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Die
vorliegende Verbindung betrifft Aminothiolester der Formel (I) sowie
ihre Verwendung als Stoffe, die die zelluläre Apoptose auslösen. Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
besitzen eine ausgeprägte
Aktivität
als Apoptoseinduktoren und können
ganz besonders für
die topische und systemische Behandlung von Karzinomen und präkanzerösen Zuständen und
dermatologischen, rheumatischen und ophthalmologischen Erkrankungen
verwendet werden.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf pharmazeutische oder
kosmetische Zusammensetzungen, die als Wirkstoff mindestens einen
Aminothiolester der Formel (I) in einem physiologisch akzeptablen Träger enthalten.
-
Unter
dem Ausdruck "Apoptose" wird das Phänomen des
Zelltods verstanden, wie es unter anderem von J.F.R. KERR et al.
in J. Cancer, 265, 239 (1972) beschrieben wurde. Die Apoptose ist
eine hochselektive Form des "Selbstmords" von Zellen, die
durch leicht erkennbare morphologische biochemische Phänomene gekennzeichnet
ist. Es wird eine Kondensation des Chromatin, die gegebenenfalls
mit einer Endonucleaseaktivität
einhergeht, die Bildung von apoptotischen Körperchen und eine Fragmentierung
der Desoxyribonucleinsäure
(DNA) in DNA-Fragmente von 180 bis 200 Basenpaaren durch Aktivierung
der Endonucleasen beobachtet, wobei diese Fragmente durch Elektrophorese
an Agarose-Gel einfach nachgewiesen werden können.
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Die
Apoptose ist an der Entwicklung, Differenzierung und Erneuerung
des Gewebes beteiligt. Die Induktion der Apoptose ist daher aus
therapeutischer Sicht und auch in kosmetischer Hinsicht sehr interessant.
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Eine
Vielzahl von natürlichen
oder synthetischen Antikrebsmitteln, die derzeit verfügbar sind,
sind Apoptoseinduktoren.
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Von
den antineoplastischen Arzneimitteln können die Alkylierungsmittel,
wie Cyclophosphamid, die Nitrosoharnstoffe, wie beispielsweise 1,3-Bis(2-chlorethyl)-1-nitrosoharnstoff
(BCNU), intercalierende Stoffe, wie Actinomycin D oder Adriamycin,
Analoga von Purinbasen oder Pyrimidinbasen, wie 6-Thioguanin und
5-Fluoruracil, Inhibitoren der De-novo-Synthese von Purinbasen,
wie Methotrexat, und schließlich
Inhibitoren der Polymerisation von Tubulin, wie Taxol®, angegeben
werden.
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Es
wurde im Übrigen
von der Anmelderin insbesondere in der Patentanmeldung WO 96/20701
bereits vorgeschlagen, einen Induktor der Apoptose zu verwenden,
der unter Methional, Malonaldehyd und allen Faktoren ausgewählt ist,
die den intrazellulären
Gehalt dieser Verbindungen erhöhen
können,
d. h., die auf den Stoffwechsel des Methional einwirken, der zur
Information in der 1 dargestellt
ist (QUASH et al., Biochem. J. 305, 1017 (1995)).
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Es
wurden in dieser Patentanmeldung Inhibitoren der 4-Methylthio-2-oxobutansäure (MTOB)-Transaminase
als Faktoren, die den intrazellulären Gehalt von Methional erhöhen, beschrieben,
die aus Estern von L-Methionin und Pyridoxal bestehen. Die MTOB-Transaminase
ist ein Enzym, das bei der Umwandlung von 4-Methylthio-2-oxobutansäure in Methionin
beteiligt ist, wobei die Verwendung dieser Verbindungen die Akkumulierung
von MTOB, dem direkten Precursor von Methional (1), fördert
(ROCH et al., Biochem. J. 313, 973 (1996)).
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Einer
der Hauptnachteile der Verwendung dieser Substanzen ist das Fehlen
einer für
tumorale Zellen selektiven apoptotischen Aktivität. Es ist daher weiterhin erforderlich,
Moleküle
anzugeben, die in tumoralem Gewebe eine maximale Apoptose induzieren,
das gesunde Gewebe des Organismus jedoch möglichst wenig und reversibel
schädigen.
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Die
Anmelderin hat in der Patentanmeldung WO 98/44919 die Verwendung
von Aminothiolestern, darunter Thioampal, als Inhibitoren des Enzyms
Aldehyddehydrogenase (ALDH) beschrieben, einem Enzym, das bei der
Umwandlung von Methional in Methylthiopropionsäure beteiligt ist, die somit
die Akkumulierung von Methional fördern, um dieser fehlenden
Selektivität
abzuhelfen. Diese Verbindungen sind selektive Inhibitoren des Wachstums
von transformierten Zellen, die wegen der Überexpression des Bcl-2-Gens
gegenüber
Apoptose resistent sind.
-
Diese
Verbindungen sind daher speziell zur Behandlung von Erkrankungen
vorgesehen, die durch einen Überexpression
des Bcl-2-Gens gekennzeichnet
sind, wie beispielsweise Brustkrebs, B-Zellen-Lymphome, Leukämie, Neuroblastome, Adenokarzinome
der Prostata, Prolactinome und andere pituitäre Adenome.
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Diese
Aminothiolesterderivate sind jedoch schwierig herzustellen. In ihren
Herstellungsverfahren übersteigen
die Ausbeuten 20 % nämlich
nicht. Außerdem
sind mit diesen Verbindungen Stabilitätsprob leme verbunden und sie
müssen
bei Temperaturen von etwa –20 °C aufbewahrt
werden, um ihre Zersetzung zu verhindern.
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Es
ist daher wünschenswert,
neue Verbindungen zu entwickeln, die stabil und in hohen Ausbeuten
einfach herstellbar sind und selektiv das Wachstum von transformierten
Zellen, die wegen der Überexpression des
Bcl-2-Gens gegenüber
Apoptose resistent sind, hemmen.
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Dies
stellt den Gegenstand der vorliegenden Erfindung dar, der neue Aminothiolester
betrifft, die durch die folgende allgemeine Formel (I) dargstellt
werden können:
worin bedeuten:
- – R1:
- – R2 und R3 unabhängig voneinander
eine gesättigte
oder ungesättigte,
cyclische, geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 7
Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen
oder eine Aralkylgruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen oder die
Gruppen R2 und R3 bilden
gemeinsam einen gesättigten
Alkyl-ring mit 3
bis 7 Kohlenstoffatomen,
- – R4 eine gesättigte oder ungesättigte,
cyclische, geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 7
Kohlenstoffatomen, eine A rylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen
oder eine Aralkylgruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen,
- – R5 und R6 unabhängig voneinander
eine gesättigte
oder ungesättigte,
cyclische, geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 7
Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen
oder eine Aralkylgruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen oder die
Gruppen R5 und R6 bilden
gemeinsam mit dem Stickstoffatom einen gesättigten oder ungesättigten
Stickstoffheterocyclus mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls mit
einem Sauerstoffatom, Schwefelatom oder Stickstoffatom substituiert
ist, das gegebenenfalls mit einer gesättigten oder ungesättigten,
cyclischen, geradkettigen oder verzweigten Alkylgruppe mit 1 bis
7 Kohlenstoffatomen, einer Arylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen
oder einer Aralkylgruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen substituiert
ist,
- – R7 ein Wasserstoffatom, eine gesättigte oder
ungesättigte,
cyclische, geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 7
Kohlenstoffatomen oder eine Arylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen
oder eine Aralkylgruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, und
- – X
ein Halogenidion oder Nitrat, Sulfat, Sulfonat, Carboxylat, Thiocyanat
oder Phosphat.
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Von
den cyclischen Alkylgruppen mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen können insbesondere
die Gruppen Cyclopropyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl oder Cycloheptyl
genannt werden.
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Von
den gesättigten
geradkettigen Alkylgruppen mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen sind insbesondere
die Gruppen Methyl, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl, n-Pentyl, n-Hexyl
oder n-Heptyl zu nennen.
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Von
den gesättigten
und verzweigten Alkylgruppen mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen kommen
insbesondere die Gruppen i-Propyl, t-Butyl, 2-Butyl, 2-Pentyl, i-Pentyl,
2-Hexyl, 3-Hexyl, 2-Heptyl, 3-Heptyl oder i-Heptyl in Betracht.
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Von
den ungesättigten
Alkylgruppen mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen können insbesondere die Gruppen Allyl
oder Vinyl angegeben werden.
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Unter
einer Aralkylgruppe mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen wird eine Phenylgruppe
verstanden, die gegebenenfalls mit geradkettigen oder verzweigten
Alkylgruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen substituiert ist und
an eine gesättigte
geradkettige Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen gebunden
ist, wie beispielsweise die Benzylgruppe, die gegebenenfalls mit
einer Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen substituiert ist, 1-Phenylethyl,
1-Phenylpropyl, 1-Phenylbutyl und 1-Phenylpentyl.
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Von
den Arylgruppen mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen können insbesondere die Gruppen
Phenyl, Tolyl, Chlorphenyl, Nitrophenyl, Methoxyphenyl, Thiophen
oder Furan angegeben werden.
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Von
den Stickstoffheterocyclen sind insbesondere Pyrrolidin, Piperidin,
Morpholin, Thiamorpholin, Piperazin, Homopiperazin oder N-Methylpiperazin zu
nennen.
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Von
den Halogeniden können
die Fluoride, Chloride und Bromide und insbesondere die Iodide angegeben
werden.
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Von
den Verbindungen der Formel (I), die vom Rahmen der vorliegenden
Erfindung umfasst werden, sind insbesondere die folgenden Verbindungen
zu nennen:
Nr. | Verbindungen |
1 – | S-Methyl-4-dimethylamino-4-methyl-pent-2-in-thioat |
2 – | S-Methyl-4-methyl-4-trimethylammonium-pent-2-in-thioat-iodid |
3 – | S-Methyl-4-di-n-propylamino-4-methyl-pent-2-in-thioat |
4 – | S-Methyl-4-methyl-4-pyrrodin-1-yl-pent-2-in-thioat |
5 – | S-Methyl-4-methyl-4-morpholin-4-yl-pent-2-in-thioat. |
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden die Verbindungen der Formel (I) besonders bevorzugt,
für die
mindestens eine der folgenden Bedingungen erfüllt ist:
- – R2 und R3 bedeuten eine Methylgruppe;
- – R4 bedeutet eine Methylgruppe;
- – R5 und R6 bedeuten
unabhängig
voneinander eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder
bilden gemeinsam mit dem Stickstoffatom einen Stickstoffheterocyclus,
der unter Pyrrolidin, Piperidin oder Morpholin ausgewählt ist;
- – R7 bedeutet eine Methylgruppe oder ein Wasserstoffatom;
und
- – X
ist ein Iodidion, ein Formiation oder ein Carboxylation.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Verfahren zur Herstellung
der Verbindungen der Formel (I).
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Die
Verbindungen der Formel (I) (R1 = N(R5R6)) gemäß der Erfindung
können
nach dem in der 2 dargestellten
Reaktionsschema hergestellt werden.
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Das
Syntheseverfahren besteht darin, Butyllithium mit einem Propargylamin
der Formel (III) in THF umzusetzen. Das als Zwischenprodukt gebildete
Lithium-Acetylen wird mit dem Kohlenoxidsulfid (COS) und dann mit
dem Iodid R4I umgesetzt. Auf diese Weise
wird der Thiolester der Formel (I) (R1 =
N(R5R6)) mit einer Ausbeute
von etwa 70 % erhalten.
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Es
kann auch in Betracht gezogen werden, das Lithium-Acetylen direkt
mit einem Dialkyl- oder Diaryl-dithiocarbonat der Formel (IV) umzusetzen,
wie dies in der 3 gezeigt
ist. Diese Verbindungen wurden ausführlich beschrieben, beispielsweise
für R4 = Methyl [I.B. DOUGLAS, G.H. WARNER, 78,
6070 – 6071, (1956)].
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Die
Herstellung von Propargylaminen der Formel (III) kann nach der Methode
von G.F. HENNION, A.P. BOISELLE, J. Am. Chem. Soc., 26, 725–727, (1961)
durchgeführt
werden. Wie dies in der 4 dargestellt ist,
besteht dieses Verfahren darin, einen tertiären Alkohol der Formel (V)
in einem Salzsäuremedium
in Gegenwart von Kupfer und Kupferchlorid mit einer Ausbeute von
etwa 70 % zu chlorieren.
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Der
Alkohol kann beispielsweise ausgehend von dem Keton der Formel R2COR3 und einem Acetylid hergestellt
werden.
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Das
Propargylchlorid der Formel (VI) wird dann gemäß [G.F. HENNIOBN, K.W. NELSON,
J. Am. Chem. Soc., 79, 2142–2144,
(1957) und G.F. HENNION, R.F. HANZEL, J. Am. Chem. Soc., 82, 4908-4912, (1960)] mit
dem Amin der Formel R5NHR6 umgesetzt.
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Die
erhaltenen Ausbeuten liegen im Allgemeinen im Bereich von 20 bis
60 %.
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Die
Verbindungen der Formel (I) (R1 = N+(R5R6R7), X) gemäß der Erfindung können nach
dem Reaktionsschema der 5 hergestellt
werden. Das Syntheseverfahren besteht darin, das Halogenid R7X (vorzugsweise das Iodid) oder die anorganische
oder organische Säure
(R7 = H) mit der Verbindung der Formel (I) (R1 = N(R5R6)) umzusetzen. Die Ausbeuten liegen in der
Gegend von 70 %.
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Die
Synthese der Verbindungen gemäß der Patentanmeldung
WO 98/44919 erfordert einen schwierigen Schritt, in dem die Schutzgruppe
von dem Propargylamin entfernt werden muss, der eine Herstellung
der Verbindungen in großem
Maßstab
verhindert, wohingegen die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen
den Vorteil hat, dass sie einfacher ist und im großen Maßstab mit
besseren Ausbeuten durchgeführt
werden kann.
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Diese
neuen Verbindungen haben außerdem
den Vorteil, dass sie stabiler und vor allem hinsichtlich der Inhibierung
des Wachstums von transformierten Zellen, die wegen der Überexpression
des Bcl-2-Gens gegenüber Apoptose
resistent sind, wesentlich aktiver als die Verbindungen sind, die
in der Patentanmeldung WO 98/44919 beschrieben sind, wie beispielsweise
Thioampal.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
weisen ferner den Vorteil auf, dass sie das Wachstum von transformierten
Zellen wirksam hemmen, die nicht nur wegen der Überexpression des Bcl-2-Gens
resistent sind, sondern auch wegen der Expression der Enzyme ALDH
(ALDH1, ALDH2 und/oder ALDH3), der Überexpression des Gens MDR «Multi Drug
Resistant» oder
des Gens Bcl-XL, wodurch ihr Anwendungsgebiet
größer wird.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft daher auch die Verwendung mindestens
eines Aminothiolesterderivats der Formel (I) zur Herstellung einer
pharmazeutischen Zusammensetzung, die dazu vorgesehen ist, die durch
einen Resistenzmechanismus verursachte Hemmung des Auslösens der
Apoptose von transformierten Zellen aufzuheben, wobei dieses Resistenzphänomen von
dem Bcl-2-Gen, dem MDR-Gen
oder dem Bcl-Xl-Gen in den Zellen oder der
ALDH-Aktivität
herrührt.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung mindestens
eines Aminothiolesterderivats der Formel (I) zur Herstellung einer
pharmazeutischen Zusammensetzung, die dazu vorgesehen ist, die durch einen
Resistenzmechanismus verursachte Inhibierung einer Chemotherapie,
einer Radiotherapie oder von Antiandrogenen von transformierten
Zellen aufzuheben.
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Die
Resistenz gegenüber
Chemotherapie oder Antiandrogenen von transformierten Zellen rührt insbesondere
von dem Bcl-2-Gen, dem Bcl-XL-Gen oder dem
MDR-Gen in den Zellen oder der Aktivität des Enzyms ALDH. Die Resistenz
gegenüber
Radiotherapie der transformierten Zellen wird insbesondere durch
die Gegenwart des Bcl-2-Gen
oder einem hohen Gehalt von Glutathion in den Zellen verursacht.
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Die
Aldehyddehydrogenasen (ALDH) katalysieren die Oxidation von verschiedenen
aliphatischen und aromatischen Aldehyden zu den entsprechenden Carbonsäuren in
Gegenwart der Cofaktoren NAD oder NADP. Die Enzyme der verschiedenen
Untergruppen und insbesondere ALDH1, ALDH2 oder ALDH3 sind in den
verschiedenen Organen vorhanden und spielen bei der Entgiftung von
Xenobiotika eine Rolle. Die Erhöhung
der Aktivität
dieser Enzyme führt
zu einer Resistenz gegenüber
Antikrebsmitteln, wie Cyclophosphamid [MAGNI et al., Blood, 87,
1097–1103,
(1996)].
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Wie
dies in der Patentanmeldung WO 98/44919 angegeben wurde, kann durch
die Verwendung eines Inhibitors der Aktivität des Enzyms ALDH1 die durch
einen Resistenzmechanismus vermittelte Inhibierung einer Chemotherapie
oder von Antiandrogenen, die durch ALDH1 ausgelöst wird, aufgehoben werden.
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In
einem Karzinom gibt es einige Krebszellen, die als Multi Drug Resistant
(MDR) bezeichnet werden und die gegenüber chemotherapeutischen Wirkstoffen
resistent sind. Von diesen wurden die Zellen R7, die das Gen MDR überexprimieren,
als resistent gegenüber
Daunorubicin [P. JEANNESSON et al., Cancer Res., 50, 1231–1236, (1990)]
beschrieben.
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Die
Zelllinie LY-ar, Lymphomzellen der Maus, wurde im Gegensatz zu den
Zellen LY-as, die gegenüber Radiotherapie
empfindlich sind, als strahlungsbeständig beschrieben [N. MIRKOVIC
et al., Oncogene, 15, 1461–1470,
(1997)]. Diese Resistenz rührt
von der Überexpression
des Bcl-2-Gens.
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Die
Verbindungen haben außerdem
den Vorteil, dass sie in den verschiedensten transformierten Zellen
die Apoptose induzieren, wodurch sie für die Herstellung von pharmazeutischen
Zusammensetzungen verwendet werden können, die für die Behandlung einer Vielzahl
von Krebserkrankungen, jedoch auch anderen Erkrankungen, insbesondere
Krankheiten, die mit einer Hyperproliferation der Zellen zusammenhängen, wie beispielsweise
Autoimmunkrankheiten oder Allergien, vorgesehen sind.
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Außer dass
sie selektiv die Apoptose von transformierten Zellen induzieren
besitzen diese Verbindungen außerdem
in bestimmten höheren
Konzentrationsbereichen die Eigenschaft, dass sie die Apoptose von normalen
Zellen induzieren, wie beispielsweise MRC5-Zellen. Hierdurch können sie
für die
Herstellung von kosmetischen Zusammensetzungen verwendet werden,
die insbesondere für
die Vorbeugung oder Behandlung der altersbedingten oder lichtinduzierten
Alterung vorgesehen sind.
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Der
Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft außerdem die
oben angegebenen Verbindungen der Formel (I) als Arzneimittel. Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
sind besonders gut für
die folgenden Behandlungsgebiete geeignet:
- 1)
Zur Behandlung oder Vorbeugung von krebsartigen Zuständen oder
Zuständen
der Präkanzerose,
- 2) zur Behandlung von dermatologischen Erkrankungen, die mit
einer Verhornungsstörung
einhergehen, welche auf der Differenzierung und Proliferation beruht,
insbesondere zur Behandlung von Acne vulgaris, Acne comedonica,
polymorpher Acne, Acne rosaceae, nodulocystischer Acne, Acne conglobata,
Acne senilis, sowie sekundären
Akneformen, wie Acne solaris, Acne medicamentosa oder Acne professionalis,
- 3) zur Behandlung von Ichtyose, ichtyosisartigen Zuständen, Palmoplantarkeratosen,
Leukoplakien oder leukoplakiformen Zuständen,
- 4) zur Behandlung von dermatologischen Erkrankungen mit einer
entzündlichen
immunoallergischen Komponente mit oder ohne Störungen der Zellproliferation
und insbesondere alle Formen von Psoriasis der Haut, der Schleimhäute oder
der Nägel,
oder zur Behandlung von Psoriasis arthropathica oder der Atopie der
Haut wie Ekzemen oder der Atopie der Atemwege oder auch Hypertrophie
des Zahnfleisches,
- 5) zur Behandlung von Proliferationen der Dermis oder Epidermis,
die gutartig oder bösartig
und gegebenenfalls viralen Ursprungs sein können, wie Verrucae vulgares,
Verrucae planae und Epidermodysplasia verruciformis, Papillomatosis
oralis oder florida, T-Zellen-Lymphomen, und Proliferationen, die
durch UV-Strahlung hervorgerufen werden können, insbesondere im Falle
von Epithelioma basocellulare und spinocellulare, sowie präkanzerösen Schädigungen
der Haut, wie Keratoakanthomen,
- 6) zur Behandlung von Immundermatosen, wie Lupus erythematodes,
bullösen
Immunkrankheiten und Erkrankungen des Kollagens, wie Sklerodermie,
- 7) zur Behandlung von dermatologischen oder allgemeinen Störungen mit
immunologischer Komponente,
- 8) zur Bekämpfung
von Funktionsstörungen
der Talgdrüse,
wie Akne-Hyperseborrhoe oder einfache Seborrhoe,
- 9) zur Behandlung von Hautstörungen,
die von einer Exposition gegenüber
UV-Strahlung hervorgerufen werden, sowie zur Behebung oder Bekämpfung von
Hautalterung, die lichtinduziert oder altersbedingt sein kann, oder
zur Verminderung von aktinischen Pigmentierungen oder aktinischen
Keratosen, oder beliebigen Pathologien, die mit der altersbedingten
oder aktinischen Alterung zusammenhängen,
- 10) zur Vorbeugung oder Behandlung von Störungen der Wundheilung oder
zur Vorbeugung oder Heilung von Streifen,
- 11) zur Behandlung von entzündlichen
Erkrankungen, wie Arthritis,
- 12) zur Behandlung beliebiger Hauterkrankungen viralen Ursprungs
oder allgemeinen Erkrankungen viralen Ursprungs, wie des Kaposi-Syndrom
oder von Hepatitis, und
- 13) zur Behandlung von verschiedenen ophthalmologischen Störungen,
insbesondere Corneopathien.
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Auf
den oben genannten therapeutischen Gebieten können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
vorteilhaft in Kombination mit 3-Methylthiopropanoylthioestern von
Thioctsäure,
Methional, zahlreichen antineoplastischen Stoffen, Retinoiden, Corticosteroiden
oder Östrogenen,
in Kombination mit Antioxidantien, α-Hydroxysäuren oder α-Ketosäuren oder deren Derivaten,
Kaliumkanalblockern, in Kombination mit anderen Arzneimitteln, die
dafür bekannt sind,
mit dem Immunsystem wechselzuwirken (beispielsweise Cyclosporin,
FK 506, Glucocorticoide, monoclonale Antikörper, Cytokine oder Wachstumsfaktoren),
in Kombination mit Derivaten von Vitamin D oder mit Analoga von
Vitamin D verwendet werden.
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Von
den antineoplastischen Stoffen können
insbesondere Dexamethason, Cyclophosphamid, Cisplatin, Etoposid
und BCNU (N,N-Bis(2-chlorethyl)-N-nitrosoharnstoff) genannt werden,
die ebenfalls befähigt
sind, die Apoptose zu induzieren.
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Von
den 3-Methylthiopropanoylthioestern von Thioctsäure können insbesondere die Verbindungen
genannt werden, die in der Patentanmeldung
EP 947 503 beschrieben sind, und besonders
die Verbindung 21, d. h. das (2'-Trimethylammonioethyl)-6-S-8-S-bis(3-methylthiopropanoyl)octanoat-iodid,
das im Folgenden als Metmetlico bezeichnet wird.
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Es
konnte nämlich
ein synergistischer Effekt der erfindungsgemäßen Verbindungen hinsichtlich
ihrer antitumoralen Aktivität
gezeigt werden, wenn sie in Kombination mit einem antitumoralen
Therapeutikum verwendet werden, wie es in der Patentanmeldung
EP 947 503 beschrieben ist.
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Unter
Retinoiden werden die Liganden der Rezeptoren RAR oder RXR vom Typ
der Agonisten oder Antagonisten verstanden, wobei diese natürlich oder
synthetisch sein können.
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Von
den D-Vitaminen oder deren Derivaten können insbesondere die Derivate
von Vitamin D2 oder D3 und
besonders das 1,25-Dihydroxyvitamin D3 und
analoge Verbindungen zu Vitamin D angege ben werden, die unter den
in den Patentanmeldungen FR 98/ 13747, FR 99/ 14783 oder FR 99/
14781 beschrieben Verbindungen ausgewählt sind.
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Von
den Antioxidantien kommen insbesondere α-Tocopherol, Superoxid-Dismutase,
Ubichinol oder einige Metallchelatbildner in Frage.
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Von
den α-Hydroxysäuren oder α-Ketosäuren oder
deren Derivaten können
insbesondere Ketoleucin, Ketoisoleucin, Ketovalin, 2-Oxo-butyrat, 4-Methylthio-2-oxobutansäure, Milchsäure, Äpfelsäure, Citronensäure, Glykolsäure, Mandelsäure, Weinsäure, Glycerinsäure oder
deren Salze, Amide oder Ester angegeben werden.
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Von
den Kaliumkanalblockern sind insbesondere das Minoxidil (2,4-Diamino-6-piperidino-pyrimidin-3-oxid)
und seine Derivate zu nennen.
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Die
Anmelderin hat ferner in überraschender
und unerwarteter Weise eine synergistische Aktivität festgestellt,
die durch die Kombination von zwei erfindungsgemäßen Verbindungen hervorgerufen
wird.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch neue pharmazeutische oder kosmetische
Zusammensetzungen, die als Wirkstoff eine wirksame Menge mindestens
einer neuen Verbindung, die Gegenstand der Erfindung ist, in einem
physiologisch akzeptablen Träger
enthalten.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft außerdem solche pharmazeutischen
Zusammensetzungen, die insbesondere zur Behandlung der oben erwähnten Erkrankungen
vorgesehen sind.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung sind auch neue pharmazeutische Zusammensetzungen
zur Behandlung, Rückbildung
und Vorbeugung von Krebs, die als therapeutischen antitumoralen
Wirkstoff eine wirksame Menge mindestens einer neuen Verbindung,
die Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, alleine oder in Kombination
mit einem antitumoralen therapeutischen Wirkstoff enthalten, der
unter den in der Patentanmeldung
EP
947 503 beschriebenen Verbindungen ausgewählt ist.
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Die
Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen
kann auf enteralem, parenteralem, topischem oder okularem Wege erfolgen.
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Für die enterale
Verabreichung können
die pharmazeutischen Zusammensetzung in Form von Tabletten, Gelatinekapseln,
Dragees, Sirup, Suspensionen, Lösungen,
Pulvern, Granulaten, Emulsionen, Mikrosphären oder Nanosphären oder
Lipid- oder Polymervesikeln vorliegen, die für eine kontrollierte Freisetzung sorgen.
Für die
parenterale Verabreichung können
die Zusammensetzungen als Lösungen
oder Suspensionen zur Perfusion oder zur Injektion vorliegen.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
der Formel (I) werden im Allgemeinen in einer täglichen Dosis von etwa 0,001
bis 100 mg/kg Körpergewicht
ein- bis dreimal täglich
verabreicht.
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Auf
topischem Wege sind die kosmetischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen
auf Basis der erfindungsgemäßen Verbindungen
insbesondere zur Behandlung der Haut, der Kopfhaut oder der Schleimhäute vorgesehen;
sie können
daher in Form von Salben, Cremes, Milchen, Pomaden, Pulvern, getränkten Tampons,
Lösun gen,
Gelen, Sprays, Lotionen oder Suspensionen vorliegen. Sie können ferner
in Form von Mikrokugeln oder Nanokugeln, Lipidvesikeln oder Polymervesikeln,
Polymerpatches oder Hydrogelen vorliegen, die eine kontrollierte
Freisetzung erlauben. Nach einer Ausführungsform kann es sich auch
um Haarwaschmittel, Konditioner oder Seife handeln.
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Die
Zusammensetzungen zur topischen Anwendung können im Übrigen nach Art der therapeutischen Indikation
in wasserfreier Form, wässriger
Form oder in Form von Emulsionen vorliegen.
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Für die okulare
Anwendung sind sie hautsächlich
Augentropfen.
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Für eine pharmazeutische
Anwendung werden die Verbindungen der Formel (I) für eine topische
oder okulare Anwendung im Allgemeinen in einer Konzentration von
0,0001 bis 10 Gew.-% und vorzugsweise 0,001 bis 1 Gew.-%, bezogen
auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, verwendet.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
der Formel (I) können
auch in der Kosmetik eingesetzt werden, insbesondere zur Körperpflege
oder Haarpflege und ganz besonders zur Behandlung von Haut mit Aknetendenz,
zur Behandlung oder Vorbeugung von Streifen, zum Schutz gegen die
schädlichen
Wirkungen der Sonne, zur Vorbeugung und/oder Bekämpfung der lichtinduzierten
oder altersbedingten Alterung und zur Bekämpfung des fettigen Aussehens
der Haut oder der Haare.
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Die
Konzentration der Verbindungen der Formel (I) in den kosmetischen
Zusammensetzungen kann im Bereich von 0,001 bis 3 Gew.- %, bezogen
auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, liegen.
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Die
erfindungsgemäßen pharmazeutischen
oder kosmetischen Zusammensetzungen können außerdem inerte oder auch pharmakodynamisch
oder kosmetisch wirksame Stoffe oder Kombinationen dieser Zusatzstoffe
enthalten, und insbesondere: Netzmittel; depigmentierende Wirkstoffe,
wie Hydrochinon, Azelainsäure,
Kaffeesäure
oder Kojisäure;
Emollientien; Hydratisierungsmittel, wie Glycerin, PEG 400, Thiamorpholinon
und seine Derivate oder Harnstoff; Wirkstoffe gegen Seborrhoe oder
gegen Akne, wie S-Carboxymethylcystein, S-Benzylcysteamin, deren
Salze und deren Derivate oder Benzoylperoxid; Antibiotika, wie Erythromycin
und seine Ester, Neomycin, Clindamycin und seine Ester, Tetracycline;
antimykotische Wirkstoffe, wie Ketoconazol oder die 4,5-Polymethylenisothiazolin-3-one; Stoffe, die
den Haarwuchs fördern,
wie Minoxidil (2,4-Diamino-6-piperidino-pyrimidin-3-oxid)
und seine Derivate, Diazoxid (7-Chlor-3-methyl-1,2,4-benzothiadiazin-1,1-dioxid)
und Phenytoin (5,4-Diphenylimidazolidin-2,4-dion); nichtsteroidale
entzündungshemmende Wirkstoffe;
Carotinoide und insbesondere β-Carotin;
Wirkstoffe gegen Psoriasis, wie Anthralin und seine Derivate, und
schließlich
Eicosa-5,8,11,14-tetrainsäure
und Eicosa-5,8,11-trünsäure, deren
Ester und deren Amide.
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Die
Zusammensetzungen können
außerdem
Stoffe zur Verbesserung des Geschmacks, Konservierungsmittel, wie
beispielsweise die Ester der p-Hydroxybenzoesäure, Stabilisierungsmittel,
Feuchtigkeitsregulatoren, pH-Regulatoren, Stoffe, die den osmotischen
Druck verändern,
Emulgatoren oder UV-A- und UV-B-Filter enthalten.
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Der
Fachmann wird selbstverständlich
die gegebenenfalls vorliegende(n) zusätzliche(n) Verbindung(en),
die in die Zusammensetzung eingearbeitet werden sollen, so auswählen, dass
die mit der vorliegenden Erfindung verbundenen vorteilhaften Eigenschaften
durch den beabsichtigten Zusatz nicht oder nicht wesentlich verändert werden.
-
Im
Folgenden werden zur Erläuterung
mehrere Beispiele für
die Herstellung von erfindungsgemäßen Wirkstoffen der Formel
(I) sowie Beispiele für
Tests zur Bestimmung der biologischen Aktivität der Verbindungen der Formel
(I) angegeben, die jedoch nicht einschränkend zu verstehen sind.
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A: BEISPIELE FÜR VERBINDUNGEN
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BEISPIEL 1
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Herstellung von S-Methyl-4-dimethylamino-4-methyl-pent-2-in-thioat
-
Zu
einer Lösung
von 0,855 g 3-Dimethylamino-3-methyl-but-1-in [G.F. HENNION, K.W.
NELSON (1957) J. Am. Chem. Soc., 79, 2142-2144] (2,80 mmol) in 14 ml Tetrahydrofuran
werden während
5 min bei –70 °C 4,07 mol
(9,24 mmol) einer Lösung
(2,27 M) von n-Butyllithium in Hexan gegeben. Nach 5 min wird das Reaktionsmedium
auf 0 °C
eingestellt und noch 30 min bei dieser Temperatur gerührt. Nach
Zurückkommen auf –70 °C werden über ein
Röhrchen
2 ml von zuvor kondensiertem Kohlenoxidsulfid zugegeben, worauf
30 min bei –70 °C gerührt wird.
Das Reaktionsmedium wird anschließend während 30 min auf 0 °C erwärmt, dann gibt
man 0,575 ml (9,24 mmol) Methyliodid zu und rührt noch 2 h bei 0 °C. Man verdünnt mit
250 ml Ether, wäscht
mit einer gesättigten
Natri umchloridlösung
(3 × 30
ml) und trocknet über
Natriumsulfat. Nach Eindampfen unter Vakuum und chromatischer Reinigung
an Kieselgel (Elution mit einem Gemisch von Petrolether und Ethylacetat
= 70/30) fallen 1,16 g der Verbindung des Beispiels 1 in Form eines
farblosen Öls
an (Ausbeute: 81 %).
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1H-NMR (300 MHz, CDCl3): ν = 1,42 (s,
6H, (CH3)2C), 2,31
(s, 6H, (CH3)2N),
2,39 (s, 3H, CH3S).
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BEISPIEL 2
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Verfahren zur Herstellung
von S-Methyl-4-methyl-4-trimethyl-ammonium-pent-2-in-thioatiodid
-
Zu
0,184 g (0,99 mmol) der in Beispiel 1 hergestellten Verbindung in
10 ml Ethylacetat werden bei Raumtemperatur 0,25 ml (4,02 mmol)
Ethyliodid gegeben. Das Gemisch wird 4 Tage in der Dunkelheit belassen.
Man dampft unter Vakuum ein und reinigt chromatographisch an Kieselgel
(Elution mit einem Gemisch Dichlormethan/Methanol = 90/10). Auf
diese Weise erhält
man 0,229 g der Verbindung des Beispiels 2 (Ausbeute 70 %) in Form
eines Feststoffs.
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1H-NMR (300 MHz, CDCl3): ν = 1,96 (s,
6H, (CH3)2C), 2,46
(s, 3H, (CH3S), 3,62 (s, 6H, (CH3)3N).
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BEISPIEL 3
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Herstellung von S-Methyl-4-di-n-propylamino-4-methyl-pent-2-in-thioat
-
Die
Herstellung erfolgt gemäß Beispiel
1, wobei das 3-Di-n-propylamino-3-methyl-but-1-in [G.F. HENNION,
R.F. HANZEL, J. Am. Chem. Soc. 82, 4908–4912, (1960)] anstelle von
3-Dimethylamino-3-methyl-but-1-in
verwendet wird. 2,8 mmol, Reinigung durch Chromatographie an Kieselgel
(Elutionsmittel Petrolether/Ethylacetat = 95/5), Ausbeute: 75 %.
Farbloses Öl.
-
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): ν = 0,86 (t,
J = 7,36m 6H, CH3-CH2)
1,46 (s, 6H, (CH3)2C),
1,47 (m, 4H, CH3-CH2)
2,38 (s, 3H, CH3S), 2,52 (m, 4H, CH2N).
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BEISPIEL 4
-
Herstellung von S-Methyl-4-methyl-pyrrolidin-1-yl-pent-2-in-thioat
-
Die
Herstellung entspricht dem Beispiel 1, wobei das 3-Methyl-3-pyrrolidin-1-yl-but-1-in
[G.F. HENNION, K.W. NELSON, J. Am Chem. Soc., 79, 2142–2144, (1957)]
anstelle von 3-Dimethylamino-3-methyl-but-1-in
verwendet wird: 2,8 mmol, chromatographische Reinigung an Kieselgel
(Elutionsmittel Petrolether/Ethylacetat = 70/30), Ausbeute 85 %.
Farbloses Öl.
-
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): ν = 1,45 (s,
6H, (CH3)2C), 1,81
(m, 4H, NCH2-CH2)
2,39 (s, 3H, CH3S), 2,72 (m, 4H, CH2N).
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BEISPIEL 5
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Herstellung von S-Methyl-4-methyl-4-morpholin-4-yl-pent-2-in-thioat
-
Die
Herstellung entspricht Beispiel 1, wobei das 3-Di-n-propylamino-3-methyl-but-1-in
[G.F. HENNION, R.F. HANZEL, J. Am. Chem. Soc., 82, 4908–4912, (1960)]
anstelle von 3-Methyl-3-morpholin-4-yl-but-1-in verwendet
wird. 1,5 mmol, Reinigung durch Chromatographie an Kieselgel (Elutionsmittel
Petrolether/Ethylacetat = 60/40), Ausbeute: 77 %. Weißer Feststoff.
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1H-NMR (300 MHz, CDCl3): ν = 1,43 (s,
6H, (CH3)2C), 2,40
(s, 3H, CH3S), 2,65 (m, 4H, CH2O),
3,97 (m, 4H, CH2N).
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B. TESTBEISPIELE FÜR DIE BESTIMMUNG
DER BIOLOGISCHEN AKTIVITÄT
DER ERFINDUNGSGEMÄSSEN
VERBINDUNGEN
-
Beispiel 1 – Effekt
der Verbindungen auf das Wachstum von transformierten oder nicht
transformierten Zellen
-
a) Wirkung der Verbindungen
auf das Wachstum von Zellen DU145 und BAF3-Bcl-2
-
Die
verwendeten Zellen gehören
zu zwei Zelllinien: metastatische Krebszellen der menschlichen Prostata
(DU145) und murine lymphoide Zellen transfektiert mit dem menschlichen
Bcl-2-Gen (BAF3-Bcl-2).
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Die
Vorgehensweise für
die Tests mit DU145 ist die Folgende:
105 Zellen
werden in verschiedenen Vertiefungen einer Mikroplatte in 1 ml Kulturmedium
inkubiert.
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Die
Verbindungen werden 4 h nach dem Einbringen der Zellen in die Vertiefungen
zugegeben.
-
Nach
72 h werden die Zellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommen.
Die DU145-Zellen werden zweimal mit PBS gewaschen und direkt mit
Natriumchlorid 0,1 M aufgenommen.
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Die
Wirkung auf das Wachstum der DU145-Zellen wird durch quantitative
Bestimmung der Proteine nach der Methode von Lowry (O.H. LOWRY,
N.J. ROSENBROUGH, A.L. FARR und RANDALL, J. Biol. Chem., 193, 165–275, (1951))
und der DNA nach dem Hoechst-Verfahren
(D.C. WEST, A. SATTAR und S. KUMAR, Anal. Biochem. 147, 189–295, (1985))
ermittelt.
-
Für die Tests
mit den BRF3-Bcl-2-Zellen wird folgendermaßen vorgegangen:
105 Zellen werden in verschiedenen Vertiefungen
einer Mikroplatte in 1 ml Kulturmedium inkubiert. Nach 4-stündiger Inkubation
werden die zu testenden Verbindungen in die Vertiefungen gegeben,
die die BAF3-Bcl-2-Zellen enthalten.
-
Für die BAF3-Bcl-2-Zellen
wird das Wachstum durch Auszählen
der lebensfähigen
Zellen in Gegenwart von Trypanblau von 0,1 % ermittelt. Die Vergleichsprobe
besteht aus Thioampal, das in der Patentanmeldung WO 98/44919 beschrieben
wurde.
-
Die
Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammengefasst:
-
-
Die
IC50-Konzentration ist die Konzentration,
die einer 50 %igen Inhibierung des Zellwachstums entspricht.
-
Die
Ergebnisse zeigen, dass die IC50-Werte der
erfindungsgemäßen Verbindungen
deutlich unter denen für
Thioampal liegen. Die Inhibierung des Wachstums von Zellen DU145
und BAF3-Bcl-2-Zellen durch die erfindungsgemäßen Verbindungen ist also größer als
die mit Thioampal erhaltene Inhibierung.
-
Die
Inhibierung des Wachstums der Zellen DU145 und BAF3-Bcl-2-Zellen rührt zumindest
zum Teil von einer Verstärkung
der Apoptosephänomene
dieser Zellen.
-
Die
Ergebnisse legen daher nahe, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen
die Apoptose der Zellen DU145 und der BAF3-Bcl-2-Zellen in größerem Maße induzieren als das Thioampal.
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b) Wirkung der Verbindungen
auf das Wachstum von Zellen L1210, L1210T, B16 und MRC5
-
Die
verwendeten Zellen gehören
zu unterschiedlichen Zelllinien:
normale embryonale Fibroblasten
der humanen Lunge (MRC5), Melanomzellen der Maus (B16), lymphozytäre Leukämiezellen
der Maus (L1210) und Zellen L1210T, die durch Infektion von L1210-Zellen
mit einem retroviralen Vektor erhalten wurden, der die menschliche
cDNA ALDH1 enthält.
-
Die
für die
Tests mit den Zellen L1210 verwendete Methode ist die Folgende:
105 Zellen werden in unterschiedlichen Vertiefungen
einer Mikroplatte in 1 ml Kulturmedium inkubiert. Nach 4-stündiger Inkubation
werden die zu testenden Verbindungen in die Vertiefungen mit den
Zellen L1210 gegeben.
-
Für die Zellen
L1210 wird das Wachstum durch Auszählen der lebensfähigen Zellen
in Gegenwart von Trypanblau von 0,1 % bestimmt.
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Für die Tests
mit den Zellen B16 und MRC5 wird folgendermaßen vorgegangen:
Die zu
testenden Verbindungen werden 4 h nach dem Einbringen der Zellen
in die Vertiefungen gegeben. Nach 72 h werden die Zellen zu verschiedenen
Zeiten entnommen. Die Zellen B16 und MRC5 werden zweimal mit PBS
gewaschen und direkt mit Natriumchlorid 0,1 M aufgenommen.
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Die
Wirkung auf das Wachstum der Zellen B16 und MRC5 wird durch quantitative
Bestimmung der Proteine nach der Methode von Lowry (O.H. LOWRY,
N.J. ROSENBROUGH, A.L. FARR und J. RAN-DALL, Bio. Chem. 193, 265–175, (1951))
und der DNA nach der Me thode von Hoechst (D.C. WEST, A. SATTAR und S.
KUMAR, Anal. Biochem. 147, 289–295
(1985)) gemessen.
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Die
Ergebnisse sind in der Tabelle II zusammengefasst. Tabelle
II
NT bedeutet nicht getestet
Die IC
50-Konzentration ist die Konzentration, die
einer 50 %-igen Inhibierung des Zellwachstums entspricht.
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Die
Ergebnisse zeigen, dass die IC50-Werte der
erfindungsgemäßen Verbindungen
sehr niedrig sind und deutlich unter den Werten liegen, die mit
Thioampal erhalten werden. Die Inhibierung des Wachstums von Zellen
L1210, L1210T, B16 und MRC5 durch die erfindungsgemäßen Verbindungen
ist also hoch und wesentlich größer als
die Inhibierung mit Thioampal.
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Die
Inhibierung des Wachstums von Zellen L1210, L1210T, B16 und MRC5
rührt zumindest
zum Teil von einer Erhöhung
der Apoptosephänomene
dieser Zellen. Diese Ergebnisse deuten also darauf hin, dass die
erfindungsgemäßen Verbindungen
die Apoptose der Zellen L1210, L1210T, B16 und MRC5 mehr induzieren
als das Thioampal.
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2 – Bestimmung der Induktion
der Apoptose in den Zellen BAF3-B0 und BAF-Bcl-2 durch die erfindungsgemäßen Verbindungen
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Die
BAF3-Bcl-2-Zellen sind Zellen BAF3 (lymphozytäre Zellen der Maus) die mit
dem Bcl-2-Gen transfektiert sind. Von diesen überexprimieren vier Linien,
die als H16, G18, B14 und G21 bezeichnet werden, das Bcl-2-Gen.
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Im
Folgenden entsprechen die als BAF3-B0-Zellen bezeichneten Zellen
den nicht mit dem Bcl-2-Gen transfektierten BAF3-Zellen.
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Die
BAF3-B0-Zellen unterliegen bei Fehlen von Interleukin 3 (IL3) innerhalb
von 16 h der Apoptose (mehr als 80 % der Zellen) [nach M.K.L. COLLINS,
J. MARVEL, P. MALDE und A. LOPEZ-RIVAS, J. Exp. Med. 176, 1043–1051, (1992)],
wohingegen die BAF3-Bcl-2-Zellen
in Abwesenheit von IL3 keinerlei Anzeichen von Apoptose zeigen.
Sie sind also gegenüber
Apoptose resistent.
-
Es
wurde folgendermaßen
vorgegangen:
Die Zellen BAF3-B0 oder BAF3-Bcl-2, die in Gegenwart
von IL3 kultiviert wurden, wurden nach einer an die von S. WRIGHT
et al., J. of Cell. Biochem., 48, 344–355, (1992) beschriebene Methode
angepasste Methode markiert.
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105 Zellen/ml wurden mit 4,62 kBq·ml–1 [3H]-Thymidin 40 h bei 37 °C inkubiert. Nach zweimaligem
Waschen mit einem Kulturmedium wurden 2,5 · 106 Zellen
in Gegenwart der zu testenden Verbindung kultiviert.
-
Nach
24-stündiger
Inkubation wurden diese Zellen durch Zentrifugieren bei 400 g während 5
min gewonnen und dreimal mit PBS-Puffer
gewaschen. Die Zellen aus dem Zentrifugat wurden in 2 ml Triton
X–100 (0,1
%), 20 mM EDTA, 5 mM Tris pH8 lysiert und bei 30 000 g 30 min bei
einer Temperatur von 4 °C
zentrifugiert. Die Überstände wurden
gewonnen, die Zentrifugate in 0,3 ml NaOH 0,5 N gelöst.
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Aliquote
Mengen des Kulturmediums (1 ml), des Überstands (0,3 ml) und des
solubilisierten Zentrifugats (0,1 ml) wurden in einem Szintillationszähler quantitativ
bestimmt.
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Der
prozentuale Anteil der DNA-Fragmente wird folgendermaßen berechnet:
(dpm =
Desintegration pro Minute)
-
Die
prozentuale DNA-Fragmentierung ist ein direktes Maß für die Apoptose
der Zellen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle III angegeben.
-
-
Die
BAF3-B0-Zellen dienen als Vergleich. Die Apoptose der Zellen wird
durch Zugabe der Verbindung des Beispiels 1 induziert, wobei dieses
Phänomen
dosisabhängig
größer wird.
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Die
Ergebnisse zeigen, dass durch die Gegenwart einer erfindungsgemäßen Verbindung
die Hemmung der Apoptose durch das Bcl-2-Gen in den Zelllinien H16, G18, B14
und G21, die das Bcl-2-Gen überexprimieren,
aufgehoben werden kann.
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Die
Vorgehensweise für
den in der Tabelle IV dargestellten Versuch entspricht dem vorhergehenden Versuch,
mit dem einzigen Unterschied, dass die Inkubationszeit anstelle
von 24 h 6 h beträgt.
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-
Die
Apoptose dieser Zellen wird durch die Verbindung des Beispiels 1
wesentlich mehr induziert als durch Thioampal, wobei diese Induktion
dosisabhängig
ist.
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Aus
den Ergebnissen geht hervor, dass durch die Gegenwart der erfindungsgemäßen Verbindung
die Inhibierung der Apoptose durch das Bcl-2-Gen aufgehoben werden
kann, und zwar wesentlich stärker
als durch die Verbindungen des Standes der Technik.
-
Beispiel 2: Wirkung der
Verbindungen auf die Aktivität
von ALDH1
-
Es
wird folgendermaßen
vorgegangen:
260 mU ALDH aus Bäckerhefe wird bei 37 oder 0 °C in einem
Gemisch von 1 mM EDTA, 100 mM KCl und 60 mM Natriumphosphatpuffer
pH 6 in einem Endvolumen von 200 µl vorinkubiert. In jedes Röhrchen,
das 200 µl des
Gemisches enthält,
wird die zu testende Verbindung in einer Konzentration von 400 µM gegeben,
mit Ausnahme einer Kontrollreihe, die keine zu testende Verbindung
enthält.
-
Die
bei 0 °C
oder 37 °C
durchgeführte
Inkubation wird durch Zugabe von 100 µg BSA (Bovin serum albumine)
und Aceton bei –20 °C bei einer
Endkonzentration von 80 % zum Fällen
der Proteine (ALDH und BSA) gestoppt. Die Röhrchen werden 1 h bei –20 °C belassen
und dann bei 10 000 upm 10 min zentrifugiert und mit 80 %-igem Aceton
gewaschen.
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Die
ausgefallenen Proteine werden in 358 µl Wasser gelöst und sofort
zu einem Reaktionsgemisch gegeben, das aus 1 mM EDTA, 100 mM KCl,
2,35 mM NAD in 60 mM Natriumphosphatpuffer pH 8,5 besteht.
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Durch
Zugabe von 2 mM Propanal wird die Reaktion gestartet, die optische
Dichte (OD) wird bei 340 nm bei T = 0 und T = 5, 10, 20 und 30 min
gemessen.
-
Die
Aktivität
des Enzyms wird durch die Änderung
der optischen Dichte Δ OD
pro Minute bestimmt (G. QUASH et al., Enzymology and molecular biology
of carbonyl metabolism, Weiner et al., Herausgeber Kluwer Adademic/Plenum
Publishers, New-York, 97–106).
-
Die
Ergebnisse sind in der
6 dargestellt.
Die prozentuale Aktivität
(A %) des Enzyms ALDH1, die bei verschiedenen Zeitspannen der Vorinkubation
der Verbindung des Beispiels 1 bei 0 °C (durch
dargestellt) oder
37 °C (durch
dargestellt)
oder ohne Vorinkubation mit der Verbindung des Beispiels 1 bei 0 °C (durch ☐ dargestellt)
oder 37 °C
(durch ⧍ dargestellt)
erhalten wird, ist in Abhängigkeit
von der Zeit (in Minuten) dargestellt.
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Wenn
die Vorinkubation mit der Verbindung des Beispiels 1 bei 0 °C durchgeführt wird,
tritt keine Inhibierungswirkung der Verbindung des Beispiels 1 auf
die Enzymaktivität
auf. Die beiden Kurven mit und ohne Vorinkubation mit der Verbindung
des Beispiels 1 liegen übereinander.
Daraus erklärt
sich die Tatsache, dass die Verbindung des Beispiels 1 bei dieser
Temperatur durch ALDH1 nicht metabolisiert werden konnte. Dadurch
konnten keine kovalenten Bindungen zwischen dem nach dem Spalten
gebildeten Wirkstoff und dem Enzym ausgebildet werden.
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Wenn
die Vorinkubation mit der Verbindung des Beispiels 1 dagegen bei
37 °C erfolgt,
metabolisiert das Enzym ALDH1 die Verbindung des Beispiels 1 und
bindet über
kovalente Bindungen daran und man beobachtet eine Inhibierung der
Enzymaktivität.
Dieser Effekt steigt in Abhängigkeit
von der Vorinkubationszeit mit der Verbindung des Beispiels 1.
-
Aus
den Ergebnissen geht hervor, dass mit den erfindungsgemäßen Verbindungen
die ALDH-Aktivität vermindert
werden kann und die erfindungsgemäßen Verbindungen den Vorteil
haben, dass sie vom Typ "Selbstvernichtung" sind (irreversible
kovalente Bindung an das Enzym ALDH), wodurch die Resistenz gegenüber Antikrebsmitteln
aufgehoben werden kann.
-
Beispiel 3: Wirkung der
Verbindungen auf die Zellen R7, die das Gen MDR überexprimieren
-
Die
in diesem Test verwendeten Zellen K562 überexprimieren das Gen MDR
nicht und dienen als Vergleich, wobei es sich um humane myeloide
Leukämiezellen
handelt. Dagegen sind die Zellen R7 Krebszellen, die das Gen MDR überexprimieren.
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Das
Ziel dieses Tests ist es, die Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen
auf die Zellen R7 zu zeigen.
-
Es
wird folgendermaßen
vorgegangen:
105 Zellen werden in verschiedenen
Vertiefungen einer Mikrotiterplatte in 1 ml Kulturmedium inkubiert.
Es handelt sich einerseits um R7-Zellen und andererseits um K562-Zellen.
Nach 4-stündiger
Inkubation wird die zu testende Verbindung (erfindungsgemäßes Beispiel
1 einerseits und Daunorubicin andererseits) in die Vertiefungen
mit den Zellen gegeben. Nach 72 h werden die Zellen zu unterschiedlichen
Zeiten entnommen.
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Das
Wachstum der Zellen wird durch Auszählen der lebensfähigen Zellen
in Gegenwart von Trypanblau 0,1 % ermittelt. Die Ergebnisse sind
in den 7 und 8 angegeben.
-
Die
7 und
8 geben die prozentuale Inhibierung (I
%) durch Daunorubicin und die Verbindung des Beispiels 1 auf das
Wachstum von Zellen R7 und K562 bei wachsenden Konzentrationen C
an. Die mit den Zellen K562 erhaltenen Ergebnisse werden durch ⧫ und die
mit den Zellen R7 erhaltenen Ergebnisse durch
symbolisiert.
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Die
Ergebnisse zeigen, dass das Daunorubicin keinerlei Inhibierungswirkung
auf das Wachstum der Zelle R7, die das Gen MDR überexprimieren, bei den Konzentrationen
besitzt, bei denen das Wachstum der Zellen K562 inhibiert wird.
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Die
Verbindung des Beispiels 1 inhibiert dagegen in hohem Maße das Wachstum
von R7-Zellen. Die Inhibierungswirkung auf das Wachstum der Zellen
R 7 ist sogar höher
als die Inhibierungswirkung, die bei den gleichen Konzentrationen
auf das Wachstum der K562-Zellen erhalten wird.
-
Die
Ergebnisse zeigen, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen die Resistenz
gegenüber
Chemotherapie, die durch das MDR-Gen verursacht wird, aufheben können.
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Beispiel 4: Wirkung einer
erfindungsgemäßen Verbindung
in Kombination mit einer Verbindung, die unter den in der Patentanmeldung
EP 947 503 beschriebenen Verbindungen ausgewählt ist, auf das Wachstum von DU145-Zellen
-
In
der Patentanmeldung
EP 947 503 wird
ausgeführt,
dass die Methionalderivate, die das Methional enthalten, das über eine
Thioesterbindung an Thioctsäure
gebunden ist, eine große
selektive a-poptotische Aktivität auf transformierte
und tumorale Zellen aufweisen. Von diesen Verbindungen kann das
(2'-Trimethylammoniumethyl)-6-S-8-S-bis(3-methylthiopropanoyl)-octanoat-iodid
(Verbindung 21 dieser Druckschrift) genannt werden, das als Metmetlico
bezeichnet wird.
-
Es
wird gemäß der folgenden
Vorgehensweise gearbeitet:
Die verwendeten Zellen entsprechen
metastatischen Krebszellen der humanen Prostata DU145.
-
105 DU145-Zellen werden in verschiedenen Vertiefungen
einer Mikrotiterplatte in 1 ml Kulturmedium inkubiert.
-
Die
zu testenden Verbindungen werden 4 h nach dem Einbringen der Zellen
in die Vertiefungen zugegeben. Nach 72 h werden die Zellen zu unterschiedlichen
Zeiten entnommen. Die Zellen werden zweimal mit PBS gewaschen und
direkt in Natriumchlorid 0,1 M aufgenommen.
-
Der
Effekt auf das Wachstum der DU145-Zellen wird durch quantitative
Bestimmung der Proteine nach der Methode von Lowry (O.H. LOWRY,
N.J. ROSENBROUGH, A.L. FARR und RANDALL, J. Biol. Chem. 193, 265–275, (1951))
und der DNA nach der Methode von Hoechst (D.C. WEST, A. SATTAR und
S. KUMAR, Anal. Biochem. 147, 289–295, (1985)) ermittelt.
-
Bei
den getesteten Produkten handelt es sich um die Verbindung des Beispiels
1, Metmetlico und deren Gemisch.
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Die
Ergebnisse sind in der Tabelle V angegeben.
-
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Die
Ergebnisse zeigen, dass die Verbindung des Beispiels 1 alleine das
Wachstum von Zellen DU145 inhibiert. Das Metmetlico alleine hat
dagegen keine Hemmwirkung auf das Wachstum von DU145-Zellen in den in
diesem Beispiel verwendeten Konzentrationen.
-
Die
Kombination einer erfindungsgemäßen Verbindung
und einer in der Patentanmeldung
EP
947 503 beschriebenen Verbindung inhibiert das Wachstum
der DU145-Zellen in synergistischer Weise. Diese Ergebnisse zeigen
die Möglichkeit,
diese Verbindungen in Kombination in Dosen verwenden zu können, die
deutlich unter den zu verwendenden Dosen liegen, wenn die Verbindungen
einzeln vorliegen.
-
Beispiel 5: Effekt der Kombination
von zwei erfindungsgemäßen Verbindungen
auf das Wachstum von Zellen DU145 oder normalen Zellen
-
105 normale Zellen der menschlichen Prostata
oder 105 Krebszellen der menschlichen Prostata (DU145)
werden in verschiedenen Vertiefungen einer Mikrotiterplatte in 1
ml Kulturmedium inkubiert. Die Verbindungen werden 4 h nach dem
Einbringen der Zellen in die Vertiefungen gegeben.
-
Nach
72 h werden die Zellen zu unterschiedlichen Zeiten entnommen. Die
Zellen DU145 oder die normalen Zellen werden zweimal mit PBS gewaschen
und direkt mit Natriumchlorid 0,1 M aufgenommen.
-
Die
Wirkung auf das Wachstum der DU145-Zellen oder der normalen Zellen
wird durch quantitative Bestimmung der Proteine nach der Methode
von Lowry (O.H. LOWRY, N.J. ROSENBROUGH, A.L. FARR und RANDALL,
J. Biol. Chem. 193, 265–275,
(1951)) und der DNA nach der Methode von Hoechst (D.C. WEST, A.
SATTAR und S. KUMAR, Anal. Biochem. 147, 289–295, (1985)) ermittelt.
-
-
Die
Kombination von zwei erfindungsgemäßen Verbindungen hemmt synergistisch
das Wachstum von Krebszellen ohne merkliche Auswirkungen auf das
Wachstum von normalen Zellen, wodurch die Aktivität und Selektivität der erfindungsgemäßen Verbindungen
gegenüber
transformierten Zellen noch erhöht
werden kann. Die Ergebnisse zeigen die Möglichkeit, die Verbindungen
in Kombination in niedrigeren Dosen als den Dosen verwenden zu können, wenn
die Verbindungen einzeln vorliegen.
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C. FORMULIERUNGSBEISPIELE
-
1) ORALE VERABREICHUNG
-
(a)
Es wird die folgende Zusammensetzung in Form einer Tablette von
0,2 g hergestellt:
Verbindung
des Beispiels 1 | 0,005
g |
vorgelierte
Stärke | 0,065
g |
mikrokristalline
Cellulose | 0,075
g |
Lactose | 0,050
g |
Magnesiumstearat | 0,005
g |
-
(b)
Es wird eine Trinksuspension hergestellt, die in Ampullen von 5
ml konfektioniert werden soll:
Verbindung
des Beispiels 2 | 0,001
g |
Glycerin | 0,500
g |
Sorbit
von 70 % | 0,500
g |
Natriumsaccharinat | 0,010
g |
Methyl-p-hydroxybenzoat | 0,040
g |
Aromastoff | qs |
entmineralisiertes
Wasser | ad
5 ml |
-
(c)
Es wird die folgende Formulierung hergestellt, die in Form von Gelatinekapseln
konfektioniert werden soll:
Verbindung
des Beispiels 1 | 0,01
mg |
Verbindung
des Beispiels 5 | 0,01
mg |
Cyclosporin | 0,050
g |
Maisstärke | 0,060
g |
Lactose | ad.
0,300 g |
-
Die
verwendeten Gelatinekapseln bestehen aus Gelatine, Titanoxid und
einem Konservierungsmittel.
-
2) TOPISCHE VERABREICHUNG
-
(a)
Es wird die folgende nichtionische Wasser-in-Öl-Creme hergestellt:
Verbindung
des Beispiels 1 | 0,100
g |
Gemisch
von emulgierenden Lanolinalkoholen, Wachsen und Ölen, die von der Firma BDF
unter der Bezeichnung "Eucerine
anhydre" im Handel
erhältlich sind | 39,900
g |
Methyl-p-hydroxybenzoat | 0,075
g |
Propyl-p-hydroxybenzoat | 0,075
g |
steriles
entmineralisiertes Wasser | ad.
100,000 g |
-
(b)
Es wird ein Gel hergestellt, indem die folgende Formulierung realisiert
wird:
Verbindung
des Beispiels 1 | 0,001
g |
Erythromycinbase | 4,000
g |
Butylhydroxytoluol | 0,050
g |
Hydroxypropylcellulose,
von der Firma Hercules unter der Bezeichnung | |
"KLUCEL HF" erhältlich | 2,000
g |
Ethanol
(95°) | ad.
100,000 g |
-
(c)
Es wird eine Lotion hergestellt, indem die folgenden Bestandteile
vermischt werden:
Verbindung
des Beispiels 2 | 0,030
g |
Propylenglykol | 5,000
g |
Butylhydroxytoluol | 0,100
g |
Ethanol
(95°) | ad.
100,000 g |
-
(d)
Es wird eine kosmetische Zusammensetzung gegen die schädlichen
Wirkungen der Sonne hergestellt, indem die folgenden Bestandteile
vermischt werden:
Verbindung
des Beispiels 1 | 1,00
g |
Benzylidencampher | 4,00
g |
Triglyceride
von Fettsäuren | 31,00
g |
Glycerylmonostearat | 6,00
g |
Stearinsäure | 2,00
g |
Cetylalkohol | 1,20
g |
Lanolin | 4,00
g |
Konservierungsmittel | 0,30
g |
Propylenglykol | 2,00
g |
Triethanolamin | 0,50
g |
Parfum | 0,40
g |
entmineralisiertes
Wasser | ad.
100,00 g |
-
(e)
Es wird die folgende nichtionische Öl-in-Wasser-Creme hergestellt:
Verbindung
des Beispiels 3 | 0,500
g |
Retinsäure | 0,020
g |
Cetylalkohol | 4,000
g |
Glycerylmonostearat | 2,500
g |
PEG
50-Stearat | 2,500
g |
Sheabutter | 9,200
g |
Propylenglykol | 2,000
g |
Methyl-p-hydroxybenzoat | 0,075
g |
Propyl-p-hydroxybenzoat | 0,075
g |
steriles
entmineralisiertes Wasser | ad.
100,000 g |
-
(f)
Es wird ein topisches Gel hergestellt, indem die folgenden Bestandteile
vermischt werden:
Verbindung
des Beispiels 4 | 0,050
g |
Ethanol | 43,000
g |
Tocopherol | 0,050
g |
Carboxyvinylpolymer,
unter der Bezeichnung "Carbopol
941" von der Firma "Goodrich" im Handel | 0,500
g |
Triethanolamin
in wässriger
Lösung
von 20 Gew.-% | 3,800
g |
Wasser | 9,300
g |
Propylenglykol | ad.
100,000 g |
-
(g)
Es wird eine Öl-in-Wasser-Creme
hergestellt, indem die folgende Formulierung realisiert wird:
Verbindung
des Beispiels 4 | 0,020
g |
Betamethason
17-valerat | 0,050
g |
S-Carboxymethylcystein | 3,000
g |
Polyoxyethylenstearat
(40 mol Ethylenoxid, unter der Bezeichnung "Myrj 52" von "ATLAS" erhältlich | 4,000
g |
mit
20 mol Ethylenoxid polyethoxyliertes Sorbitanmonolaurat, unter der
Bezeichnung "Tween
20" von "ATLAS" erhältlich | 1,800
g |
Gemisch
von Glycerylmono- und -distearat, unter der Bezeichnung "Geleol" von GATTEFOSSE" im Handel | 4,200
g |
Propylenglykol | 10,000
g |
Butylhydroxyanisol | 0,010
g |
Butylhydroxytoluol | 0,020
g |
Cetostearylalkohol | 6,200
g |
Konservierungsmittel | qs |
Perhydrosqualen | 18,000
g |
Gemisch
von Capryl/Caprintriglyceriden, unter der Bezeichnung "Miglyol 812" von "DYNAMIT NOBEL" angeboten | 4,000
g |
Triethanolamin
(99 Gew.-%) | 2,500
g |
-
(h)
Es wird die folgende Creme von Öl-in-Wasser-Typ
hergestellt:
Milchsäure | 5,000
g |
Verbindung
des Beispiels 2 | 0,020
g |
Polyoxyethylenstearat
(40 mol Ethylenoxid), unter der Bezeichnung "Myrj 52" von der Firma "ATLAS" im Handel | 4,000
g |
mit
20 mol Ethylenoxid polyethoxyliertes Sorbitanmonolaurat, unter der
Bezeichnung "Tween
20" von "ATLAS" erhältlich | 1,800
g |
Gemisch
von Glycerylmono- und -distearat, unter der Bezeichnung "Geleol" von der Firma "GATTEFOSSE" erhältlich | 4,200
g |
Propylenglykol | 10,000
g |
Butylhydroxyanisol | 0,010
g |
Butylhydroxytoluol | 0,020
g |
Cetostearylalkohol | 6,200
g |
Konservierungsmittel | qs |
Perhydrosqualen | 18,000
g |
Gemisch
von Capryl/Caprintriglyceriden, unter der Bezeichnung "Miglyol 812" von "DYNAMIT NOBEL" im Handel | 4,000
g |
Wasser | ad.
100,000 g |
-
(i)
Es wird die folgende wasserfreie Salbe hergestellt:
Verbindung
des Beispiels 1 | 5,00
g |
Vaselineöl | 50,00
g |
Butylhydroxytoluol | 0,05
g |
-
3) INTRALÄSIONALE
VERABREICHUNG
-
(a)
Es wird die folgende Zusammensetzung hergestellt:
Verbindung
des Beispiels 3 | 0,002
g |
Ethyloleat | qs
10 g |
-
(b)
Es wird die folgende Zusammensetzung hergestellt:
Verbindung
des Beispiels 1 | 0,05
% |
Polyethylenglykol | 20
% |
NaCl-Lösung von
0,9 % | qs
100 |
-
(c)
Es wird die folgende Zusammensetzung hergestellt:
Verbindung
des Beispiels 3 | 2,5
% |
Polyethylenglykol
400 | 20
% |
NaCl-Lösung von
0,9 % | qs
100 |
-
4) INTRAVENÖSE VERABREICHUNG
-
(a)
Es wird die folgende injizierbare Zusammensetzung hergestellt:
Verbindung
des Beispiels 1 | 0,001
% |
Metmetlico | 0,01
% |
Polyethylenglykol
400 | 20
% |
NaCl-Lösung von
0,9 % | qs
100 |
-
(b)
Es wird die folgende injizierbare Zusammensetzung hergestellt:
Verbindung
des Beispiels 2 | 0,01
% |
Polyethylenglykol
400 | 20
% |
NaCl-Lösung von
0,9 % | qs
100 |
-
(c)
Es wird die folgende Cyclodextrinzusammensetzung hergestellt:
Verbindung
des Beispiels 3 | 0,1
mg |
Cyclodextrin | 0,10
g |
Wasser
zur Injektion | ad.
10,00 g |
-
(d)
Es wird die folgende Cyclodextrinzusammensetzung hergestellt:
Verbindung
des Beispiels 4 | 0,01
g |
2-Hydroxypropyl-cyclodextrin | 0,10
g |
Wasser
zur Injektion | ad.
10,00 |