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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft verbesserte Verfahren zum Transkribieren
und Amplifizieren von Nukleinsäuren.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum
reversen Transkribieren von RNA durch Zugabe einer RNA-Transkriptionsmischung
direkt zu einer die RNA umfassenden trockenen Zusammensetzung bereit.
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Hintergrund der Technologie
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Beim
Herstellen einer RNA-umfassenden Probe zur reversen Transkription
und Amplifikation ist die Unversehrtheit der RNA von höchster Bedeutung.
Der Abbau von RNA durch RNase vor dem Durchführen einer reversen Transkriptionsreaktion
zum Synthetisieren von cDNA von der RNA kann katastrophal sein.
Wenn ein solcher Abbau der RNA stattfindet, ist die Empfindlichkeit
des Systems insgesamt für
einen Assay unter Verwendung von Amplifikationstechnologien verloren.
Wenn ein falsches negatives Ergebnis aufgrund von RNA-Abbau erzielt
wird, könnte
das Resultat für
einen Patienten beim Testen auf infektiöse Erkrankungen, wie das humane
Immunschwächevirus
(HIV) oder das Hepatitis-C-Virus (HCV), verheerend sein.
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Eine
Anzahl verschiedener Prozeduren werden zur RNA-Probenzubereitung
verwendet: Einschließlich
eines Probenherstellungsverfahrens auf Guanidinium-Basis, wie beschrieben
in Molecular Cloning: A Laboratory Manual von Sambrook, Fritsch,
und Maniatis ((1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York),
eines PURESCRIPT-RNA-Isolierungskit von Gentra System (Minneapolis,
MN) und des quantitativen Testkit MONITOR-HIV-RNA von F. Hoffman
La Roche.
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Nach
dem Isolieren der RNA, gewöhnlich
als zentrifugiertes Pellet, unter Verwendung dieser oder verwandter
Verfahren, erfordern alle früheren
Protokolle das Rehydratisieren des die RNA umfassenden Pellets in
einem Volumen von wenigstens 20 [μl]
RNase-freiem Wasser (Diethylpyrocarbonat-behandeltes Wasser), wobei
einige Prozeduren eine Rehydratisierung in bis zu 400 μl RNase-freiem
Wasser erfordern. Nach dem Rehydratisieren der RNA wird ein Aliquot
der Lösung,
enthaltend die rehydratisierte RNA, entnommen und einem separatem
RNase-freien Röhrchen
zugegeben, indem reverse Transkription und PCR durchgeführt werden.
Daher wird nur ein Teil der isolierten RNA in einer darauffolgenden
reversen Transkription und Polymerasekettenreaktions-Amplifikation
verwendet.
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EP-A-1026263 und
EP-A-1035220 , die
beide zum Prioritätsdatum
der vorliegenden Anmeldung nicht veröffentlicht waren, offenbaren
Verfahren, in denen ein RNA-Pellet in einer Puffermischung vor Zugabe
von reversen Transkriptionsreagenzien resuspendiert wird.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung eliminiert das Erfordernis von separaten Rehydratisierungs-
und Transferschritten und ermöglicht,
daß die
gesamte Menge isolierter RNA in darauffolgenden Prozeduren verwendet wird,
wie etwa reverser Transkription und Polymerasekettenreaktion. Die
vorliegende Erfindung reduziert das Risiko eines RNA-Abbaus durch
RNase dramatisch und erhöht
die Empfindlichkeit insgesamt von darauffolgenden reversen Transkriptions-
und Polymerasekettenreaktions(RT-PCR)-Schritten. Die Isolierung
von RNA in trockener Form aus einer Probe kann unter Verwendung
von zum Beispiel Guanidinium-basierenden Verfahren, einem PURESCRIPT-RNA-Isolierungsverfahren
oder ähnlichen
auf dem Gebiet bekannten Verfahren durchgeführt werden. Das Verfahren der
Erfindung ist besonders vorteilhaft bei Verwendung mit Proben mit einer
Ziel-RNA mit niedriger Kopienzahl. Eine niedrige Kopienzahl ist
für die
Zwecke der vorliegenden Erfindung definiert als weniger als oder
ungefähr
gleich 250 Kopien der Ziel-RNA pro Milliliter Probe. Zum Beispiel werden
Proben, die von Individuen erhalten worden sind, welche von HIV
oder HCV betroffen sind, die sich in den frühen Stadien einer Infektion
vor einer Serokonversion befinden, im allgemeinen einen niedrigen
viralen oder viralen Nukleinsäuretiter
enthalten.
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum reversen
Transkribieren eines RNA-Ziels bereitzustellen. Das Verfahren umfaßt die Schritte:
- (i) Isolieren von Nukleinsäuren aus einer Probe, um eine
trockene Zusammensetzung, umfassend eine Ziel-RNA, zu bilden; und
- (ii) direktes In-Kontakt-Bringen der trockenen Zusammensetzung
mit einer RNA-Transkriptionsmischung, umfassend
einen Primer, der sich an das RNA-Ziel anla gern wird, vier verschiedene
Nukleosidtriphosphate und ein Enzym mit reverser Trankskriptaseaktivität, unter
solchen Bedingungen, daß das
RNA-Ziel revers transkribiert wird, um eine cDNA zu bilden, die
zu dem RNA-Ziel komplementär
ist.
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Im
Anschluß an
die reverse Transkription kann die so gebildete cDNA in Nukleinsäureamplifikationsverfahren
verwendet werden, wie etwa der Polymerasekettenreaktion (PCR), Strangverdrängungsamplifikation
(SDA), Ligasekettenreaktion (LCR) und anderen, die auf dem Gebiet
bekannt sind.
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Einzelheiten
der PCR sind gut bekannt. Zusammenfassend werden zwei oder mehrere
Oligonukleotid-Primer an die denaturierten Stränge einer Zielnukleinsäure angelagert,
und Primer-Verlängerungsprodukte werden
durch Polymerisation von Desoxynukleosidtriphosphaten durch ein
Polymerisationsmittel gebildet, um einen komplementären Strang
zu bilden. Das Polymerisationsmittel ist oft eine thermostabile
DNA-Polymerase. Ein typisches PCR-Protokoll beinhaltet repetitive Zyklen
der Templat-Nukleinsäuredenaturierung,
Primer-Anlagerung,
und Verlängerung
der angelagerten Primer durch das Polymerisationsmittel, was zu
einer exponentiellen Amplifikation der Zielnukleinsäure führt. Daher
wird der Nachweis von Zielen möglich,
die in sehr niedrigen Konzentrationen in einer Probe vorliegen.
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Verschiedene
andere Aufgabe und Vorteile werden aus der detaillierten Beschreibung
der Erfindung deutlich werden.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 ist
eine Gel-Photographie, die die Ergebnisse der in Bespiel 1 beschriebenen
Experimente zeigt.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt verbesserte Verfahren zum reversen
Transkribieren und Amplifizieren von Nukleinsäuren bereit, einschließlich DNA
und RNA. Sie stellt eine einfaches und effizientes Verfahren zum reversen
Transkribieren von RNA bereit, die aus einer Probe in trockener
Form isoliert worden ist. Dieses Verfahren bietet Vorteile gegenüber zuvor
bekann ten Prozeduren, wie oben dargestellt, im Hinblick auf eine
erhöhte
Empfindlichkeit, ein verringertes Risiko des Abbaus von RNA durch
RNase, Eliminierung der separaten Rehydratations- und Transfer-Schritte,
und sie ermöglicht,
daß die
gesamte Menge an isolierter RNA verwendet werden kann.
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Im
Verfahren der vorliegenden Erfindung wird RNA aus einer Probe isoliert
und revers transkribiert, um cDNA zu bilden. Die in der Probe vorhandene
RNA wird unter Verwendung von Verfahren isoliert, die in der Lage
sind, eine trockene Zusammensetzung zu erzeugen, die die Nukleinsäure umfaßt. Solche
Verfahren schließen
ein, sind aber nicht beschränkt
auf Saure-Phenol-Behandlung (Perry, R.P. et al (1972) Biochem. Biophys.
Acta Bd. 262, S. 220) und RNAgents Total RNA Isolation System, Promega
Corporation, Madison, WI, Qiagen RNeasy Kit für Zellen (Qiagen, Deutschland),
Qiagen RNeasy Kit für
Plasma (Qiagen, Deutschland), Bio 101 RNeasy Kit für Zellen
(Bio101, San Diego, CA), Guanidin-HCl-Behandlung (Molecular Cloning:
A Laboratory Manual 2. Auflage, (Sambrook, Fritsch, Maniatis) 1989
Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)), PURESCRIPT-RNA-Isolierungs-Kit
(Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MN), und Verfahren zur differentiellen
Fällung
(Birnboim, Nucleic Acid Research, Bd. 16:4, Seiten 1487-1497, 2-25-1988).
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Wenn
die trockene Nukleinsäurezusammensetzung
gemäß der vorliegenden
Erfindung erhalten worden ist, kann sie direkt mit einer Lösung kombiniert
werden, umfassend ein Enzym mit reverser Transkriptase-Aktivität, wodurch
separate Rehydratations- und Transfer-Schritte eliminiert werden,
die in früheren
Verfahren erforderlich sind, wodurch die gesamte Menge der so erhaltenen
RNA verwendet werden kann.
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Enzyme,
die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind,
schließen
ein, sind aber nicht beschränkt
auf reverse Transkriptasen und DNA-Polymerasen mit reverser Transkriptase-Aktivität. Bevorzugt
ist die DNA-Polymerase thermostabil. Beispiele für geeignete reverse Transkriptasen
schließen
ein, sind aber nicht beschränkt
auf Superscript RNa-seH-RT
und Superscript II RNaseH-RT, beide von GibcoBRL (Gaithersburgh,
MD) und AMV (Vogel-Myeloblastosis-Virus) und M-MLV (Moloney Murin-Leukämie-Virus).
In ähnlicher
Weise schließen
Beispiele für
geeignete thermostabile DNA-Polymerasen ein, sind aber nicht beschränkt auf
Tfl (Thermus flavus) DNA-Polymerase, Tli (Thermus litorlis) DNA-Polymerase und Taq
(Thermus aquaticus) Polymerase. Ein Beispiel für eine DNA-Polymerase mit reverser Transkriptaseaktivität schließt ein, ist
aber nicht beschränkt
auf Tth (Thermus thermophilus) DNA-Polymerase. Alle oben erwähnten Enzyme
sind von verschiedenen kommerziellen Verkäufern erhältlich.
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Zusätzlich zu
einem Enzym mit reverser Transkriptaseaktivität können andere Reagenzien direkt
mit der trockenen Nukleinsäurezusammensetzung
kombiniert werden, wie etwa ein Nukleotid-Primer, der sich an die
Ziel-RNA anlagern wird, und vier verschiedene Nukleosidtriphosphaten
(dNTPs). Diese Reagenzien werden mit der trockenen Nukleinsäurezusammensetzung
unter Bedingungen kombiniert, so dass die Ziel-RNA revers transkribiert
wird, um cDNA zu bilden, die zu dem Ziel komplementär ist. Solche
Bedingungen und Einzelheiten über
das reverse Transkribieren von RNA sind gut bekannt und werden in
zahlreichen Veröffentlichungen
dargestellt, z. B.
US-Patent
Nr. 5,322,770 , Promega PCR-Guide, Kapitel 4-6 (Promega,
Madison, WI) und GeneAmp EzrTth RNA PCR Kit Technical Manual (Perkin-Elmer Cat. Nr. BIO-71).
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Der
Begriff „Primer" bezieht sich auf
ein Oligonukleotid, sei es natürlich
vorkommend oder synthetisch hergestellt, das in der Lage ist, als
ein Initiationspunkt zur Synthese zu fungieren, wenn es in Bedingungen gebracht
wird, in denen die Synthese eines Primer-Verlängerungsproduktes
induziert wird, das zu dem Nukleinsäure-Templat komplementär ist.
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Die
vorliegende Erfindung ist zum Transkribieren und Amplifizieren von
RNA von einer Anzahl von Quellen geeignet. Solche Quellen schließen ein,
sind aber nicht beschränkt
auf biologische Proben, Nukleinsäurezubereitungen
aus Organismen (viral und bakteriell), zelluläre Trümmer, aufgereinigte Gesamt-RNA
und aufgereinigte mRNA. Der Begriff „biologische Probe" schließt ein,
ist aber nicht beschränkt
auf zelluläres
oder virales Material, Haare, Körperflüssigkeiten
oder zelluläres
Material, das Nukleinsäuren
enthält,
die nachgewiesen werden können.
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Die
cDNA, die gebildet wird, kann unter Verwendung von bekannten Techniken
amplifiziert werden, wie oben dargestellt. Die allgemeinen Prinzipien
und Bedingungen zur Amplifikation und Nachweis von Nukleinsäuren, einschließlich cDNAs,
unter Verwendung von PCR sind ziemlich gut bekannt. Einzelheiten
zum Durchführen
von PCR werden in zahlreichen Publikationen bereitgestellt, einschließlich
US-Patenten Nr. 4,683,195 ,
4,683,202 und
4,965,188 . Daher sollte im Hinblick
auf das Fachwissen und die hierin bereitgestellte Lehre ein Fachmann
keine Schwierigkeiten beim Ausüben
der vorliegenden Erfindung durch Amplifizieren von cDNA haben, die
aus in trockener Form isolierter RNA erzeugt und gemäß der vorliegenden
Erfindung revers transkribiert worden ist.
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BEISPIELE
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Die
folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um bestimmte Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung zu veranschaulichen, und sollen nicht
als die Erfindung einschränkend
ausgelegt werden. Die PURESCRIPT RNA-Isolierungsprozedur wurde als
ein Mittel zum Erhalten einer trockenen, RNA umfassenden Zusammensetzung
ausgewählt,
aber sie wird nur zu veranschaulichenden Zwecken hierin verwendet.
Die trockenen Pellets, die die Ziel-RNA umfassen, erhalten unter
Verwendung des PURESCRIPT-Verfahrens, wurden dann entweder rehydratisiert
wie in früheren
RNA-Transkriptions- und Amplifikationsverfahren oder direkt gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet, wie hierin dargestellt.
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Materialien und Methoden
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Jedes
Material, dessen Quelle nicht spezifisch angezeigt wurde, wurde
von gut bekannten kommerziellen Verkäufern erworben. Alle wässrigen
Lösungen
wurden mit RNase-freiem Wasser hergestellt (Ambion, Texas).
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HIV-RNA-Plasma
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Ein
Humanplasma-Stamm, umfassend eine spezifizierte Kopienzahl von HIV-RNA
pro Einheitsvolumen, wurde von Boston Biomedica, Inc. erhalten.
Ein Aliquot des Stamm-Plasmas wurde mit humanem Plasma verdünnt, von
dem bekannt war, dass es HIV-RNA negativ war, um Plasma-Proben mit
100, 500 und 1000 Kopien pro mL HIV-RNA zu ergeben, die in der unten
beschriebenen RNA-Isolierungsprozedur verwendet wurden.
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RNA-Isolierung
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Die
PURESCRIPT-Prozedur wurde in Abweichung von der des Herstellers
folgendermaßen
modifiziert: 40μg
Glycogen, statt 20 μg,
wurden zu den Plasma-Proben zugegeben, um bei der Fällung von
viraler RNA zu helfen. Nach einer Isopropyl-Alkohol-Fällung der
RNA wurden ein oder zwei Ethanolwaschungen an dem RNA-Pellet durchgeführt, und
RNase-freies Wasser wurde anstelle der vom Hersteller bereitgestellten Rehydratisierungslösung verwendet,
um das RNA-Pellet zu rehydratisieren.
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PURESCRIPT-Lysepuffer
(500 μl)
wurde zu einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zugegeben, enthaltend
100 μl Plasmaprobe,
wie oben beschrieben. Der Inhalt wurde für 5-10 Sekunden unter Verwendung eines
VORTEX-Mixers gemischt. Die Mischung wurde bei 70°C für 5 Min.
erhitzt, bei Zimmertemperatur für
2 Min. gekühlt.
Zu der Mischung wurden 200μl
PURESCRIPT-Protein-DNA-Fällungslösung zugegeben.
Der Inhalt wurde sanft gemischt, indem das Röhrchen mehrere Male umgedreht
wurde. Das Röhrchen
wurde dann für
5 Min. auf Eis gebracht, gefolgt von einer Zentrifugation bei 14000
Upm (13000-16000 × g)
für 5 Min.,
um ein festes Pellet zu bilden. Der Überstand (ungefähr 750μL) wurde
in ein sauberes 1,5 ml Röhrchen
pipettiert, enthaltend 600 μl
100 % Isopropanol und 2 μl
einer 20 μg/ml
wässrigen
Lösung
von Glycogen, auf einen Schüttler
für 2 Min.
zum Mischen gebracht. Er wurde bei 14000 Upm (13000-16000 × g) für 5 Min.
rezentrifugiert. Der Überstand
wurde entfernt, ohne das Pellet zu zerstören. Eine Ethanolwaschung wurde
durchgeführt durch
Zugabe von 1 ml 70 % Ethanol zu dem Pellet. Der Inhalt wurde durch
Umdrehen gemischt, rezentrifugiert bei 14000 Upm (13000-16000 × g) für 2 Min.,
der Überstand
entfernt, und es wurde erneut kurz rezentrifugiert (3-5 Sekunden),
um verbleibende Flüssigkeit
herabzubringen, die dann entfernt wurde. Das Pellet wurde bei Zimmertemperatur
getrocknet.
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Reverse-Transkriptions(RT)-Mischung
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Die
Reverse-Transkriptions(RT)-Mischung wurde unmittelbar vor ihrer
Verwendung hergestellt und auf Eis gelagert. Die folgenden Reagenzien
wurden in den spezifizierten Volumina pro Reaktion verwendet: 3,0 μl 50 μM Primer
(Zufalls-Hexamer-Primer (pd(N)6, Pharmacia, Upsala, Schweden), 5,0 μl Erst-Strang-5x-Puffer (Gibco,
BRL Gaithersburgh, Maryland), 2,5 μl 0,1 M Dithiothreitol (DTT),
1,0 μl dNTP
für eine
dNTP-Gesamt-Endkonzentration von 0,4 mM, d.h. jeweils 0,1 mM von
Thiamin (T)-, Cytosin (C)-, Guanin (G)- und Adenin (A)-Nukleosidtriphosphat,
Pharmacia-Produkt #27-2035-02), 0,5 μl RNasin (40 U/μl, Promega)
und 1,0 μl M-MLV
(200 Einheiten/μl,
Gibco, BRL).
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PCR-Amplifikation von cDNA
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Die
cDNA-Mischung (25μl),
erhalten in Beispielen 1 und 2, unten beschrieben, wurde mit 75 μl einer PCR-Amplifikationsmischung
kombiniert, enthaltend jeweils 0,4 μM Primer, die für IPC (unten
beschrieben), HIV-1-LTR-Region, HIV-1-Pol-Region, HIV-2-Hüllregion
und HIV-2-LTR-Region spezifisch war, 25 mM Tris(hydroxmethyl)aminomethan-Puffer,
pH 8,5, 3 mM MgCl
2, 0,725 mM Ethylendiaminetetraessigsäure (EDTA),
54 mM KCl, 3,72 mM NaCl, 40 μm
DTT, 108 μg/ml
Gelatine, 9,5 % Glycerin, 0,02 % NP40-Detergens (Nonylphenoxypolyethoxyethanol),
2 μg Kalbsthymus-DNA,
insgesamt 1,2 mM dNTPs (jeweils 0,3 mM T, A, G, C), 10 Kopien linearisierter
IPC-Plasmid-DNA, 16 Einheiten Taq-Polymerase und 55:1 molares Verhältnis von
Anti-Taq-Polymerase-Antikörper,
wie beschrieben in
US-Patenten 5,338,671 und
5,587,287 .
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Die
DNA wurde unter Verwendung eines PE-9600-Thermocycler (Perkin-Elmer
Corp., Norwalk, CT) unter Verwendung des folgenden Protokolls amplifiziert:
einer anfänglichen
Denaturierung für
3 min bei 96°C, gefolgt
von 5 Zyklen Denaturierung bei 96°C
für 5 Sekunden
und 62°C
Anlagerung und Verlängerung
für 40 Sekunden,
dann 35 Zyklen Denaturierung bei 96°C für 5 Sekunden und 62°C Anlagerung
und Verlängerung für 40 Sekunden.
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Nachweis des amplifizierten
Produkts
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Das
PCR-Produkt wurde unter Verwendung eines nicht-isotopen Verfahrens
nachgewiesen. PCR-Produkte wurden biotinyliert unter Verwendung
von am 5'-Ende Biotin-markierten
Primern (Sinn-Strang) während der
Amplifikation. Das Produkt wurde durch Hybridisierung an Oligonukleotid-Sonden
eingefangen, die kovalent an Latex-Partikel angehängt waren,
die auf der Oberfläche
einer Durchflussmembran abgelegt wurden (SURECELL, Johnson & Johnson). Der
Komplex aus Sonde/Produkt wurde mit einem Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat umgesetzt,
das die oxidative Umwandlung eines Farbstoff-Vorläufers in
einen blauen Farbstoff katalysiert. Die Farbintensität wurde
visuell bewertet (0 = keine Farbe, 10 = intensives Blau) durch Vergleich
der beobachteten Intensität
mit Farbstandards. Alle sichtbaren Farbwerte größer als 3 wurden als positiv
angesehen.
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In
der DNA-Amplifikation- und Detektions-Prozedur wurde eine interne
positive Kontrolle (IPC) verwendet, um sicherzustellen, dass eine
ordnungsgemäße DNA-Amplifikation
stattfand. Die IPC ist ein synthetisierter DNA-Strang bekannter
Länge und
Kopienzahl, der direkt zu der PCR-Mischung vor der Amplifikation zugegeben
wurde. Primer, die für
die IPC spezifisch waren, waren in der PCR-Mischung vorhanden. Eine
negative Kontrolle war in jedem Experiment eingeschlossen, um sicherzustellen,
dass kein Produkt-Übertrag stattfand.
Die negative Kontrolle bestand aus Plasma, von dem bekannt war,
dass es frei von HIV-Nukleinsäure war.
Sie wurde durch dieselbe RNA-Isolierungsprozedur und Amplifikationsprozeduren
wie die Testproben geführt.
Keine falschen positiven Ergebnisse wurden mit den negativen Kontrollen
beobachtet, was die Zuverlässigkeit
der Ergebnisse bestätigte.
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Beispiel 1:
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Früheres
Verfahren der RNA-Isolierung und RT-PCR
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RNase-freies
Wasser (24 μl)
wurde zu dem trockenen Pellet zugegeben, erhalten von der oben beschriebenen
PURESCRIPT-Probenzubereitung, um die RNA zu rehydratisieren. Sie
wurde auf einem VORTEX-Mischer für
5-10 Sekunden gemischt, kurz bei 14000 Upm zentrifugiert und auf
Eis für
5-10 Min. gehalten, bis das RNA-Pellet vollständig aufgelöst war.
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Eine
RNA-Transkriptionsmischung wurde hergestellt durch Kombinieren von
13 μl RT-Mischung mit 12 μl der rehydratisierten
RNA in einem RNase-freien Röhrchen.
Eine Übertragung
der rehydratisierten RNA in ein neues RNA-freies Röhrchen wurde
unter Verwendung einer RNase-freien Pipettenspitze in einem RNase-freien
Arbeitsraum durchgeführt.
Die RNA-Transkription wurde durchgeführt, indem die RNA-Transkriptionsmischung
bei 42°C
für 30
min inkubiert wurde. Die Mischung wurde dann auf 100°C für 5 Min.
erhitzt, um RT-Aktivität zu zerstören, auf
Eis für
1 min gekühlt
und kurz zentrifugiert, um Flüssigkeit
herunterzubringen, die in dem Röhrchen
kondensiert war. Die jetzt cDNA umfassende Mischung wurde unmittelbar
einer PCR-Amplifikation unterzogen, wie oben beschrieben. Die cDNA-Mischung kann bei
oder unterhalb von –20°C gelagert werden,
bevor sie mit PCR-Amplifikationsreagenzien
kombiniert wird, sofern erwünscht.
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Beispiel 2:
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RNA-Isolierung und RT-PCR gemäß der vorliegenden
Erfindung
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Die
RNA-Transkriptionsmischung wurde hergestellt durch Zugabe von 25 μl der RT-Mischung direkt zu
dem trocknen RNA-Pellet, das aus der oben beschriebenen PURESCRIPT-Prozedur
erhalten wurde, gemischt und kurz zentrifugiert, um kleine Tropfen
Flüssigkeit,
die an die Seiten und den Deckel des Röhrchens anhingen, herunterzubringen.
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Die
RNA-Transkription wurde durchgeführt,
wie oben beschrieben, indem die RNA-Transkriptionsmischung bei 42°C für 30 min
inkubiert wurde. Sie wurde dann auf 100°C für 5 min erhitzt, auf Eis für 1 min
gekühlt
und kurz zentrifugiert. Die jetzt cDNA umfassende Mischung wurde
unmittelbar für
die PCR verwendet. Wie oben ausgeführt, könnte die cDNA-Mischung bei oder
unterhalb von –20°C vor einer
Kombination mit PCR-Amplifikationsreagenzien
gelagert werden, sofern erwünscht.
Die DNA-Amplifikation und der Produkt-Nachweis wurden durchgeführt, wie
oben beschrieben.
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Ergebnisse
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Vergleich
der RNA-Isolierung, Transkription und cDNA-Amplifikation und Nachweis
wie in Beispiel 1 (früheres
Verfahren) und Beispiel 2 (Verfahren der vorliegenden Erfindung)
unter Verwendung eines RNA-Ziels mit relativ hoher Kopienzahl.
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Replikate 1-5
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Die
Kopienzahl von HIV-RNA in der ursprünglichen Plasmaprobe war 1000
Kopien pro ml. Die RNA wurde gemäß dem oben
beschriebenen Verfahren isoliert und transkribiert, und die cDNA
amplifiziert und das Produkt nachgewiesen wie in Beispiel 1. Wenn
alle Schritte, die zur RNA-Transkription führen, 100 % Wiedergewinnung
der Ziel-RNA in der Plasmaprobe ergeben, wäre die Ziel-RNA in 12,5 Kopien
pro 25 μl
der endgültigen
RT-Mischung vorhanden.
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Replikate 6-10
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Die
Kopienanzahl der HIV-RNA in der ursprünglichen Plasmaprobe war 500
Kopien pro ml. Die RNA wurde gemäß dem oben
beschriebenen Verfahren isoliert und transkribiert, und die cDNA
wurde amplifiziert und das Produkt wie in Beispiel 2 nachgewiesen.
Wenn alle Schritte, die zur RNA-Transkription führen, 100 % Wiedergewinnung
der Ziel-RNA in der Plasmaprobe (ihren, wäre die Ziel-RNA in 25 Kopien
pro 25 μl
der endgültigen
RT-Mischung vorhanden.
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Replikate 11-15
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Die
Kopienzahl von HIV-RNA in der ursprünglichen Plasmaprobe war 1000
Kopien pro ml. Die RNA wurde gemäß dem oben
beschriebenen Verfahren isoliert und transkribiert, und die cDNA
wurde amplifiziert und das Produkt nachgewiesen wie in Beispiel
2. Wenn alle Schritte, die zur RNA-Transkription führen, 100
% Wiedergewinnung der Ziel-RNA in der Plasmaprobe ergeben, wäre die Ziel-RNA
in 100 Kopien pro 100 μl
der endgültigen
RT-Mischung vorhanden.
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Replikate 16-20
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Wie
Replikate 6-10; jedoch wurden zwei Ethanol-Waschschritte in der
PURESCRIPT-Isolierungsprozedur
verwendet.
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Replikate 21-25
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Wie
Replikate 11-15; jedoch wurden zwei Ethanol-Waschschritte in der
PURESCRIPT-Isolierungsprozedur
verwendet.
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Die
Ergebnisse werden in
1 und in Tabelle 1 unten gezeigt.
HIV-1-LTR und HIV-1-Pol-Sonden-Werte
sind in Tabelle 1 enthalten. IPC-Werte sind nicht enthalten, da
sie alle positiv waren (sichtbarer Wert größer als 3). HIV-2-Sonden wurden
nicht getestet, da das Plasma bekanntermaßen negativ für HIV-2
ist. Tabelle 1 RNA-Transkription und cDNA-Amplifikation
einer Ziel-RNA mit relativ hoher Kopienzahl Früheres
Verfahren gegen Erfindung
| Nummer
des Replikats | RT-PCR
gemäß | HIV-1-LTR-Sonde-Farbwert | HIV-1-POL-Sonde-Farbwert |
| 1 | Beispiel
1 | 7 | 6,5 |
| 2 | Beispiel
1 | 6 | 5,5 |
| 3 | Beispiel
1 | 7,5 | 7 |
| 4 | Beispiel
1 | 7 | 5 |
| 5 | Beispiel
1 | 8 | 8 |
| 6 | Beispiel
2 | 7,5 | 5 |
| 7 | Beispiel
2 | 7,5 | 7 |
| 8 | Beispiel
2 | 7,5 | 7,5 |
| 9 | Beispiel
2 | 7 | 4,5 |
| 10 | Beispiel
2 | 8 | 8 |
| 11 | Beispiel
2 | 7,5 | 7,5 |
| 12 | Beispiel
2 | 7 | 4 |
| 13 | Beispiel
2 | 8 | 7,5 |
| 14 | Beispiel
2 | 8 | 8 |
| 15 | Beispiel
2 | 8 | 8 |
| 16 | Beispiel
2 | 7 | 6,5 |
| 17 | Beispiel
2 | 8 | 7,5 |
| 18 | Beispiel
2 | 8 | 7,5 |
| 19 | Beispiel
2 | 7 | 7 |
| 20 | Beispiel
2 | 8 | 7,5 |
| 21 | Beispiel
2 | 8 | 8 |
| 22 | Beispiel
2 | 8 | 8 |
| 23 | Beispiel
2 | 8 | 8 |
| 24 | Beispiel
2 | 8 | 8 |
| 25 | Beispiel
2 | 8 | 7 |
-
Diese
Experimente zeigen, dass die reverse Transkription einer Ziel-RNA
mit relativ hoher Kopienzahl, darauffolgende cDNA-Amplifikation
und Produktnachweis, ähnliche
Ergebnisse in einem früheren
Verfahren und dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ergaben.
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Vergleich
der RNA-Isolierung, Transkription und cDNA-Amplifikation und Nachweis
wie in Beispiel 1 (früheres
Verfahren) und Beispiel 2 (Verfahren der vorliegenden Erfindung)
unter Verwendung eines RNA-Ziels mit niedriger Kopienzahl.
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RNA-Transkription
in Kombination mit cDNA-Amplifikation und Produktnachweis unter
Verwendung eines früheren
Rehydratationsverfahrens und des Verfahrens der vorliegenden Erfindung
wurde durchgeführt, um
die Gesamtempfindlichkeit des Assay bei einem RNA-Ziel mit niedriger
Kopienzahl zu vergleichen. HIV-1-RNA wurde aus Plasma mit einer
Konzentration von 100 Kopien pro ml Plasma isoliert.
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Proben
mit solch niedrigen Kopienzahlen müssen bestimmt werden, um dabei
zu helfen, die Ausbreitung einer HIV-Infektion und anderer infektiöser Erkrankungen
zu reduzieren. Daher ist jegliche Zunahme an Empfindlichkeit eines
Assay, die den Nachweis einer Ziel-RNA mit niedriger Kopienzahl
ermöglicht,
wünschenswert.
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Replikate 1-9 und 20-27
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Die
Kopienzahl von HIV-RNA in der ursprünglichen Plasmaprobe war 100
Kopien pro ml. Die RNA wurde gemäß dem oben
beschriebenen Verfahren isoliert und transkribiert, und die cDNA
amplifiziert und das Produkt nachgewiesen wie in Beispiel 1. Wenn
alle Schritte, die zu der RNA-Transkription führen, 100 % Wiedergewinnung
der Ziel-RNA in der Plasmaprobe ergeben, wäre die Ziel-RNA in 1,25 Kopien
pro 25 μl
der endgültigen
RT-Mischung vorhanden.
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Replikate 10-18 und 28-36
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Die
Kopienzahl von HIV-RNA in der ursprünglichen Plasmaprobe war 100
Kopien pro ml. Die RNA wurde gemäß dem oben
beschriebenen Verfahren isoliert und transkribiert und die cDNA
amplifiziert und das Produkt nachgewiesen wie in Beispiel 2. Wenn
alle Schritte, die zu der RNA-Transkription führen, 100 % Wiedergewinnung
der Ziel-RNA in der Plasmaprobe ergeben, wäre die Ziel-RNA in 2,5 Kopien
pro 25 μl
der endgültigen
RT-Mischung vorhanden.
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RNA-Transkription,
cDNA-Amplifikation und Produktnachweis wurden durchgeführt, wie
beschrieben. Eine negative Kontrolle war enthalten. Die Ergebnisse
werden in Tabelle 2 unten gezeigt. IPC-Werte werden nicht gezeigt,
da sie alle positiv waren (visuelle Werte größer als 3,0), außer im Fall
des Replikats Nr. 29. Das Fehlen eines Positivsignals für IPC bei
Replikat Nr. 29 legt nahe, dass der beobachtete niedrige Wert für HIV-1-LTR
ein Artefakt war. Tabelle 2 RNA-Transkription und cDNA-Amplifikation
einer Ziel-RNA mit relativ hoher Kopienzahl Früheres
Verfahren gegen Erfindung
| Früheres Verfahren | Verfahren
der Erfindung |
| Replikat
Nummer | HIV-1
LTR-Farbwert | Replikat
Nummer | HIV-1-LTR-Farbwert |
| 1 | 0 | 10 | 5 |
| 2 | 6 | 11 | 8 |
| 3 | 0 | 12 | 7 |
| 4 | 0 | 13 | 4 |
| 5 | 0 | 14 | 6 |
| 6 | 0 | 15 | 7 |
| 7 | 5 | 16 | 7 |
| 8 | 7 | 17 | 5 |
| 9 | 0 | 18 | 6 |
| 19 | 7 | 28 | 8 |
| 20 | 8 | 29 | 2 |
| 21 | 5 | 30 | 7 |
| 22 | 0 | 31 | 7 |
| 23 | 7 | 32 | 0 |
| 24 | 0 | 33 | 6 |
| 25 | 0 | 34 | 0 |
| 26 | 0 | 35 | 7 |
| 27 | 7 | 36 | 8 |
| Empfindlichkeit | 44% | Empfindlichkeit | 83% |
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Das
in Tabelle 2 bereitgestellte Maß der
Empfindlichkeit wurde bestimmt, indem der prozentuale Anteil an
für HIV-1
positiven Replikate für
jedes Verfahren berechnet wurde.
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Eine
signifikante Zunahme an Empfindlichkeit wird bei der Verwendung
der vorliegenden Erfindung demonstriert: 44 % Empfindlichkeit insgesamt
wird mit einem früheren
Rehydratationsverfahren beobachtet, im Vergleich zu einer Empfindlichkeit
insgesamt von 83 % bei einer Verwendung des Verfahrens der vorliegenden
Erfindung mit einem RNA-Ziel mit niedriger Kopienzahl.
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Dies
veranschaulicht deutlich den signifikanten Vorteil beim Verwenden
der vorliegenden Erfindung, da die Empfindlichkeit eines der wichtigsten
Eigenschaften eines diagnostischen Test für infektiöse Erkrankungen ist. Die gesamte
RNA, die aus einer Probe isoliert wird, wird für eine darauf folgende Transkription
beim Verwenden des Verfahrens der vorliegenden Erfindung verfügbar gemacht.
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Während die
obige Erfindung in bestimmten Einzelheiten aus Gründen der
Klarheit und des Verständnis
beschrieben worden ist, wird es für einen Fachmann klar sein,
dass, basierend auf der Lektüre
dieser Offenbarung, verschiedene Veränderungen hinsichtlich Form
und Einzelheiten gemacht werden können.