DE60116113T2

DE60116113T2 - Verfahren zur herstellung und reinigung von thiolhaltigen maytansinoiden

Info

Publication number: DE60116113T2
Application number: DE60116113T
Authority: DE
Inventors: Vankeepuram Ravi CHARI; Charles Wayne WIDDISON
Original assignee: Immunogen Inc
Current assignee: Immunogen Inc
Priority date: 2000-08-18
Filing date: 2001-04-26
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2021-04-27
Also published as: JP2004506738A; AU5311801A; HK1056357A1; US6333410B1; USRE39151E1; AU763107B2; CA2373554C; DE60116113D1; EP1313738A4; CA2373554A1; CA2678754A1; ATE313545T1; ES2253371T3; JP4922535B2; CA2678754C; DK1313738T3; EP1313738B1; EP1313738A1; WO2002016368A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung und Reinigung zytotoxischer Mittel. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung und Reinigung zytotoxischer Mittel umfassend Thiol-enthaltende Maytansinoide. Diese zytotoxischen Mittel können als therapeutische Mittel durch ihre Verknüpfung mit einem zellbindenden Mittel, durch die Thiol Gruppe, und ihrem anschließenden Transport zu einer spezifischen Zellpopulation in einer gezielten Weise verwendet werden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
In den letzten Jahren ist eine Vielzahl von Berichten über das versuchte spezifische Abzielen auf Tumorzellen mit monoklonalen Antikörper-Arzneimittel Konjugaten erschienen (R. V. J. Chari, 31 Adv. Drug Deliv. Res., 89–104 (1998); G. A. Pietersz und K. Krauer, 2 J. Drug Targeting 183–215 (1994); Sela et al., in Immunoconjugates 189–216 (C. Vogel, Hrsg., 1987); Ghose et al., in Targeted Drugs 1–22 (E. Goldberg, Hrsg., 1983); Diener et al., in Antibody mediated delivery systems 1–23 (J. Rodwell, Hrsg., 1988); Pietersz et al., in Antibody mediated delivery systems 25–53 (J. Rodwell, Hrsg., 1988); Bumol et al., in Antibody mediated delivery systems 55–79 (J. Rodwell, Hrsg., 1988). Zytotoxische Arzneimittel, wie Methotrexat, Daunorubicin, Doxorubicin, Vincristin, Vinblastin, Melphalan, Mitomycin C und Chlorambucil wurden mit einer Vielzahl von murinen monoklonalen Antikörpern konjugiert. In einigen Fällen wurden die Arzneimittel Moleküle mit den Antikörper Molekülen durch ein intermediäres Trägermolekül, wie Serum Albumin verbunden (Garnett et al., 46 Cancer Res. 2407–2412 (1986); Ohkawa et al., 23 Cancer Immunol. Immunother. 81–86 (1986); Endo et al., 47 Cancer Res. 1076–1080 (1980)), Dextran (Hurwitz et al., 2 Appl. Biochem. 25–35 (1980); Manabi et al., 34 Biochem. Pharmacol. 289–291 (1985); Dillman et al., 46 Cancer Res. 4886–4891 (1986); Shoval et al., 85 Proc. Natl. Acad. Sci. 8276–8280 (1988)), oder Polyglutaminsäure (Tsukada et al., 73 J. Natl. Canc. Inst. 721–729 (1984); Kato et al. 27 J. Med. Chem. 1602–1607 (1984); Tsukada et al., 52 Br. J. Cancer 111–116 (1985)).
Eine große Ansammlung von Linkertechnologien wurden für die Herstellung von solchen Immunkonjugaten verwendet, und sowohl spaltbare als auch nicht spaltbare Linker wurden untersucht. In den meisten Fällen konnte das vollständige zytotoxische Potenzial der Arzneimittel jedoch nur beobachtet werden, wenn die Arzneimittel Moleküle von den Konjugaten in nicht modifizierter Form an der Zielstelle freigesetzt werden konnten.
Einer der spaltbaren Linker, die für die Herstellung von Antikörper-Arzneimittel Konjugaten eingesetzt wurden, ist ein säurelabiler Linker, der auf cis-Aconitsäure beruht, der den Vorteil der sauren Umgebung von verschiedenen intrazellulären Kompartimenten, wie die Endosomen, die während Rezeptor vermittelter Endozytose auftreten, und die Lysosomen, nutzt. Shen und Ryser führten dieses Verfahren zur Herstellung von Konjugaten von Daunorubicin mit makromolekularen Trägern ein (102 Biochem. Biophys. Res. Commun. 1048–1054 (1981)). Yang und Reisfeld verwendeten die gleiche Technik, um Daunorubicin an einen Anti-Melanom Antikörper zu konjugieren (80 J. Natl. Canc. Inst. 1154–1159 (1988)). Dillman et al., verwendeten ebenfalls einen säurelabilen Linker in einer ähnlichen Weise, um Konjugate von Daunorubicin mit einem Anti T Zell Antikörper herzustellen (48 Cancer Res. 6097–6102 (1988)). Trail et al., verbanden Doxorubicin mit Antikörpern über eine säurelabile Hydrazon Brücke (52 Cancer Res. 5693–5700 (1992)).
Ein alternativer Ansatz, der von Trouet et al., untersucht wurde, schloss das Verbinden von Daunorubicin mit einem Antikörper über einen Peptidspacer Arm ein (79 Proc. Natl. Acad. Sci. 626–629 (1982)). Dies wurde unter der Annahme durch geführt, dass freies Arzneimittel von einem solchen Konjugat durch die Wirkung von lysosomalen Peptidasen freigesetzt werden könnte.
In vitro Zytotoxizitätstests haben jedoch gezeigt, dass Antikörper-Arzneimittel Konjugate selten die gleiche Zytotoxizitätsstärke wie die freien nicht konjugierten Arzneimittel erreichen. Dies legte nahe, dass die Mechanismen, durch die Arzneimoleküle von den Antikörpern freigesetzt werden, sehr ineffizient sind. Im Bereich der Immuntoxine wurde gezeigt, dass Konjugate, die über Disulfidbrücken zwischen monoklonalen Antikörpern und katalytisch aktiven Proteintoxinen gebildet wurden, toxischer waren als Konjugate, die andere Linker enthielten. Siehe, Lambert et al., 260 J. Biol. Chem. 12035–12041 (1985); Lambert et al., in Immunotoxins 175–209 (A. Frankel, Hrsg., 1988); Ghetie et al., 48 Cancer Res. 2610–2617 (1988). Dies wurde der hohen intrazellulären Konzentration von Glutathion zugeschrieben, das zu der effizienten Spaltung der Disulfidbrücke zwischen einem Antikörper Molekül und einem Toxin beitrug. Trotzdem gibt es nur wenige berichtete Beispiele von der Verwendung von Disulfidbrücken für die Herstellung von Konjugaten zwischen Arzneimitteln und Makromolekülen. Shen et al., beschrieben die Umwandlung von Methotrexat in ein Mercaptoethylamid Derivat, gefolgt durch Konjugation mit poly-D-Lysin über eine Disulfidbrücke (260 J. Biol. Chem. 10905–10908 (1985)). Ein kürzlicher Bericht beschrieb die Herstellung eines Konjugats des Trisulfid-enthaltenden toxischen Arzneimittels Calicheamicin mit einem Antikörper (L. M. Hinman et al., 53 Cancer Res. 3336–3342 (1993); E. L. Sievers et al., 93 Blood 3678–3684 (1999)).
Ein Grund für den Mangel an Dilsulfid verknüpften Antikörper-Arzneimittel Konjugaten ist die mangelnde Verfügbarkeit von zytotoxischen Arzneimitteln, die eine Schwefelatom enthaltende Einheit besitzen, die einfach verwendet werden kann, um das Arzneimittel mit einem Antikörper über eine Disulfidbrücke zu verknüpfen. Darüber hinaus ist die chemische Modifikation von bestehenden Arzneimitteln ohne ihr zytotoxisches Potenzial zu verringern, schwierig.
Ein anderer großer Nachteil bei bestehenden Antikörper-Arzneimittel Konjugaten ist ihre Unfähigkeit, eine ausreichende Konzentration des Arzneimittels zu einer Zielstelle zu transportieren, aufgrund der begrenzten Anzahl der abgezielten Antigene und der relativ moderaten Zytotoxizität von cancerostatischen Arzneimitteln, wie Methotrexat, Daunorubicin und Vincristin. Zum Beispiel wurde ein Antikörper Konjugat von Doxorubicin in menschlichen klinischen Versuchen bewertet, und es wurde gefunden, dass es unwirksam ist (Tolcher, et al., 17 J. Clinical Oncol. 478–484 (1999)). Um eine signifikante Zytotoxizität zu erreichen wird die Verknüpfung einer großen Zahl von Arzneimittel Molekülen, entweder direkt mit dem Antikörper oder über ein polymeres Trägermolekül, notwendig. Jedoch zeigen solche stark modifizierten Antikörper häufig beeinträchtigte Bindung zu dem Ziel Antigen und schnelle in vivo Entfernung aus dem Blutstrom.
Maytansinoide sind hochtoxische Arzneimittel. Maytansin wurde zuerst von Kupchan et al., aus dem ostafrikanischen Busch Maytenus serrata isoliert, und es wurde gezeigt, dass es 100- bis 1000-mal zytotoxischer ist als herkömmliche Krebs chemotherapeutische Mittel wie Methotrexat, Daunorubicin und Vincristin (US Patent Nr. 3,896,111). Anschließend wurde entdeckt, dass einige Mikroben auch Maytansinoide bilden, wie Maytansinol und C-3 Ester von Maytansinol (US Patent Nr. 4,151,042). Es wurde von synthetischen C-3 Estern von Maytansinol und Analogen von Maytansinol berichtet (Kupchan et al., 21 J. Med. Chem. 31–37 (1978); Higashide et al., 270 Nature 721–722 (1977); Kawai et al., 32 Chem. Pharm. Bull. 3441–3451 (1984)). Beispiele von Analogen von Maytansinol, aus denen C-3 Ester hergestellt wurden, schließen Maytansinol mit Modifikationen im aromatischen Ring (z.B. (Dechlor) oder am C-9, C-14 (z.B. hydroxylierte Methylgruppe), C-15, C-18, C-20 und C-4,5 ein.
Die natürlich vorkommenden und synthetischen C-3 Ester können in zwei Gruppen eingeteilt werden:

(a) C-3 Ester mit einfachen Carbonsäuren (US Patent Nrn. 4,248,870; 4,265,814; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,317,821; 4,322,348; und 4,331,598), und
(b) C-3 Ester mit Derivaten von N-Methyl-L-alanin (US Patent Nrn. 4,137,230; 4,260,608; 5,208,020; 5,416,064; und 12 Chem. Pharm. Bull. 3441 (1984)).

Von Estern der Gruppe (b) wurde gefunden, dass sie zytotoxischer sind als Ester der Gruppe (a).
Maytansin ist ein mitotischer Inhibitor. Es wurde berichtet, dass die Behandlung von L1210 Zellen in vivo mit Maytansin dazu führt, dass 67% der Zellen in der Mitose akkumulieren. Von den unbehandelten Zellen wurde berichtet, dass sie einen mitotischen Index im Bereich von zwischen 3,2 bis 5,8% zeigen (Sieber et al., 43 Comparative Leukemia Research 1975, Bibl. Haemat. 495–500 (1976)). Experimente mit Seeigel Eiern und Venusmuschel Eiern haben nahegelegt, dass Maytansin die Mitose inhibiert, indem es mit der Bildung von Mikrotubuli durch die Inhibierung der Polymerisierung des Mikrotubulus Proteins, Tubulin, interferiert (Remillard et al., 189 Science 1002–1005 (1975)).
Es wurde gefunden, dass in vitro P388, L1210 und LY5178 murine Leukämie Zellsuspensionen durch Maytansin in Dosen von 10^–3 bis 10^–1 Mikrogramm/mL inhibiert werden, wobei die P388 Linie am empfindlichsten war. Von Maytansin wurde auch gezeigt, dass es ein aktiver Inhibitor von in vitro Wachstum von menschlichen Nasopharyngs Karzinomzellen ist. Von der menschlichen akuten lymphoblastischen Leukämie Linie C. E. M. wurde berichtet, dass sie durch Konzentrationen so niedrig wie 10^–7 Mikrogramm/mL inhibiert wird (Wolpert-DeFillippes et al., 24 Biochem. Pharmacol. 1735–1738 (1975)).
Es wurde auch gezeigt, dass Maytansin in vivo aktiv ist. Es wurde gezeigt, dass das Tumorwachstum in dem P388 lymphozytischen Leukämie System über einen 50- bis 100-fachen Dosisbereich inhibiert wurde, was einen hohen therapeutischen Index nahe legte; signifikante inhibitorische Aktivität konnte auch mit dem L1210 Maus Leukämie System, dem menschlichen Lewis Lungenkarzinom Sys tem und dem menschlichen B-16 Melanomkarzinom System, gezeigt werden (Kupchan, 33 Ped. Proc. 2288–2295 (1974)).
Weil die Maytansinoide stark zytotoxisch sind, wurde von ihnen angenommen, dass sie in der Behandlung von vielen Erkrankungen, wie Krebs, verwendet werden können. Diese Erwartung muss noch verwirklicht werden. Klinische Versuche mit Maytansin waren aufgrund einer Vielzahl von Nebenwirkungen nicht vorteilhaft (Issel et al., 5 Can. Trtmnt. Rev. 199–207 (1978)). Gegenteilige Wirkungen auf das zentrale Nervensystem und gastrointestinale Symptome waren dafür verantwortlich, dass manche Patienten eine weitere Therapie ablehnten (Issel in 204), und es erschien, dass Maytansin mit peripherer Neuropathie assoziiert ist, die kumulativ sein könnte (Issel in 207).
Jedoch können Formen von Maytansinoiden, die sehr zytotoxisch sind, dennoch wirksam in der Behandlung von vielen Erkrankungen, die beschrieben wurden, verwendet werden (US Patent Nrn. 5,208,020 und 5,416,064; Chari et al., 52 Cancer Res. 127–131 (1992); Liu et al., 93 Proc. Natl. Acad. Sci. 8618–8623 (1996)).
Ein weiterer Nachteil der therapeutischen Verwendung von Maytansinoiden, der hier von Interesse ist, ist, dass das Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Thiol-enthaltenden Maytansinoiden einige ineffiziente Chromatographieschritte einschließt, die umständlich, nicht einfach skalierbar sind und nur zu moderaten Ausbeuten führen.
Die US Patente Nrn. 5,208,020 und 5,416,064 offenbaren, dass ein Thiol-enthaltendes Maytansinoid hergestellt werden kann, indem zuerst ein Maytansinoid, das eine Ester Gruppe trägt, in Maytansinol umgewandelt wird, anschließend das resultierende Maytansinol mit N-Methyl-L-alanin oder N-Methyl-L-cystein Derivaten verestert wird, um Disulfid enthaltende Maytansinoide zu erhalten, gefolgt von einer Spaltung der Disulfidgruppe mit Dithiothreitol zu den Thiol-enthaltenden Maytansinoiden. Jedoch schließt dieses Verfahren einige ineffziente Schritte ein, die umständlich sind und zu moderaten Ausbeuten führen.
Insbesondere ist Maytansinol zunächst von Maytansin oder anderen Estern von Maytansinol durch Reduktion, wie mit Lithiumaluminiumhydrid, abgeleitet (Kupchan, S. M. et al., 21 J. Med. Chem. 31–37 (1978); US Patent Nr. 4,360,462). Es ist auch möglich, Maytansinol aus dem Mikroorganismus Nocardia zu isolieren (siehe Higashide et al., US Patent Nr. 4,151,042). In einem besonderen Beispiel wurde die Umwandlung von Ansamitocin P-3 in Maytansinol durch reduktive Hydrolyse mit Lithiumaluminiumhydrid in Tetrahydrofuran bei –5°C in dem US Patent Nr. 4,162,940 beschrieben. Jedoch führt die Reaktion mit Lithiumaluminiumhydrid zu der Bildung von einigen Nebenprodukten, die nur durch vorsichtige präparative Dünnschichtchromatographie auf Silica-Gel entfernt werden können. Somit ist dieses Verfahren der Verwendung im industriellen Maßstab nicht zugänglich.
Der nächste Schritt in dem Verfahren ist die Umwandlung von Maytansinol in verschiedene Ester Derivate unter Verwendung von N-Methyl-L-alanin oder N-Methyl-L-cystein Derivaten und geeigneten Mitteln, wie Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und katalytische Mengen von Zinkchlorid (siehe US Patent Nr. 4,137,230; Kawai et al., 32 Chem. Pharm. Bull. 3441–3951 (1984); US Patent Nr. 4,260,609). Zwei diastereomere Produkte enthaltend die D- und L-Aminoacyl Seitenketten resultieren daraus, ebenso wie ein kleiner Anteil von nicht reagiertem Maytansinol. Während das nicht reagierte Maytansinol einfach von seinen Estern durch Säulenchromatographie auf Silica-Gel abgetrennt werden kann, sind die diastereomeren Maytansinoidester kaum trennbar. In dem zuvor beschriebenen Verfahren (Kupchan, S. M., 21 J. Med. Chem. 31–37 (1978); US Patent Nr. 4,360,462) wird der gewünschte L-Aminoacylester nach Reinigung über zwei Silica-Gel Säulen, gefolgt durch weitere Reinigung durch präparative Dünnschichtchromatographie auf Silica-Gel erhalten. Somit ist auch dieses Verfahren nicht der Verwendung im industriellen Maßstab zugänglich.
Der letzte Schritt in dem Verfahren, die Reduktion der Disulfid enthaltenden Maytansinoide zu den entsprechenden Thiol-enthaltenden Maytansinoiden, wird durch Behandlung mit Dithiothreitol (DTT), Reinigung durch HPLC unter Verwendung einer C-18 Säule und Elution mit einem linearen Gradienten von 55% bis 80% Acetonitril in H₂O erreicht. Jedoch führt dieser Schritt zu geringen Ausbeuten und ist ebenfalls der Verwendung im industriellen Maßstab nicht zugänglich. Thiol-enthaltende Maytansinoide sind nicht gut in Ethanol/Wasser Lösungsmittelgemischen, die für die Reaktion verwendet werden, löslich. Darüber hinaus führt die Reinigung durch HPLC auf einer reversen Phase C-18 Säule unter Verwendung von Acetonitril/Wasser als der mobilen Phase zu einer schlechten Ausbeute und kann zu der Dimerisierung von Teilen des Produkts führen.
Demzufolge wird ein verbessertes Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Thiol-enthaltenden Maytansinoiden, das die Komplexität des Verfahrens verringert, die Größenmaßstabsanpassung erlaubt und die Ausbeute erhöht, stark benötigt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Somit ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Thiol-enthaltenden Maytansinoiden bereitzustellen, das die Komplexität des Verfahrens verringert, die Größenmaßstabsanpassung erlaubt und die Ausbeute verbessert.
Dieses und andere Ziele wurden durch das Bereitstellen eines verbesserten Verfahrens zur Herstellung und Reinigung von Thiol-enthaltenden Maytansinoiden erreicht.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Thiol-enthaltenden Maytansinoids bereit, umfassend die Schritte:

(1) Durchführung reduktiver Hydrolyse eines Maytansinoid C-3 Esters mit einem Reduktionsmittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lithiumtrimethoxyaluminiumhydrid (LiAl(OMe)₃H), Lithiumtriethoxyaluminiumhydrid (LiAl(OEt)₃H), Lithiumtripropoxyaluminiumhydrid (LiAl(OPr)₃H), Natriumtrimethoxyaluminiumhydrid (NaAl(OMe)₃H), Natriumtriethoxyaluminiumhydrid (NaAl(OEt)₃H) und Natriumtripropoxyaluminiumhydrid (NaAl(OPr)₃H), um ein Maytansinol zu erhalten;
(2) Reinigung des Maytansinols, um Nebenprodukte zu entfernen, wenn vorhanden;
(3) Veresterung des gereinigten Maytansinols mit einer Carbonsäure, um ein Reaktionsgemisch eines L- und eines D-Aminoacylesters des Maytansinols zu erhalten;
(4) Trennung des L-Aminoacylesters des Maytansinols von dem Reaktionsgemisch in (3);
(5) Reduktion des L-Aminoacylesters des Maytansinols, um ein Thiol-enthaltendes Maytansinoid zu erhalten; und
(6) Reinigung des Thiol-enthaltenden Maytansinoids.

Vorzugsweise ist das Reduktionsmittel in (1) Lithiumtrimethoxyaluminiumhydrid.
Ebenfalls bevorzugt wird das Reduktionsmittel in (1) in einer Konzentration von etwa 5 bis 100 Äquivalenten pro Mol des Maytansinoid C-3 Esters verwendet. Weiter bevorzugt wird das Reduktionsmittel in (1) in einer Konzentration von etwa 7,5 bis 30 Äquivalenten pro Mol des Maytansinoid C-3 Esters verwendet. Am meisten bevorzugt wird das Reduktionsmittel in (1) in einer Konzentration von etwa 10 bis 20 Äquivalenten pro Mol des Maytansinoid C-3 Esters verwendet.
Vorzugsweise wird die reduktive Hydrolyse in (1) bei einer Temperatur von etwa –80°C bis 0°C durchgeführt. Weiter bevorzugt wird die reduktive Hydrolyse in (1) bei einer Temperatur von etwa –45°C bis –27,5°C durchgeführt. Am meisten bevorzugt wird die reduktive Hydrolyse in (1) bei einer Temperatur von etwa –35°C bis –30°C durchgeführt.
Vorzugsweise wird das Reduktionsmittel in (1) über einen Zeitraum von etwa 5 bis 40 Minuten hinzugefügt. Weiter bevorzugt wird das Reduktionsmittel in (1) über einen Zeitraum von etwa 7 bis 20 Minuten hinzugefügt. Am meisten bevorzugt wird das Reduktionsmittel in (1) über einen Zeitraum von etwa 8 bis 12 Minuten hinzugefügt.
Vorzugsweise wird das Maytansinol in (2) durch Chromatographie gereinigt. Weiter bevorzugt wird das Maytansinol in (2) durch Chromatographie gereinigt, wobei die Chromatographie Silical-Gel Säulenchromatographie, präparative Dünnschichtchromatographie auf Silica-Gel oder Cyano-gebundene Silica HPLC Säulenchromatographie ist. Am meisten bevorzugt wird das Maytansinol in (2) durch Chromatographie gereinigt, wobei die Chromatographie Silica-Gel Säulenchromatographie ist.
Vorzugsweise wird die Reinigung in (2) bei Umgebungstemperatur durchgeführt.
Vorzugsweise wird das Maytansinol in (2) zu einer Reinheit von etwa 95% gereinigt.
Vorzugsweise ist die Carbonsäure in (3) aus der Gruppe, bestehend aus N-Methyl-N-methyldithioacetyl-L-alanin, N-Methyl-N-(3-methyldithio-propanoyl)-L-alanin, N-Methyl-N-(3-methyldithio-butanoyl)-L-alanin, N-Methyl-N-(4-methyldithio-butanoyl)-L-alanin, N-Methyl-N-(5-methyldithio-pentanoyl)-L-alanin, N-Methyl-N-(3-phenyldithio-propanoyl)-L-alanin, N-Methyl-N-(3-(4-nitrophenyldithio)propanoyl)-L-alanin, N-Acetyl-N-methyl-methyldithiocystein und N-Acyl-N-methyl-methyldithio-homocystein, ausgewählt. Weiter bevorzugt ist die Carbonsäure in (3) N-Methyl-N-(3-methyldithio-propanoyl)-L-alanin.
Vorzugsweise wird die Veresterung in (3) bei Umgebungstemperatur durchgeführt.
Vorzugsweise umfasst die Veresterung in (3) weiter die Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid und Zinkchlorid.
Vorzugsweise wird die Trennung in (4) durch Leiten des Reaktionsgemisches über eine Cyano-gebundene Silica HPLC-Säule durchgeführt.
Vorzugsweise wird die Trennung in (4) bei etwa 25°C durchgeführt.
Vorzugsweise verwendet die Reduktion in (5) Dithiothreitol als das Reduktionsmittel.
Vorzugsweise wird die Reduktion in (5) in einem Gemisch aus Ethylacetat-Methanol-wässrigem Puffer durchgeführt, das befähigt ist, Puffersalze, Dithiothreitol, unreduzierte Maytansinoide und reduzierte Maytansinoide in Lösung zu halten. Weiter bevorzugt ist das Gemisch aus Ethylacetat-Methanol-wässrigem Puffer 1:1,5:1, v/v/v, Ethylacetat:Methanol-wässrigem Puffer.
Vorzugsweise ist die Konzentration des Thiol-enthaltenden Maytansinoids eine solche, dass das Thiol-enthaltende Maytansinoid in Ethylacetat-Methanol-wässrigem Puffer löslich bleibt. Vorzugsweise ist die Konzentration des Thiol-enthaltenden Maytansinoids etwa 4 g/L.
Vorzugsweise wird die Reduktion in (5) in einer sauerstofffreien Atmosphäre durchgeführt.
Vorzugsweise wird die Reduktion in (5) bei etwa 25°C durchgeführt.
Vorzugsweise wird die Reinigung des Thiol-enthaltenden Maytansinoids in (6) mittels Chromatographie durchgeführt. Weiter bevorzugt wird die Chromatographie mittels einer Cyano-gebundenen HPLC-Säule durchgeführt. Am meisten bevorzugt wird die Chromatographie mittels einer Cyano-gebundenen HPLC-Säule durchgeführt, welche mit einem organischen Lösungsmittel äquilibriert und betrie ben wird. Vorzugsweise ist das organische Lösungsmittel ein Gemisch aus Hexanen:2-Propanol:Ethylacetat, weiter bevorzugt ist das Lösungsmittel ein 78:0:5,5:16,5, v/v/v Gemisch von Hexanen:2-Propanol:Ethylacetat.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Reduktion von Ansamitocinen 1a–e, um Maytansinol (2) zu erhalten.
2a zeigt die Umwandlung der ω-Mercaptocarbonsäuren 3a–e in die jeweiligen Methyl-dithio Derivate 4a–e.
2b zeigt die Umwandlung der ω-Mercaptocarbonsäure 3b in die jeweiligen Aryl-dithio Derivate 5a–b.
2c zeigt die Umwandlung der Methyl-dithio Derivate 4a–e und der Aryl-dithio Derivate 5a–b in N-Methyl-L-alanin Derivate 6a–g, die eine Disulfidgruppe enthalten.
3a zeigt die Umwandlung von N-Methylcystein und N-Methylhomocystein (7a–b) in die jeweiligen Disulfid Derivate 8a–b.
3b zeigt die Acylierung der Disulfid Derivate 8a–b in N-Methyl-L-cystein Derivate 9a–b, die eine Disulfid Gruppe enthalten.
4 zeigt die Veresterung von Maytansinol (2) mit den N-Methyl-L-alanin Derivaten 6a–g, die eine Disulfidgruppe enthalten, um die Disulfid enthaltenden Maytansinoid Stereoisomere 10 zu erhalten, von denen die L-Isomere über Chromatographie getrennt werden, um die Disulfid enthaltenden Maytansinoid L-Isomere 10a–g zu erhalten, die wiederum reduziert werden, um die Thiol-enthaltenden Maytansinoide 11a–g zu erhalten.
5 zeigt die Veresterung von Maytansinol (2) mit den N-Methyl-L-cystein Derivaten 9a–b, die eine Disulfidgruppe enthalten, um die Disulfid enthaltenden Maytansinoid Stereoisomere 12 zu erhalten, von denen die L-Isomere über Chromatographie getrennt werden, um die Dislufid enthaltenden Maytansinoid L-Isomere 12a–b zu erhalten, die wiederum reduziert werden, um die Thiol-enthaltenden Maytansinoide 13a–b zu erhalten.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung beruht auf der Synthese von Thiol-enthaltenden Maytansinoid Derivaten, die hohe Zytotoxizität behalten und die wirksam mit Zellbindungsmitteln verknüpft werden können. Der Stand der Technik zeigt, dass die existierenden Verfahren zur Herstellung von Thiol-enthaltenden Maytansinoiden komplex, nicht skalierbar sind und niedrige Produktausbeute bilden. Die vorliegende Erfindung löst diese Probleme durch die Offenbarung eines neuen Verfahrens zur Herstellung von Thiol-enthaltenden Maytansinoiden, das die Komplexität des Verfahrens reduziert, die Größenmaßstabsanpassung erlaubt und die Produktausbeute verbessert.
Somit stellt die Erfindung ein neues Verfahren zur Herstellung von Thiol-enthaltenden Maytansinoiden, nützlichen Mitteln für die Eliminierung von erkrankten oder abnormalen Zellen, die getötet oder lysiert werden sollen, wie Tumorzellen (insbesondere solide Tumorzellen), Virus infizierte Zellen, durch Mikroorganismen infizierte Zellen, durch Parasiten infizierte Zellen, Autoimmunzellen (Zellen, die Autoantikörper bilden), aktivierte Zellen (solche, die in Transplantatabstoßung oder Transplantat versus Wirtserkrankung involviert sind) oder irgendeine andere Art von erkrankten oder abnormalen Zellen, bereit, während sie ein Minimum an Nebenwirkungen zeigen.
Diese Thiol-enthaltenden Maytansinoide sind chemisch mit einem zellbindenden Mittel verknüpft, während sie eine hohe Zytotoxizität entweder in gebundener Form oder in freigesetzter Form oder in beiden Zuständen behalten. Hohe Zytoto xizität ist definiert als das Zeigen einer Zytotoxizität mit einer IC₅₀ – der inhibierenden Konzentration einer toxischen Substanz, die eine überlebende Fraktion von 0,5 zurücklässt – von etwa 10^–8 M oder weniger, wenn sie in vitro mit KB Zellen nach 24 Stunden Expositionszeit gegenüber dem Arzneimittel gemessen wird.
Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen als therapeutische Mittel hängt von der sorgfältigen Auswahl eines geeigneten Zellbindungsmittels ab. Zellbindungsmittel können irgendeine der derzeit bekannten Art sein, oder jene die bekannt werden und Peptide und Nicht-Peptide einschließen. Im Allgemeinen können dies Antikörper (insbesondere monoklonale Antikörper), Lymphokine, Hormone, Wachstumsfaktoren, Nährstofftransport Moleküle (wie Transferrin) oder irgendein anderes zellbindendes Molekül oder Substanz sein.
Geeignete Maytansinoide
Es gibt eine Vielzahl von Offenbarungen, welche die Herstellung von Maytansinoiden und Maytansinoid Derivaten lehren, die als ein zytotoxisches Mittel verwendet werden können. Beispiele von geeigneten Maytansinoiden schließen Maytansinol und Maytansinol Analoga ein. Beispiele von geeigneten Maytansinol Analoga schließen jene, die einen modifizierten aromatischen Ring aufweisen und jene, die Modifikationen an anderen Positionen aufweisen, ein.
Besondere Beispiele von geeigneten Analoga von Maytansinol, die einen modifizierten aromatischen Ring aufweisen, und das Verfahren für ihre Herstellung, schließen ein:

(1) C-19-Dechlor (US Patent Nr. 4,256,746) (hergestellt durch Lithiumaluminiumhydrid Reduktion von Ansamitocin P-2);
(2) C-20-Hydroxy (oder C-20-Demethyl) +/–C-19-Dechlor (US Patent Nrn. 4,361,650 und 4,307,016) (hergestellt durch Demethylierung unter Verwendung von Streptomyces oder Actinomyces oder Entchlorung unter Verwendung von LAH); und
(3) C-20-Demethoxy, C-20-Acyloxy (-OCOR), +/–Dechlor (US Patent Nr. 4,294,757) (hergestellt durch Acylierung unter Verwendung von Acylchloriden).

Besondere Beispiele von geeigneten Analoga von Maytansinol, die Modifikationen an anderen Positionen aufweisen, schließen ein:

(1) C-9-SH (US Patent Nr. 4,424,219) (hergestellt durch die Reaktion von Maytansinol mit H₂S oder P₂S₅);
(2) C-14-Alkoxymethyl(demethoxy/CH₂OR) (US Patent Nr. 4,331,598);
(3) C-14-Hydroxymethyl oder Acyloxymethyl (CH₂OH oder CH₂OAc) (US Patent Nr. 4,450,254) (hergestellt aus Nocardia);
(4) C-15-Hydroxy/Acyloxy (US Patent Nr. 4,364,866) (hergestellt durch die Umwandlung von Maytansinol durch Streptomyces);
(5) C-15-Methoxy (US Patent Nrn. 4,313,946 und 4,315,929) (isoliert aus Trewia nudlflora);
(6) C-18-N-Demethyl (US Patent Nrn. 4,362,633 und 4,322,348) (hergestellt durch die Demethylierung von Maytansinol durch Streptomyces); und
(7) 4,5-Desoxy (US Patent Nr. 4,371,533) (hergestellt durch die Titantrichlorid/LAH Reduktion von Maytansinol).

Um das Maytansinoid mit dem zellbindenden Mittel zu verknüpfen, wird eine Verknüpfungsgruppe verwendet.
Geeignete Verknüpfungsgruppen sind im Stand der Technik gut bekannt und schließen Disulfidgruppen, Thioethergruppen, säurelabile Gruppen, fotolabile Gruppen, Peptidase labile Gruppen und Esterase labile Gruppen ein. Bevorzugt sind Disulfidgruppen und Thioethergruppen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Verknüpfungsgruppe Teil eines chemischen Restes, der kovalent mit dem Maytansinoid durch die offenbarten Verfahren verbunden ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der chemische Rest kovalent mit dem Maytansinoid über eine Esterverknüpfung verbunden.
Von vielen Postionen auf Maytansinoiden wird erwartet, dass sie als Verknüpfungsposition, in Abhängigkeit von der Art der Verknüpfung, nützlich sind. Zum Beispiel wird für die Bildung einer Esterverknüpfung von der C-3 Position, die eine Hydroxyl Gruppe aufweist, der C-14 Position, die mit Hydroxymethyl modifiziert ist, der C-15 Position, die mit Hydroxy modifiziert ist und der C-20 Position, die eine Hydroxy Gruppe aufweist, erwartet, dass sie nützlich sind. Jedoch ist die C-3 Position bevorzugt, und die C-3 Position von Maytansinol ist besonders bevorzugt.
Ebenfalls bevorzugt ist ein N-Methyl-L-alanin enthaltender C-3 Ester von Maytansinol und ein N-Methyl-L-cystein enthaltender C-3 Ester von Maytansinol oder ihre Analoga.
Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zur Herstellung und Reinigung eines Thiol-enthaltenden Maytansinoids, das die Verknüpfungsgruppe an C-3 des Maytansinols anordnet.
Schritt 1: Synthese von Maytansinol (2) aus einem Ester tragenden Maytansinoid
Der erste Schritt in der Herstellung und Reinigung von Thiol-enthaltenden Maytansinoiden schließt die reduktive Hydrolyse eines Maytansinoid C-3 Esters zu Maytansinol (2) ein.

A) Ein Maytansinoid C-3 Ester wird in einem wasserfreien Lösungsmittel gelöst, anschließend unter eine inerte Gasatmosphäre gegeben und gekühlt. Vorzugsweise ist der Maytansinoid C-3 Ester Maytansin oder Ansamitocin P-3 (1c). Irgendein Ansamitocin (1a–e), wie Ansamitocin P-4, P-3, P-2 und P-1 (beschrieben in Asai et al., 35 Tetrahedron 1079–1085 (1979); US Patent Nr. 4,450,234; Hatano et al., 48 Agric. Biol. Chem. 1721–1729 (1984)) können ebenfalls verwendet werden, weiter bevorzugt Ansamitocin P-3 (1c). Maytansin kann erhalten werden, wie von Kupchan et al., 42 J. Org. Chem. 2349–2357 (1977) beschrieben ist. Die mikrobiologische Herstellung von Ansamitocin P-3 (1c) ist in dem US Patent Nr. 4,450,234 und in Hatano et al., Agric. Biol. Chem. 1721–1729 (1984), beschrieben. Vorzugsweise ist das wasserfreie Lösungsmittel Tetrahydrofuran (THF), 2-Methoxyethylether, Dioxan oder Diethylether, obwohl andere Lösungsmittel verwendet werden können. Weiter bevorzugt ist das wasserfreie Lösungsmittel Tetrahydrofuran. Vorzugsweise werden 20 bis 30 mL des wasserfreien Lösungsmittels pro Gramm Ester verwendet, weiter bevorzugt 25 mL/g. Vorzugsweise ist das inerte Gas Argon, Stickstoff oder Helium, obwohl andere Gase verwendet werden können. Weiter bevorzugt ist das inerte Gas Argon. Vorzugsweise wird die Lösung bei etwa zwischen 0 und –80°C, weiter bevorzugt zwischen etwa –30 bis –50°C, am meisten bevorzugt zwischen etwa –35 bis –45°C in einem trockenen Eisacetonbad gehalten.
B) Ein Reduktionsmittel wird ebenfalls gekühlt und anschließend in die gekühlte Lösung des Maytansinoid C-3 Esters übertragen. Die Reaktion wird unter einer inerten Gasatmosphäre, bei einer niedrigen Temperatur, gehalten und gerührt. Vorzugsweise ist das Reduktionsmittel Lithiumtrimethoxyaluminiumhydrid (LiAl(OMe)₃H), Lithiumtriethoxyaluminiumhydrid LiAl(OEt)₃H), Lithiumtripropoxyaluminiumhydrid (LiAl(OPr)₃H), Natriumtrimethoxyaluminiumhydrid (NaAl(OMe)₃H), Natriumtriethoxyaluminiumhydrid (NaAl(OEt)₃H) und Natriumtripropoxyaluminium hydrid (NaAl(OPr)₃H). Weiter bevorzugt ist das Reduktionsmittel Lithiumtrimethoxyaluminiumhydrid (LiAl(OMe)₃H). Vorzugsweise wird das Reduktionsmittel auf etwa –30 bis –40°C in einem trockenen Eisacetonbad gekühlt. Vorzugsweise wird das gekühlte Reduktionsmittel in die abgekühlte Lösung des Maytansinoid C-3 Esters über eine Kanüle übertragen. Vorzugsweise ist das inerte Gas Argon, Stickstoff oder Helium, obwohl andere Gase verwendet werden können. Weiter bevorzugt ist das inerte Gas Argon. Vorzugsweise wird das Reduktionsmittel in einer Konzentration von etwa 5 bis 100 Äquivalenten pro Mol des Maytansinoid C-3 Esters, weiter bevorzugt von etwa 7,5 bis 30 Äquivalenten pro Mol, am meisten bevorzugt von etwa 10 bis 20 Äquivalenten pro Mol verwendet. Der Fachmann wird verstehen, dass die Verwendung des Reduktionsmittels in Mengen größer als etwa 100 Äquivalente pro Mol des Maytansinoid C-3 Esters zu unerwünschten Nebenprodukten führen kann. Vorzugsweise wird das Reduktionsmittel zu der gekühlten Lösung des Maytansinoid C-3 Esters über einen Zeitraum im Bereich von etwa 5 bis 40 Minuten, weiter bevorzugt von etwa 7 bis 20 Minuten, am meisten bevorzugt von etwa 8 bis 12 Minuten hinzugefügt. Vorzugsweise wird die Reaktion unter einer inerten Gasatmosphäre bei einem Temperaturbereich von etwa –25°C bis –80°C, weiter bevorzugt von etwa –27°C bis –45°C, am meisten bevorzugt von etwa –30°C bis –35°C gehalten. Vorzugsweise wird die Reaktion zwischen etwa 30 min. und drei Stunden, weiter bevorzugt für etwa drei Stunden gerührt. Der Fachmann wird verstehen, dass die Menge des verwendeten Reduktionsmittels, die Temperatur, die während der Reaktion aufrechterhalten wird, die Länge des Zeitraums, während dem das Reduktionsmittel hinzugefügt wird und die Reaktionszeit jeweils voneinander abhängen. Je niedriger zum Beispiel die Menge des Reduktionsmittels ist, desto länger ist die Reaktionszeit. Genauso, je niedriger die Temperatur ist, desto größer ist der benötigte Überschuss des Reduktionsmittels und desto länger die Zeit, die für den Abschluss der Reaktion benötigt wird. Je langsamer darüber hinaus die Geschwindigkeit ist, mit der das Reduktionsmittel hinzugefügt wird, desto länger ist die Reaktionszeit, die für den Abschluss der Reaktion benötigt wird.
C) Die Reaktion wird gequenscht, extrahiert, getrocknet und filtriert. Das Lösungsmittel wird unter reduziertem Druck verdampft, um Roh Maytansinol zu erhalten. Vorzugsweise wird die Reaktion durch das Hinzufügen von gesättigter Natriumchlorid Lösung, Wasser oder Ammoniumchlorid Lösung, weiter bevorzugt durch das Hinzufügen von gesättigter Natriumchlorid Lösung, gequenscht. Vorzugsweise wird die Reaktion unter Verwendung von zwischen etwa 20 bis 40 mL der Lösung pro Gramm des verwendeten Maytansinoid Esters gequenscht. Vorzugsweise wird die Reaktion mit Ethylacetat, Dichlormethan, Toluol, Chloroform oder Ether, weiter bevorzugt mit Ethylacetat, extrahiert. Vorzugsweise wird die Reaktion in einer Geschwindigkeit von zwischen etwa 4 × 80 bis 4 × 200 mL/g verwendetem Maytansinoid Ester extrahiert. Vorzugsweise werden die vereinigten Ethylacetat Extrakte über Natriumsulfat oder Magnesiumsulfat, weiter bevorzugt Natriumsulfat getrocknet, und filtriert.
D) Das Roh Maytansinol (2) kann, wenn notwendig, durch Chromatographie gereinigt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Roh Maytansinol (2) durch sein Lösen in einem minimalen Volumen an Ethylacetat, Dichlormethan, Ether, Chloroform oder Toluol, weiter bevorzugt Ethylacetat, gereinigt werden und über Silica-Gel Säulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan, Chloroform, Ethylacetat oder Toluol, weiter bevorzugt Dichlormethan, gereinigt werden. Vorzugsweise wird das Maytansinol (2) mit einem Stufengradienten, der mit Dichlormethan oder Ethylacetat oder einer Gemisch aus Dichlormethan:Ethylacetat:Alkohol, Chloroform:Ethylacetat oder Toluol:Ethylacetat, vorzugsweise 77:23:0, v/v/v, Dichlormethan:Ethylacetat:Alkohol beginnt, eluiert werden. Die Konzentration des Alkohols wird langsam von 0 bis etwa 20%, vorzugs weise von 0 bis etwa 10% erhöht. Die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthalten, werden vereinigt und unter reduziertem Druck verdampft, um reines Maytansinol (2) als einen weißen Feststoff zu erhalten. Die Reinigung kann bei Umgebungstemperatur durchgeführt werden. Vorzugsweise wird die Reinigung bei einer Temperatur von etwa 20°C und 25°C durchgeführt. Vorzugsweise ist der Alkohol Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, n-, iso-, sec- oder tert-Butanol, weiter bevorzugt Methanol.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann das Roh Maytansinol (2) unter Verwendung einer Cyano-gebundenen Silica HPLC-Säule gereinigt werden, die in Normal-Phase, unter Verwendung von organischen Lösungsmitteln in der mobilen Phase, betrieben wird. Das Roh Maytansinol (2) wird in Ethylacetat, Ethylacetat:Isopropanol:Hexan (mobile Phase) oder in Ethylacetat-Isopropanol, vorzugsweise Ethylacetat, in die Säule eingespritzt, gelöst, und der/die geeignete Peak (Spitze) wird gesammelt. Vorzugsweise ist die Cyano-gebundene HPLC-Säule, die für die Trennung verwendet wird, eine, die Cyanopropyl und Cyano-di-isopropyl Gruppen stabil gebunden an dem Silica Rückgrat aufweist. Solche Säulen sind unter den Handelsnamen Diazem^TM, Zorbax^TM, Monochrom^TM und Kromasil^TM erhältlich, um einige zu nennen. Vorzugsweise ist das organische Lösungsmittel, das in der mobilen Phase verwendet wird, Hexane:2-Propanol:Dichlormethan:Ethylacetat. Vorzugsweise liegt die Konzentration jedes Bestandteils des organischen Lösungsmittels jeweils im Bereich von 65-75:2-4:15-20:5-10, v/v/v/v. Weiter bevorzugt beträgt die Konzentration jedes Elements des organischen Lösungsmittels 72:3:18:7, v/v/v/v.
Vorzugsweise ist das Maytansinol (2), das durch dieses Verfahren gereinigt wurde, mindestens 90% rein, weiter bevorzugt mindestens 95% rein. Der Fachmann wird verstehen, dass, falls Maytansinol (2) von weniger als 90% Reinheit in den folgenden Schritten verwendet wird, zusätzliche Reinigungsschritte notwendig sein können.
Der Fachmann wird verstehen, dass die Reduktionsreaktion zu kleinen Mengen unerwünschter Nebenprodukte, zusätzlich zu dem Maytansinol (2) führen kann. So kann Reinigung erforderlich sein, um die Verunreinigungen zu entfernen. Wenn jedoch die Nebenprodukte nicht gebildet werden, wie in den Fällen, in denen die exakten Zeiten, Temperaturen und Mengen eingehalten werden, dann wird kein Reinigungsschritt benötigt.
Schritt 2: Synthese von Estern von Maytansinol (2) mit einer Verknüpfungsgruppe
Das Maytansinol (2) aus Schritt 1 wird als nächstes mit Disulfid enthaltenden N-Methyl-L-alanin Derivaten 6a–g oder N-Methyl-L-cystein Derivaten 9a–b in der Anwesenheit von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und Zinkchlorid verestert, um L- und D-Aminoacylester 10a–g und 12a–b von Maytansinol zu erhalten, die eine Disulfid-Verknüpfungsgruppe enthalten. Die Stereoisomere werden anschließend getrennt, und der L-Aminoacylester wird gesammelt. Weil die Veresterungsreaktion zu etwas Epimerisierung an dem chiralen Zentrum der Aminosäure Derivate 6a–g und 9a–b führt, wird der Fachmann verstehen, dass die racemischen Versionen von 6a–g und 9a–b (d.h. eine D, L-Gemisch) in Schritt 2, anstelle der Stereoisomere, verwendet werden können.

A) In einer Ausführungsform werden die N-Methyl-L-alanin Derivate 6a–g, die eine Disulfidgruppe enthalten, durch Umwandlung von ω-Mercaptocarbonsäuren 3a–e verschiedener Kettenlängen in ihre jeweiligen Methyldithio, z.B. 4a–e (wo n = 1–4, einschließlich verzweigten und zyklischen Aliphaten) oder Aryl-Dithio, z.B. 5a–b Derivate umgesetzt, indem sie mit Methylmethanthiolsulfonat oder Aryldisulfiden, wie Diphenyldisulfid und ringsubstituierten Diphenyldisulfiden und heterozyklischen Disulfiden, wie 2,2'-Dithiopyridin, reagiert werden. Diese Carbonsäuren werden anschließend mit N-Methyl-L-alanin reagiert, um die gewünschten N-Methyl-L-alanin Derivate zu bilden, die eine Disulfidgruppe 6a–g enthalten, die mit Maytansinol (2) kondensieren wird, um Maytansinoide, die Disulfid-Verknüpfungsgruppen 10a–g enthalten, zu bilden. N-Methyl-L-alanin kann hergestellt werden wie in der Literatur beschrieben (siehe Fu, S. J. & Birnbaum, S. M. 75 J. Amer. Chem. Soc. 918 (1953)), oder es ist kommerziell erhältlich (Sigma Chemical Company). Vorzugsweise sind die N-Methyl-L-alanin Derivate, die eine Disulfidgruppe enthalten, N-Methyl-N-methyldithioacetyl-L-alanin, N-Methyl-N-(3-methyldithio-propanoyl)-L-alanin, N-Methyl-N-(3-methyldithio-butanoyl)-L-alanin, N-Methyl-N-(4-methyldithio-butanoyl)-L-alanin, N-Methyl-N-(5-methyldithio-pentanoyl)-L-alanin, N-Methyl-N-(3-phenyldithio-propanoyl)-L-alanin und N-Methyl-N-[3-(4-nitrophenyldithio)propanoyl]-L-alanin.
B) In einer anderen Ausführungsform kann N-Methyl-L-cystein (7a) oder N-Methyl-L-homocystein (7b) in die jeweiligen Disulfid Derivate 8a–b (n = jeweils 1 und 2) umgewandelt werden, die anschließend acyliert werden, um die gewünschten N-Methyl-L-cystein oder N-Methyl-L-homocystein Derivate zu erhalten, die eine Disulfidgruppe enthalten 9a–b (n = jeweils 1 und 2). Diese Disulfid enthaltenden Derivate 9a–b werden mit Maytansinol (2) kondensiert, um Maytansinoide zu bilden, die Disulfid-Verknüpfungsgruppen 12a–b enthalten. N-Methyl-L-cystein kann hergestellt werden wie in Undheim und Edem, 23 Acta Chem. Scand. 3129–3133 (1970), beschrieben ist. Vorzugsweise sind die N-Methyl-L-cystein Derivate, die eine Disulfidgruppe enthalten, N-Acetyl-N-methyl-methyldithio-cystein (9a) und N-Acetyl-N-methyl-methyldithio-homocystein (9b).
C) Maytansinol (2) wird mit einem N-Methyl-L-alanin oder N-Methyl-L-cystein Derivat, das eine Disulfidgruppe (6a–g und 9a–b) enthält, verestert, indem zunächst eine Lösung des Disulfid enthaltenden Derivats hergestellt wird. Diese Lösung wird unter einer inerten Gasatmosphäre gerührt und nacheinander mit Lösungen aus (a) DCC oder EDC ([3-(Dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid), vorzugsweise DCC, (b) ZnCl₂ und (c) Maytansinol, behandelt. Das Gemisch wird bis zum Abschluss der Reaktion gerührt. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, wird es gefiltert und das Filtrat unter reduziertem Druck verdampft, was ein Gemisch aus den L- und D-Aminoacyl Estern 10 und 12 von Maytansinol ergibt. Weil die Veresterungsreaktion zu etwas Epimerisierung an dem chiralen Zentrum der Aminosäure Derivate 6a–g und 9a–b, wie oben angemerkt, führt, wird der Fachmann verstehen, dass die racemischen Versionen von 6a–g und 9a–b (d.h ein D, L-Gemisch) anstelle der Stereoisomere verwendet werden können. Vorzugsweise ist das N-Methyl-L-alanin oder N-Methyl-L-cystein Derivat, das eine Disulfidgruppe enthält, jeweils N-Methyl-N-(methyldithio-propanoyl)-L-alanin (6b) bzw. N-Acetyl-N-methyl-methyldithiocystein (9a). Vorzugsweise umfasst die Lösung des Disulfid enthaltenden Derivats trockenes Methylenchlorid, Dihydrofuran oder Ether, vorzugsweise trockenes Methylenchlorid, unter Verwendung von zwischen etwa 10 bis 50 mL/Gramm Maytansinol, vorzugsweise 20 mL/Gramm. Vorzugsweise ist das inerte Gas Argon, Stickstoff oder Helium, obwohl andere Gase verwendet werden können. Am meisten bevorzugt ist das inerte Gas Argon. Vorzugsweise liegt das DCC oder EDC in Methylenchlorid, Tetrahydrofuran oder Ether, vorzugsweise Methylenchlorid, vor, unter Verwendung von etwa 10 bis 15 mL pro Gramm DCC oder EDC, vorzugsweise 12 mL/g. Vorzugsweise wird die DCC oder EDC Lösung in einer Geschwindigkeit von etwa 5 bis 7 mol/mol Maytansinol hinzugefügt. Vorzugsweise beträgt das ZnCl₂ etwa 1 M, und es wird bei zwischen etwa 1,2 bis 1,5 mol/mol Maytansinol, vorzugsweise 1,25 mol, in Ether oder Methylenchlorid, vorzugsweise Ether verwendet. Vorzugsweise liegt Maytansinol in Methylenchlorid, Tetrahydrofuran oder Ether, weiter bevorzugt Methylenchlorid, unter Verwendung von etwa 10 bis 120 mL Lösungsmittel pro Gramm Maytansinol, vorzugsweise 100 mL/g, vor. Das Reaktionsgemisch wird bei etwa 4 bis 30°C, vorzugsweise Raumtemperatur, für 1 bis 24 Stunden, vorzugsweise drei Stunden gerührt. Der Fachmann wird verstehen, dass die Länge der Reaktionszeit das Rühren in Abhängigkeit von der Temperatur benötigt, wobei geringere Temperaturen zu längerer Reaktionszeit führen.
D) Die Trennung der L- und D-Aminoacyl Maytansinol Ester 10a–g und 12a–b wird über eine Cyano-gebundene Silica HPLC-Säule erreicht, die in Normal-Phase unter Verwendung von organischen Lösungsmitteln in der mobilen Phase betrieben wird. Eine Lösung des L- und D-Aminoacyl Maytansinol Ester Gemisches, gelöst in Ethylacetat oder in Hexanen:2-Propanol:Ethylacetat, wird auf die Säule gespritzt. Die mobile Phase kann eingestellt werden, um die Trennung in Rückhaltezeiten der zwei Isomere, die größer ist als 10 Minuten, zu erhalten.

Alternativ dazu kann die Trennung unter Verwendung von Silica-Gel Chromatographie durchgeführt werden, aber das Verfahren kann nicht einfach in einen industriellen Maßstab umgewandelt werden. Die Trennung kann auch durch andere, weniger wünschenswerte Mittel, wie HPLC unter Verwendung von chiralen Säulen oder Silica-Säulen, erreicht werden.
Vorzugsweise sind die Cyano-gebundenen HPLC-Säulen, die für die Trennung verwendet werden, jene, die Cyanopropyl und Cyanodiisopropyl Gruppen stabil gebunden an dem Silica Rückgrat enthalten. Solche Säulen sind unter anderem unter den Handelsnamen Diazem^TM, Zorbax^TM, Monochrom^TM und Kromasil^TM erhältlich. Vorzugsweise ist das organische Lösungsmittel, das in der mobilen Phase verwendet wird, Hexane:2-Propanol:Ethylacetat. Vorzugsweise ist die Ausbeute der Trennung größer als etwa 90%, und das Produt ist mindestens etwa 95 rein, weiter bevorzugt optisch rein. Unter den zuvor genannten Bedingungen besitzt das gewünschte L-Isomer eine Rückhaltezeit von etwa 36 bis 46 min., vorzugsweise 42 min., während das D-Isomer nach etwa 50 bis 60 Minuten, vorzugsweise 56 min. eluiert. Vorzugsweise wird die Veresterung bei etwa 25°C durchgeführt.
Schritt 3: Synthese von Thiol-enthaltendem Maytansinoid 11a–g und 13a–b
Um Thiol-enthaltende Maytansinoide 11a–g und 13a–b zu erhalten, werden die L-Aminoacyl Maytansinol Ester, die aus Schritt 2 erhalten wurden, in einer Lösung gelöst, die ein Lösungsmittel und einen Alkohol enthält. Dieses Gemisch wird unter einer inerten Gasatmosphäre gerührt und mit einer Lösung von Diithiothreitol oder Dithioerythritol in einem Puffer, der Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthält, behandelt. Der Verlauf der Reaktion kann durch HPLC überwacht werden und ist für gewöhnlich in 3 h abgeschlossen, obwohl er zwischen 1 und 24 h schwanken kann. Die abgeschlossene Reaktion wird mit einer gepufferten Lösung, die EDTA enthält, behandelt und anschließend extrahiert. Die organischen Schichten werden vereinigt, gewaschen und getrocknet. Das Verdampfen des Lösungsmittels ergibt einen Rückstand aus Roh Thiol-enthaltendem Maytansinoid 11a–g und 13a–b, der unter Verwendung einer präparativen Cyano-gebundenen Silica HPLC-Säule gereinigt werden kann. Die Fraktionen, die das Produkt enthalten, können verdampft werden, um reines Thiol-enthaltendes Maytansinoid als einen weißen Feststoff zu erhalten.
Vorzugsweise ist das Lösungsmittel, in dem die L-Aminoacyl Maytansinol Ester, die aus Schritt 2 erhalten wurden, gelöst werden, Ethylacetat, Dichlormethan oder Ether, weiter bevorzugt Ethylacetat, wobei von etwa 60 bis 80 mL Lösungsmittel pro Gramm Maytansinoid, vorzugsweise 72 mL/g verwendet wird. Vorzugsweise ist der Alkohol, in dem die L-Aminoacyl Maytansinol Ester, die aus Schritt 2 erhalten werden, gelöst werden, Methanol oder Ethanol, weiter bevorzugt Methanol, wobei von etwa 90 bis 120 mL Alkohol pro Gramm Maytansinoid, vorzugsweise 108 mL/g verwendet wird. Vorzugsweise findet die Reaktion zwischen L-Aminoacyl Maytansinol Estern und Dithiothreitol in einem Gemisch aus Ethylacetat:Methanol:wässrigem Puffer statt, das befähigt ist, Puffersalze, Dithiothreitol und Maytansinoide (reduzierte und nicht reduzierte Formen) in Lösung zu erhalten. Weiter bevorzugt findet die Reaktion zwischen L-Aminoacyl Maytansinol Estern und Dithiothreitol in einem 1:5:1 Gemisch aus Ethylacetat:Methanol:wässrigem Puffer statt.
Vorzugsweise ist die Konzentration von L-Aminoacyl Maytansinol Estern, die in Schritt 3 verwendet werden, geringer als etwa 4 g/L, so dass die L-Aminoacyl Maytansinol Ester gelöst bleiben.
Vorzugsweise wird die Reduktionsreaktion in einer sauerstofffreien Atmosphäre durchgeführt. Vorzugsweise ist das inerte Gs Argon, Stickstoff oder Helium, obwohl andere Gase verwendet werden können. Vorzugsweise ist das inerte Gas Argon.
Vorzugsweise wird die Reduktionsreaktion zwischen 4 und 30°C, weiter bevorzugt bei Raumtemperatur durchgeführt. Der Fachmann wird verstehen, dass die Reaktion bei niedrigeren Temperaturen durchgeführt werden kann, jedoch ist die Zeit, die für den Abschluss der Reaktion benötigt wird, länger.
Vorzugsweise wird die Lösung, welche die L-Aminoacyl Maytansinol Ester enthält, mit Dithiothreitol, Dithioerythritol oder einem Phosphinreagenz, wie tris(2-Carboxyethyl)phosphin (TCEP), weiter bevorzugt Dithiothreitol behandelt, wobei etwa 2 bis 3 mol Reduktionsmittel pro Mol Maytansinoid, vorzugsweise 2,5 mol/mol in Kaliumphosphat Puffer, Natriumphosphat Puffer oder Triethanolamin Puffer, vorzugsweise Kaliumphosphat Puffer verwendet werden, wobei der Puffer in einer Konzentration zwischen etwa 20 bis 100 mM, vorzugsweise 50 mM, vorliegt, wobei 60 bis 80 mL des gepufferten DTT pro Gramm Maytansinoid, vorzugsweise 72 mL/g und enthaltend von etwa 1 bis 10 mM, vorzugsweise 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) verwendet wird.
Vorzugsweise wird die abgeschlossene Reaktion mit einer 0,2 M Lösung von Kaliumphosphat Puffer, Natriumphosphat Puffer oder Triethanolamin Puffer, weiter bevorzugt Kaliumphosphat Puffer behandelt, wobei von etwa 120 bis 160 mL Puffer pro Gramm Maytansinoid, vorzugsweise 144 mL/g und enthaltend von etwa 1 bis 10 mM, vorzugsweise 2 mM EDTA, verwendet werden. Vorzugsweise wird die Extraktion mit Ethylacetat, Dichlormethan oder Ether, weiter bevorzugt Ethylacetat, wobei 200 bis 500 mL pro Gramm Maytansinoid, vorzugsweise 300 mL/g ver wendet werden, dreimal wiederholt. Vorzugsweise werden die vereinigten organischen Schichten mit einer gesättigten Lösung Natriumchlorid Lösung, Wasser oder einer gesättigten Ammoniumchlorid Lösung, weiter bevorzugt einer gesättigten Natriumchlorid Lösung gewaschen, wobei 40 bis 100 mL pro Gramm Maytansinoid, vorzugsweise 50 mL/g verwendet und anschließend über Natriumsulfat oder Magnesiumsulfat, vorzugsweise Natriumsulfat getrocknet werden.
Vorzugsweise sind die Cyano-gebundenen HPLC-Säulen, die für die Trennung verwendet werden, jene, die Cyanopropyl und Cyano-di-isopropyl Gruppen stabil an ein Silica Rückgrat gebunden, enthalten. Solche Säulen sind unter den Handelsnamen Diazem^TM, Zorbax^TM, Monochrom^TM und Kromasil^TM erhältlich, um einige zu nennen. Weiter bevorzugt wird eine Diazem präparative CN-Säule (250 mm × 50 mm, 10 Mikron Teilchengröße) verwendet. Vorzugsweise ist das organische Lösungsmittel, das in der mobilen Phase verwendet wird, Hexane:2-Propanol:Ethylacetat. Weiter bevorzugt ist das organische Lösungsmittel, das in der mobilen Phase verwendet wird, ein 78,0:5,5:16,5 (v/v/v) Gemisch aus Hexanen:2-Propanol:Ethylacetat. Vorzugsweise beträgt die Durchflussmenge 150 mL/min. Vorzugsweise ist die Ausbeute der Trennung größer als 75%, und das Produkt ist mindestens etwa 90% rein, weiter bevorzugt mindestens etwa 95% rein. Vorzugsweise besitzen die gewünschten Thiol-enthaltenden Maytansinoide 11a–d und 13a–b eine Rückhaltezeit von 16 min., innerhalb eines Bereichs von 14 bis 18 min.
Besondere Beispiele der N-Methyl-L-alanin enthaltenden Maytansinoid Derivate, die durch die vorliegende Erfindung gelehrt werden, sind durch die Formeln (I)–(IV) dargestellt:
wobei: Z H oder SR darstellt, wobei R eine Methyl-, lineare Alkyl-, verzweigte Alkyl-, zyklische Alkyl-, einfache oder substituierte Aryl- oder heterozyklische Gruppe darstellt; / stellt eine ganze Zahl von 1 bis 10 dar; und may stellt ein Maytansinoid dar.
wobei: R₁ und R₂, die gleich oder verschieden sein können, H, CH₃ oder CH₂CH₃ darstellen; Z H oder SR darstellt, wobei R Methyl, lineares Alkyl, verzweigtes Alkyl, zyklisches Alkyl, einfaches oder substituiertes Aryl oder heterozyklisch darstellt; m stellt 0, 1, 2 oder 3 dar; und may stellt ein Maytansinoid dar.
wobei: Z H oder SR darstellt, wobei R Methyl, lineares Alkyl, verzweigtes Alkyl, zyklisches Alkyl, einfaches oder substituiertes Aryl oder heterozyklisch darstellt; p eine ganze Zahl von 3 bis 8 darstellt; und may ein Maytansinoid darstellt.
wobei: Z H oder SR darstellt, wobei R Methyl, lineares Alkyl, verzweigtes Alkyl, zyklisches Alkyl, einfaches oder substituiertes Aryl oder heterozyklisch darstellt; q eine ganze Zahl von 1 bis 10 darstellt; Y Cl oder H darstellt; und X oder H oder CH₃ darstellt.
Besondere Beispiele von N-Methyl-L-cystein enthaltenden Maytansinoid Derivaten, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind durch die Formeln (V) und (VI) dargestellt:
wobei: Z H oder SR darstellt, wobei R Methyl, lineares Alkyl, verzweigtes Alkyl, zyklisches Alkyl, einfaches oder substituiertes Aryl oder heterozyklisch darstellt; o 1 oder 2 darstellt; q 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 10 darstellt; und may ein Maytansinoid darstellt.
wobei: Z H oder SR darstellt, wobei R Methyl, lineares Alkyl, verzweigtes Alkyl, zyklisches Alkyl, einfaches oder substituiertes Aryl oder heterozyklisch darstellt; o 1 oder 2 darstellt; q 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 10 darstellt; Y Cl oder H darstellt; und X H oder CH₃ darstellt.
Beispiele von linearen Alkylen schließen Methyl, Ethyl, Propyl Butyl, Pentyl und Hexyl ein.
Beispiele von verzweigten Alkylen schließen Isopropyl, Isobutyl, sec.-Butyl, tert.-Butyl, Isopentyl und 1-Ethylpropyl, ein.
Beispiele von zyklischen Alkylen schließen Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl und Cyclohexyl ein.
Beispiele von einfachen Arylen schließen Phenyl und Naphthyl ein.
Beispiele von substituierten Arylen schließen Aryle wie jene, die oben beschrieben sind, substituiert mit Alkylgruppen, mit Metallogenen, wie Cl, Br, F, Nitro Gruppen, Amino Gruppen, Sulfonsäure Gruppen, Carbonsäure Gruppen, Hydroxy Gruppen und Alkoxy Gruppen, ein.
Beispiele von Heterozyklen sind Verbindungen, in denen die Heteroatome ausgewählt sind aus 0, N und S und Pyrrollyl, Pyridyl, Furyl und Thiopen.
Definitionen
So wie hier verwendet, bedeuten die Begriffe "Raumtemperatur" und "Umgebungstemperatur" Umwelttemperatur und nicht kontrollierte Temperatur. Der Begriff "optische Reinheit" bedeutet, dass die Reinheit 98% übersteigt. Wo hier Bereiche angegeben sind z.B. Temperatur, Zeit, Konzentration etc., schließt der Bereich alle spezifischen Werte innerhalb des Bereichs ebenso wie alle Unterbereiche, die innerhalb den breiten Bereich fallen, ein. Wo Werte als "etwa" eines spezifischen Werts, oder eines Bereichs von Werten angegeben sind, wird verstanden, dass statistisch nicht signifikante Abweichungen in diesen Werten ebenfalls eingeschlossen sind.
BEISPIELE
Die Erfindung wird jetzt durch Bezugnahme auf nicht einschränkende Beispiele dargestellt. Außer es ist anders angegeben, beziehen sich alle Prozentangaben, Verhältnisse und Teile etc. auf das Gewicht.
Beispiel 1 – Synthese von Thiol-enthaltenden Maytansinoid Derivaten
Die Schmelzpunkte wurden auf einem elektrothermischen Schmelzpunktapparat bestimmt. Die Protonen magnetischen Resonanz (¹H NMR) Spektren wurden auf einem Varian^TM EM360 Spektrometer bei 60 MHz oder auf einer Bruker^TM AM300 Maschine bei 300 MHz erhalten. Chemische Shifts sind in δ Werten relativ zu einem internen Tetramethylsilan (TMS) Standard angegeben. Die UV Spektren wurden auf einem Perkin Elmer^TM λ4A Spektrophotometer aufgenommen. Die optischen Drehungen wurden unter Verwendung eines Perkin Elmer^TM Modell 241 Polarimeters bestimmt. Ein Rainin^TM HP, Hewlett Packard^TM oder Hitachi^TM Instrument, das mit einem Wellenlängen oder Dioden Array UV Detektor ausgestattet ist und eine Waters^TM Radialpak C-18 Säule oder Diazem^TM Cyano oder Chromasil^TM Cyano-Säule wurden für HPLC Analysen und Reinigung verwendet. Die Elementaranalysen wurden von Atlantic Mikrolabs, Atlanta, GA durchgeführt.
2-Mercaptoessigsäure (3a), 3-Mercaptoproprionsäure (3b) und 4-Mercaptobuttersäure (3c) sind kommerziell erhältlich.
5-Mercaptopentansäure (3d). 5-Mercaptopentansäure (3d) wurde durch eine Modifikation eines Literaturverfahrens hergestellt (Khim et al., 37 J. Org. Chem. 2714–2720 (1972)). Zu einer gerührten Lösung von 5-Brompentansäure (1,80 g, 0,01 mol) in reinem Ethanol (25 mL) wurde Thioharnstoff (0,761 g, 0,01 mol) hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde unter Rückfluss für 6 Stunden behandelt. Eine Lösung von 50% wässrigem NaOH (20 mL) wurde anschließend hinzugefügt, und das Gemisch wurde für weitere zwei Stunden unter Rückfluss behandelt. Das Gemisch wurde anschließend mit Wasser (100 mL) verdünnt, angesäuert (wässrige HCl) und mit Ethylacetat (4 × 50 mL) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck verdampft. Der Rückstand wurde über Silica-Gel chromatographiert, mit Methylenchlorid/Ethylacetat eluiert, um 0,885 g (66%) einer farblosen Flüssigkeit zu ergeben. ¹H NMR (CDCl₃) δ 1,3 (1H, t), 1,6 (4H, m), 2,4 (4H, m), 11,5 (1H, s).
3-Mercaptobuttersäure (3e). Eine Lösung des kommerziell erhältlichen β-Butyrolactons (3,0 g, 35,0 mmol) in Tetrahydrofuran (20 mL) wurde zu Diisopropylethylamin (10,0 g, 77,5 mmol) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde unter einer Argonatmosphäre gerührt und mit Thioessigsäure (3,0 g, 39,0 mmol) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 6 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde anschließend verdampft und das Produkt durch Säulenchromatographie über Silica-Gel gereinigt, mit Ethyl:Hexanen (3:1, v/v) enthaltend 3% Essigsäure eluiert. Das Thioacetat Derivat von 3e wurde als ein farbloses Öl erhalten (2,0 g, 35% Ausbeute). ¹H NMR (CDCl₃): δ 1,5 (3H, d), 2,3 (3H, s), 2,8 (2H, d), 4,0 (1H, m) und 11,3 (1H, s). Das Thioacetat wurde in das Thiol 3e durch basische Hydrolyse umgewandelt. Eine Lösung des Thioacetats (1,5 g, 9,3 mmol) in Methanol (6 mL) wurde mit einer Lösung von 3,3 M Natriumhydroxid in Wasser (10 mL) behandelt. Die Reaktion wurde unter einer Argonatmosphäre gerührt. Der Verlauf der Reaktion wurde durch TLC überwacht, und wurde nach 3 h als abgeschlossen bewertet. Das Reaktionsgemisch wurde durch Hinzufügen von 1 M Salzsäure (40 mL) angesäuert und mit Ethylacetat (70 mL) extrahiert. Der organische Extrakt wurde über Natriumsulfat getrocknet, gefiltert und unter reduziertem Druck verdampft, um 3-Mercaptobuttersäure (3e) zu erhalten, die ohne weitere Reinigung für die Synthese von 4e verwendet wurde.
Methyldithioessigsäure (4a). Zu einer gerührten Lösung von Mercaptoessigsäure (3a) (3,0 g, 0,0326 mmol) in Wasser (100 mL), gekühlt in einem Eisbad, wurde Methylmethanthiosulfonat (4,52 g, 0,036 mol) in reinem Alkohol (40 mL) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch erwärmte sich auf Raumtemperatur und wurde über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit gesättigter wässriger NaCl (300 mL) verdünnt und mit Diethylether (3 × 100 mL) extrahiert. Die vereinigte organische Schicht wurde mit gesättigtem Natriumchlorid (100 mL) gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet und gefiltert. Das Filtrat wurde unter reduziertem Druck verdampft, und der Rückstand wurde unter Vakuum destilliert, um 4a als ein farbloses Öl zu erhalten (2,90 g, 64% Ausbeute) SP_1mm = 100°C. ¹H NMR: δ 2,4 (3H, s), 3,5 (3H, s) und 10,2 (1H, s).
3-Methyldithioproprionsäure (4b). Zu einer gerührten Lösung von Mercaptoproprionsäure (3b) (5,00 g, 0,047 mol) in Wasser (150 mL), gekühlt in einem Eisbad, wurde Methylmethanthiosulfonat (6,54 g, 0,052 mol) in reinem Alkohol (75 mL) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde anschließend mit gesättigter wässriger NaCl (400 mL) verdünnt und mit Ether (3 × 150 mL) extrahiert. Die vereinigten Ether Extrakte wurde mit gesättigter NaCl gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Der Rückstand wurde destilliert, um eine farblose Flüssigkeit zu erhalten (6,47 g, 90% Ausbeute): SP_1,0105°C. ¹H NMR (CDCl₃) δ 2,3 (3H, s), 2,8 (4H, m), 11,2 (1H, s).
4-Methyldithiobuttersäure (4c). Zu einer gerührten Lösung von bis-(3-Carboxypropyl)-disulfid (1,00 g, 4,20 mmol) in Methanol (20 mL) wurde eine Lösung von Dithiothreitol (0,647 g, 4,20 mmol) in Wasser (20 mL) hinzugefügt. Eine Lösung von 10 M NaOH (0,842 mL, 8,42 mmol) wurde anschließend hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt, um die Reduktion abzuschließen. Methylmethanthiosulfonat (1,17 g, 9,24 mmol) wurde hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde für weitere drei Stunden gerührt. Das Gemisch wurde anschließend mit gesättigter wässriger NaCl (150 mL) verdünnt, angesäuert (wässrige HCl) und mit Ethylether (3 × 100 mL) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit gesättigter NaCl gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), konzentriert, und das Konzentrat wurde auf Silica-Gel chromatographiert, mit Ethylenchlorid/Ethylacetat eluiert, um 0,867 g (56%) einer klaren Flüssigkeit zu erhalten. ¹H NMR (CDCl₃) δ 2,1 (2H, m), 2,4 (3H, s), 2,4 (2H, m), 2,7 (2H, m), 11,1 (1H, s).
5-Methyldithiopentansäure (4d). Zu einer gerührten Lösung von 5-Mercaptopentansäure (3d) (0,500 g, 3,73 mmol) in Wasser (20 mL) wurde eine Lösung von Methylmethanthiosulfonat (0,517 g, 4,10 mmol) in reinem Alkohol (5 mL) hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde anschließend mit wässriger gesättigter NaCl (100 mL) verdünnt und mit Ethylether (3 × 100 mL) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit gesättigter NaCl gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), unter reduziertem Druck verdampft, und das Konzentrat wurde über Silica chromatographiert, mit Methylenchlorid/Ethylacetat eluiert, um 0,602 g (90%) weißer Kristalle zu erhalten. SP 42–44°C. ¹H NMR (CDCl₃) δ 1,7 (4H, m), 2,4 (3H, s), 2,4 (2H, m), 2,7 (2H, m), 11,1 (1H, s).
3-Methyldithiobuttersäure (4e). Eine Lösung aus 3e (1,1 g, 9,3 mmol) in Ethylacetat (10 mL) wurde nacheinander mit Diisopropylethylamin (3,4 g, 27 mmol) und einer Lösung von Methylmethanthiosulfonat (1,5 g, 12,0 mmol) in reinem Alkohol (8 mL) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur unter Argon für 3 h gerührt. Das Lösungsmittel wurde anschließend verdampft, und der Rückstand wurde mit 3 M Salzsäure (15 mL) behandelt und mit Ethylacetat (40 mL) extrahiert. Die organische Schicht wurde getrennt, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und verdampft. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie über Silica-Gel gereinigt, mit Ethylacetat:Hexanen (3:1, v/v) enthaltend 3% Essigsäure, eluiert. Das Produkt 4e wurde als ein farbloses Öl erhalten (0,61 g, 40% (Ausbeute). ¹H NMR (CDCl₃) δ 1,4 (3H, d), 2,3 (3H, s), 2,8 (2H, d), 3,9 (1H, m) und 11,5 (1H, s).
3-Phenyldithioproprionsäure (5a). Zu einer gerührten Lösung von Diphenyldisulfid (3,0 g, 13,8 mmol) in einem Gemisch von Ether (10 mL) und Methanol (20 mL) unter einer Stickstoffatmosphäre bei Raumtemperatur, wurde eine Lösung von 3-Mercaptoproprionsäure (3b) (0,49 g, 4,6 mmol) in Ether (5 mL), gefolgt von einer Lösung von 10 M NaOH (0,46 mL, 4,6 mmol) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 20 Stunden gerührt, anschließend von den Lösungsmitteln unter reduziertem Druck getrennt. Das Produkt wurde durch Säulenchromatographie auf Silica-Gel gereinigt, mit Ethylacetat/Hexan eluiert. Das Produkt als ein weißer Feststoff (0,56 g, 56,6%), SP 57–59°C, erhalten. ¹H NMR (CDCl₃, TMS) δ 2,6–3,0 (4H, m), 7,1–7,6 (5H, m), 10,6 (1H, s).
3-(4-Nitrophenyldithio)-proprionsäure (5b). Zu einer gerührten Lösung von bis-(4-Nitrophenyl)-disulfid (3,00 g, 9,73 mmol), gelöst in einem Gemisch von THF (200 mL) und Methanol (50 mL) wurde 3-Mercaptoproprionsäure (3b) (0,688 g, 6,49 mmol) hinzugefügt. Ein Tropfen einer Lösung von 10 N NaOH wurde anschließend zu dem Gemisch hinzugefügt, und die Reaktion wurde für eine Stunde gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit gesättigter NaCl (100 mL) verdünnt und mit Ethylacetat (3 × 75 mL) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über Natriumsulfat getrocknet, unter reduziertem Druck verdampft, und das Produkt wurde über Silica-Gel chromatographiert, mit Ethylchlorid/Ethylacetat eluiert, um 0,885 g (53%) eines leicht gelben Feststoffs zu erhalten; SP 98–100°C. ¹H NMR (CDCOCD₃) δ 2,8 (2H, m), 3,1 (2H, m), 7,8 (2H, d), 8,2 (2H, d).
N-Methyl-N-methyldithioacetoyl-L-alanin (6a). Zu einer gerührten Lösung von 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (2,99 g, 15,6 mmol) und Triethylamin (1,58 g, 15,6 mmol) in trockenem CH₂Cl₂ (40 mL) bei 0°C wurde eine Lösung von Methyldithioessigsäure (Singh et al., 104 Anal. Biochem. 51–58 (1980) (4a) (1,66 g, 12,0 mmol) in trockenem CH₂Cl₂ (20 mL) hinzugefügt. Eine Lösung von 4-Dimethylaminopyridin (0,073 g, 0,60 mmol) in trockenem CH₂Cl₂ (2 mL) wurde hinzugefügt, und das Gemisch wurde für 45 min. bei 0°C gerührt. Ein Gemisch von N-Methyl-L-alanin (0,619 g, 6,00 mmol) und Triethylamin (0,607 g, 6,00 mmol) in trockenem DMF (30 mL) wurde anschließend hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei 0°C für zwei Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser (100 mL) verdünnt, für weitere dreißig Minuten gerührt, anschließend angesäuert (wässrige HCl) und mit Ethylacetat (4 × 75 mL) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden einige Male mit Wasser gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und unter reduziertem Druck verdampft. Der Rückstand wurde über Silica-Gel chromatographiert, mit Methylenchlorid/Ethylacetat eluiert, um 0,25 g (19%) eines blassgelben Öls zu erhalten. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 1,4 (3H, d), 2,4 (3H, s), 2,9, 3,0 (gesamt 3H, 2s), 3,6 (2H, s), 4,7, 5,2 (gesamt 1H, 2q), 9,8 (1H, s).
N-Methyl-N-(3-methyldithio-propanoyl)-L-alanin (6b). Zu einer gerührten Lösung von 3-Methyldithioproprionsäure (4b) (1,00 g, 6,57 mmol) in trockenem THF (20 mL) bei –10°C unter Argon wurde Isobutylchlorformat (0,897 g, 6,57 mmol) und Triethylamin (0,665 g, 6,57 mmol) hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde für 15 Minuten gerührt. Ein Gemisch von N-Methyl-L-alanin (0,677 g, 6,57 mmol) und Triethylamin (1,33 g, 13,14 mmol) in Wasser (10 mL) wurde hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde anschließend mit Wasser (50 mL) verdünnt, angesäuert (wässrige HCl) und mit Ethylacetat (4 × 50 mL) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über Natriumsulfat getrocknet, das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck verdampft und der Rückstand über Silica-Gel chromatographiert, mit Methylenchlorid/Ethylacetat eluiert, um 0,556 g (34%) weiße Kristalle zu erhalten: SP 98–100°C. ¹H NMR (CDCl₃) δ 1,3 (3H, d), 2,2 (3H, s), 2,7 (4H, m), 4,5 (1H, q), 10,7 (1H, s). Anal. berechnet für C₈H₁₅NO₃S₂: C, 40,49; H, 6,37; N, 5,90; mol Gew. 237,33. Gefunden: C, 40,42; H, 6,41; N, 5,93.
N-Methyl-N-(4-methyldithio-butanoyl)-L-alanin (6c). Zu einer gerührten Lösung von 4-Methyldithiobuttersäure (4c) (0,200 g, 1,20 mmol) in trockenem THF (10 mL) bei –20°C unter Argon wurde Isobutylchlorformat (0,164 g, 1,20 mmol) und Triethylamin (0,121 g, 1,20 mmol) hinzugefügt, und das Gemisch wurde für 20 Minuten gerührt. Ein Gemisch von N-Methyl-L-alanin (0,124 g, 1,20 mmol) und Triethylamin (0,243 g, 2,40 mmol) in Wasser (5 mL) wurde anschließend hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für fünf Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend wie oben für 6b beschrieben, behandelt, was die Titelverbindung als weiße Kristalle ergab (0,135 g, 44%): SP 92–93°C. ¹H NMR (CDCl₃) δ 1,4 (3H, d), 2,0 (2H, m), 2,3 (3H, s), 2,7 (4H, m), 2,9 (3H, s), 5,1 (1H, q), 10,5 (1H, s).
N-Methyl-N-(5-methyldithio-pentanoyl)-L-alanin (6d). Zu einer gerührten Lösung von 5-Methyldithiopentansäure (4d) (0,202 g, 1,12 mmol) in trockenem THF (15 mL) bei –40°C unter Argon wurde Isobutylchlorformat (0,153 g, 1,12 mmol) und Triethylamin (0,113 g, 1,12 mmol) hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde für 20 Minuten bei –10°C gerührt. Eine Lösung von N-Methyl-L-alanin (0,116 g, 1,12 mmol) und Triethylamin (0,227 g, 2,24 mmol) in Wasser (5 mL) wurde anschließend hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei 0°C für fünf Stunden gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde, wie oben für 6b beschrieben, behandelt, was die Titelverbindung als weiße Kristalle lieferte (0,196 g, 66%): SP 84°C. ¹H NMR (CDCl₃) δ 1,4 (3H, d), 1,8 (4H, m), 2,4 (3H, s), 2,7 (4H, m), 3,0 (3H, s), 5,2 (1H, q), 10,7 (1H, s).
N-Methyl-N-(3-phenyldithio-propanoyl)-L-alanin (6e). Eine Lösung von 3-Phenyldithiopropansäure (5a) (1,8 g, 8,4 mmol) in trockenem THF wurde kräftig unter einer Stickstoffatmosphäre gerührt und auf –15°C abgekühlt. Isobutylchlorformat (1,2 mL, 9,25 mmol) und Triethylamin (1,29 mL, 9,25 mmol) wurden hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde bei dieser Temperatur für zehn Minuten gerührt. Eine Lösung von N-Methyl-L-alanin (0,87 g, 8,4 mmol) und Triethylamin (1,29 mL, 9,25 mmol) in Wasser (10 mL) wurde anschließend hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde für 15 Minuten bei –15°C gerührt und anschließend auf Raumtemperatur erwärmt und für einen weiteren Zeitraum 2,5 Stunden gerührt. 1 M HCl (10 mL) wurde hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde mit Ethylacetat (4 × 50 mL) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Na₂SO₄ getrocknet, gefiltert und unter reduziertem Druck verdampft. Das Rohgemisch wurde durch Säulenchromatographie auf Silica-Gel gereinigt, mit Ethylacetat/Hexan enthaltender 2% Essigsäure eluiert, um 6e als weißen Feststoff zu ergeben (1,5 g, 60%): SP 96–97°C. ¹H NMR (CDCl₃/TMS) δ 1,4 (2H, d), 2,7–3,0 (7H, m), 5,2 (1H, q), 7,2–7,6 (5H, m).
N-Methyl-N-[3-(4-nitrophenyldithio)-propanoyl]-L-alanin (6f). Zu einer gerührten Lösung von 3-(4-Nitrophenyldithio)-proprionsäure (5b) (0,100 g, 0,386 mmol) in trockenem THF (10 mL) bei –40°C unter Argon wurde Isobutylchlorformat (0,053 g, 0,386 mmol) und Triethylamin (0,039 g, 0,38 mmol) hinzugefügt, und die Reaktion wurde bei 0°C für eine Stunde gerührt. Eine wässrige Lösung (5 mL) von N-Methyl-L-alanin (0,040 g, 0,386 mmol) und Triethylamin (0,039 g, 0,0386 mmol) wurde anschließend hinzugefügt, und das Gemisch bei 0°C für fünf Stunden gerührt. Die Gemisch wurde mit Wasser (50 mL) verdünnt, angesäuert (wässrige HCl) und mit Ethylether (3 × 25 mL) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden getrocknet (Na₂SO₄) und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck verdampft. Der Rückstand wurde über Silica-Gel chromatographiert, mit Methylenchlorid/Ethylacetat eluiert, um 0,048 g (36%) gelbe Kristalle zu erhalten: SP 74–77°C. ¹H NMR (CDCl₃) δ 1,4 (3H, d), 2,6–3,4 (4H, m), 2,9 (3H, s), 6,1 (1H, q), 7,6–8,3 (4H, 2d).
N-Methyl-N-(3-methyldithio-butanoyl)-L-alanin (6g). Eine Lösung von 4e (3,52 g, 21,2 mmol) in Tetrahydrofuran (20 mL) wurde auf –20°C abgekühlt und unter einer Argonatmosphäre gerührt. Isobutylchlorformat (3,48 mL, 21,2 mmol) und Triethylamin (3,7 mL, 25,4 mmol) wurden anschließend hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei –20°C für 15 min. gerührt. Eine Lösung von N-Methyl-L-alanin (2,74 g, 26,6 mmol) in Wasser (5 mL) und Triethylamin (7,4 mL, 50,8 mmol) wurde hinzugefügt und die Reaktion auf Raumtemperatur erwärmt und für 2 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser (100 mL) verdünnt und auf einen pH-Wert von 2 durch Hinzufügen von 1 M HCl angesäuert. Das Produkt wurde mit Ethylacetat (5 × 50 mL) extrahiert. Die vereinigte organische Schicht wurde mit Natriumsulfat getrocknet, gefiltert und verdampft. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie über Silica-Gel gereinigt, mit Ethylacetat:Hexanen (1:1, v/v) eluiert, um reines 6g als einen weißen Feststoff zu ergeben (0,69 g, 12 Ausbeute). ¹H NMR (CDCl₃): δ 1,3 (3H, d), 1,5 (3H, d), 2,41 (3H, s), 2,8 (2H, m), 3,0 (3H, s), 3,5 (1H, m) und 5,3 (1H, m).
Methyldithio-N-methylcystein (8a). Eine Lösung von N-Methylcystein (7a) (Undheim, K., & Eidem, A., 23 Acta Chem. Scandinavica 3129–3133 (1970)) (1,5 g, 11,1 mmol) in H₂O (20 mL) wurde bei Raumtemperatur unter einer Argonatmosphäre gerührt und mit einer Lösung von Methylmethanthiolsulfonat (3,0 mL, 29,2 mmol) in Ethanol (10 mL) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde bei dieser Temperatur für zwei Stunden gerührt und anschließend mit H₂O (100 mL) verdünnt und mit Ether (4 × 40 mL) gewaschen. Die wässrige Schicht wurde auf pH 2 angesäuert und durch eine Amberlite IRA 93 (-OH Form) Säule geleitet. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen, und der Durchfluss wurde gesammelt und bis zur Trockenheit unter reduziertem Druck verdampft, um einen weißen Feststoff zu ergeben (1,2 g, 60%), SP 194–195°C. ¹H NMR (D₂O, TMS Ext. Standard): δ 2,2 (3H, s), 2,5 (3H, s), 3,2 (2H, d), 3,7 (1H, q).
Methyldithio-N-methyl-homocystein (8b). Der Fachmann weiß wie er Methyldithio-N-methyl-homocystein (8b) aufgrund des Verfahrens zur Herstellung von Methyldithio-N-methylcystein (8a) herstellt.
N-Methyl-homocystein (7b) kann durch das zuvor beschriebene Verfahren für N-Methylcystein hergestellt werden (Undheim, K. & Eidem, A., 23 Acta Chem. Scandinavia 3129–3133 (1970)).
N-Acetyl-N-methyl-methyldithiocystein (9a). Zu einer Lösung von Eisessigsäure (0,25 mL, 4,4 mmol) in trockenem THF (4 mL), bei –20°C unter einer N₂ Atmosphäre wurden unter Rühren Isobutylchlorformat (0,57 mL, 4,4 mmol) und Triethylamin (0,61 mL, 4,4 mmol) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei dieser Temperatur für 20 Minuten gerührt und anschließend mit einer Lösung von Methyldithio-N-methylcystein (8a) (0,4 g, 2,2 mmol) und Triethylamin (0,45 mL, 3,3 mmol) in H₂O behandelt und anschließend über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde anschließend mit Wasser (25 mL) verdünnt und auf pH 2 mit HCl angesäuert und mit Ethylacetat (4 × 50 mL) extrahiert. Die vereinigte organische Schicht wurde mit Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck verdampft, um das Produkt als einen blassgelben Feststoff zu ergeben (0,2 g, 55%) SP 137–138°C. ¹H NMR (CDCl₃): δ 2,1 (3H, s), 2,3 (3H, s), 3,0 (3H, s), 3,2 (2H, d) und 4,8 (1H, q).
N-Acetyl-N-methyl-methyldithio-homocystein (9b). Der Fachmann wird wissen, wie er N-Acetyl-N-methyl-methyldithio-homocystein (8b) aufgrund des Verfahrens zur Herstellung von N-Acetyl-N-methyl-methyldithiocystein (9a) herstellt.
Schritt 1: Reduktion von Ansamitocin P-3 (1c) zu Maytansinol
Ansamitocin P-3 (1c) wurde in Maytansinol (2) durch reduktive Hydrolyse umgewandelt. Ansamitocin P-3 (1c) (3,2 g, 5,0 mmol) wurde in wasserfreiem THF (80 mL) gelöst, und die Lösung wurde unter eine Argonatmosphäre gegeben und in einem Eisacetonbad auf –40°C abgekühlt.
Zu einer separaten Flasche wurde eine Lösung von Lithiumaluminiumhydrid (75 mmol, 75 mL einer 1,0 M Lösung in THF) hinzugefügt. Die Lösung wurde unter eine Argonatmosphäre gegeben und auf –40°C abgekühlt. Eine Lösung von wasserfreiem Methanol (9,1 mL, 225 mmol) in THF (40 mL) wurde tropfenweise unter Verwendung eines Tropftrichters hinzugefügt. Die Temperatur wurde zwischen –30 und –40°C gehalten und, nachdem das Hinzufügen abgeschlossen war, wurde das Reaktionsgemisch für einen weiteren Zeitraum von 10 min. gerührt. Die resultierende Lösung von Lithiumtrimethoxyaluminiumhydrid (LiAlH(OMe)₃H) wurde über eine Kanüle über 10 min. in die gekühlte Lösung von Ansamitocin P-3 (1c) übertragen. Die Reaktionstemperatur wurde zwischen –30 und –35°C unter Argon aufrechterhalten und für 1 h gerührt.
Die Reaktion wurde durch das Hinzufügen von gesättigter Natriumchloridlösung (100 mL) gequenscht und mit Ethylacetat (4 × 400 mL) extrahiert. Die vereinigten Ethylacetate wurden über Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck verdampft, um Roh Maytansinol (2) zu ergeben.
Das Rohprodukt wurde in Ethylacetat gelöst und auf eine Silica-Gel Säule, die in Dichlormethan gepackt war, geladen. Die Säule wurde mit einem Stufengradienten, beginnend mit einer Gemisch von Dichlormethan:Ethylacetat:Methanol (77:23:0, v/v/v) und langsam ansteigender Konzentration von Methanol von 0% auf 10% eluiert. Die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthielten, wurden vereinigt und unter reduziertem Druck verdampft, um reines Maytansinol (71 Ausbeute) als einen weißen Feststoff zu ergeben.
Das Maytansinol wurde weiter durch HPLC wie folgt gereinigt. Eine Kromasil^TM Cyano präparative HPLC-Säule (250 mL × 50 mm, 10 Mikron Teilchengröße) wur de in einem Gemisch von Hexanen:2-Propanol:Dichlormethan:Ethylacetat (72:3:18:7, v/v/v/v) bei einer Durchflussmenge von 150 mL/min. äquilibriert. Eine Lösung des Maytansinols wurde auf die Säule gespritzt. Unter diesen Bedingungen besaß das Maytansinol eine Rückhaltezeit von 22 min. und eine Reinheit von > 98%.
Schritt 2: Veresterung von Maytansinol (2) mit N-Methyl-N-methyldithioacetoyl-L-alanin (6a)
Eine Lösung von N-Methyl-N-methyldithioacetoyl-L-alanin (6a) (4,2 mg, 0,017 mmol) in Dichlormethan (0,1 mL) wurde unter einer Argonatmosphäre gerührt und nacheinander mit einer Lösung von Maytansinol (2 mg, 0035 mmol) in Dichlormethan (0,2 mL), DCC (4,4 mg) in Dichlormethan (0,2 mL) und 1 M Zinkchlorid (0,0035 mmol) in Ether behandelt. Die Reaktion wurde für 75 min. gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend gefiltert, und das Lösungsmittel wurde verdampft. Der Rückstand wurde über präparative TLC auf Silica-Gel unter Verwendung von 6% Methanol in Chloroform gereinigt, um den gewünschten L-Maytansinoid Ester 10a zu ergeben.
Die Verbindung 10a kann wirksamer unter Verwendung einer Diazem^TM Cyano HPLC-Säule (250 mm × 10 mm, 10 Mikro Teilchengröße), die in einem Gemisch aus Hexanen:2-Propanol:Ethylacetat (17:2:6, v/v/v) bei einer Durchflussmenge von 4,7 mL/min. äquilibriert wurde, gereinigt werden. ¹H NMR (CDCl₃) L-Aminoacylisomer (10a): δ 0,90 (3H, s), 1,3 (6H, d,d), 1,46–1,52 (1H, m), 1,60 (3H, s), 2,30 (1H, d), 2,50 (3H, s), 2,7 (1H, dd), 2,90 (1H, m), 3,15 (3H, s), 3,28 (3H, s), 3,3 (1H, d), 3,35 (3H, s), 3,50 (1H, m), 3,65 (2H, d), 3,77 (1H, d), 4,02 (3H, s), 4,03 (1H, t); 4,82 (1H, dd), 5,15 (1H, q, J = 7 Hz), 5,90 (1H, dd), 6,25 (1H, s), 6,47 (1H, dd), 6,60 (1H, d), 6,75 (1H, d), 6,85 (1H, d).
Veresterung von Maytansinol (2) mit N-Methyl-N-(3-methyldithio-propanoyl)-L-alanin (6b)
Eine Lösung von N-Methyl-N-(3-methyldithio-propanoyl)-L-alanin (6b) (5,0 g, 21,5 mmol) in trockenem Methylenchlorid (80 mL) wurde unter einer Argonatmosphäre gerührt und nacheinander mit Lösungen von DCC (4,58 g, 22,2 mmol) in Methylenchlorid (54 mL), 1 M ZnCl₂ in Ether (4,4 mmol) und Maytansinol (2) (2,0 g, 3,5 mmol) in Methylenchlorid (80 mL) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für vier Stunden gerührt und anschließend filtriert.
Eine Diazem^TM Cyano präparative HPLC-Säule (250 mm × 50 mm, 10 Mikron Teilchengröße) wurde in einem Gemisch von Hexanen:2-Propanol:Ethylacetat (17:2:6, v/v/v) bei einer Durchflussmenge von 150 mL/min. äquilibriert. Eine Lösung des Gemisches der L- und D-Aminoacylester 10 von Maytansinol (1 g in 25 mL Ethylacetat) wurde auf die Säule gespritzt. Unter diesen Bedingungen besaß das gewünschte L-Isomer (10b) eine Rückhaltezeit von 42 min., während das D-Isomer nach 56 min. eluierte. Durch dieses Verfahren wurde optisch reines Produkt erhalten, und der Gewinn beträgt > 90%.
¹H NMR (CDCl₃) L-Aminoacylisomer (10b): δ 0,84 (3H, s), 1,11–1,23 (1H, m), 1,31 (3H, d, J = 6 Hz), 1,35 (3H, d, J = 7 Hz), 1,46–1,52 (1H, m), 1,68 (3H, s), 1,97 (1H, d, J = 9 Hz), 2,24 (1H, dd, J = 12 Hz und 15 Hz), 2,30 (3H, s), 2,65 (1H, dd, J = 12 Hz und 15 Hz), 2,73–2,86 (2H, m), 2,90 (3H, s), 2,92–3,03 (2H, m), 3,08 (1H, d, J = 9 Hz), 3,14 (1H, d, J = 12 Hz), 3,28 (3H, s), 3,39 (3H, s), 3,54 (1H, d, J = 9 Hz), 3,72 (1H, d, J = 13 Hz), 4,02 (3H, s), 4,31 (1H, t, J = 11 Hz), 4,82 (1H, dd, J = 3 Hz und 12 Hz), 5,45 (1H, q, J = 7 Hz), 5,69 (1H, dd, J = 9 Hz und 15 Hz), 6,25 (1H, s), 6,47 (1H, dd, J = 11 Hz und 15 Hz), 6,67 (1H, d, J = 1,5 Hz), 6,77 (1H, d, J = 11 Hz), 6,85 (1H, d, J = 1,5 Hz).
Veresterung von Maytansinol (2) mit N-Methyl-N-(methyldithio-butanoyl)-L-alanin (6c)
Eine Lösung von N-Methyl-N-(methyldithio-butanoyl)-L-alanin (6c) (8,9 g, 35,5 μmol) in trockenem Methylenchlorid (0,15 mL) wurde unter einer Argonatmosphä re gerührt und nacheinander mit Lösungen von DCC (8,8 mg, 42,6 μmol) in Methylenchlorid, 1 M ZnCl₂ (7,1 μmol) in Ether und Maytansinol (2) (4,0 mg, 7,1 μmol) in Methylenchlorid behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für drei Stunden gerührt, anschließend gefiltert, und das Filtrat wurde unter reduziertem Druck verdampft, was zu einem Gemisch von L- und D-Aminoacylestern von Maytansinol führte. Dieses Material kann weiter unter Verwendung einer Diazem^TM Cyano präparativen HPLC-Säule (250 mm × 50 mm, 10 Mikron Teilchengröße), die in einem Gemisch von Hexanen:2-Propanol:Ethylacetat (17:2:6, v/v/v) bei einer Durchflussmenge von 150 mL/min., wie oben für 10b beschrieben, äquilibriert wurde, gereinigt werden.
Veresterung von Maytansinol (2) mit N-Methyl-N-(ghenyldithio-propanoyl)-L-alanin (6e)
Eine Lösung von N-Methyl-N-(phenyldithio-propanoyl)-L-alanin (6e) (31,5 mg, 105 μmol) in Methylenchlorid (0,4 mL) wurde unter Argon gerührt und nacheinander mit Lösungen von DCC (26 mg, 126 μmol) in Methylenchlorid, 1 M ZnCl₂ (17,7 μmol) in Ether und Maytansinol (2) (10 mg, 17,7 μmol) in Methylenchlorid (0,2 mL) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für drei Stunden gerührt. Das Präzipitat wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat unter reduziertem Druck konzentriert.
Das Gemisch kann weiter unter Verwendung einer Diazem^TM Cyano präparativen HPLC-Säule (250 mm × 50 mm, 10 Mikron Teilchengröße), die in einem Gemisch von Hexanen:2-Propanol:Ethylacetat (17:2:6, v/v/v) bei einer Durchflussmenge von 150 mL/min., wie oben für (10b) beschrieben, äquilibriert wurde, gereinigt werden.
¹H NMR (CDCl₃) L-Aminoacylisomer (10e): δ 0,82 (3H, s), 1,11–1,25 (1H, m), 1,33 (3H, d, J = 3 Hz), 1,61 (3H, s), 1,63 (3H, d, J = 14 Hz), 2,19 (1H, dd, J = 13 Hz und 15 Hz), 2,61 (1H, dd, J = 12 Hz und 15 Hz), 2,78 (3H, s), 2,68–3,03 (2H, m), 3,07 (1H, d, J = 9 Hz), 3,20 (3H, s), 3,38 (3H, s), 3,53 (1H, d, J = 9 Hz), 3,63 (1H, d, J = 13 Hz), 3,68 (3H, s), 4,01 (3H, s), 4,30 (1H, t, J = 11 Hz), 4,79 (1H, dd, J = 3 Hz und 8 Hz), 5,43 (1H, q, J = 7 Hz), 5,68 (1H, dd, J = 9 Hz und 15 Hz), 6,23 (1H, s), 6,45 (1H, dd, J = 12 Hz und 15 Hz), 6,60 (1H, d, J = 1,5 Hz), 6,75 (1H, d, J = 12 Hz), 6,77 (1H, d, J = 1,5 Hz), 7,22–7,40 (5H, m).
Veresterung von Maytansinol (2) mit N-Methyl-N-(3-methyldithio-butanoyl)-L-alanin (6g)
Eine Lösung von N-Methyl-N-(3-methyldithio-butanoyl)-L-alanin (6g) (23,2 mg, 0,088 mmol) in Dichlormethan (0,2 mL) wurde unter einer Argonatmosphäre gerührt und nacheinander mit einer Lösung von Maytansinol (5 mg, 0,0088 mmol) in Dichlormethan (0,2 mL), DCC (20,6 mg) in Dichlormethan (0,2 mL) und 1 M Zinkchlorid (0,0088 mmol) in Ether behandelt. Die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend gefiltert, und das Lösungsmittel wurde verdampft. Der Rückstand wurde durch präparative TLC auf Silica-Gel, unter Verwendung von 6% Methanol in Chloroform gereinigt, um den gewünschten L-Maytansinoid Ester 10g zu ergeben. Das Produkt 10g kann wirksamer unter Verwendung einer Diazem^TM Cyano präparativen HPLC-Säule (250 mm × 10 mm, 10 Mikron Teilchengröße), die in einem Gemisch von Hexanen:2-Propanol:Ethylacetat (17:2:6, v/v/v) bei einer Durchflussmenge von 4,70 mL/min., wie oben für (10b) beschrieben, äquilibriert wurde, gereinigt werden.
Veresterung von Maytansinol (2) mit N-Acetyl-N-methyl-methyldithiocystein (9a)
Eine Lösung von N-Acetyl-N-methyl-methyldithiocystein (9a) (15,6 mg, 0,07 mmol) in trockenem Methylenchlorid (0,45 mL) wurde bei Raumtemperatur unter einer Argonatmosphäre gerührt und nacheinander mit Lösungen von 1 M ZnCl₂ in Ethylether (0,028 mmol), DCC (17,3 mg, 0,084 mmol) in Methylenchlorid (0,2 mL) und Maytansinol (2) (4,0 mg, 0,007 mmol) in Methylenchlorid (0,1 mL) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde für drei Stunden gerührt und anschließend filtriert und das Filtrat unter reduziertem Druck verdampft.
Der Rückstand kann weiter unter Verwendung einer Diazem^TM Cyano präparativen HPLC-Säule (250 mm × 50 mm, 10 Mikron Teilchengröße), die in einem Gemisch von Hexanen:2-Propanol:Ethylacetat (17:2:6, v/v/v) bei einer Durchflussmenge von 150 ml/min., wie oben für (10b) beschrieben, äquilibriert wurde, gereinigt werden.
Schritt 3: Reduktion von Disulfid enthaltendem Maytansinoid
Eine Lösung des Disulfid enthaltenden L-Aminoacylesters von Maytansinol 10b (1,95 g, 2,5 mmol) in einem Gemisch von Ethylacetat (140 mL) und Methanol (210 mL) wurde bei Raumtemperatur unter einer Argonatmosphäre gerührt und mit einer Lösung von Dithiothreitol (0,95 g, 6,2 mmol) in 0,05 M Kaliumphosphat Puffer (140 mL), pH 7,5, enthaltend 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) behandelt. Der Verlauf der Reaktion wurde durch HPLC beobachtet, und sie war in drei Stunden abgeschlossen.
Das abgeschlossene Reaktionsgemisch wurde mit einer Lösung von 0,2 M Kaliumphosphat Puffer (250 mL), pH 6,0, enthaltend 2 mM EDTA behandelt und anschließend mit Ethylacetat (3 × 600 mL) extrahiert. Die organischen Schichten wurden vereinigt, mit Salzlösung (100 mL) gewaschen und anschließend über Natriumsulfat getrocknet. Das Verdampfen des Lösungsmittels ergab einen Rückstand von rohem Thiol-enthaltenden Maytansinoid 11b.
Das rohe Thiol-enthaltende Maytansinoid 11b wurde durch HPLC unter Verwendung einer präparativen Diazem^TM Cyano HPLC-Säule (250 mm × 50 mm, 10 Mikron Teilchengröße), die in einem Gemisch von Hexanen:2-Propanol:Ethylacetat (78,0:5,5:16,5, v/v/v) äquilibriert und bei einer Durchflussmenge von 150 mL/min. betrieben wurde, gereinigt. Thiol-enthaltendes Maytansinoid 11b eluierte als Spitze in der Mitte bei 16 min. Die Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden verdampft, um reines Thiol-enthaltendes Maytansinoid 11b als einen weißen Feststoff zu ergeben (76% Ausbeute mit einer Reinheit von 99%).
Die Anwesenheit von einem Mol Sulfhydryl Gruppe/mol Produkt wurde unter Verwendung des Ellman Assay bestätigt. Das Produkt wurde weiter durch NMR Spektroskopie charakterisiert. ¹H NMR (CDCl₃): δ 0,84 (3H, s), 1,33 (3H, d, J = 5 Hz), 1,35 (3H, d, J = 5 Hz), 1,60 (3H, s), 1,68 (3H, s), 2,22 (1H, dd, J = 3 Hz und 14 Hz), 2,60–2,82 (2H, m), 2,88 (3H, s), 3,08–3,20 (2H, m), 3,25 (3H, s), 3,39 (3H, s), 3,55 (1H, d, J = 9 Hz), 3,71 (1H, d, J = 12 Hz), 4,02 (3H, s), 4,32 (1H, t, J = 10 Hz), 4,81 (1H, dd, J = 3 Hz und 12 Hz), 5,45 (1H, q, J = 7 Hz), 5,67 (1H, dd, J = 9 Hz und 15 Hz), 6,25 (1H, s), 6,47 (1H, dd, J = 11 Hz und 15 Hz), 6,70 (1H, d, J = 1,5 Hz), 6,75 (1H, d, J = 11 Hz), 6,86 (1H, d, J = 1,5 Hz).
Während die Erfindung im Detail und unter Bezugnahme auf die besonderen Ausführungsformen davon beschrieben wurde, ist es für den Fachmann offensichtlich, dass verschiedene Änderungen und Modifikationen daran gemacht werden können, ohne den Geist und den Schutzbereich davon zu verlassen.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Thiol-enthaltenden Maytansinoids, umfassend die Schritte: (1) Durchführung reduktiver Hydrolyse eines Maytansinoid C-3 Esters mit einem Reduktionsmittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lithiumtrimethoxyaluminiumhydrid (LiAl(OMe)₃H), Lithiumtriethoxyaluminiumhydrid (LiAl(OEt)₃H) und Lithiumtripropoxyaluminiumhydrid (LiAl(OPr)₃H), um ein Maytansinol zu erhalten; (2) Reinigung des Maytansinols, um Nebenprodukte zu entfernen, wenn vorhanden; (3) Veresterung des gereinigten Maytansinols mit einer Carbonsäure, um ein Reaktionsgemisch eines L- und eines D-Aminoacylesters des Maytansinols zu erhalten; (4) Trennung des L-Aminoacylesters des Maytansinols von dem Reaktionsgemisch; (5) Reduktion des L-Aminoacylesters des Maytansinols, um ein Thiol-enthaltendes Maytansinoid zu erhalten; und (6) Reinigung des Thiol-enthaltenden Maytansinoids.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reduktionsmittel in (1) Lithiumtrimethoxyaluminiumhydrid ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Reduktionsmittel in (1) in einer Konzentration von etwa 5 bis 100 Äquivalenten pro Mol des Maytansinoid C-3 Esters verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Reduktionsmittel in (1) in einer Konzentration von etwa 7,5 bis 30 Äquivalenten pro Mol des Maytansinoid C-3 Esters verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Reduktionsmittel in (1) in einer Konzentration von etwa 10 bis 20 Äquivalenten pro Mol des Maytansinoid C-3 Esters verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die reduktive Hydrolyse in (1) bei einer Temperatur von etwa –80°C bis 0°C durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die reduktive Hydrolyse in (1) bei einer Temperatur von etwa –45°C bis –27,5°C durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die reduktive Hydrolyse in (1) bei einer Temperatur von etwa –35°C bis –30°C durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Reduktionsmittel in (1) über einen Zeitraum von etwa 5 bis 40 Minuten hinzugefügt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Reduktionsmittel in (1) über einen Zeitraum von etwa 7 bis 20 Minuten hinzugefügt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Reduktionsmittel in (1) über einen Zeitraum von etwa 8 bis 12 Minuten hinzugefügt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Maytansinol in (2) durch Chromatographie gereinigt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Chromatographie Silica-Gel Säulenchromatographie, präparative Dünnschichtchromatographie auf Silica-Gel oder Cyano-gebundene Silica HPLC Säulenchromatographie ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Chromatographie Silica-Gel Säulenchromatographie ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Reinigung bei Umgebungstemperatur durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Maytansinol zu einer Reinheit von etwa 95% gereinigt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die Carbonsäure in (3) aus der Gruppe, bestehend aus N-Methyl-N-methyldithioacteyl-L-alanin, N-Methyl-N-(3-methyldithio-propanoyl)-L-alanin, N-Methyl-N-(3-methyldithio-butanoyl)-L-alanin, N-Methyl-N-(4-methyldithio-butanoyl)-L-alanin, N-Methyl-N-(5-methyldithio-pentanoyl)-L-alanin, N-Methyl-N-(3-phenyldithio-propanoyl)-L-alanin, N-Methyl-N-(3-(4-nitrophenyldithio)propanoyl)-L-alanin, N-Acetyl-N-methyl-methyldithiocystein und N-Acetyl-N-methyl-methyldithio-homocystein, ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die Carbonsäure in (3) N-Methyl-N-(3-methyldithio-propanoyl)-L-alanin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die Veresterung in (3) bei Umgebungstemperatur durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die Veresterung in (3) weiter die Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid und Zinkchlorid umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die Trennung in (4) durch Leiten des Reaktionsgemisches über eine Cyano-gebundene Silica HPLC-Säule durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei die Trennung in (4) bei etwa 25°C durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei die Reduktion in (5) Dithiothreitol als das Reduktionsmittel verwendet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei die Reduktion in (5) in einem Gemisch aus Ethylacetat-Methanol-wässrigem Puffer durchgeführt wird, das befähigt ist, Puffersalze, Dithiothreitol, unreduzierte Maytansinoide und reduzierte Maytansinoide in Lösung zu halten.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Gemisch aus Ethylacetat-Methanol-wässrigem Puffer 1:1,5:1 ist, v/v/v, Ethylacetat:Methanol:wässriger Puffer.
Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, wobei die Konzentration des Thiol-enthaltenden Maytansinoids eine solche ist, dass das Thiol-enthaltende Maytansinoid in Ethylacetat-Methanol-wässrigem Puffer löslich bleibt.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Konzentration des Thiol-enthaltenden Maytansinoids etwa 4 g/L ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 27, wobei die Reduktion in (5) in einer sauerstofffreien Atmosphäre durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 28, wobei die Reduktion in (5) bei etwa 25°C durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 29, wobei die Reinigung des Thiol-enthaltenden Maytansinoids in (6) mittels Chromatographie durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Reinigung des Thiol-enthaltenden Maytansinoids in (6) mittels einer Cyano-gebundenen HPLC Säulenchromatographie durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Chromatographie mittels einer Cyano-gebundenen HPLC-Säule durchgeführt wird, welche mit einem organischen Lösungsmittel äquilibriert und betrieben wird.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei das organische Lösungsmittel ein Gemisch aus Hexanen:2-Propanol:Ethylacetat ist.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei das organische Lösungsmittel ein Gemisch 78,0:5,5:16,5, v/v/v, von Hexanen:2-Propanol:Ethylacetat ist.
Verfahren zur Reinigung von Maytansinol aus einem Roh-Maytansinol durch chemisch modifizierte Silica HPLC Säulenchromatographie.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei das chemisch modifizierte Silica ein Cyano-gebundenes Silica ist.
Verfahren nach Anspruch 35 oder 36, welches eine Säule, die in Normal-Phase betrieben wird, verwendet.
Verfahren nach Anspruch 37, welches organische Lösungsmittel in der mobilen Phase verwendet.