Serin- oder Cystein-Proteasekatalysierten Reaktion (8) fähig ist. Die relativen Potenzen der Inhibitoren folgten gemäß diesem Ergebnis dem erwarteten elektrophilen Charakter der reaktiven Carbonylgruppe. Eine ähnliche Korrelation zwischen Carbonyl-Elektrophilie und Bindungskonstante war bei Inhibitoren der Insect-juvenilen Hormonesterase zu beobachten (Linderman et al., Rev. Pestic. Toxicol. 1991, 1, 261–269) und bei der Anandaminase (Koutek et al., J. Biol. Chem. 1994, 269, 22937–22940). Das elektrophilste Element der Menge, der Tricarbonyl-Inhibitor 11, zeigte jedoch eine relativ schlechte Bindung bei 150 nM. Dieses Verhalten kann das Ergebnis destabilisierender sterischer Wechselwirkungen zwischen dem im Überfluss vorhandenen tert-Butyl-Ester und dem Enzym oder teilweise auch auf den sp²-Charakter bei C-3 zurückzuführen sein, was für das natürliche Substrat uncharakteristisch ist.
Der Grad der Hydratisierung und der relativ elektrophile Charakter der Inhibitor-Carbonylgruppen konnte leicht und exakt durch NMR-Analyse gemessen werden, und folgten den erwarteten Trends (z.B. 11 > 12 > 8 > 6 ≥ 4). Die zentrale Carbonylgruppe des Tricarbonyl-Inhibitors 11 war nach der Präparation und Charakterisierung vollständig hydratisiert: Die verbleibenden Wirkstoffe wurden isoliert und als ihre Carbonylstrukturen ohne Hydratisierung einschließlich den reaktiven Trifluormethylketonen charakterisiert. ¹H NMR und ¹³C NMR wurden zur Bestimmung bzw. Quantifizierung der Addition von CD₃OD oder D₂O zur elektrophilen Carbonylgruppe in CD₃OD bzw. Aceton-d₆ (2) verwendet. Repräsentativ für diese Trends wurden 11 und 12 vollständig in ihre Halbacetale in CD₃OD umgewandelt, und die verbleibenden Wirkstoffe wiesen eine verminderte Halbacetalbildung übereinstimmend mit ihrem erwarteten elektrophilen Charakter auf: 11 (100%), 12 (100%), 8 (75%), 6 (48%) und 4 (47%).
Auch wenn die α-keto-Amide 6 und 7 wahrscheinlich mindestens teilweise als die sp²-keto-Spezies in Lösung existieren, wurden α-keto-Amide in aktiven Zentren von Proteasen beobachtet, die vollständig sp³ waren. In ähnlicher Weise binden Aldehyde im aktiven Zentrum der Cystein-Protease Papain als Thio-Halbacetale (Mackenzie et al., Biochemisitry 1986, 25, 2293–2298, Schultz et al., FEBS Lett. 1975, 50, 47–49). Die Hypothese, dass diese Inhibitoren als (thio-)Halbketale und nicht als gem-Diole (hydratisierte Ketone) binden, wird weiter unterstützt durch die geringe Hemmung der Oleamid-Hydrolase durch 16, 17 und 18, trotz ihrer strukturellen Ähnlichkeit mit gem-Diol. Wir stellen fest, dass zwar Elektrophilie der reaktiven Carbonylgruppe eine große Rolle beim Festlegen der Affinität spielt, mit der diese Inhibitoren an die Oleamid-Hydrolase binden, es aber wahrscheinlich noch andere Faktoren gibt, die ebenfalls einen Einfluss auf die Affinität dieser Verbindungen für die Oleamid-Hydrolase ausüben. Während die Aldehyde 4 und das α-keto-Amid 7 anscheinend gleich elektrophil sind, bindet das α-keto-Amid stärker, was vermuten lässt, dass zusätzliche günstige Wechselwirkungen zwischen dem Enzym und der Amidfunktionalität bestehen, möglicherweise (eine) zusätzliche Wasserstoffbindung(en).
Interessanterweise stellte sich heraus, dass das Aldehyd 5, das eine Carbonyl gruppe an einer zu C-2 von Oleamid analogen Position enthält, sich fünf Mal fester bindet als 4, das die Aldehyd-Carbonylgruppe in der mit C-1 von Oleamid analogen Position aufweist. Diese Unterscheidung war in den α-keto-Amiden oder Trifluormethylketonen nicht zu sehen. In diesen Inhibitorklassen lieferte die Anordnung der elektrophilen Carbonylgruppe am C-2 gegenüber C-1 der Oleamidposition genauso wirksame Inhibitoren. Dies lässt vermuten, dass es für die Analogpositionen der Carbonylgruppe von C-1 gegenüber C-2 feine Unterschiede im Bindungsmodus von Oleamid gibt.
Diese Untersuchungen erbrachten außerdem, dass die Oleamid-Hydrolase eine ungefähr zehn Mal so große Präferenz für Fettsäureinhibitoren aufweist, die bei der Position 9 eine cis-Doppelbindungs-Stereochemie in ähnlicher Weise zum natürlichen Substrat aufweisen.
Die meisten potentiell irreversiblen Inhibitoren (3, 19–21) zeigten keine messbare zeitabhängige Inhibitoraktivität während der ersten fünfzehn Minuten der Inkubation bei Konzentrationen bis zu ihren Löslichkeitsgrenzen. Das Chlormethylketon 3 ergab eine zeitunabhängige, jedoch moderate Hemmung (K_i = 0,7 μM), was mit der Bildung eines reversiblen (thio-) Halbketals zwischen dem vermutlichen Cystein im aktiven Zentrum und dem Keton (Bell et al., Advan. Phys. Org. Chem. 1966, 4, 1–29 und die darin genannten Referenzen) übereinstimmte, oder einen reversiblen und nicht covalenten Enzym-Inhibitor-Komplex. Die Anwesenheit eines benachbarten Chlorsubstituenten verstärkt die Elektrophilie der Carbonylgruppe, was einen nukleophilen Angriff fördert. 2-Chlor-Ölsäure (20, K_i = 0,3 μM) schien auch reversibel zu binden, wobei der Bindungsmodus möglicherweise ähnlich zu Olsäure war (K_i = 6 μM). Diazomethylketon 21 zeigte eine schwächere Bindung (K_i = 18 μM).
Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass 1 ein prototypisches Element einer Klasse biologischer Fettsäure-Primär-Amid-Signalisierungsmoleküle ist, bei denen die Diversität und Selektivität der Funktion von der Länge der Alkylkette sowie von der Position, Stereochemie und dem Grad der Ungesättigtheit abhängt.
Die Rate der enzymkatalysierten Oleamid-Hydrolyse stellte sich als pH-abhängig heraus (7) mit pK_as bei 5,4, 9,7 und 10,3 im aktiven Zentrum. Das ungewöhnliche Profil der Abhängigkeit von pH, Oleamid K_m und die Inhibitionsergebnisse für PMSF stimmen mit Ergebnissen von Maurelli (Maurelli et al., FEBS Lett. 1995, 377, 82–86; Mackenzi et al., Biochemistry 1986, 25, 2293-2298) überein, was vermuten lässt, dass die hier vorgestellte Oleamid-Hydrolase (aus Rattenlebermembranfraktionen) und die Anandamid-Amidhydrolase (aus Maus-Neuroblastoma-Zellkultur-Membranfraktionen), mit Inter-Spezies-Variationen, das gleiche Enzym sein könnte. Ohne Sequenzdaten oder ein gereinigtes Enzym, wobei das Letztere bei integralen Membranproteinen oft schwierig herzustellen ist, bleibt allerdings der Beweis hierfür noch offen. Unsere Ergebnisse unterscheiden sich jedoch erheblich von einem anderen Bericht einer Anandamid-Amidhydrolaseaktivität, die Ratenmaxima bei den pH-Werten 6 und 8 aufwies (Desarnaud et al., J. Biol. Chem. 1995, 270, 6030–6035), so dass es auch Beweise gibt, die für ein Viel-Enzym-Modell einer Fettsäure-Amid-Hydrolyse in vivo sprechen. Die Inhibitoren wurden bei einem pH-Wert von 10,0 getestet, was der pH-Wert ist, bei dem unter unseren Testbedingungen die Oleamid-Hydrolase-Aktivität ihr Maximum hat.
Agonisten-Aktivität
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist auf ein Verfahren zur Induzierung von Schlaf bei einem Oleamid-empfindlichen Tier durch Verabreichen einer wirksamen Dosis eines Agonisten der Oleamid-Hydrolase gerichtet. Ein bevorzugter Agonist ist die Verbindung 6. Die Verbindung 6 wurde in einem Mineralöl gelöst, und eine wirksame Dosis wurde durch intraabdominale Injektion in das Peritoneum einer Ratte injiziert. Der Schlaf wurde über die folgenden vier Stunden überwacht. Die Gesamtschlafzeit wurde durch standardmäßige elektrophysiologische Verfahren bestimmt. Es wurde eine Verlängerung des tiefen orthodoxen Schlafs (slow-wave sleep / SWS) bei einer Verringerung der Wachperiode beobachtet. Es wurde eine Verlängerung des SWS von ungefähr 30% und ein ähnlicher Prozentsatz der Verringerung des Wachzustands beobachtet.
Inhibitorsynthese
Viele der Inhibitoren wurden aus Olsäure durch bekannte Verfahren oder angepasste bekannte Verfahren hergestellt (9). Eine Reaktion des aus Ölsäure hergestellten Säurechlorids (3 Äquivalente (COCl)₂, CH₂Cl₂, 25°C, 3 Stunden) mit Hydroxylamin oder Diazomethan ergab 2 und 21 und eine direkte Kondensation von Olsäure mit Hydrazin (1,1 Aquivalente, 2,2 Aquivalente EDCI, 0,2 Aquivalent DMAP, CH₂Cl₂, 25°C, 19 Stunden) ergab 22. Eine Behandlung von 21 mit wasserfreiem 1 N HCl-EtOAc (25°C, 10 Minuten, 92%) ergab ganz sauber 3. Das Aldehyd 4 (Mancuso et al., J. Org. Chem. 1978, 43, 2480–2482) zusammen mit dem Dimethylacetal 16 (Marx et al., J Med. Chem. 1989, 32, 1319–1322) konnte, wie beschrieben, direkt aus Olsäure hergestellt werden. Ein Einschluss (Trap) des aus der Olsäure abgeleiteten Enolats (LDA, THF) mit CCl₄ oder O₂ ergab 20 (Snider et al., J. Org. Chem. 1987, 52, 307–310) bzw. 18 (Konen et al., J. Org. Chem. 1975, 40, 3253–3258), die in die entsprechenden Primäramide 19 und 17 über eine Säurechloridgeneration (3 Äquivalente (COCl)₂, CH₂Cl₂, 25°C, 3 Stunden) und eine Kondensation mit wässrigem NH₄OH umgewandelt wurden.
Das C-18 Ölsäure-basierte α-Ketoamid 6 und der α-Ketoester 8, die an der zu C-2 des Oleamids analogen Position und nicht bei C-1 eine elektrophile Carbonylgruppe aufwiesen, wurden durch Oxidation des α-Hydroxiamid 17 (PDC) und α-Hydroxysäure 18 (Dess-Martin), gefolgt von einer Ethylesterbildung (9) hergestellt. Das α-Ketoamid 7 einer ähnlichen Länge wurden durch eine Kohlenstoffverlängerung von Ölsäure hergestellt, die durch eine Wolff-Umordnung von 21 (cat. AgOBz, CH₃OH, 25°C, 2,5 Stunden, 82%) verfügbar war, um den Methylester 23 herzustellen. Eine Hydrolyse des Methylesters, gefolgt von einer Umwandlung der C-19-Carboxylsäure 24 in das α-Ketoamid folgte der für 6 angegebenen Vorgehensweise.
Eine oxidative Spaltung der α-Hydroxidsäure 18 (Pb(OAc)₄, 1,1 Äquivalente, 25°C, Benzol, 50 Minuten) ergab Aldehyd 5. Dieses wurde weiter oxidiert (NaClO₂) und ergab die Säure 27, die zur Herstellung von 13 verwendet wurde.
Der Tricarbonylinhibitor 11 wurde den von Wasserman (Wasserman et al., Tetrahedron Lett. 1992, 33, 6003–6006) angegebenen Prozeduren folgend hergestellt. Eine Behandlung des aus Palmitinsäure abgeleiteten Säurechlorids mit tert-Butyl (Triphenylphosphoranyliden)-Acetat (29) in Anwesenheit von bis(Trimethylsilyl)Acetamin (BSA), gefolgt von einer Oxon-Oxidation, ergab 11 (11).
Potente Inhibitoren des Enzyms Oleamid-Hydolyse, das für die Hydrolyse eines endogenen schlafinduzierenden Lipids (1, cis-9-Octadecenamid) verantwortlich ist, wurden entwickelt, wobei sich Einsichten in den Mechanismus des Enzyms und die Grundlage für die Entwicklung von Wirkstoffen für die Steuerung und Regulierung des Schlafs ergaben.
SYNTHESEPROTOKOLLE
Allgemein
Optische Rotationen wurden auf dem Spektrophotometer Perkin-Elmer 241 gemessen, UV und sichtbare Spektren wurden auf dem Beckmann-Spektrometer DU-70 aufgezeichnet. ¹H und ¹³C NMR-Spektren wurden bei 400 und 500 MHz auf dem Bruker-Spektrometer AMX-400 und AMX-500 aufgezeichnet. Hochauflösende Massenspektren (HRMS) wurden auf dem Massenspektrometer VG ZAB-ZSE unter Bedingungen eines schnellen Atombombardements (FAB) aufgezeichnet. Eine Säulenchromatographie wurde mit Kieselsäure-Gel einer Maschenzahl von 70 – 230 durchgeführt. Eine vorbereitende TLC wurde auf Merck Art. 5744 (0,5 mm) durchgeführt.
Synthese der Verbindung 1
Verbindung 1 wurde mittels Verfahren von Cravatt et al., Science 1995, 268, 1506-1509 hergestellt.
Synthese der Verbindung 4
Verbindung 4 wurde mittels Verfahren von Mancuso, A. J. et al., J. Org. Chem. 1978, 43, 2480–2482 hergestellt.
Synthese der Verbindung 16
Verbindung 16 wurde mittels Verfahren von Marx, M. H. et al., J Med. Chem. 1989, 32, 1319–1322 hergestellt.
Synthese der Verbindung 18
Verbindung 18 wurde mittels Verfahren von Konen et al., J Org. Chem. 1975, 40, 3253–3258 hergestellt.
Synthese der Verbindung 20
Verbindung 20 wurde mittels Verfahren von Snider et al., J Org. Chem. 1987, 52, 307–310 hergestellt.
Synthese der Verbindung 29
Verbindung 29 wurde mittels Verfahren von Cooke et al., J Org. Chem. 1982, 47, 4955–4963 hergestellt.
Synthese von N-Hydroxy-9Z-Octadecenamid (2)
Ölsäure (250 μl, 0,79 mMol, 1 Äquivalent) wurde in wasserfreiem CH₂Cl₂ (4 ml) gelöst und unter N₂ auf 0°C abgekühlt. Oxalylchlorid (2 M in CH₂Cl₂, 1,2 ml, 2,4 mMol, 3 Aquivalente) wurde langsam dazugegeben. Die Lösung wurde auf 25°C erwärmt und 3 Stunden im Dunkeln gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und die Flasche auf 0°C abgekühlt. Überschüssiges Hydroxylamin in EtOAc (das Hydrochloridsalz wurde vor der Verwendung in EtAOc aus einer 50%- igen NaOH-Lösung extrahiert) wurde langsam hinzugegeben. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und eine Chromatographie (SiO₂, 1,5 × 13 cm, 33–66% EtOAc-Hexangradientenelution) ergab N-Hydroxy-9Z-Octadecenamid 2 als weißen Feststoff (104 mg, 45%): mp 61–62°C; ¹H NMR (CD₃OD, 400 MHz) δ 5,28–5,20 (m, 2H), 2,00–1,91 (m, 6H), 1,50 (p, 2H, J = 6,8 Hz), 1,22–1,19 (m, 20H), 0,80 (t, 3H, J = 6,9 Hz); ¹³C NMR (CD₃OD, 100 MHz) δ 173,0, 130,9, 130,8, 33,8, 33,1, 30,9(2), 30,6, 30,5, 30,4, 30,33(2), 30,26, 30,19, 28,2, 26,8, 23,8, 14,5; IR (Film) v_max 3276, 2999, 2917, 2849, 1665, 1621, 1463, 1428, 1117, 1067, 968 cm^–1; FABHRMS (NBA-NaI) m/z 320,2577 (C₁₈H₃₅NO₂ + Na⁺ erfordert 320,2565).
Synthese von 1-Chlor-10Z-Nonadec-2-On (3)
Eine Probe von 21 (347 mg, 1,13 mMol, 1 Aquivalent) wurde mit 1 M HCl in EtOAc (4,0 ml, 4,0 mMol, 3,5 Äquivalente) 10 Minuten lang bei 25°C behandelt, bevor die Mischung im Vakuum konzentriert wurde. Eine Chromatographie (SiO₂, 3 × 13 cm, 5% EtOAc-Hexan) ergab 3 (328 mg, 92%) als ein klares Öl: ¹H NMR (CD₃OD, 400 MHz) δ 5,29–5,21 (m, 2H), 4,18 (s, 2H), 2,48 (t, 2H, J = 7,3 Hz), 1,93 (m, 4H), 1,50 (p, 2H, J = 7,1 Hz), 1,31–1,21 (m, 20H), 0,81 (t, 3H, J = 6,8 Hz); ¹³C NMR (CD₃OD, 100 MHz) δ 204,5, 130,9, 130,8, 49,3, 40,3, 33,1, 30,9, 30,8, 30,6, 30,5, 30,40, 30,37, 30,19, 30,17(2), 28,1, 24,6, 23,8, 14,5; IR (Film) v_max 2925, 2854, 1722, 1463, 1403, 1260, 1101, 796, 723 cm^–1'; FABHRMS (NBA) m/z 315,2468 (C₁₉H₃₅OCl + H⁺ erfordert 315,2455).
Synthese von 8Z-Heptadecenal (5)
Eine Lösung von 18 (120 mg, 0,40 mMol, 1 Äquivalent) in wasserfreiem Benzol (1,6 ml) bei 25°C unter N₂ wurde mit Pb(OAc)₄ (197 mg, 0,44 mMol, 1,1 Äquivalente) behandelt und das Reaktionsgemisch wurde 50 Minuten lang gerührt. Wasser (2 ml) wurde hinzugefügt und die wässrige Schicht wurde mit EtOAc (6 × 2 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden getrocknet (Na₂SO₄), gefiltert, und im Vakuum konzentriert. Eine Chromatographie (SiO₂, 2 × 13 cm, 1–5% EtOAc-Hexangradientenelution) ergab 5 (68 mg, 67%) als ein klares Öl. Die Spektraleigenschaften stimmen mit denjenigen überein, die in der Literatur beschrieben sind (Doleshall et al., Tetrahedron Lett. 1977, 381–382; Kemp et al., J. Am. Oil Chem. Soc. 1975, 52, 300–302).
Synthese von 2-Oxo-9Z-Octadecenamid (6)
Eine Lösung von 17 (8 mg, 0,027 mMol, 1 Aquivalent) in wasserfreiem DMF (0,13 ml) unter Ar wurde mit PDC (51 mg, 0,13 mMol, 5 Äquivalente) behandelt, und das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde lang bei 25°C gemischt. Die Rohreaktion wurde mit H₂O (2 ml) behandelt, und die wässrige Schicht wurde mit Et₂O (4 × 2 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden getrocknet (Na₂SO₄), gefiltert und im Vakuum konzentriert. Eine Chromatographie (SiO₂, 1 × 3 cm, 20–66% EtOAc-Hexangradientenelution) ergab 6 (6 mg, 70%) als einen weißen Feststoff und etwas rückgewonnenes Startmaterial (2 mg, 26%). Für 6: mp 85–86°C; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 6,79 (br, 1H), 5,47 (br, 1H), 5,37–5,28 (m, 2H), 2,89 (t, 2H, J = 7,4 Hz), 2,02–1,93 (m, 4H), 1,59 (p, 2H, J = 7,2 Hz), 1,39–1,24 (m, 20H), 0,86 (t, 3H, J = 6,8 Hz); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ 198,6, 161,9, 130,1, 129,6, 36,5, 31,9, 29,7, 29,5(2), 29,3(2), 28,9(2), 27,2, 27,1, 23,1, 22,7, 14,1; IR (Film) v_max 3391, 2915, 2850, 1716, 1668, 1470, 1400, 1108 cm^–1; FABHRMS (NBA-CsI) m/z 428,1547 (C₁₈H₃₃NO₂ + Cs⁺ erfordert 428,1566).
Synthese von 2-Oxo-10Z-Nonadecenamid (7)
Eine Lösung von 26 (42 mg, 0,14 mMol, 1 Äquivalent) in wasserfreiem CH₂Cl₂ (2,8 ml) bei 25°C wurde mit o-Ph(CO₂)I(Oac)₃ (174 mg, 0,41 mMol, 3 Äquivalente) behandelt und das Reaktionsgemisch wurde 1,5 Stunden lang gerührt. Die Mischung wurde mit 10% wässrigem NaOH (30 ml) behandelt und die wässrige Schicht wurde mit EtOAc (3 × 30 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden getrocknet (Na₂SO₄), gefiltert und im Vakuum konzentriert. Eine Chromatographie (SiO₂, 1,5 × 13 cm, 10–20% EtOAc-Hexangradientenelution) ergab 7 (24 mg, 57%) als einen weißen Feststoff: mp 69–70°C; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 6,82 (br, 1H), 5,68 (br, 1H), 5,36–5,28 (m, 2H), 2,88 (t, 2H, J = 7,4 Hz), 1,98 (m, 4H), 1,58 (p, 2H, J = 7,0 Hz), 1,28–1,24 (m, 20H), 0,85 (t, 3H, J = 6,9 Hz); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ 198,7, 162,0, 130,0, 129,7, 36,5, 31,9, 29,74, 29,66, 29,5, 29,3(2), 29,2, 29,1, 29,0, 27,2, 27,1, 23,1, 22,7, 14,1; IR (Film) v_max 3395, 3217, 2922, 2850,1718, 1672, 1601, 1469, 1406, 1115 cm^–1; FABHRMS (NBA-NaI) m/z 332,2570 (C₁₉H₃₅NO₂ + Na⁺ erfordert 332,2565).
Synthese von tert-Butyl 3-Oxo-2,2-dihydroxyoctadecanoat (11)
Eine Lösung von 28 (161 mg, 0,26 mMol, 1 Äquivalent) in THF-H₂O (2:1; 3 ml) wurde mit Oxon (249 mg, 0,41 mMol, 1,6 Aquivalente) behandelt und die Reaktionsmischung wurde bei 25°C 7 Stunden lang gerührt. Wasser (30 ml) wurde zugegeben und die wässrige Schicht mit EtOAc (3 × 30 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden kombiniert, getrocknet (NazSO₄), gefiltert und im Vakuum konzentriert. Eine Chromatographie (SiO₂, 2 × 15 cm, 10–20% EtOAc-Hexangradientenelution) ergab 11 (65 mg, 64%) als einen weißen Feststoff; mp 49-51 °C; ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 6,96 (s, 2H), 2,17 (t, 2H, J = 7,4 Hz), 1,49–1,38 (m, 11H), 1,22 (s, 24H), 0,84 (t, 3H, J = 6,8 Hz);¹³C NMR (DMSO-d₆, 100 MHz) δ 205,6, 174,5, 94,2, 81,5, 35,6, 33,6, 31,3, 29,0(3), 28,9, 28,8, 28,72, 28,70, 28,53, 28,46, 27,4(2), 24,5, 22,9, 22,1, 13,9; IR (Film) v_max 3440, 2914, 2849, 1728, 1471, 1371, 1260, 1122, 831, 718 cm^–1; FABHRMS (NBA-NaI) m/z 409,2925 (C₂₂H₄₂O₅ + Na⁺ erfordert 409,2930).
Synthese von 2-Hydroxy-9Z-Ocatdecenamid (17)
Eine Lösung von 18 (52 mg, 0,18 mMol, 1 Äquivalent) in wasserfreiem CH₂Cl₂ (0,7 ml), unter N₂ auf 0°C abgekühlt, wurde mit Oxalylchlorid (2 M in CH₂Cl₂, 0,22 ml, 0,44 mMol, 3 Äquivalente) behandelt. Die Lösung wurde auf 25°C erwärmt und 3 Stunden lang im Dunkeln gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und das Säurechlorid auf 0°C abgekühlt. Die Probe wurde mit überschüssig konzentriertem wässrigem NH₄OH behandelt. Eine Chromatographie (SiO₂, 1,5 × 10 cm, 66–100% EtOAc-Hexangradientenelution) ergab 17 (31 mg, 60%) als einen weißen Feststoff; mp 103–104°C, ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 6,37 (br, 1H), 5,64 (br, 1H), 5,36–5,28 (m, 2H), 4,12 (t, 1H, J = 3,8 Hz), 2,66 (br, 1H), 2,02–1,94 (m , 4H), 1,86–1,77 (m, 1H), 1,68–1,59 (m, 1H), 1,43–1,24 (m, 20H), 0,86 (t, 3H, J = 6,8 Hz); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ 176,6, 130,0, 129,7, 71,9, 34,8, 31,9, 29,7, 29,6, 29,5, 29,3(2), 29,2, 29,1, 27,2, 27,1, 24,9, 22,7, 14,1; IR (Film) v_max 3381, 3289, 2917, 2848, 1637, 1461, 1417, 1331, 1074 cm^–1; FABHRMS (NBA) m/z 298,2760 (C₁₈H₃₅NO₂ + H⁺ erfordert 298,2746).
Synthese von 2-Chlor-9Z-Octadecenamid (19)
Eine Lösung von 20 (48 mg, 0,15 mMol, 1 Äquivalent) in wasserfreiem CH₂Cl₂ (0,7 ml), unter N₂ auf 0°C abgekühlt, wurde mit Oxalylchlorid (2 M in CH₂Cl₂, 0,23 ml, 0,46 mMol, 3 Äquivalente) behandelt. Die Lösung wurde auf 25°C erwärmt und 3 Stunden lang im Dunkeln gerührt, bevor das Lösungsmittel im Vakuum entfernt wurde. Das rohe Säurechlorid wurde auf 0°C abgekühlt und mit überschüssig konzentriertem wässrigem NH₄OH behandelt. Eine Chromatographie (SiO₂, 1,5 × 10 cm, 20–33% Et OAc-Hexangradientenelution) ergab 19 (37 mg, 78%) als einen gelben Feststoff: mp 49–50°C; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 6,49 (br, 1H), 5,92 (br, 1H), 5,36–5,27 (m, 2H), 4,29 (m, 1H), 2,12–1,86 (m, 6H), 1,53-1,16 (m, 20H), 0,85 (t, 3H, J = 6,9 Hz); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ 171,9, 130,1, 129,6, 60,6, 35,5, 31,9, 29,7, 29,6, 29,5, 29,3(2), 29,0, 28,7, 27,2, 27,1, 25,8, 22,7, 14,1; IR (Film) v_max 3383, 3183, 3001, 2921, 2850, 1657, 1465, 1412, 1240, 1100 cm^–1; FABHRMS (NBA) m/z 316,2415 (C₁₈H₃₄NOCl + H⁺ erfordert 316,2407).
Synthese von 1-Diazo-10Z-Nonadecen-2-on (21)
Ölsäure (1,0 ml, 3,2 mMol, 1 Aquivalent) wurde in wasserfreiem CH₂Cl₂ (15 ml) unter N₂ gelöst. Die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und Oxalylchlorid (2 M in CH₂Cl₂, 4,8 ml, 9,6 mMol, 3 Äquivalente) wurde zugefügt. Die Reaktionsmischung wurde auf 25°C erwärmt und 3 Stunden lang im Dunkeln gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, bevor das Säurechlorid in eine Flasche ohne geschliffene Glasverbindungen verbracht und auf 0°C abgekühlt wurde. Überschüssiges Diazomethan in Et₂O (aus N-Nitrosomethylharnstoff in 50% wässrigem KOH und Trocknung über KOH-Pellets) wurde zugefügt. Die Reaktion wurde bei 0°C 1 Stunde lang gerührt, bevor sie über Nacht auf 25°C erwärmt wurde. Die Lösung wurde mit EtOAc (60 ml) verdünnt und mit gesättigtem wässrigem NaHCO₃ (60 ml) und gesättigtem wässrigem NaCl (60 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (Na,SO₄), gefiltert und im Vakuum konzentriert. Eine Chromatographie (SiO₂, 4,0 × 16 cm, 5–10% EtOAc-Hexangradientenelution) ergab 21 (0,89 g, 92%) als ein gelbes Öl: ¹H NMR (CD₃OD, 400 MHz) δ 5,72 (br, 1H), 5,29–5,21 (m, 2H), 2,23 (m, 2H), 1,94 (m, 4H), 1,50 (p, 2H, J = 6,9 Hz), 1,23–1,20 (m, 20H), 0,81 (t, 3H, J = 6,9 Hz);¹³C NMR (CD₃OD, 100 MHz) δ 198,8, 130,9, 130,8, 41,6, 33,1, 30,9, 30,8(2), 30,6, 30,5, 30,4(2), 30,3, 30,2, 28,1(2), 26,5, 23,8, 14,5; IR (Film) v_max 3083, 2924, 2854, 2102, 1644, 1463, 1372, 1144 cm^–1; FABHRMS (NBA) m/z 307,2738 (C₁₉H₃₄N₂O + H⁺ erfordert 307,2749).
Synthese von N-Amino-9Z-Octadecenamid (22)
Eine Lösung von Ölsäure (250 μl, 0,79 mMol, 1 Äquivalent) und Hydrazinmonohydrat (42 μl, 0,87 mMol, 1,1 Äquivalente) in wasserfreiem CH₂Cl₂ (12 ml} unter N₂ bei 0°C wurde mit EDCI (267 mg, 0,90 mMol, 1,1 Äquivalente) und DMAP (20 mg, 0,16 mMol, 0,21 Äquivalente) behandelt, bevor die Reaktionsmischung bei 25°C 7 Stunden lang gerührt wurde. Ein weiterer Teil von EDCI (269 mg, 0,91 mMol, 1,1 Äquivalente) wurde zugefügt und die Reaktion bei 25°C zusätzliche 12 Stunden lang gerührt, bevor das Lösungsmittel im Vakuum entfernt wurde. Eine Chromatographie (SiO₂, 3 × 18 cm, 20–100% EtOAc-Hexangradientenelution) ergab 22 (123 mg, 52%) als einen weißen Feststoff: mp 95–96°C; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 8,94 (s, 1H), 5,36–5,27 (m, 2H), 2,23 (t, 2H, J = 7,6 Hz), 1,98 (m, 4H), 1,63 (p, 2H, J = 7,0 Hz), 1,27–1,24 (m, 20H), 0,86 (t, 3H, J = 6,7 Hz); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ 169,7, 130,0, 129,7, 34,1, 31,9, 29,8, 29,7, 29,5, 29,3(2), 29,23, 29,19, 29,12, 27,21, 27,17, 25,4, 22,7, 14,1; IR (Film) v_max 3201, 2917, 2848, 1595, 1410, 1184, 1090, 927, 717, 671 cm^–1; FABHRMS (NBA-NaI) m/z 297,2916 (C₁₈H₃₆N₂O + H⁺ erfordert 297,2906).
Synthese von Methyl-10Z-Nonadecenoat (23)
Ein Lösung von Silberbenzoat (21,8 mg, 0,095 mMol, 0,1 Äquivalente) und wasserfreiem Et₃N (0,19 ml, 1,36 mMol, 1,4 Äquivalente) wurde tropfenweise hinzugegeben zu einer Lösung von 1-Diazo-10Z-Nonadecen-2-On (21, 298 mg, 0,97 mMol, 1 Äquivalent) in wasserfreiem CH₃OH (1,5 ml) unter N₂ und die Reaktion bei 25°C 2,5 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit EtOAc (30 ml) verdünnt und mit 1N wässrigem HCl (30 ml) und gesättigtem wässrigem NaHCO₃ (30 ml) gewaschen. Die organischen Schichten wurden getrocknet (NaSO₄), gefiltert und im Vakuum konzentriert. Eine Chromatographie (SiO₂, 3 × 15 cm, 1–5% EtOAc-Hexangradientenelution) ergab 23 (246 mg, 82%) als ein klares Öl: ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 5,35–5,27 (m, 2H), 3,63 (s, 3H), 2,27 (t, 2H, J = 7,6 Hz), 1,97 (m, 4H), 1,59 (p, 2H, J = 7,3 Hz), 1,26–1,24 (m, 22H), 0,85 (t, 3H, J = 6,8 Hz);¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ 174,3, 129,9, 129,8, 51,4, 34,1, 31,9, 29,74, 29,70, 29,5 29,3(2), 29,2(2), 29,1(2), 27,2(2), 24,9, 22,6, 14,1; IR (Film) v_max 2925, 2854, 1744, 1465, 1436, 719 cm^–1; FABHRMS (NBA-NaI) m/z 311,2969 (C₂₀H₃₈O₂ + H⁺ erfordert 311,2950).
Synthese von 10Z-Nonadecensäure (24)
Eine Lösung von 23 (620 mg, 2,0 mMol, 1 Äquivalent) in THF-CH₃OH-H₂O (3:1:1; 7 ml) bei 25°C wurde mit LiOH H₂O (250 mg, 5,96 mMol, 3 Äquivalente) behandelt und die Reaktionsmischung 3 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde unter Zugabe von 1 N wässrigem HCl (60 ml) angesäuert und die wässrige Schicht mit EtOAc (2 × 60 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden getrocknet (Na₂SO₄), gefiltert und im Vakuum konzentriert. Eine Chromatographie (SiO₂, 4 × 15 cm, 10–100% EtOAc-Hexangradientenelution) ergab 24 (510 mg, 86%) als ein hellgelbes Öl: ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 5,37–5,28 (m, 2H), 2,32 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 1,98 (m, 4H), 1,61 (p, 2H, J = 7,3 Hz), 1,27–1,25 (m, 22H), 0,86 (t, 3H, J = 6,9 Hz); ¹3C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ 180,4, 130,0, 129,8, 34,1, 31,9, 29,8, 29,7, 29,5, 29,3(2), 29,2(2), 29,0(2), 27,20, 27,17, 24,6, 22,7, 14,1; IR (Film) v_max 2925, 2854, 1711, 1466, 1412, 1260, 1093, 1019, 938, 801, 722 cm^–1; FABHRMS (NBA-NaI) m/z 319,2605 (C₁₉H₃₆O₂ + Na⁺ erfordert 319,2613). Diese Verbindung kann alternativ auch durch das Verfahren von Doleshall, G. Tetrahedron Lett. 1980, 21, 4183–4186 hergestellt werden.
Synthese von 2-Hydroxy-10Z-Nonadecensäure (25)
Eine frische Lösung von LDA wurde bei –55°C unter Ar aus Diisopropylamin (0,4 ml, 2,9 mMol, 4,5 Äquivalente) und n-BuLi (2,3M, 1,1 ml, 2,5 mMol, 4 Äquivalente} in wasserfreiem THF (2 ml) hergestellt. Eine Lösung von 10Z-Nonadecensäure (24, 188 mg, 0,63 mMol, 1 Äquivalent) und wasserfreiem HMPA (0,11 ml, 0,63 mMol, 1 Aquivalent) in THF (0,5 ml) wurde tropfenweise zur LDA-Lösung bei –55°C zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde allmählich auf 25°C erwärmt und bei 50°C 30 Minuten lang gewärmt. Nachdem die Reaktionsmischung wieder auf 25°C abgekühlt war, wurde 20 Minuten lang O₂ durch die Mischung hindurch gesprudelt. Die Mischung wurde mit 1N wässrigem HCl (30 ml) behandelt und die wässrige Schicht mit EtOAc (3 × 30 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden getrocknet (Na₂SO₄), gefiltert und im Vakuum konzentriert. Eine Chromatographie (SiO₂, 2 × 13 cm, 50–100% EtOAc-Hexangradientenelution) ergab 25 (96 mg, 49%) als einen weißen Feststoff: mp 53-54°C, ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 5,36, 5,28 (m, 2H), 4,24 (dd, 1H, J = 7,5 Hz, 7,6 Hz), 1,98 (m, 4H), 1,83 (m, 1H), 1,67 (m, 1H), 1,47–1,24 (m, 22H), 0,86 (t, 3H, J = 6,8 Hz); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ 179,8, 130,0, 129,7, 70,2, 34,2, 31,9, 29,8, 29,7, 29,5, 29,33, 29,31(2), 29,22, 29,19, 27,20, 27,16, 24,8, 22,7, 14,1; IR (Film) v_max 3512, 2917, 2849, 1704, 1467, 1293, 1274, 1251, 1212, 1143, 1079, 1041, 918, 726, 648 cm^–1; FABHRMS (NBA-NaI) m/z 335,2574 (C₁₉H₃₅O₃ + Na⁺ erfordert 335,2562).
Synthese von 2-Hydroxy-10Z-Nonadecenamid (26)
Eine Lösung aus 25 (71 mg, 0,23 mMol, 1 Äquivalent) in wasserfreiem CH₂Cl₂ (1,5 ml) wurde unter N₂ auf 0°C abgekühlt und tropfenweise mit Oxalylchlorid (2 M in CH₂Cl₂, 0,34 ml, 0,68 mMol, 3 Äquivalente) behandelt. Die Reaktionsmischung wurde auf 25°C erwärmt und 3 Stunden lang im Dunkeln gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, der Rest kühlte auf 0°C aus, und überschüssig konzentriertes wässriges NH₄OH (2 ml) wurde zugefügt. Eine Chromatographie (SiO₂, 1,5 × 13 cm, 50–66% EtOAc-Hexangradientenelution) ergab 26 (53 mg, 75%) als einen weißen Feststoff: mp 101–102°C; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 6,36 (br, 1H), 5,65 (br, 1H), 5,36–5,28 (m, 2H), 4,12 (dd, 1H, J = 7,9 Hz, 8,0 Hz), 1,99 (m, 4H), 1,81 (m, 1H), 1,63 (m, 1H), 1,43–1,24 (m, 22H), 0,86, (t, 3H, J = 6,9 Hz); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ 176,6, 130,0, 129,8, 71,9, 34,8, 31,9, 29,8, 29,7, 29,5, 29,4, 29,3(3), 29,2, 27,20, 27,16, 24,9, 22,7, 14,1; IR (Film) v_max 3383, 3290, 2917, 2849, 1644, 1467, 1426, 1331, 1075 cm^–1; FABHRMS (NBA-NaI) m/z 334,2731 (C₁₉H₃₇NO₂ + Na⁺ erfordert 334,2722).
Synthese von 8Z-Heptadecensäure (27)
Eine Lösung von 5 (66 mg, 0,26 mMol, 1 Äquivalent) und 2-Methyl-2-Buten (1,6 ml, 15,1 mMol, 58 Äquivalente) in tBuOH (6,5 ml) bei 25°C unter N₂ wurde tropfenweise mit einer Lösung aus NaClO₂ (80%, 208 mg, 2,3 mMol, 9 Äquivalente) und NaH₂PO₄ H₂O (250 mg, 1,8 mMol, 7 Äquivalente) in entionisiertem H₂O (2,5 ml) behandelt. Die Reaktionsmischung wurde zusätzliche 15 Minuten gerührt, bevor sie im Vakuum konzentriert wurde. Der Rest wurde mit Wasser (30 ml} behandelt und die wässrige Schicht mit EtOAc (3 × 30 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden getrocknet (Na₂SO₄), gefiltert und im Vakuum konzentriert. Eine Chromatographie (SiO₂, 2 × 13 cm, 10–20% EtOAc-Hexangradientenelution) ergab 27 (66 mg, 95%) als ein klares Öl. Die Spektraleigenschaften stimmen mit denjenigen überein, die in den Druckschriften Mirallès et al., Lipids 1995, 30, 459–466; und Couderc et al., Lipids 1995, 30, 691-699, beschrieben sind.
3-Oxo-2-(Triphenylphosphoranyliden)Octadecenoat (28)
Eine Lösung aus Palmitinsäure (103 mg, 0,40 mMol, 1 Äquivalent) in wasserfreiem CH₂Cl₂ (2 ml) wurde unter N₂ auf 0°C abgekühlt und mit Oxalylchlorid (2 M in CH₂Cl₂, 0,6 ml, 1,2 mMol, 3 Äquivalente) behandelt. Die Lösung wurde bei 25°C 3 Stunden lang gerührt, bevor das Lösungsmittel im Vakuum entfernt wurde. Eine Lösung aus tert Butyl(Triphenylphosphoranyliden)Acetat (Cooke et al., J. Org. Chem. 1982, 47, 4955–4963) 29, 167 mg, 0,44 mMol, 1,1 Äquivalente) und bis(Trimethylsilyl)Acetamid (195 μl, 0,79 mMol, 2 Aquivalente) in wasserfreiem Benzol (3 ml) bei 5°C wurde tropfenweise mit einer Lösung des rohen Säurechlorids in Benzol (3 ml) behandelt. Die Reaktionsmischung wurde auf 25°C erwärmt und 1,5 Stunden lang gerührt, bevor das Lösungsmittel im Vakuum entfernt wurde. Eine Chromatographie (SiO₂, 2 × 15 cm, 10–20% EtOAc-Hexangradientenelution) ergab 28 (193 mg, 78%) als ein klares Öl: ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 7,67–7,61 (m, 6H), 7,49–7,37 (m, 9H), 2,82 (t, 2H, J = 7,6 Hz), 1,55 (p, 2H, J = 7,0 Hz), 1,23–1,21 (m, 24H), 1,04 (s, 9H), 0,86 (t, 3H, J = 6,8 Hz); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ 197,9 (d, J = 6 Hz), 167,3 (d, J = 13 Hz), 132,9 (d, 6C, J = 9 Hz), 131,3(3), 128,4 (d, 6C, J = 12 Hz), 127,4 (d, 3C, J = 96 Hz), 78,4, 71,2 (d, J = 114 Hz), 40,0, 31,9, 29,70(8), 29,66, 29,3, 28,1(3), 25,9, 22,7, 14,1; IR (Film) v_max 3426, 2923, 2852, 1665, 1551, 1438, 1363, 1302, 1173, 1106, 1081, 746, 690 cm^–1; FABHRMS (NBA-CsI) m/z 615,3959 (CaoHssO₃P + H⁺ erfordert 615.3967).
Bestimmung von Bindungskonstanten
Die Potenz dieser Verbindungen gegenüber der Oleamid-Hydrolyse wurde unter der Verwendung einer ionenselektiven Ammoniakelektrode (ATI/Orion) zum direkten Messen von Ammoniakbildung als dem Reaktionsprodukt bestimmt. Alle K_i außer für dasjenige von Ölsäure wurden durch das Dixon-Verfahren bestimmt. (X Messungen gewichteter linearer Verläufe von [I] in Abhängigkeit von 1/Rate bei einer konstanten Substratkonzentration wurden in K_i umgewandelt, wobei die Formel I_i = –X_int / [1 + [S]/K_m] zur Anwendung kam.) Das Ölsäure-K_i wurde aus einem nicht linearen gewichteten Verlauf nach dem Verfahren der kleinsten Quadrate der Rate in Abhängigkeit von Substrat- und Inhibitorkonzentrationen erhalten. Die Versuche wurden unter konstantem Rühren in 10 ml 50 mM CAPS-Puffer (Sigma) durchgeführt, der auf einen pH-Wert 10,0 eingestellt war, den pH-Wert, bei dem die Rate der enzymkatalysierten Oleamid-Hydrolase maximal ist. In allen Fällen, in denen eine Dixon-Analyse zum Einsatz kam, war die Substratkonzentration 100 μM. Das Ölsäure-K_i wurde über einen Bereich von Substratkonzentrationen zwischen 10 und 100 μM bestimmt. Das Substrat und die Inhibitoren wurden in DMSO gelöst, bevor sie in den 50-mM-CAPS-Puffer gegeben wurden, wobei eine letztendliche DMSO-Versuchskonzentration von 1,67% entstand. Konzentrationen von bis zu 20% DMSO zeigten nur geringfügige Auswirkungen auf die Rate. Die Enzymkonzentration wurde so eingestellt, dass dabei eine Rate von ungefähr 0,2 μM/min in Abwesenheit des Inhibitors entstand, und die Rate der Ammoniakproduktion wurde über einen Zeitraum von 7 bis 10 Minuten beobachtet.
Das Enzym wurde als ein rohes, heterogenes, Membran-enthaltendes Präparat aus Rattenleber verwendet. Über 5 Minuten gekochtes Enzym zeigte keinerlei Aktivität. Innerhalb der Löslichkeitsgrenzen erreichten alle Inhibitoren eine 100%-ige Hemmung der Aktivität bei Konzentrationen von mehr als 100 K_i. Keinerlei erkennbare Aktivität wurde in Abwesenheit von Oleamid festgestellt. Ebenso wurde nur eine höchst minimale Rate einer Ammoniakproduktion von 100 μM Oleamid in der Abwesenheit des Enzyms bei diesem pH-Wert beobachtet. Dies lässt vermuten, dass die in diesem rohen Enzym-Präparat zu beobachtende katalytische Oleamid-Hydrolyse-Aktivität aufgrund eines einzigen Proteins zustande kommt.
Das K_m für Oleamid wurde als das durchschnittliche K_m bestimmt, das aus vier verschiedenen Versuchen erhalten wurde. Jeder eigene K_m wurde aus einem gewichteten linearen Verlauf von Daten in einem Lineweaver-Burke-Plot erhalten. Ein fünftes gleichzeitiges K_m wurde als Ergebnis der Bestimmung einer Ölsäureinhibition durch nicht lineare Verfahren erhalten. Die Ratendaten wurden mit der standardmäßigen kinetischen Michaelis-Menten-Gleichung in einen Verlauf gebracht. (Die Gleichung für die Rate einer Ping-Pong-Bi-Bi-Kinetik kollabiert zu einer einfachen Michaelis-Menten-ähnlichen Gleichung, wenn die Konzentration des zweiten Substrats, in diesem Fall Wasser, konstant ist.) Im Bereich von 30 – 100 μM hat die Reaktionsrate im Wesentlichen eine Abhängigkeit nullter Ordnung von der Substratkonzentration.
Da es bis jetzt noch nicht möglich war, die Menge der Oleamid-Hydrolase zu bestimmen, die in der Enzymprobe vorhanden ist, geben wir hier keine Werte für V_max an. Unsere Inhibitionsdaten lassen vermuten, dass die Enzymkonzentration niedriger als 2 nM ist, da höhere Enzymkonzentrationen eine beträchtliche Abreicherung des Inhibitors in der Lösung verursacht hätten, was im einschränkenden Fall von [E] » K_i dazu geführt hätte, dass das in Erscheinung tretende K_i als [E]/2 gemessen worden wäre. Da 1 nM die niedrigste Inhibitionskonstante war, gilt: [E] < 2 nM.
Bei K_i auftretende Fehler sollten als Verlaufsgüteschätzungen (goodness of fit) betrachtet werden, die aus einer Behandlung der Daten auf eine Fehlerausbreitung abgeleitet sind. Sie sind nicht notwendigerweise ein Zeichen für Wiederholbarkeit. In Fällen, wo Experimente wiederholt wurden, waren die Ergebnisse jedoch statistisch stimmig, wie auch durch die hier angegebenen Fehlerwerte vorhergesagt.
pH-Ratenabhängigkeit
Das rohe Enzym wurde einer Lösung von 200 μM Oleamid (ungefähr die Löslichkeitsgrenze) 1 in einem 20-ml-Puffer, der 5% DMSO enthielt, beim entsprechenden pH-Wert zugefügt. (Konzentrationen von bis zu 20% DMSO hatten nur minimale Auswirkungen auf die Enzymraten.) Ein 50-mM-Natriumcitrat/Bis-Tris-Puffer wurde für Datenpunkte im pH-Wertebereich von 4–9 verwendet. Ein 50-mM-Bis-Tris/CAPS wurde für Datenpunkte im Bereich von 8–11 verwendet. Beim pH-Wert 12 wurde angenommen, dass die Lösung selbstpuffernd ist. In regelmäßigen Zeitabständen wurden 1 ml aliquote Teile entfernt und mit 9 ml Puffer bei einem pH-Wert 14 verdünnt. Ammoniakkonzentrationen wurden mit einer ionenselektiven Ammoniakelektrode (Orion) gemessen, die an einen 720A-Messer (Orion) angeschlossen war, der auf bekannte Standards kalibriert war. Die Rate wurde aus dem linearen Teil der Kurve erhalten, die unter der Verwendung eines standardmäßigen Verfahrens der kleinsten Quadrate erstellt wurde. Diese Raten wurden erneut in Abhängigkeit vom pH-Wert aufgetragen und mit der Gleichung von 12 in eine Kurve gebracht (Fersht, A., Enzyme Structure and Mechnism; W. H. Freeman and Co.: New York, 1985, S. 157; Conners, K. A., Binding Constants; Wiley: New York, 1987, S. 385–395) durch ein gewichtetes nicht lineares Verfahren der kleinsten Quadrate (Conners, K. A., Binding Constants; Wiley: New York, 1987, S. 385–395).
In Fällen, wo zwei pKa nahe (weniger als eine Einheit) beieinander lagen, tritt eine beträchtliche Durchmischung verschiedener Spezies in der Lösung vorhandener Enzyme auf. Unter diesen Bedingungen kann eine Manifestation des theoretischen Ratenmaximums dieser Spezies vielleicht nie richtig beobachtet werden, weil die aktivsten Spezies des Enzyms vielleicht nie einen hohen Grad der Abundanz erreichen. Aus diesem Grund kann es vorkommen, dass einfache grafische Verfahren zur Bestimmung von pKa's nicht mit den hier angegebenen pH-Werten 9,7 und 10,3 übereinstimmen.
Leberplasma-Membranpräparat, große Anzahl (12–14 Rattenlebern)
Zwölf bis vierzehn Rattenlebern wurden seziert und in 300 ml von 1 mM NaHCO₃ gelegt. Die Lösung der geschnittenen Leber wurde abgegossen und mit zusätzlichen 300 ml 1 mM NaHCO₃ gewaschen. Sichtbares Bindegewebe wurde entfernt. Die Leber wurde in frische 800 ml 1 mM NaHCO₃ verbracht, gerührt und dann in aliquoten Teilen von 400 ml in einen Mixer gegeben. Die gemischten aliquoten Teile der Leber wurden kombiniert und durch 8 Schichten Mull gefiltert. Dies wurde dann mit 1 mM NaHCO₃ auf 1,0 1 verdünnt und 20 Minuten lang bei 6000 U/min bei 4°C zentrifugiert (Beckman JA-17-Rotor). Die überstehende Flüssigkeit wurde dekantiert, die Pellets in 1 mM NaHCO₃ resuspendiert, kombiniert und Dounce-homogenisiert. Die Zentrifugierung, Dekantierung und Resuspension/Homogenisierung wurden wiederholt, um schließlich zu einem Volumen von ungefähr 90 ml zu gelangen. Das Homogenat wurde zu 2 Volumenäquivalenten von 67% Sukrose hinzugegeben, gründlich vermengt und in ultrazentrifugenkompatible Röhren verbracht. Die Röhren wurden mit 30% Sukrose aufgefüllt und 2 Stunden lang bei 27.000 U/min rotiert (SW-28-Rotor). Das mittlere gelbe Band wurde vom Sukrosegradienten entfernt, kombiniert, in 1 mM NaHCO₃ resuspendiert und Dounce-homogenisiert. Die Probe wurde weiter 45 Minuten lang bei 17.000 U/min und 4°C zentrifugiert (JA-17-Rotor). Die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt, die Pellets in 100 mM Na₂CO₃ resuspendiert, Dounce-homogenisiert und 30 Minuten lang auf Eis ruhen gelassen. Die Lösung wurde 1 Stunde lang bei 27.000 U/min zentrifugiert (SW-28-Rotor), die überstehende Flüssigkeit wurde dekantiert und die Pellets in 15 ml von 50 mM Tris HCl, pH 7,4 mit 1 mM EDTA resuspendiert und mit einem Dounce-Homogenisierer homogenisiert. Dieses Material wurde in mehrere aliquote Teile aufgeteilt und bis zur Verwendung bei –78°C eingefroren. Jede Enzymprobe wurde nur ein Mal eingefroren.

Claims

Inhibitor für Oleamidhydrolase, welcher Inhibitor eine Kopfgruppe und eine Kohlenwasserstoffkette, die an die Kopfkette covalent gebunden ist, aufweist, bei welchem die Kopfgruppe eine elektrophile Carbonylgruppe aufweist und aus einer Gruppe bestehend aus Radikalen, die durch die folgenden Strukturen repräsentiert sind, ausgewählt ist:
und bei welcher die Kohlenwasserstoffkette aus einer Gruppe bestehend aus Radikalen, die durch die folgenden Strukturen repräsentiert werden, ausgewählt ist:
Inhibitor für Oleamidhydrolase, die durch eine Struktur, ausgewählt aus den folgenden Strukturen repräsentiert ist:
Verwendung eines Inhibitors mit einer Kopfgruppe und einer an die Kopfgruppe covalent gebundenen Kohlenwasserstoffkette, bei welchem die Kopfgruppe eine elektrophile Carbonylgruppe aufweist und aus einer Gruppe bestehend aus Radikalen, die durch folgende Strukturen repräsentiert sind, ausgewählt ist:
und bei welcher die Kohlenwasserstoffkette aus einer Gruppe bestehend aus Radikalen, die durch die folgenden Strukturen repräsentiert werden, ausgewählt ist:
bei der Herstellung eines Medikaments zur Auslösung von Schlaf.
Verwendung wie in Anspruch 3 beschrieben, wobei der Inhibitor durch eine Struktur repräsentiert wird, die aus folgenden Strukturen ausgewählt ist.
Verbindung zur Verwendung in der Therapie, insbesondere zum Inhibieren von Oleamidhydrolase durch Kontakt mit der Verbindung, wobei die Verbindung wie in den Ansprüchen 1 oder 2 wiedergegeben ist oder eine Struktur aufweist, wie sie in Anspruch 3 oder 4 wiedergegeben ist.
Verwendung einer Verbindung wie. in Anspruch 1 oder Anspruch 2 beansprucht zur Anwendung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Schlafstörungen.