CN109806249B - 类胡萝卜素在制备激活tmem16a离子通道的产品中的应用、激活剂、试剂盒和药物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种类胡萝卜素在制备激活TMEM16A离子通道的产品中的应用、激活剂、试剂盒和药物，涉及生物技术领域。类胡萝卜素广泛用于医药和食品领域，其生物安全性较高且毒副作用较低，将类胡萝卜素应用于制备激活TMEM16A离子通道的产品，可用于制备实验试剂、试剂盒以及以TMEM16A离子通道为靶点的药物，具有激活效果好和毒副作用低的优点。

Description

类胡萝卜素在制备激活TMEM16A离子通道的产品中的应用、激 活剂、试剂盒和药物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种类胡萝卜素在制备激活TMEM16A离子通道的产品中的应用、激活剂、试剂盒和药物。

背景技术

生物膜离子通道是各种无机离子跨膜被动运输的通路。生物膜对离子的通透性与多种生命活动过程密切相关。例如，感受器电位的发生，神经兴奋与传导和中枢神经系统的调控功能，心脏搏动，平滑肌蠕动，骨骼肌收缩，激素分泌等。

生物体内有多种阴离子如I^-、Br^-、NO₃ ^-、SCN^-、PO₄ ^3-、F^-和Cl^-等，其中Cl^-是含量最多的一种阴离子，Cl^-通道广泛分布在原核和真核细胞等各种细胞，并且Cl^-是细胞内外含量最多的阴离子，因此Cl^-通道是一类非常重要的阴离子通道。

氯离子转运障碍会引起肺囊性纤维化，失聪，肾结石和骨质疏松症等多种疾病。氯离子通道主要包括配体门控氯离子通道、电压门控氯离子通道、cAMP依赖氯离子通道和钙激活氯离子通道。

钙激活氯离子通道(calcium-activatedchloridechannel，CaCCs)是一类广泛表达于内皮细胞、上皮细胞等非兴奋细胞，以及心肌细胞、神经细胞、血管平滑肌细胞等兴奋细胞上的阴离子通道，具有多种重要的生理功能，对膜电位具有敏感性，当细胞质Ca²⁺浓度在100nmol/L到1μmol/L范围内时可以激活CaCCs。

TMEM16A属于钙激活氯离子通道中具有多次跨膜结构的蛋白质家族——TMEM16家族，TMEM16A蛋白质结构具有8个跨膜域，氨基端与羧基端均位于细胞内。TMEM16A在血管上皮细胞、胰腺上皮细胞、唾液腺上皮细胞和支气管粘膜下颌下腺腺泡中有TMEM16A表达，在乳腺和肾小管中也有TMEM16A表达。TMEM16A作为CaCCs中的一种对上皮体液转运、胃肠动力调节、平滑肌收缩等多种生理过程具有重要的作用。因此TMEM16A与多种疾病密切相关。

因此筛选出能够制备激活TMEM16A离子通道的产品对TMEM16A的研究和制备药物具有重要作用。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供类胡萝卜素在制备激活TMEM16A离子通道的产品中的应用，类胡萝卜素对TMEM16A离子通道具有良好的激活作用，可应用于制备TMEM16A离子通道的激活剂或以TMEM16A离子通道作为靶点的药物。

本发明的第二目的在于提供TMEM16A离子通道的激活剂，该激活剂以类胡萝卜素作为活性成分。

本发明的第三目的在于提供包含上述激活剂的试剂盒。

本发明的第四目的在于提供一种以TMEM16A离子通道作为靶点的药物，该药物以类胡萝卜素或其药学上可接受的盐作为活性成分。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

类胡萝卜素在制备激活TMEM16A离子通道的产品中的应用。

优选地，所述类胡萝卜素包括角黄素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、番茄红素、叶黄素、隐黄素、玉米黄质、紫黄素和虾青素中的至少一种；

优选地，所述类胡萝卜素包括角黄素，所述角黄素具有如下结构式：

本发明还提供了一种TMEM16A离子通道的激活剂，该激活剂以类胡萝卜素作为活性成分；

优选地，所述类胡萝卜素包括角黄素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、番茄红素、叶黄素、隐黄素、玉米黄质、紫黄素和虾青素中的至少一种；

优选地，所述类胡萝卜素包括角黄素；

优选地，所述TMEM16A离子通道的激活剂中，角黄素的浓度为10-500μmol/L；优选为10-200μmol/L；更优选为30-100μmol/L。

本发明还提供了一种包含上述TMEM16A离子通道的激活剂的试剂盒。

本发明还提供了一种以TMEM16A离子通道作为靶点的药物，该药物以类胡萝卜素或其药学上可接受的盐作为活性成分；

优选地，所述类胡萝卜素包括角黄素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、番茄红素、叶黄素、隐黄素、玉米黄质、紫黄素和虾青素中的至少一种；

优选地，所述类胡萝卜素包括角黄素。

优选地，所述以TMEM16A离子通道作为靶点的药物治疗的疾病包括肺囊性纤维化、急性肺损伤、胃肠动力学障碍和干燥综合症中的一种或者多种。

优选地，所述以TMEM16A离子通道作为靶点的药物用于治疗肺囊性纤维化，所述药物以角黄素或其药学上可接受的盐作为活性成分。

优选地，所述药物还包括任意的药学领域可接受的辅料；

所述辅料包括稀释剂、填充剂、赋形剂、粘合剂、湿润剂、崩释剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂和香味剂中的一种或多种。

优选地，所述药物的剂型为注射剂、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、微胶囊或口服液。

优选地，所述药物为包含类胡萝卜素或其药学上可接受的盐的微胶囊。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

类胡萝卜素广泛的存在于植物、藻类和微生物中。在植物中，类胡萝卜素主要是以光合色素-蛋白质复合体的形式存在于高等植物中。藻类主要含有β-胡萝卜素，产胡萝卜素的藻类包括地木耳、柱胞鱼腥草、巨大螺旋藻和杜氏藻等。微生物中也普遍存在类胡萝卜素，包括真菌、酵母、霉菌和红螺菌等。类胡萝卜素广泛应用于临床医学、食品和保健品，其生物安全性较高且毒副作用较低。将类胡萝卜素应用于制备激活TMEM16A离子通道的产品，有助于离子通道的实验研究和以TMEM16A离子通道为靶点的药物研发与制备。基于上述发明构思，本发明还提供了TMEM16A离子通道的激活剂、包含TMEM16A离子通道的激活剂的试剂盒和一种以TMEM16A离子通道作为靶点的药物。

离子通道的结构改变和功能异常会导致许多疾病的发生，并且疾病的发生也常常伴随着离子通道的过度激活或者过度抑制，因此以离子通道为靶点的药物已成为药物筛选的重要靶点。TMEM16A离子通道在上皮细胞中为氯离子的分泌提供路径，包括呼吸道上皮、唾液腺、胰腺导管细胞和肠道上皮细胞，对上皮细胞液体分泌的过程十分重要；TMEM16A离子通道在血管收缩和增殖中的作用也十分重要，在冠状动脉、主动脉和肠系膜上动脉具有TMEM16A离子通道的表达；TMEM16A离子通道还参与神经元兴奋及膜电位调节。因此以TMEM16A离子通道作为靶点的药物适用于多种疾病的治疗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中，在转染了TMEM16A质粒和荧光蛋白YFP三突变体YFP-F46L/H148Q/I152L质粒的HEK-293T细胞中，在培养环境中存在150mM I^-的条件下，分别加入角黄素和ATP后细胞中的荧光随时间变化的曲线，其中曲线A为阴性对照组，曲线B为加入角黄素的试验组，曲线C为加入ATP的阳性对照组；

图2A为本发明提供的实施例1中阴性对照组在实验前的荧光强度；

图2B为本发明提供的实施例1中阴性对照组在实验后的荧光强度；

图2C为本发明提供的实施例1加入ATP的阳性对照组在加入ATP前细胞的荧光强度；

图2D为本发明提供的实施例1加入ATP的阳性对照组在加入ATP后细胞的荧光强度；

图2E为本发明提供的实施例1加入角黄素的阳性对照组在加入角黄素前细胞的荧光强度；

图2F为本发明提供的实施例1加入角黄素的阳性对照组在加入角黄素后细胞的荧光强度；

图3为本发明提供的实施例2中不同种类的类胡萝卜素对TMEM16A通道的激活作用；

图4为本发明提供的实施例3中，膜片钳的记录程序中，不同浓度的角黄素下TMEM16A的电流大小，其中a为膜片钳的记录程序：先是将膜电压钳制在0mV，接着给-80到+80不同的阶跃电压，最后膜电压为-80mV，b-h为100nmol至100μmol浓度的角黄素下TMEM16A的电流大小，i为激活电流可被TMEM16A离子通道抑制剂CaCC_inh-A01迅速抑制到初始水平；

图5为本发明提供的实施例3中角黄素激活TMEM16A通道的I-V曲线；

图6为本发明提供的实施例3中角黄素激活TMEM16A通道的量效曲线；

图7为本发明提供的实施例4中细胞增殖结果；

图8为本发明提供的实施例6中小鼠的胸腔液体吸收率。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明提供了一种类胡萝卜素在制备激活TMEM16A离子通道的产品中的应用。TMEM16A在生命过程中扮演重要角色，广泛分布于生物的各种组织中，例如上皮细胞、神经元、乳腺细胞、肌肉细胞、嗅觉和感光细胞和淋巴细胞等，其激活与抑制与多种疾病相关。

类胡萝卜素(carotenoids)是一类呈黄色、橙红色或红色的多烯烃各物质，一般由8个类异戊二烯单位组成。类胡萝卜素为以胡萝卜素为母体衍生得到的一系列的化合物，胡萝卜素具有如结构(Ⅰ)所示结构。类胡萝卜素可以分为胡萝卜素(carotenes)和叶黄素(xanthophylls)两大类：胡萝卜素类为只含有碳氢的类胡萝卜素，叶黄素是氧化了的胡萝卜素，分子含有一个或多个氧原子，形成羟基、羰基、甲氧基或环氧化物。

将类胡萝卜素应用于制备激活TMEM16A离子通道的产品，具有多种用途，例如可以为但不限于为将类胡萝卜素作为实验试剂，应用于以TMEM16A离子通道为靶点的体外的细胞实验或体内的动物实验，以满足实验室对TMEM16A离子通道、CaCCs离子通道以及其他离子通道的机制研究，以进一步揭示离子通道对生物的机体和病理的影响；将类胡萝卜素应用于激活TMEM16A离子通道，还可以作为潜在的药物活性成分，所述药物可以为以TMEM16A离子通道为靶点的药物的活性成分，以治疗例如由于TMEM16A离子通道异常，或TMEM16A缺陷或者被抑制造成的疾病。相应的，本发明在一些实施方式中提供了一种包含类胡萝卜素的激活剂；本发明在另一些实施方式中还提供了一种以类胡萝卜素作为主要活性成分或辅助活性成分的以TMEM16A离子通道作为靶点的药物。

本发明中所述的类胡萝卜素包括但不限于为作为烃的胡萝卜素和作为叶黄素类的胡萝卜素的氧合衍生物；所述胡萝卜素类(只含有碳氢的类胡萝卜素)包括但不限于为：番茄红素、α-胡萝卜素、γ-胡萝卜素和β-胡萝卜素；所述叶黄素类(含有氧的类胡萝卜素)包括但不限于为：梳黄质、蛤黄质、甲壳黄素、番茄黄素、紫红醇、腐菌黄素、异黄素、阿朴胡萝卜醇、胡萝卜醇、隐黄质、羟基胡萝卜酮、叶黄素、视紫红质、紫黄质、玉米黄质、柠黄质、玉米黄质、金莲花色素、圆酵母红素醛、红酵母红素、虾青素、角黄素、辣椒红素、辣椒玉红素、隐辣椒质、3-OH-角黄素、扇贝醇酮、玉红黄素酮、管藻黄素、虾红素、岩藻黄质、酸浆果红素、β-阿朴-2’-胡萝卜素醛、枳橙黄素、藏红花酸、珊瑚红素、β-胡萝卜素酮、多甲藻黄素、半-α-胡萝卜素酮和紫衫紫素。

需要说明的是，本发明中所述的类胡萝卜素不限制其来源，例如可以为但不限于为通过化学合成得到的类胡萝卜素；通过从天然物质中提取得到的类胡萝卜素；还可以为通过微生物代谢得到的类胡萝卜素，所述微生物可以为经过诱变或者基因工程改造的微生物。可以理解的是，每种类胡萝卜素化合物将以许多不同的同分异构体形式存在，本发明所述的类胡萝卜素包括每种类胡萝卜素的同分异构体；当类胡萝卜素用于制备药物时，本发明所述的类胡萝卜素还包括类胡萝卜素在药学上可接受的盐。

在一些优选的实施方式中，所述类胡萝卜素包括角黄素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、番茄红素、叶黄素、隐黄素、玉米黄质、紫黄素和虾青素中的至少一种。

角黄素，具有如结构式(ⅰ)所示结构:

α-胡萝卜素，具有如结构式(ⅱ)所示结构:

β-胡萝卜素，具有如结构式(ⅲ)所示结构:

γ-胡萝卜素，具有如结构式(ⅳ)所示结构:

番茄红素，具有如结构式(ⅴ)所示结构:

隐黄素，具有如结构式(ⅵ)所示结构:

叶黄素，具有如结构式(ⅶ)所示结构：

玉米黄质，具有如结构式(ⅷ)所示结构：

紫黄素，具有如结构式(ⅸ)所示结构:

虾青素，具有如结构式(ⅹ)所示结构：

通过膜片钳实验可以看出，角黄素能够浓度依赖性的激活TMEM16A离子通道，角黄素的EC₅₀＝6.406±0.403μmol，说明角黄素起效剂量低，且经细胞毒性实验发现其安全无毒。角黄素(Canthaxanthin)是一种非维生素A源的酮式类胡萝卜素，化学系统命名是β,β’-胡萝卜素-4,4’-二酮，分子式为C₄₀H₅₂O₂，相对分子质量为564.9，纯角黄素是紫红色晶体，熔点约210℃。角黄素的化学结构是由4个异戊二烯单位以共轭双键形式联结，两端又有2个异戊二烯单位组成的六元环结构，在六元环结构的C4，C4’位上含有氧功能团酮基。

本发明还提供了一种TMEM16A离子通道的激活剂，该激活剂包含类胡萝卜素，该激活剂以类胡萝卜素作为激活TMEM16A离子通道的活性成分，可以有效激活TMEM16A离子通道。

在一些可选的实施方式中，该激活剂用于体外激活细胞的TMEM16A离子通道，可作为一种用于细胞实验的实验试剂，在一些优选的实施方式中，以角黄素作为TMEM16A离子通道的激活剂中的活性成分效果更优，角黄素的浓度优选为10-500μmol/L；例如可以为但不限于为10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L、80μmol/L、100μmol/L、120μmol/L、150μmol/L、175μmol/L、200μmol/L、225μmol/L、250μmol/L、275μmol/L、300μmol/L、325μmol/L、350μmol/L、375μmol/L、400μmol/L、425μmol/L、450μmol/L、475μmol/L或500μmol/L；优选为10-200μmol/L；更优选为30-100μmol/L。通过调整和优化角黄素的浓度可以进一步优化角黄素对TMEM16A离子通道的激活效果。

本发明还提供了一种包含上述激活剂的试剂盒，该试剂盒可应用于关于离子通道机制研究的体外细胞实验或体内的动物实验。可选地，该试剂盒还可以包含常规的分子生物学试剂和实验耗材。

在一些优选的实施方式中，该试剂盒用于细胞的膜片钳实验，包含角黄素、细胞浴液和电极内液。其中细胞浴液优选为由下列组分组成：150mM NaCl，1mM MgCl₂·6H₂O，10mMHEPES，10mM葡萄糖，10mM甘露醇；电极内液优选为由下列组分组成：130mM CsCl，10mMEGTA，1mM MgATP，1mM MgCl₂·6H₂O和10mM HEPES，电极内液渗透压为290-300mOsm/L。

本发明还提供了一种以TMEM16A离子通道作为靶点的药物，该药物以类胡萝卜素或其药学上可接受的盐为主要活性成分或辅助活性成分。离子通道在生命体中扮演重要角色，一旦离子通道的结构变异和功能异常，将会导致许多疾病的发生。以离子通道为靶点的药物已成为药物筛选的重要靶点，同时也成为评价药物安全性的重要指标。TMEM16A通道电流由细胞内钙浓度升高所引发，其功能可影响神经元及肌肉细胞兴奋调节、上皮细胞分泌、嗅觉信号的转导、调节受体对光信号的影响等生理活动。在一些可选的实施方式中，所述以TMEM16A离子通道作为靶点的药物治疗的疾病包括肺囊性纤维化、急性肺损伤、胃肠动力学障碍和干燥综合症中的一种或者多种，更优选地，该药物是以角黄素或其药学上可接受的盐作为活性成分，用于治疗肺囊性纤维化。

囊性纤维变性膜电导调节体积(CFTR)Cl^-通道是一类重要的Cl^-通道，主要为Cl^-跨上皮传输提供选择性通道，对于跨上皮的眼泪运输，液体流动和离子浓度的调节有重要的作用。肺囊性纤维化(CF)是一种常染色体隐形遗传疾病，是由于囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)基因突变导致的。现有研究已经证明呼吸道上皮细胞中CFTR功能缺陷导致了肺部的改变，CFTR功能的突变导致Cl^-分泌减少和Na⁺流入增加，水吸收增加，卤化物和碳酸氢盐的分泌受损严重，这些会导致严重的后果。首先，减少电解质和水的分泌会导致呼吸道表面脱水，从而导致粘膜纤毛间隙受损；其次，碳酸氢盐分泌减少会使顶端细胞表面液体酸化，从而导致抗菌机制的缺陷；第三，碳酸氢盐分泌减少损害了杯状细胞和粘膜下腺中粘蛋白的释放和扩增。最终结果是CF患者的被致密的粘液阻塞并为慢性感染和炎症提供有利环境，这将导致不可逆性的结构性肺损伤和肺功能下降。因此，缺陷细胞中阴离子转运的恢复被认为是CF中治疗策略的重要目标。TMEM16A是在分泌性上皮细胞(包括呼吸道上皮细胞)中表达的跨膜蛋白，参与粘蛋白的产生、HCO₃ ^-渗透性和细胞增殖。研究表明，减少TMEM16A基因表达可显著降低跨上皮的钙依赖性氯分泌和粘膜纤毛清除功能受损，这表明TMEM16A在呼吸道中有重要生理作用。因此TMEM16A可能能够恢复Cl^-外排和改善呼吸道上皮细胞增殖和异常修复。

TMEM16A激活剂可以激活TMEM16A通道，刺激阴离子转运，从而改善呼吸道杯状细胞的粘蛋白的释放和粘膜纤毛清除功能。因此，TMEM16A可以作为肺囊性纤维化的重要治疗靶点，TMEM16A的激活可以补偿CF患者中CFTR基因受损引起的功能失调。

胃肠动力学障碍(Disorders of gastrontestinal motility，DGImol/L)属于常见疾病，其表现形式多样，例如可以为但不限于为胃肠功能减弱、胃肠功能亢进和胃肠功能紊乱。胃肠运动的调节主要受肠神经系统和体液因素的影响。TMEM16A基因表达于小肠间质细胞中，能够控制平滑肌的收缩节律。类胡萝卜素可以激活TMEM16A离子通道蛋白活性，进而影响胃肠平滑肌的收缩张力，从而可以用于胃肠动力学障碍的治疗。

上述以TMEM16A离子通道作为靶点的药物，包括用于治疗人的与TMEM16A离子通道相关的疾病，也可以包括用于治疗例如可以为但不限于为牛、马、羊、狗、猫、猪或鼠的与TMEM16A离子通道相关的疾病。

上述以TMEM16A离子通道作为靶点的药物除去包含作为药物活性物质的类胡萝卜素，还可以包括药学领域可接受的辅料，例如可以为但不限于包括稀释剂、填充剂、赋形剂、粘合剂、湿润剂、崩释剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂和香味剂中的一种或多种。上述药物的剂型例如可以为但不限于为注射剂、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、微胶囊或口服液，本发明对此不做限制。优选将以TMEM16A离子通道作为靶点的药物制成微胶囊，以增加生物的稳定性并提高产品的生物学效价。

微胶囊技术是指利用成膜材料将固体、液体或气体囊于其中，形成直径几微米至上千米的微小容器。以TMEM16A离子通道作为靶点的药物的微胶囊剂型的配制方法和制备方法均使用药学上可公知的可接受的形式，其配制方法和制备方法是本领域技术人员所能掌握的。

下面结合优选实施例进一步说明本发明的有益效果：

实施例1

荧光共聚焦实验鉴定角黄素为TMEM16A通道的激活剂：黄色荧光蛋白(YFP)是一种来源于绿色荧光蛋白(GFP)的荧光蛋白，可在波长515nm下被激发发出黄色荧光。碘离子可以与YFP结合使荧光淬灭，而突变其两个位点H148Q和I152L可以使YFP对碘离子的敏感性增强。CaCCs通道不仅是一种氯通道，其对包括碘离子在内的大部分阴离子都有通透作用。共聚焦激光扫描显微镜(CLSM，Leica SP5，德国)用于检测荧光并观察TMEM16A通道的活性。

在荧光实验前36小时将TMEM16A质粒和黄色荧光蛋白YFP三突变体YFP-F46L/H148Q/I152L质粒共转染到HEK-293T细胞中并接种在24孔板上。将24孔板中的共转染细胞用PBS(1000μL/洗涤)洗涤3次，每孔留下500μl。然后向每个孔中加入500μl含碘的PBS(150mM I^-)。将24孔板置于物镜台上，并使用共聚焦激光扫描显微镜聚焦细胞用于荧光观察。然后用来自Kr/Ar激光器的488nm线激发YFPF46L/H148Q/I152L质粒，并通过设定在520±15nm的标准荧光素滤光器检测。以ATP作为阳性对照，浓度和角黄素的使用浓度相同。在开始记录之后将角黄素工作溶液加入到孔中至终浓度为100mol。荧光检测实验持续长达20分钟。加入角黄素后，YFP的荧光强度下降70％，荧光变化如图1所示。分别记录在加入ATP和角黄素前后细胞的发光情况，共聚焦激光扫描显微镜扫描结果如图2A-图2F所示，可以看出阴性对照组在实验前后发荧光的细胞数量无明显变化，加入角黄素的试验组和阳性对照组(加入ATP的试验组)在加入角黄素和ATP后发光细胞的数量明显减少。上述实验结果说明TMEM16A可以由角黄素激活使得I^-离子内流入细胞使YFP荧光蛋白猝灭。

实施例2

比较几种类胡萝卜素对TMEM16A离子通道的激活作用，试验组分别为角黄素、β-胡萝卜素、叶黄素、虾青素、玉米黄质、α-胡萝卜素、辣椒红素和番茄红素，阳性对照为等浓度的ATP。

在荧光实验前36小时将TMEM16A质粒和黄色荧光蛋白YFP三突变体YFP-F46L/H148Q/I152L质粒共转染到HEK-293T细胞中并接种在24孔板上。将24孔板中的共转染细胞用PBS(1000μL/洗涤)洗涤3次，每孔留下500μl。然后向每个孔中加入500μl含碘的PBS(150mM I^-)。将24孔板置于物镜台上，并使用共聚焦激光扫描显微镜聚焦细胞用于荧光观察。然后用来自Kr/Ar激光器的488nm线激发YFPF46L/H148Q/I152L质粒，并通过设定在520±15nm的标准荧光素滤光器检测。以ATP作为阳性对照，浓度和角黄素的使用浓度相同。在开始记录之后将角黄素工作溶液加入到孔中至终浓度为100μM，记录分别记录实验前后细胞的荧光强度，然后以实验后细胞荧光强度降低的百分比作为评价标准，结果如图3所示，从图3可以看出，多种类胡萝卜素均能增强TMEM16A离子通道活性，且角黄素的效果最优。

实施例3

本实施例采用全细胞模式记录不同浓度角黄素处理下的离子通道TMEM16A的电流。所用仪器为EPC10放大器(HEKA，德国)以及PULSE软件(HEKA)数据记录。将瞬时转染TMEM16A通道的HEK-293细胞铺于细胞爬片上，细胞浴液成分为150mM NaCl，1mM MgCl₂·6H₂O，10mM HEPES，10mM葡萄糖，10mM甘露醇以及不同浓度的角黄素(pH 7.4，NaOH调节)渗透压控制在290-310mOsm/L，电极内液成分为130mM CsCl，10mM EGTA，1mM MgATP，1mMMgCl₂·6H₂O，10mM HEPES(pH 7.4，CsOH调节)渗透压控制在290-300mOsm/L。膜片钳的记录程序为先是将膜电压钳制在0mV，接着给-80到+80不同的阶跃电压，最后保持膜电位为-80mV，如图4所示。图4为不同浓度的角黄素下(b:100nM、c：300nM、d：1μM、e：3μM、f：10μM、g：30μM、h：100μM)TMEM16A的电流大小，不难看出随着角黄素浓度的增大，TMEM16A的电流也逐步增大。图5为角黄素激活TMEM16A通道的I-V曲线，图6为角黄素激活TMEM16A通道的量效曲线。通过膜片钳实验可以看出，角黄素的EC₅₀＝6.406±0.403μM，说明角黄素起效剂量低。

实施例4

角黄素没有细胞毒性：本实验采用MTT法测定细胞增殖的情况，首先收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，在96孔板中每孔加入100μl，铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。5％CO₂，37℃培养至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度的角黄素，原设5个复孔。5％CO₂，37℃孵育24小时后，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)。继续培养4h后，终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。结果如图7所示，**表示0μmol的角黄素处理相比具有显著性差异P<0.01。从图7可以看出随着角黄素浓度的升高，HEK-293细胞系和转染TMEM16A通道的HEK细胞系的细胞增殖率逐步升高，角黄素对转染TMEM16A通道的HEK细胞系增殖效果明显，说明角黄素安全无毒。

实施例5

肠推进率测定：实验动物：30只，BALB/c小鼠，普通级，体质量18～22g；随机分为6组，每组5只。

试验组：角黄素、β-胡萝卜素、虾青素和玉米黄质，剂量为2g/kg，阴性对照为生理盐水。

空白组给予普通饲料，其余试验组连续3天给予大米，不予饮水。第4天开始给药，连续给药7d，所有动物饮食同前，自由饮水。灌胃给药末次给药前禁食10h，给药20min后各组灌胃给药0.05％的酚红溶液(0.3mL/只)，30min后，颈椎脱颈法处死，取贲门至直肠末端取肠，取出小肠分离肠系膜，剪取幽门至回盲肠部的肠管，置于托盘上，轻轻将小肠拉成直线，测量酚红前进的距离。实验结果如表1所示：

表1肠推进率测定结果

组别	小肠全长(cm)	酚红推进长度(cm)
			空白组	41.54±1.85	11.86±1.85
角黄素	42.12±2.86	20.48±1.78
			β-胡萝卜素	41.45±2.18	17.56±1.82
虾青素	41.78±1.95	16.84±1.80
			玉米黄质	43.44±1.75	15.25±1.94
生理盐水	42.87±2.45	13.45±2.05

实施例6

本实验中注入胸膜腔液体中的药物浓度为0.1mM异丙肾上腺素、30μM角黄素、30μMCaCC_inh-A01。本实验采用CFTR敲除昆明小鼠制造囊性纤维化小鼠模型(CFTR^-/-)，采用胸腔液体转运研究方法确定角黄素的效果。小鼠吸入乙醚麻醉后，用注射器将0.25ml液体注入右侧胸膜腔。穿刺点为第五肋间与腋前线交界处，穿刺时针尖斜面与肺表面平行，以免刺破肺脏。达到预定时间后，快速剪开胸腔收集胸腔内液体。小鼠分为正常组、肺囊性纤维化组(CFTR^-/-)。小鼠吸入麻醉后，注入右侧胸膜腔内0.25ml等渗液体，分别观察60min后处死动物，尽量收集胸膜腔中的液体测量体积。

胸腔液体吸收率(％)＝(Vi-Vt)/Vi×100％(其中Vi：注射前等渗液体体积；Vt：注射后某一时间收集标本的体积。采用异丙肾上腺素(iso)促进小鼠胸腔液体分泌。)实验结果如图8所示。实验结果发现，给予老鼠角黄素后，肺囊性纤维化模型老鼠组的胸腔分泌液减小，囊性纤维化症状减轻，说明氯离子和液体输送被修复了。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (1)

1.角黄素在制备以TMEM16A离子通道作为靶点的药物中的应用，其特征在于，所述以TMEM16A离子通道作为靶点的药物用于治疗肺囊性纤维化，所述药物以角黄素或其药学上可接受的盐作为活性成分。

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