DE60032601T2

DE60032601T2 - Als antikrebsmittel verwendbare heterocyklische derivate

Info

Publication number: DE60032601T2
Application number: DE60032601T
Authority: DE
Inventors: George Thomas Groton GANT; Carl Mark Groton NOE
Original assignee: Pfizer Products Inc
Current assignee: Pfizer Products Inc
Priority date: 1999-05-19
Filing date: 2000-05-03
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2020-05-04
Also published as: TNSN00104A1; AR029634A1; EP1187826B1; MXPA01011920A; MA26733A1; WO2000071532A1; AU4137400A; JP2005008641A; ES2276681T3; ATE349440T1; BR0010746A; DZ3042A1; CA2374247A1; PA8494101A1; CA2374247C; JP3692041B2; US6380214B1; JP2003500401A; GT200000069A; CO5170417A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Diese Erfindung betrifft neue Isothiazolderivate, die bei der Behandlung von hyperproliferativen Erkrankungen, wie Krebserkrankungen, bei Säugern verwendbar sind. Diese Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Verwendung der Verbindung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung hyperproliferativer Erkrankungen bei Säugern, insbesondere Menschen, und die Verbindung enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen.
Es ist bekannt, dass eine Zelle aufgrund der Transformation von einem Teil von deren DNA in ein Onkogen (d.h. ein Gen, das bei Aktivierung zur Bildung maligner Tumorzellen führt) kanzerös werden kann. Viele Onkogene codieren für Proteine, die aberrante Tyrosinkinasen mit der Fähigkeit zum Bewirken einer Zelltransformation sind. Alternativ kann die Überexpression einer normalen protoonkogenen Tyrosinkinase ebenfalls zu proliferativen Störungen, die manchmal zu einem malignen Phänotyp führen, führen. Es wurde gezeigt, dass bestimmte Tyrosinkinasen bei vielen humanen Krebserkrankungen, wie Hirntumor, Lungenkrebs, Plattenepithelkarzinom, Blasenkrebs, Magenkrebs, Brustkrebs, Krebs des Kopfes und Nackens, Speiseröhrenkrebs, einer gynäkologischen Krebserkrankung und Schilddrüsenkrebs, mutiert oder überexprimiert sein können. Ferner kann die Überexpression eines Liganden für einen Tyrosinkinaserezeptor zu einer Steigerung im Hinblick auf den Aktivierungszustand des Rezeptors führen, was zu einer Proliferation der Tumorzellen oder Endothelzellen führt. Daher wird angenommen, dass Inhibitoren von Rezeptortyrosinkinasen, wie die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, als selektive Inhibitoren des Wachstums von Säu gerkrebszellen verwendbar sind.
Es ist bekannt, dass Polypeptidwachstumsfaktoren, wie vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), der hohe Affinität für den humanen, eine Insertdomäne enthaltenden Kinaserezeptor (KDR) oder den murinen fetale-Leber-Kinase-1(FLK-1)-Rezeptor aufweist, mit der Proliferation von Endothelzellen und insbesondere Vaskulogenese und Angiogenese in Verbindung stehen. Siehe die internationale PCT-Anmeldungsveröffentlichung WO 95/21613 (veröffentlicht am 17. August 1995). Mittel, wie die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die zur Bindung an den oder Modulation des KDR/FLK-1-Rezeptor fähig sind, können zur Behandlung von mit Vaskulogenese und Angiogenese verbundenen Erkrankungen, wie Diabetes, diabetische Retinopathie, Hämangiom, Gliom, Melanom, Kaposi-Sarkom und Eierstockkrebs, Brustkrebs, Lungenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Kolonkrebs und Plattenepithelkarzinom, verwendet werden. Isothiazolderivate, die bei der Behandlung hyperproliferativer Erkrankungen verwendbar sind, sind in der US 6 235 764 B1 (United States Provisional Application Nr. 60/087 963, eingereicht am 4. Juni 1998) angegeben.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbindung der Formel 1
und pharmazeutisch akzeptable Salze und Solvate derselben, worin:
Z S ist,
X CR⁴ ist,
X¹ O ist,
R -CONR⁵R⁶, worin R⁵ und R⁶ H sind, ist,
R¹ Propyl ist,
R² H ist,
R³ -CONR⁵R⁶, worin R⁵ und R⁶ Methyl sind, ist,
R⁴ H ist.
Speziell betrifft die vorliegende Erfindung die folgende Verbindung:
2-(3,3-Dimethyl-ureido)-4-propoxy-thiophen-3-carbonsäureamid und die pharmazeutisch akzeptablen Salze und Hydrate der vorhergehenden Verbindung.
Die Erfindung betrifft ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung der Formel 1 oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes oder Hydrats derselben und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst. In einer Ausführungsform dient die pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung einer Krebserkrankung, wie Hirntumor, Lungenkrebs, Plattenepithelkarzinom, Blasenkrebs, Magenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Brustkrebs, Krebs des Kopfes, Nackens, Nierenkrebs, Prostatakrebs, kolorektales Karzinom, Speiseröhrenkrebs, eine gynäkologische Krebserkrankung (wie Eierstockkrebs) oder Schilddrüsenkrebs.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der Verbindung der Formel 1 oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes oder Hydrats derselben bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, die durch Angiogenese vermittelt wird, wobei die Erkrankung eine Krebserkrankung, wie Hirntumor, Plattenepithelkarzinom, Blasenkrebs, Magenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Brustkrebs, Krebs des Kopfes, Nackens, Speiseröhrenkrebs, Prostatakrebs, kolorektales Karzinom, Lungenkrebs, Nierenkrebs, eine gynäkologische Krebserkrankung (wie Eierstockkrebs) oder Schilddrüsenkrebs, ist.
Patienten, die mit der Verbindung der Formel 1 und den pharmazeutisch akzeptablen Salzen und Hydraten der Verbindung behandelt werden können, umfassen beispielsweise Patienten, bei denen die Diagnose gestellt wurde, dass sie Psoriasis, BPH, Lungenkrebs, Knochenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Hautkrebs, Krebs des Kopfes und Nackens, dermales oder intraokuläres Melanom, Gebärmutterkrebs, Eierstockkrebs, Rektumkrebs oder Krebs der Analregion, Magenkrebs, Kolonkrebs, Brustkrebs, gynäkologische Tumore (beispielsweise Uterussarkome, Eileiterkarzinom, Endometriumkarzinom, Zervixkarzinom, Vaginakarzinom oder Vulvakarzinom), Hodgkin-Krankheit, Speiseröhrenkrebs, Dünndarmkrebs, Krebs des endokrinen Systems (beispielsweise Schilddrüsenkrebs, Nebenschilddrüsenkrebs oder Nebennierenkrebs), Weichteilsarkome, Harnröhrenkrebs, Peniskrebs, Prostatakrebs, chronische oder akute Leukämie, solide juvenile Tumore, lymphatisch/lymphocytische Lymphone, Blasenkrebs, eine Krebserkrankung der Niere oder des Harnleiters (beispielsweise hypernephroides Karzinom, Nierenbeckenkarzinom) oder Neoplasmen des Zentralnervensystems (beispielsweise primäres ZNS-Lymphom, Wirbelsäulentumore, Hirnstammgliome oder Hypophysenadenome) haben.
Der hierin verwendete Ausdruck "pharmazeutisch akzeptable(s) Salze(e)" umfasst, falls nicht anders angegeben, Salze sauerer oder basischer Gruppen, die in den Verbindungen der Formel 1 vorhanden sein können. Die Verbindungen der Formel 1, die basischer Natur sind, sind zur Bildung einer breiten Vielzahl von Salzen mit verschiedenen anorganischen und organischen Säuren fähig. Die Säuren, die zur Herstellung pharmazeutisch akzeptabler Säureadditionssalze derartiger basischer Verbindungen der Formel 1 verwendet werden können, sind diejenigen, die nichttoxische Säureadditionssalze, d.h. Salze, die pharmakologisch akzeptable Anionen enthalten, wie die Hydrochlorid-, Hydrobromid-, Hydroiodid-, Nitrat-, Sulfat-, Bisulfat-, Phosphat-, sauren Phosphat-, Isonicotinat-, Acetat-, Lactat-, Salicylat-, Citrat-, sauren Citrat-, Tartrat-, Pantothenat-, Bitartrat-, Ascorbat-, Succinat-, Maleat-, Gentisinat-, Fumarat-, Gluconat-, Glucuronat-, Saccharat-, Formiat-, Benzoat-, Glutamat-, Methansulfonat-, Ethansulfonat-, Benzolsulfonat-, p-Toluolsulfonat- und Pamoat[d.h. 1,1'-Methylen-bis-(2-hydroxy-3-naphthoat)]salze, bilden.
Die Verbindungen der Formel 1, die saurer Natur sind, sind zur Bildung von Basesalzen mit verschiedenen pharmakologisch akzeptablen Kationen fähig. Beispiele für derartige Salze umfassen die Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze und insbesondere die Natrium- und Kaliumsalze.
Die vorliegende Erfindung umfasst ferner isotopenmarkierte Verbindungen und die pharmazeutisch akzeptablen Salze derselben, die mit den in Formel 1 angegebenen identisch sind, mit Ausnahme der Tatsache, dass ein oder mehrere Atome durch ein Atom mit einer Atommasse oder Massenzahl, die von der üblicherweise in der Natur gefundenen Atommasse oder Massenzahl verschieden ist, ersetzt sind. Beispiele für Isotope, die in Verbindungen der Erfindung eingearbeitet werden können, umfassen Isotope von Wasserstoff, Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor, Fluor und Chlor, wie ²H, ³H, ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁸O, ¹⁷O, ³⁵S, ¹⁸F bzw. ³⁶Cl. Verbindungen der vorliegenden Erfindung und pharmazeutisch akzeptable Salze der Verbindungen, die die im vorhergehenden genannten Isotope und/oder andere Isotope andere Atome enthalten, liegen ebenfalls innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung. Bestimmte isotopenmarkierte Verbindungen der vorliegenden Erfindung, beispielsweise diejenigen, in die radioaktive Isotope, wie ³H und ¹⁴C eingearbeitet sind, sind in Arzneimittel- und/oder Substratgewebeverteilungstests verwendbar. Tritium-, d.h. ³H-, und Kohlenstoff-l4-, d.h. ¹⁴C-, Isotope sind wegen ihrer leichten Herstellung und Nachweisbarkeit besonders bevorzugt. Ferner kann eine Substitution mit schwereren Isotopen, wie Deuterium, d.h. ²H, bestimmte therapeutische Vorteile infolge der größeren Metabolisierungsstabilität, beispielsweise einer erhöhten In-vivo-Halbwertszeit oder geringerer Dosisanforderungen, bieten und daher in einigen Fällen bevorzugt sein. Isotopenmarkierte Verbindungen der Formel 1 der vorliegenden Erfindung und Prodrugs derselben können im allgemeinen durch Durchführen der in den folgenden Reaktionsschemata und/oder Beispielen und Herstellungsbeispielen offenbarten Verfahren durch Ersetzen eines nicht-isotopenmarkierten Reagens durch ein ohne weiteres verfügbares isotopenmarkiertes Reagens hergestellt werden.
Die Verbindung der Formel 1 mit freien Amino-, Amido-, Hydroxyl- oder Carboxylgruppen kann in Prodrugs umgewandelt werden. Prodrugs umfassen Verbindungen, worin ein Aminosäurerest oder eine Polypeptidkette von zwei oder mehreren (beispielsweise zwei, drei oder vier) Aminosäureresten über eine Amid- oder Esterbindung an eine freie Amino-, Hydroxy- oder Carbonsäuregruppe der Verbindung der Formel 1 gebunden sind. Die Aminosäurereste umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, die 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren, die üblicherweise mit Dreibuchstabensymbolen bezeichnet werden, und sie umfassen ferner 4-Hydroxyprolin, Hydroxylysin, Demosin, Isodemosin, 3-Methylhistidin, Norvalin, beta-Alanin, gamma-Aminobuttersäure, Citrullin, Homocystein, Homoserin, Ornithin und Methioninsulfon.
Weitere Arten von Prodrugs werden ebenfalls genannt. Beispielsweise können freie Carboxylgruppen als Amide oder Alkylester derivatisiert werden. Die Amid- und Estereinheiten können Gruppen enthalten, die, ohne hierauf beschränkt zu sein, Ether-, Amin- und Carbonsäurefunktionalitäten umfassen. Freie Hydroxygruppen können unter Verwendung von Gruppen, die, ohne hierauf beschränkt zu sein, Hemisuccinate, Phosphatester, Dimethylaminoacetate und Phosphoryloxymethyloxycarbonyle umfassen, gemäß den Angaben bei D. Fleisher, R. Bong, B. H. Stewart, Advanced Drug Delivery Reviews (1996) 19, 115, derivatisiert werden. Carbamatprodrugs von Hydroxy- und Aminogruppen werden ebenfalls genannt, wie auch Carbonatprodrugs und Sulfatester von Hydroxygruppen. Eine Derivatisierung von Hydroxygruppen als (Acyloxy)methyl- und (Acyloxy)ethylether, worin die Acylgruppe ein Alkylester sein kann, die optional mit Gruppen substituiert sind, die, ohne hierauf beschränkt zu sein, Ether-, Amin- und Carbonsäurefunktionalitäten umfassen, oder worin die Acylgruppe ein Aminosäureester wie oben beschrieben ist, werden ebenfalls genannt. Prodrugs dieser Art sind in R. P. Robinson et al., J. Medicinal Chemistry (1996) 39, 10, beschrieben.
Diese Erfindung betrifft die Verwendung aller optischen Isomere und Stereoisomere der Verbindung der Formel 1 und von Gemischen derselben. Die Verbindung der Formel 1 kann auch als Tautomere existieren. Diese Erfindung betrifft ferner die Verwendung aller derartigen Tautomere und von Gemischen derselben.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Verbindung der Formel 1 und pharmazeutisch akzeptable Salze und Solvate derselben können wie angegeben hergestellt werden: Reaktionsschema 1
In Reaktionsschema 1 kann ein Kondensationspartner wie der Ketoester 8 mit einer geeigneten Base, wie Natriumhydrid, in einem geeigneten Lösemittel, wie Tetrahydrofuran (THF), und anschließende Reaktion mit einem Aminoacylisothiocyanat, wie Verbindung 9, in einem Temperaturbereich zwischen –20 °C und Rückflußtemperatur, vorzugsweise bei 0 °C, umgesetzt werden, bis die Reaktion vollständig ist, wobei das Thiophen 10 erhalten wird. Das Thiophen kann dann mit einem geeigneten Alkohol in einem geeigneten Lösemittel, wie dem Alkohol selbst, mit einer geeigneten Menge eines geeigneten Katalysators, wie H₂SO₄, bei einer geeigneten Temperatur, wie Rückflußtemperatur, umgesetzt werden, bis die Reaktion vollständig ist, wobei das Thiophen 11 erhalten wird. Die Amidfunktionalität kann dann durch Reaktion von 11 mit einer Ammoniakquelle, wie Ammoniumhydroxid, in Ethanol bei einer geeigneten Temperatur, wie 40 °C, in einem fest verschlossenen Rohr installiert werden, wobei die Verbindung der Formel 1 erhalten wird.
Diastereomerengemische können in deren individuelle Stereoisomere auf der Basis von deren physikalischen/chemischen Unterschieden durch dem Fachmann bekannte Verfahren, beispielsweise durch Chromatographie oder fraktionierte Kristallisation, getrennt werden. Enantiomere können durch Umwandlung der Enantiomerengemische in ein Diastereomerengemisch durch Reaktion mit einer geeigneten optisch aktiven Verbindung (beispielsweise einem Alkohol), Trennung der Diastereomere und Umwandlung (beispielsweise Hydrolyse) der individuellen Diastereomere in die entsprechenden reinen Enantiomere getrennt werden. Alle derartigen Isomere, die Diastereomerengemische und reine Enantiomere umfassen, werden als Teil der Erfindung betrachtet.
Die Verbindungen der Formel 1, die basischer Natur sind, sind zur Bildung einer breiten Vielzahl verschiedener Salze mit verschiedenen anorganischen und organischen Säuren fähig. Obwohl derartige Salze zur Verabreichung an tierische Lebewesen pharmazeutisch akzeptabel sein müssen, ist es in der Praxis häufig günstig, zunächst die Verbindung der Formel 1 aus dem Reaktionsgemisch als pharmazeutisch nichtakzeptables Salz zu isolieren und dann einfach das letztere in die Verbindung der freien Base durch Behandlung mit einem alkalischen Reagens umzuwandeln und anschließend die letztere freie Base in ein pharmazeutisch akzeptables Säureadditionssalz umzuwandeln. Die Säureadditionssalze der Baseverbindungen dieser Erfindung werden durch Behandeln der Baseverbindung mit einer im wesentlichen äquivalenten Menge der gewählten Mineral- oder organischen Säure in einem wässrigen Lösemittelmedium oder einem geeigneten organischen Lösemittel, wie Methanol oder Ethanol, ohne weiteres hergestellt. Bei vorsichtigem Abdampfen des Lösemittels wird das gewünschte feste Salz ohne weiteres erhalten. Das gewünschte Säuresalz kann auch aus einer Lösung der freien Base in einem organischen Lösemittel durch Zugabe einer geeigneten Mineral- oder organischen Säure zu der Lösung ausgefällt werden.
Die Verbindungen der Formel 1, die saurer Natur sind, sind zur Bildung von Basesalzen mit verschiedenen pharmakologisch akzeptablen Kationen fähig. Beispiele für derartige Salze umfassen die Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze und insbesondere die Natrium- und Kaliumsalze. Diese Salze werden alle durch herkömmliche Techniken hergestellt. Die chemischen Basen, die als Reagentien zur Herstellung der pharmazeutisch akzeptablen Basesalze dieser Erfindung verwendet werden, sind diejenigen, die mit den sauren Verbindungen der Formel 1 nichttoxische Basesalze bilden. Derartige nichttoxische Basesalze umfassen die von pharmakologisch akzeptablen Kationen, wie Natrium, Kalium, Calcium und Magnesium und dgl., abgeleiteten. Diese Salze können ohne weiteres durch Behandeln der entsprechenden sauren Verbindungen mit einer wässrigen Lösung, die die gewünsch ten pharmakologisch akzeptablen Kationen enthält, und dann Eindampfen der gebildeten Lösung zur Trockne, vorzugsweise unter vermindertem Druck, hergestellt werden. Alternativ können sie auch durch Zusammenmischen von Niederalkanollösungen der sauren Verbindungen und des gewünschten Alkalimetallalkoxids und dann Eindampfen der gebildeten Lösung zur Trockne in der gleichen Weise wie zuvor hergestellt werden. In jedem Fall werden stöchiometrische Mengen von Reagentien vorzugsweise verwendet, um die Vollständigkeit der Reaktion und maximale Ausbeuten des gewünschten Endprodukts sicherzustellen.
Von der vorliegenden Erfindung werden Verbindungen umfasst, die mit der Verbindung der Formel 1 identisch sind, jedoch mit Ausnahme der Tatsache, dass ein oder mehrere Wasserstoff- oder Kohlenstoffatome durch Isotope derselben ersetzt sind. Derartige Verbindungen sind als Forschungs- und Diagnosewerkzeuge bei pharmakokinetischen Metabolisierungsuntersuchungen und in Bindungsassays verwendbar. Spezielle Anwendungen in der Forschung umfassen Radioligandenbindungsassays, Autoradiographieuntersuchungen und In-vivo-Bindungsuntersuchungen. Von den radioaktiv markierten Formen der Verbindungen der Formel 1 werden die Tritium- und C¹⁴-Isotope derselben umfasst.
Die In-vitro-Aktivität der Verbindung der Formel 1 im Hinblick auf die Hemmung des KDR/VEGF-Rezeptors kann durch das folgende Verfahren bestimmt werden.
Die Fähigkeit der Verbindung der vorliegenden Erfindung zur Hemmung von Tyrosinkinaseaktivität kann unter Verwendung eines rekombinanten Enzyms in einem Assay, der die Fähigkeit von Verbindungen zur Hemmung der Phosphorylierung des exogenen Substrats PolyGluTyr (PGT, Sigma^TM, 4:1) ermittelt, ermittelt werden. Die Kinasedomäne des humanen KDR/VEGF- Rezeptors (Aminosäuren 805–1350) wird in Sf9-Insektenzellen als Glutathion-S-Transferase(GST)-Fusionsprotein unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystems exprimiert. Das Protein wird aus den Lysaten dieser Zellen unter Verwendung von Glutathion-Agaroseaffinitätssäulen gereinigt. Der Enzymassay wird in 96-Vertiefungen-Platten, die mit dem PGT-Substrat beschichtet sind (0,625 μg PGT pro Vertiefung), durchgeführt. Testverbindungen werden in Dimethylsulfoxid (DMSO) verdünnt und dann so zu den PGT-Platten gegeben, dass die Endkonzentration von DMSO in dem Assay 1,6 % (V/V) beträgt. Das rekombinante Enzym wird in Phosphorylierungspuffer (50 mM Hepes, pH 7,3, 125 mM NaCl, 24 mM MgCl₂) verdünnt. Die Reaktion wird durch die Zugabe von ATP bis zu einer Endkonzentration von 10 μM initiiert. Nach 30 min Inkubation bei Raumtemperatur unter Schütteln wird das Reaktionsgemisch abgesaugt und die Platten werden mit Waschpuffer (PBS, das 0,1 % Tween-20 enthält) gewaschen. Die Menge an phosphoryliertem PGT wird durch Inkubation mit einem HRP-konjugierten (HRP ist Meerrettichperoxidase) PY-54-Antikörper (Transduction Labs) bestimmt, mit TMB-Peroxidase (TMB ist 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin) entwickelt und das Reaktionsgemisch wird quantitativ auf einem BioRad^TM Microplate Reader bei 450 nm bestimmt. Eine Hemmung der Kinaseenzymaktivität durch die Testverbindung wird als verringerte Extinktion detektiert und die Konzentration der Verbindung, die zur Hemmung des Signals um 50 % erforderlich ist, wird als der IC₅₀-Wert für die Testverbindung angegeben.
Zur Ermittlung der Fähigkeit der Verbindung zur Hemmung von KDR-Tyrosinkinaseaktivität für das Protein voller Länge, das in einem zellulären Kontext existiert, können die Schweineaortaendothel(PAE)zellen, die mit dem humanen KDR transfiziert sind (Wallenberger et al., J. Biol. Chem. 269: 26988, 1994), verwendet werden. Zellen werden ausplattiert und an den 96-Vertiefungen-Schalen im gleichen Medium (Ham's F12) mit 10 % FBS (fetales Rinderserum) anheften gelassen. Die Zellen werden dann gewaschen, erneut mit serumabgereichertem Medium, das 0,1 % (V/V) Rinderserumalbumin (BSA) enthält, versorgt und 24 h inkubiert. Unmittelbar vor einer Dosisgabe der Verbindung werden die Zellen erneut mit dem serumabgereicherten Medium (ohne BSA) versorgt. Testverbindungen, die in DMSO gelöst sind, werden in das Medium verdünnt (DMSO-Endkonzentration 0,5 % (V/V)). Am Ende einer Inkubation von 2 h wird VEGF₁₆₅ (Endkonzentration 50 ng/ml) zu dem Medium für eine Inkubation von 8 min gegeben. Die Zellen werden gewaschen und in HNTG-Puffer (20 mM Hepes, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,2 % Triton^TM X-100, 10 % Glycerin, 0,2 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid), 1 μg/ml Pepstatin, 1 μg/ml Leupeptin, 1 μg/ml Aprotonin, 2 mM Natriumpyrophosphat, 2 mM Natriumorthovanadat) lysiert. Das Ausmaß der Phosphorylierung von KDR wird unter Verwendung eines ELISA-Assays ermittelt. Die 96-Vertiefungen-Platten werden mit 1 μg pro Vertiefung mit Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper beschichtet. Ungebundener Antikörper wird von der Platte abgewaschen und verbleibende Stellen werden mit Superblock Buffer (Pierce) vor der Zugabe des Anti-flk-1-C-20-Antikörpers (C,5 μg pro Platte, Santa Cruz) blockiert. Etwaiger ungebundener Antikörper wird von den Platten vor der Zugabe des Zelllysats abgewaschen. Nach einer Inkubation von 2 h der Lysate mit dem flk-1-Antikörper wird das KDR-assoziierte Phosphotyrosin durch Entwicklung mit dem HRP-konjugieretn PY-54-Antikörper und TMB wie oben beschrieben quantitativ bestimmt. Die Fähigkeit der Verbindungen zur Hemmung der VEGF-stimulierten Autophosphorylierungsreaktion um 50 %, bezogen auf VEGF-stimulierte Kontrollen, wird als der IC₅₀-Wert für die Testverbindung angegeben.
Die Fähigkeit der Verbindung zur Hemmung der Mitogenese in humanen Endothelzellen wird durch deren Fähigkeit zur Hemmung des Einbaus von ³H-Thymidin in HUVE-Zellen (humane Nabelvenenendothelzellen, Clonetics^TM) ermittelt. Dieser Assay ist in der Literatur beschrieben (J Waltenberger et al., J. Biol. Chem. 269: 26988, 1994; Y Cao et al., J. Biol. Chem. 271: 3154, 1996). Kurz gesagt werden 10⁹ Zellen in kollagenbeschichteten 24-Vertiefungen-Platten ausplattiert und anheften gelassen. Die Zellen werden in serumfreiem Medium erneut versorgt und 24 h später werden sie mit verschiedenen Konzentrationen einer Verbindung (hergestellt in DMSO, Endkonzentration von DMSO in dem Assay 0,2 % (V/V)) und 2-30 ng/ml VEGF₁₆₅ behandelt. Während der letzten 3 h der Behandlung der Verbindung während 24 h werden die Zellen mit ³H-Thymidin (NEN, 1 μCi pro Vertiefung) gepulst. Die Medien werden dann entfernt und die Zellen werden intensiv mit eiskalter Hank's Balanced Salt Solution und dann zweimal mit eiskalter Trichloressigsäure (10 % (V/V)) gewaschen. Die Zellen werden durch Zugabe von 0,2 ml 0,1 N NaOH lysiert und die Lysate werden in Szintillationsampullen überführt. Die Vertiefungen werden dann mit 0,2 ml 0,1 N HCl gewaschen und diese Waschflüssigkeit wird dann in die Ampullen überführt. Das Ausmaß des Einbaus von ³H-Thymidin wird durch Szintillationszählung ermittelt. Die Fähigkeit der Verbindungen zur Hemmung des Einbaus um 50 %, bezogen auf die Kontrolle (VEGF-Behandlung mit nur DMSO-Vehikel), wird als der IC₅₀-Wert für die Testverbindung angegeben.
Die Aktivität der Verbindung der Formel 1 in vivo kann durch die Menge der Hemmung von Tumorwachstum durch eine Testverbindung, bezogen auf eine Kontrolle, bestimmt werden. Die Tumorwachstumshemmwirkung verschiedener Verbindungen wird gemäß den Verfahren von T. H. Corbett et al., "Tumor Induction Relationships in Development of Transplantable Cancers of the Colon in Mice for Chemotherapy Assays, with a Note on Carcinogen Structure", Cancer Res., 35, 2434–2439 (1975), und T. H. Corbett et al., "A Mouse Colon-tumor Model for Experimental Therapy", Cancer Chemother. Rep. (Part 2)", 5, 169–186 (1975) mit leichten Modifikationen ermittelt. Tumore werden in der Flanke durch subkutane Injektion von 1 × 10⁸ kultivierten Tumorzellen der logarithmischen Phase, die in 0,1–0,2 ml PBS suspendiert sind, induziert. Nach dem Verstreichen eines ausreichenden Zeitraums, damit die Tumore tastbar werden (5–6 mm Durchmesser), werden die Testtiere (athymische Mäuse) mit aktiver Verbindung (durch Auflösung in geeignetem Verdünnungsmittel, beispielsweise Wasser oder 5 % Gelucire^TM 44/14 m PBS formuliert) auf intraperitonealem (ip) oder oralem (po) Verabreichungsweg einmal oder zweimal täglich während 5–10 aufeinanderfolgenden Tagen behandelt. Um eine Antitumorwirkung zu bestimmen, wird der Tumor in Millimetern mit Vernier-Greifzirkeln über zwei Durchmesser gemessen und das Tumorvolumen (mm³) unter Verwendung der Gleichung: Tumorgewicht = (Länge × [Breite]²)/2 nach den Verfahren von R. I. Geran et al., "Protocols für Screening Chemical Agents and Natural Products Against Animal Tumors and Other Biological Systems", 3. Auflage, Cancer Chemother. Rep., 3, 1–104 (1972), berechnet. Die Flankenstelle einer Tumorimplantation ergibt reproduzierbare Dosis-Ansprechen-Wirkungen für eine Vielzahl chemotherapeutischer Mittel und das Messverfahren (Tumordurchmesser) ist ein zuverlässiges Verfahren zur Feststellung von Tumorwachstumsraten.
Die Verabreichung der Verbindung der vorliegenden Erfindung (im folgenden die "aktive Verbindung(en)") kann durch ein beliebiges Verfahren, das eine Abgabe der Verbindungen am Wirkort ermöglicht, bewirkt werden. Diese Verfahren umfassen orale Wege, intraduodenale Wege, parenterale Injektion (einschließlich intravenöser, subkutaner, intramuskulärer, intravaskulärer Injektion oder Infusion), eine topische und rektale Verabreichung.
Die Menge der verabreichten aktiven Verbindung hängt von dem zu behandelnden Subjekt, der Schwere der Störung oder des Zustands, der Verabreichungsrate und der Beurteilung des verschreibenden Arztes ab. Jedoch liegt eine wirksame Dosierung im Bereich von etwa 0,001 bis etwa 100 mg pro kg Körpergewicht pro Tag, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 35 mg/kg/Tag in einer Einzeldosis oder geteilten Dosen. Für einen Menschen von 70 kg macht dies eine Menge von etwa 0,05 bis etwa 7 g/Tag, vorzugsweise etwa 0,2 bis etwa 2,5 g/Tag aus. In einigen Fällen können Dosierungsmengen unter der Untergrenze des im vorhergehenden genannten Bereichs mehr als adäquat sein, während in anderen Fällen noch größere Dosen ohne das Bewirken einer schädlichen Nebenwirkung verwendet werden können, vorausgesetzt, derartige größere Dosen werden zunächst in mehrere kleine Dosen zur Verabreichung über den Tag geteilt.
Die aktive Verbindung kann als eine einzige Therapie angewandt werden oder sie kann eine oder mehrere andere Antitumorsubstanzen umfassen, beispielsweise die aus beispielsweise Mitoseinhibitoren, beispielsweise Vinblastin; Alkylierungsmitteln, beispielsweise Cisplatin, Carboplatin und Cyclophosphamid; Antimetaboliten, beispielsweise 5-Fluoruracil, Cytosinarabinosid und Hydroxyharnstoff, oder beispielsweise einem der bevorzugten Antimetaboliten gemäß der Offenbarung in der europäischen Patentanmeldung 239362, wie N-(5-[N-(3,4-Dihydro-2-methyl-4-oxochinazolin-6-ylmethyl)-N-methylamino]-2-thenoyl)-L-glutaminsäure; Wachstumsfaktorinhibitoren; Zellzyklusinhibitoren; interkalierenden Antibiotika, beispielsweise Adriamycin und Bleomycin; Enzymen, beispielsweise Interferon; und Antihormonen, beispielsweise Antiöstrogenen, wie Nolvadex^TM (Tamoxifen), oder beispielsweise Antiandrogenen, wie Casodex^TM (4'-Cyano-3-(4-fluorphenylsulfonyl)-2-hydroxy-2-methyl-3'-(trifluor methyl)propionanilid), ausgewählten. Eine derartige gemeinsame Behandlung kann mittels gleichzeitiger, aufeinanderfolgender oder getrennter Dosierung der individuellen Komponenten der Behandlung erreicht werden.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann beispielsweise in einer zur oralen Verabreichung geeigneten Form als Tablette, Kapsel, Pille, Pulver, Formulierungen mit nachhaltiger Freisetzung, Lösung, Suspension, zur parenteralen Injektion geeigneten Form als sterile Lösung, Suspension oder Emulsion, zur topischen Verabreichung geeigneten Form als Einreibemittel oder Creme oder zur rektalen Verabreichung geeigneten Form als Suppositorium sein. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann in einer Einheitsdosierungsform, die zur Einzelverabreichung präziser Dosierungen geeignet ist, sein. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann einen herkömmlichen pharmazeutischen Träger oder ein Streckmittel und eine Verbindung gemäß der Erfindung als Wirkstoff umfassen. Ferner kann sie weitere medizinische oder pharmazeutische Mittel, Träger, Adjuvantien und dgl. umfassen.
Beispiele für parenterale Verabreichungsformen umfassen Lösungen oder Suspensionen aktiver Verbindungen in sterilen wässrigen Lösungen, beispielsweise wässrigen Propylenglykol- oder Dextroselösungen. Derartige Dosierungsformen können, falls gewünscht, in geeigneter Weise gepuffert sein.
Geeignete pharmazeutische Träger umfassen inerte Verdünnungsmittel oder Füllstoffe, Wasser und verschiedene organische Lösemittel. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können, falls gewünscht, zusätzliche Bestandteile, wie Aromatisierungsmittel, Bindemittel, Streckmittel und dgl., enthalten. Daher könne zur oralen Verabreichung Tabletten, die verschiedene Streckmittel, wie Citronensäure, enthalten, zusammen mit verschiedenen Desintegrationsmitteln, wie Stärke, Alginsäure und bestimmte komplexe Silicate, und mit Bindemitteln, wie Saccharose, Gelatine und Akaziengummi, verwendet werden. Ferner sind Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, Natriumlaurylsulfat und Talkum, häufig für Tablettierungszwecke verwendbar. Feste Zusammensetzungen einer ähnlichen Art können auch in weichen und harten gefüllten Gelatinekapseln verwendet werden. Bevorzugte Materialien umfassen daher Lactose oder Milchzucker und Polyethylenglykole mit hohem Molekulargewicht. Wenn wässrige Suspensionen oder Elixiere zur oralen Verabreichung gewünscht werden, kann die aktive Verbindung darin mit verschiedenen Süßungs- oder Aromatisierungsmitteln, Farbmitteln oder Farbstoffen und, falls gewünscht, Emulgatoren oder Suspendiermitteln zusammen mit Verdünnungsmitteln, wie Wasser, Ethanol, Propylenglykol, Glycerin oder Kombinationen derselben, kombiniert werden.
Verfahren zur Herstellung verschiedener pharmazeutischer Zusammensetzungen mit einer spezifischen Menge einer aktiven Verbindung sind bekannt oder dem Fachmann offensichtlich. Siehe beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easter, Pa., 15. Auflage (1975).
Die im folgenden angegebenen Beispiele und Herstellungsbeispiele erläutern die Verbindung der vorliegenden Erfindung und Verfahren zur Herstellung einer derartigen Verbindung und geben Beispiele hierfür an. Es ist klar, dass der Umfang der vorliegenden Erfindung in keinster Weise durch den Umfang der folgenden Beispiele und Herstellungsbeispiele beschränkt ist.
HERSTELLUNGSBEISPIEL 1
2-(3,3-Dimethyl-ureido)-4-oxo-4,5-dihydro-thiophen-3-carbonsäuremethylester
Eine Lösung von Methyl-4-chloracetoacetat (1,77 ml, 15,3 mmol) in THF (10 ml) wurde zu einer Suspension von Natriumhydrid (386 mg) von 0 °C in THF (40 ml) gegeben. Das Rühren wurde fortgesetzt, bis die Blasenbildung aufhörte, wobei eine hellgelbe Lösung erhalten wurde. Als nächstes wurde eine Lösung von N,N-Dimethylaminoacylisothiocyanat (2,00 g, 15,4 mmol) in THF (10 ml) zugegeben. Nach etwa 1 min bildete sich eine hellgelbe Suspension. Das Reaktionsgemisch wurde bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde als nächstes zwischen Wasser und einem Ethylacetat/Methylenchlorid-Gemisch verteilt. Die organische Schicht wurde getrocknet (Na₂SO₄), eingeengt und aus Methanol umkristallisiert, wobei die Titelverbindung als hellgelber Feststoff erhalten wurde (2,09 g, 8,56 mol, 56 %). ¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) 3,10 (br. s, 6 H), 3,56 (s, 2 H), 3,86 (s, 3 H), 12,41 (s, 1 H).
2-(3,3-Dimethyl-ureido)-4-propoxy-thiophen-3-carbonsäuremethylester
Eine Lösung von 2-(3,3-Dimethyl-ureido)-4-oxo-4,5-dihydrothiophen-3-carbonsäuremethylester (50 mg, 0,205 mmol) in n-Propanol (5 ml) wurde mit H₂SO₄ (5 ml) behandelt und 12 h bei Umgebungstemperatur gerührt. Es wurde eine geringe Reaktion beobachtet, weshalb die Temperatur auf 100 °C erhöht wurde. Nach 2 h wurde eine geringe Reaktion beobachtet, weshalb 4-Å-Siebe zugegeben wurden und die Reaktion bei 100 °C weitere 2 h fortgesetzt wurde, wobei an diesem Punkt ausreichend Produkt beobachtet wurde. Das Gemisch wurde dann eingeengt und der Rückstand wurde über Radialchromatographie auf einer 4-mm-Platte unter Verwendung von Hexanen/Ethylacetat (1/1) gereinigt, wobei die Titelver bindung als weißer Feststoff erhalten wurde (31 mg, 0,108 mmol, 53 %).
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) 1,03 (t, 3 H, J = 7,3 Hz), 1,78–1,84 (m, 2 H), 3,06 (s, 6 H), 3,84–3,89 (m, 5 H), 5,51 (s, 1H), 11,08 (s, 1 H).
Beispiel 1
2-(3,3-Dimethyl-ureido)-4-propoxy-thiophen-3-carbonsäureamid
Eine Lösung von 2-(3,3-Dimethyl-ureido)-4-propoxy-thiophen-3-carbonsäuremethylester in Ethanol (6 ml) wurde mit konzentriertem Ammoniumhydroxid (6 ml) in einem verschlossenen Rohr behandelt und 5 h auf 40 °C erhitzt. Das Gemisch wurde dann gekühlt, eingedampft, mit einer kleinen Menge Essigsäure angesäuert und über Radialchromatographie auf einer 2-mm-Platte unter Verwendung von Hexanen/Ethylacetat (3/1) plus 2 % Methanol als Elutionsmittel gereinigt, wobei ein weißer Feststoff erhalten wurde (15 mg, 55,3 Mikromol, 51 %).
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) 1,03 (t, 3 H, J = 7,3 Hz), 1,81–1,88 (m, 2 H), 3,04 (s, 6 H), 3,97 (t, 2 H, J = 6,6 Hz), 5,33 (breites s, 1 H), 5,55 (s, 1 H), 7,50 (breites s, 1 H), 12,00 (s, 1 H).

Claims

Die Verbindung 2-(3,3-Dimethyl-ureido)-4-propoxythiophen-3-carbonsäureamid oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz oder Solvat derselben.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung nach Anspruch 1 oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz oder Hydrat derselben und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer durch Angiogenese vermittelten Erkrankung, wobei die Erkrankung eine Krebserkrankung ist, die aus einem Hirntumor, Plattenepithelkarzinom, Blasenkrebs, Magenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Brustkrebs, Krebs des Kopfes, Nackens, Speiseröhrenkrebs, Prostatakrebs, kolorektalem Karzinom, Lungenkrebs, Nierenkrebs, Eierstockkrebs, einer gynäkologischen Krebserkrankung und Schilddrüsenkrebs ausgewählt ist.