DE3889088T2 - Verfahren zur Herstellung von Fettsäureestern. - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Fettsäureestern.

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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6458—Glycerides by transesterification, e.g. interesterification, ester interchange, alcoholysis or acidolysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Description

  • Diese Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Fettsäureestern oder zur Umlagerung von Fetten und pflanzlichen Ölen, worin die Fettsäure- und Alkoholreste liefernden Reaktanten unter dem Einfluß von Lipasen als Katalysatoren umgesetzt werden.
  • Bei der Umlagerung von Fetten und pflanzlichen Ölen werden ihre Fettsäurebestandteile gemäß dem für die Reaktion gewählten Katalysator mehr oder weniger stark in Richtung der Triglyceride, aus denen die Fette und Öle weitgehend bestehen, umgelagert. Unter dem Einfluß von Alkalimetallen, ihren Hydroxiden und Alkoxiden ist die Umlagerung unweigerlich zufällig. In einem in jüngerer Zeit entwickelten und in der US-A-4 275 081 beschriebenen Verfahren unter Verwendung von Lipasekatalysatoren kann die Umlagerung entsprechend der gewählten Lipase zufällig oder selektiv sein, und zusätzliche, als freie Säure oder Alkylester in den Reaktantenzusammensetzungen vorliegende Fettsäurereste können teilnehmen. Wie in diesem und anderen Dokumenten beschrieben, ist das Enzym vorzugsweise auf einem inerten Trägermaterial fixiert, das anorganisch und/oder organisch sein kann, und man kann die Reaktion chargenweise oder kontinuierlich in Gegenwart oder Abwesenheit von Lösungsmitteln für die Reaktanten und bei Temperaturen und anderen Bedingungen durchführen, bei welchen die Reaktanten in flüssiger, homogener, mit Wasser nicht mischbarer Phase vorliegen und der Katalysator aktiv ist.
  • Während Umlagerungsverfahren unter dem Einfluß von Alkalimetallkatalysatoren unter strengem Ausschluß von Wasser durchgeführt werden müssen, um eine Nebenreaktion mit Produktion von Seife und Verlust an Katalysatoraktivität zu vermeiden, erfordern Enzymkatalysatoren während der gesamten Reaktion eine geringe Wassermenge zur Aktivierung. Genügend Wasser kann in der Beschickung im Fall kontinuierlicher Reaktionen vorgelegt werden, in denen das Enzym auf einem Katalysatorträger in einem Bett fixiert ist, durch welches die Beschickung läuft, wobei die Wassemenge gewöhnlich weniger als 1 % und sogar nur 0,1 Gew.-% der Beschickung beträgt. In Gegenwart erheblich größerer Wassermengen als diese bleibt der Katalysator aktiv, die Reaktion wird jedoch auf die Produktion von Hydrolyseprodukten unter Verlust an Triglyceriden gerichtet. Dagegen führen Versuche zum Minimeren der vorliegenden Wassermenge zu einer Abnahme der Katalysatoraktivität.
  • Ähnliche Überlegungen gelten bezüglich der begrenzten zulässigen Wassermenge bei Veresterungsreaktionen, die unter dem Einfluß von Lipaseenzymen als Katalysator (einschließlich Alkoholysereaktionen) durchgeführt werden, in welchen der Alkoholrest eines Esters - der selbstversätndlich ein Glyceridester, z.B. ein Triglycerid, sein kann - durch den eines anderen Alkohols ersetzt wird. Diese Reaktionen teilen mit den Umlagerungsreaktionen die Notwendigkeit, das vorliegende Wasser im Reaktionssystem in sehr geringen Mengen zu halten, um die Bildung unerwünschter Hydrolyseprodukte zu vermeiden.
  • In den beschriebenen Umlagerungsverfahren und verwandten Verfahren, die in Gegenwart sehr begrenzter Wassermengen unter dem Einfluß von Lipaseenzym auf einem Träger als Katalysator durchgeführt werden, ist das Enzym auf einem eine große Oberfläche bietenden Trägermaterial abgeschieden, das anorganisch, wie Siliciumdioxid und dessen Derivate, einschließlich insbesondere Celite (Warenname für Diatomeenerde), oder organisch, wie ionische Austauscherharze mit einer makroretikulären Struktur, sein kann, in dessen Poren das Enzym untergebracht werden kann. Bisher wurde bei diesen Reaktionen die Bindung des Enzyms an das Trägermaterial physikalisch durch Präzipitieren des Enzyms auf einer hydrophilen Trägeroberfläche herbeigeführt, oder, wie in der EP-A- 147 914 beschrieben, durch Aufbringung einer organometallischen Kupplungsverbindung zum chemischen Binden des Enzyms an den Träger, wobei eine hydrophobe Umgebung gebildet wird, oder durch ionische Bindung an ein Ionenaustauschermaterial, wie in der EP-A-140 542 beschrieben. Die ionische Bindung von Enzymen an modifiziertes Polystyrolpolymer wird in der US-A-4 551 482 beschrieben. Die Herstellung einer anfänglich hydrophoben Polymeroberfäche durch Eintauchen in eine verdünnte Lösung eines langkettigen kationischen grenzflächenaktiven Mittels vor der Enzymimmobilisierung wird in der US-A-4 539 294 beschrieben.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung verbesserter Verfahren zur Herstellung von Fettsäureestern.
  • Es ist nun gefunden worden, daß die obigen Aufgaben durch ein Verfahren zur Herstellung von Fettsäureestern oder zur Umlagerung von Fetten und pflanzlischen Ölen erfüllt werden können, wonach Fettsäure- und Alkoholreste liefernde Reaktanten in einer im wesentlichen nichtwäßrigen homongenen flüssigen Phase, die maximal 1 Gew.-% Wasser enthält, in Gegenwart eines Lipageträgerkatalysators umgesetzt werden, der durch physikalisches Binden der Lipase durch Adsorption an das Trägermaterial erhalten ist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der Träger für den Lipasekatalysator aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 1) Polyalkylenen, ausgewählt aus der aus Homo- oder Copolymeren von Ethylen, Styrol, Butadien oder Isopren und Homopolymeren von Propylen bestehenden Gruppe, und 2) anorganischen porösen Materialien besteht, deren Oberflächen zwecks Hydrophobierung behandelt worden sind, wobei dieses Trägermaterial eine durchschnittliche Porengröße von 0,05 bis 5 hat.
  • Die erfindungsgemäße Reaktion erfolgt daher in einer im wesentlichen nichtwäßrigen Phase, wobei jedoch etwas Wasser nötig ist, um mit dem Enzym assoziiert zu werden. Diese Wassermenge ist fast ummeßbar gering. So genügt z .B. die Sättigung der nichtwäßrigen Phase mit Wasser; eine Sättigung von 50 % oder mehr kann ebenfalls eingesetzt werden. Es liegt keine wäßrige Phase vor.
  • Die Trägermaterialien müssen porös sein; dies kann durch Verwendung von Blähmitteln während der Polymerisation erreicht werden. Anorganische poröse Materialien, wie Glas und feuerfestes Material, z.B. Siliciumdioxide, deren Oberfläche durch z .B. eine Silanbehandlung hydrophobiert wurde, sind ebenfalls geeignet. Fur eine gute Immobilisierung des Enzyms beträgt die durchschnittliche Porengröße des Trägermaterials nicht weniger als 50 nm, insbesondere 0,05 bis 5 um. Unter durchschnittlicher Porengröße verstehen wir den mittleren Porendurchmesser, gemessen nach den Standardtechniken der Quecksilberporosimetrie. Die Teilchengröße eines geeigneten Materials beträgt vorzugsweise 0,01 bis 5 mm, insbesondere 0,1 bis 1,5 mm, für Polyolefine und 0,5 bis 3 mm für feuerfeste Materialien, wie Siliciumdioxid.
  • Auf hydrophobem Material abgeschiedene Enzyme werden in der US-A-4 629 742 beschrieben, wo sie zur Hydrolyse von Fetten eingesetzt werden. In der vorliegenden Erfindung geeignete synthetische Polymere sind insbesondere Polystyrole, wie sie z.B. durch Emulsionsverfahren mit hoher innerer Phase, beschrieben in der EP-A-60 138, hergestellt werden.
  • Die EP 195 311 offenbart ein Verfahren, wonach Sterolester oder spezielle aliphatische Alkoholester von Fettsäuren durch ein Enzymverfahren hergestellt werden können. Das Enzymaterial befindet sich auf einen Träger.
  • Die im obigen System verwendete Wassermenge ist jedoch beträchtlich.
  • Das Enzym auf dem Träger kann nach vier Verfahren, einschließlich eines Adsorptionsverfahrens, hergestellt werden. Es wird jedoch offenbart, daß das Adsorptionsverfahren nur bei hydrophilen Trägern angewendet werden kann, die modifiziert worden sind, z.B. bei modifizierten Polysacchariden.
  • Es wird auch offenbart, daß anorganische Träger im Adsorptionsverfahren eingesetzt werden könnten. Die genannten anorganischen Materialien sind jedoch alle hydrophile Materialien. Wir haben gefunden, daß diese Trägermaterialien für den Zweck unserer Erfindung ungeeignet sind.
  • Das Trägermaterial umfaßt vorzugsweise ein poröses polymeres Material mit einem Porengesamtvolumen von mindestens 50 %, das eine Vielzahl durch Löcher verbundener Hohlräume, die einen durchschnittlichen Durchmesser innerhalb des Bereiches von 1 bis 150 um haben, umfaßt. Das Porengesamtvolumen beträgt insbesondere mindestens 75 %, z.B. 90 % oder mehr.
  • Weitere Einzelheiten bezüglich geeigneter poröser Materialien zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung finden sich in der oben genannten EP-A-60 138 und zusätzlich in der EP-A-105 634, EP-A-156 541, EP-A-157 504, GB-A-2 155 481, EP-A-200 528, Ep-A-223 574, EP-A-239 360, EP-A-240 343, EP-A-264 268, EP-A-289 238, EP-A-288 310 und der EP-A-299 762.
  • Jede dieser Patentschriften beschreibt ein poröses Material, das den vorliegenden Porositätsanforderungen entspricht. In allen Fällen kann das Material durch Polymerisieren von Ausgangsmaterialien in Form einer Emulsion mit hoher innerer Phase hergestellt werden, die entweder eine Wasser-in-Öl-Emulsion, eine Öl-in-Wasser-Emulsion oder eine Emulsion sein kann, die zwischen irgendwelchen zwei ausreichend unmischbaren Lösungen gebildet ist. Unter "Wasser" verstehen wir eine wäßrige Grundlage, und unter "Öl" verstehen wir ein mit dem wäßrigen System nicht mischbares Material. Diese in verschiedenen Dokumenten beschriebenen Materialien unterscheiden sich in inren Ausgangsmaterialien und/oder Endeigenschaften.
  • Die japanische Patentveröffentlichung J84 091 883 beschreibt eine Herstellung eines Enzyms auf einem Träger durch Kontaktieren einer Enzymlösung mit Styrol- oder Methacrylsäureestern. Styrolpolymere werden als Enzymträgermaterial in der russischen Patentschrift SU 804 647 beschrieben. Hoq et al (JAOCS 61, (4), April 1984, Seiten 776-81) beschreiben die Glyceridsynthese unter dem Einfluß einer auf einem hydrophoben porösen Trägermaterial, wie Polypropylen, immobilisierten Lipase als Katalysator in einer heterogenen Reaktionsmasse, die unmischbare wäßrige und nichtwäßrige Phasen umfaßt.
  • In der Erfindung verwendbare alternative Träger sind anorganische feuerfeste Materialien, wie Siliciumdioxid oder Glas. Ein solches Material muß behandelt worden sein, um seine Oberfäche hydrophob zu machen, z .B. durch Behandlung mit einer Polymerbeschichtung aus hydrophobem organischem Siliciumdioxid.
  • Zur Verwendung in der Erfindung geeignete Enzyme schließen Lipasen aus Lipasespezies der Arten Mucor, Aspergillus, Rhizopus, Pseudomonas, Candida, Humicola, Thermomyces und Penicillium ein.
  • Die in der Erfindung zur Erzeugung von Fettsäure- und Alkoholresten verwendeten Reaktanten umfassen vorzugsweise Glyceridester, z.B. mindestens einen eines Fettes und eines Öles.
  • Ein bevorzugtes Reaktantensystem umfaßt Glyceridester zusammen mit mindestens einer freien Fettsäure oder einem Alkylester davon.
    • BEISPIELE
  • Zur Veranschaulichung der Erfindung wird nun eine Anzahl von Beispielen gegeben.
  • In diesen Beispielen werden verschiedene Träger für die Lipasen verwendet. Ihre Kennzeichnung ist wie folgt:
    • EP-100, EP-400
  • Erhältlich von Enka, Niederlande
  • Typ: makroporöse Teilchen von Polypropylen (EP-100, EP-400) mit großen Zellen (Hohlräumen), die durch Löcher verbunden sind.
  • Handelsname: Accurel Teilchengröße; mm Porenvolumen; ml/g Oberfläche; m&supmin;/g Schüttdichte; g/ml mittl. Porendurchmesser; nm Zellgröße; pm Lochgröße; rm Hohlraumvolumen; %
    • S, 980G
  • Erhältlich von Shell
  • Typ: poröse kugelige Siliciumdioxidteilchen
  • Teilchengröße 1,5 mm
  • Porenvolumen 1,2 ml/g
  • Oberfläche 63 m²/g
  • Schüttdichte 0,4 g/ml
  • mittl. Porendurchmesser 60 nm
    • 5693-93, 78-7300
  • Erhältlich von National Starch & Chemical Ltd., Vereinigtes Königreich
  • Typ: makroporöse Polystyrolteilchen mit großen Zellen (Hohräumen), die durch Löcher verbunden sind, hergestellt durch Emulsionspolymerisation mit den Monomeren in der äußeren Phase und einem hohen Volumen der innneren Phase. Porengesamtvolumen größer als 90 %. Oberfläche (BET Porengrößenverteilung mittl. Porendurchmesser Porengesamtvolumen
    • Amberlite XE-305
  • Erhältlich von Rohm & Haas
  • Typ: makroporöse Polystyrolteilchen
  • Oberfläche (BET) 43,7 m /g
  • Porengrößenverteilung 30-200 nm
  • mittl. Porendurchmesser 55 nm
    • PG-2000- 120
  • Erhältlich von Sigma Chemical Co. Ltd.
  • Typ: Glasperlen geregelter Poren
  • Oberfläche 11,1 m²/g
  • mittl. Porendurchmesser 205,9 nm
    • Beispiel 1 i) Immobilisierung
  • 8 g EP 100 wurden zu 100 ml Ethänol zugefügt und heftig gerührt, um sicherzustellen, daß alles Pulver benetzt war. 60 ml überschüssiges Ethanol wurden dekantiert, und 200 ml 0, 1M Phosphatpuffer, pH 7,0, wurden zugefügt und gerührt, um vollstandiges Mischen zu gewährleisten. Der überschüssige Puffer wurde durch vorsichtiges Abnutschen auf einem Trichter aus gesintertem Glas entfernt. Das benetzte Pulver wurde dann zu 100 ml 0,1M Phosphat, pH 7,0, die 10,0 g 1,3 selektives Mucor miehei-Lipasepulver (erhältlich von Novo, Dänemark) enthielten, zugefügt und langsam gerührt. Die Adsorption der Lipase durch das Polymer wurde durch den Verlust an Lipaseaktivität aus der Lösung bestimmt. Nach 28 h hatte die Träger 93 % der Lipaseaktivität adsorbiert, was eine theoretische Beladung von 16 000 LU/g (Lipase-Units/g) ergab. Der Katalysator wurde abfiltriert, zweimal mit 200 ml 0,1M Phosphat, pH 57, 0, gewaschen und unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet.
    • ii) Gegenseitige Veresterung
  • 2,0 g Katalysator wurden in eine Säule von 15 mm Durchmesser zusammen mit 4 g nassem ID Silicagel (erhältlich von Crosfields, Vereinigtes Königreich), enthaltend 3,2 g Wasser, als eine Vorsäule, gepackt. Eine mit Wasser gesättigte Beschickung aus 1 Gew.-Teil Sonnenblumenöl mit hohem Oleatgehalt, 0,7 Gew.-Teilen Laurinsäure und 4 Gew.-Teilen Petrolether (BP 100-120") wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 25,0 ml/h durch die Säule gepumpt, und diese wurde durch Einsatz eines Wassermantels auf 50ºC gehalten. Die dem Triglycerid einverleibte Laurinsäuremenge wurde durch FAME/GC-Analyse ("Fatty Acid Methyl Ester/Gas Chromatography analysis") bestimmt.
  • Ein Kontrollversuch erfolgte unter ähnlichen Bedingungen, wobei ein Markenkatalysator "Lipozyme" (Novo) auf der Basis von Mucor miehei-Lipase auf einem (hydrophilen) Ionenaustauscherharz verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 verglichen, die die Triglyceridanalyse des Beschickungsöles und des Reaktionsproduktes angibt. Tabelle 1 Fettsäure in Triglyceriden Beschickungsöl Produkt EP100 Lipozyme
    • Beispiel 2
  • Beispiel 1 wurde zweimal unter Verwendung von EP100- bzw. EP400-Pulver als Katalysatorträger und mit einer unterschiedlichen Lipase wiederholt. Die Lipase war Rhizopus niveus (Amano N, erhältlich von Armano, Japan). Die Herstellung war wie in Beispiel 1 beschrieben, wobei jedoch theoretische Lipasebeladungen von 10 000 LU/g erhalten wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Fettsäure in Triglyceriden Beschickungsöl Produkt EP400
  • Aus Tabelle 1 wird klar, daß der Ersatz durch Laurinsäure mit einem hydrophoben Katalysatorträger erheblich größer ist, verglichen mit der Wirkung des hydrophilen Materials; und aus Tabelle 2 geht hervor, daß man auch mit anderen Trägern und einem anderen Enzym gute Ergebnisse erhält.
    • Beispiel 3 i) Trägerherstellung und Immobilisierung des Enzyms
  • 5 g Siliciumdioxidkügelchen S.980G wurden durch halbstündiges vorsichtiges Schütteln in 100 ml 1,1,1-Trichlorethan, das 10 g Dimethyldichlorsilan enthielt, hydrophobiert. Nach Filtrieren und zweimaligem Waschen mit 100 ml Trichlorethan wurden die Kügelchen unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur getrocknet. Die silanisierten Kügelchen wurden in 50 ml Ethanol vorsichtig geschüttelt, um ein vollständiges Benetzen sicherzustellen, und 100 ml 0,1M Natriumphosphatpuffer, pH 7, wurden unter vorsichtigem Schütteln zugefügt um ein vollständiges Mischen zu gewährleisten. Nach Dekantieren des überschüssigen Puffers wurden 50 ml wäßrige Lipaselösung (Mucor miehei bei 1000 LU/ml Aktivität zugefügt und 16 h mit den Kügelchen geschüttelt. Die Kügelchen wurden dann filtriert, zweimal mit einer Pufferlösung gewaschen und dann wie zuvor getrocknet.
    • ii) Gegenseitige Veresterung
  • Der erhaltene Katalysator wurde in dem in Beispiel 1 beschriebenen Umlagerungsverfahren unter Verwendung von 0,53 Teilen Laurinsäure und 0, 27 Teilen Myristinsäure pro Teil Sonnenblumenöl als Beschickung eingesetzt. Die Ergebnisse der Triglyceridanalyse erscheinen in Tabelle 3. Tabelle 3 Fettsäure in Triglyceriden Beschickungsöl Produkt 5980G
  • Die Ergebnisse von Tabelle 3 zeigen, daß ein ausgezeichneter Ersatz der ungesättigten Säuren im Sonnenblumenöl durch die Laurin- und Myristinsäuren unter dem Einfluß des Trägerenzyms stattfindet.
    • Beispiel 4 i) Herstellung eines porösen Trägers
  • Eine Wasser-in-Öl-Emulsion mit hoher innerer Phase wurde hergestellt, in der die Ölphase Styrol, Divinylbenzol und das grenzflächenaktive Mittel Span 80 (4,42, 0,44 bzw. 0,88 kg) umfaßte und die wäßrige Phase Wasser, Natriumpersulfat und Calciumchlorid (44,25, 0,097 bzw. 9,0 kg) enthielt. Span 80 ist Sorbitanmonooleat. Die Emulsion wurde nach ihrer Bildung 30 min einer Scherwirkung von 85 U/min unterzogen. Anschließend erfolgte die Polymerisation 40 h bei 60ºC. Das erhaltene Polymer wurde gemahlen, dann auf die gewunschte Teilchengröße gesiebt und zur Entfernung von Span 80 mit Isopropanol mittels Soxhletvorrichtung extrahiert und dann mit entionisiertem Wasser gewaschen und schließlich getrocknet. Die mikroskopische Untersuchung zeigte, daß das Polystyrolmaterial eine Porosität von 90 %, eine Zell(hohlraum)größe von mindestens 30 um, eine Größe der verbindenden Löcher von mindestens 10 uM und eine Teilchengröße von 1,0 bis 2,0 mm hatte.
    • ii) Immobilisierung
  • Das Polymer (2,0 g) wurde zu seinem völligen Benetzen in absolutes Ethanol (135 ml) gegeben. Überschüssiges Ethanol (120 ml) wurde dekantiert, und 0,1M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, (200 ml) wurde zugefügt und 2 h vorsichtig gerührt, um ein völliges Mischen sicherzustellen. Die überschüssige Lösung wurde dekantiert (195 ml), und eine weitere Puffermenge (200 ml) wurde zugesetzt und 10 min gerührt. Die überschüssige Lösung wurde erneut dekantiert (200 ml). Lipaselösung (100 ml) 0,1M Natriumphosphat pH 7, enthaltend 7,4 g der Lipase Rhizopus niveus (Amano), wurde zugefügt und vorsichtig gerührt. Die Lipaseadsorption wurde durch den Aktivitätsverlust aus der Lösung mittels Assay verfolgt. Nach 24 h hatte das Polymer 92,7 % der Lipaseaktivität adsorbiert, was eine theoretische Beladung von 9 270 LU/g Polymer ergab. Das Polymer wurde abfiltriert, zweimal mit Phosphatpuffer (200 ml) gewaschen und unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet.
    • iii) Gegenseitige Veresterung
  • Der obige Katalysator wurde wie folgt auf Aktivität der gegenseitigen Veresterung untersucht: Die Probe (100 mg) wurde in ein Reaktionsröhrchen gegeben, und eine 0,5 g Olivenöl, 0,129 g Myristinsäure und 10,0 ml Petrolether (Kp. 100-120ºC) enthaltende Lösung wurde zugefügt. Das Röhrchen wurde verschlossen und bei 40ºC in ein Wasserbad (mit Schüttler) gegeben. Nach 1 h wurden Proben entnommen, und die dem Triglycerid einverleibte Myristinsäuremenge wurde durch FAME/GC-Analyse bestimmt.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammen mit den Ergebnissee des Lipozyme- Katalysators (Mucor miehei-Lipase auf einem Ionenaustauscherharz, von Novo) gezeigt. Der Novo LU-Assay ist ein konventioneller Standardassay zur Bestimmung der Enzymaktivität. Tabelle 4 Katalysator gegenseitige Veresterung (% einverleeete Myristinsäure) Novo LU-Assay (umol/min/g) Polystyrol Lipozyme
    • Beispiel 5 i) Immobilisierung
  • Zu hydrophoben makroporösen Polystyrolteilchen 5693-93 (2,0 g) wurden 30 ml Ethanol unter Rühren zugefügt, um sicherzustellen, daß alle Polymerteilchen benetzt waren. Hierzu wurden 200 ml 0,1M Natriumphosphatpuffer (pH 7) unter Rühren zugefügt, um ein vollständiges Mischen zu gewährleisten Die überschüssige Lösung wurde abdekantiert, und eine weitere Menge von 200 ml Puffer, enthaltend 47,5 ml Mucor miehei-Lipaselösung (Lipozyme, Novo), wurde zugesetzt. Die Lösung wurde vorsichtig gerührt. Die Lipaseadsorption durch das poröse Polymer wurde durch den Aktivitätsverlust aus der Lösung verfolgt.
  • Nach 167 h hätte der Träger 68 % der Lipaseaktivität adsorbiert, was eine theoretische Beladung von 173 100 LU/g ergab. Der Katalysator wurde abfiltriert, zweimal mit 0, 1M Phosphatpuffer (200 ml) gewaschen und unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet.
    • ii) Gegenseitige Veresterung
  • Eine Mischung des Katalysators (0,25 g) und des gleichen Trägers (0,705 g) ohne Lipase wurde in eine Säule von 15 mm Durchmesser zusammen mit 4 g nassem ID Silicagel (Crosfields), enthaltend 3,2 g Wasser als Vorsäule, gepackt. Die mit Wasser gesättigte Beschickung, die 1 Gew.-Teil Sonnenblumenöl mit hohem Oleatgehalt, 0,7 Gew.-Teile Laurinsäure und 4 Gew.-Teile Petrolether (Kp. 100-120ºC) umfaßte, wurde durch die Säule gepumpt, die durch Verwendung eines Wassermantels auf 50ºC gehalten wurde. Die den Triglyceriden einverleibte Laurinsäuremenge wurde durch FAME/GC-Analyse bestimmt. Die Anfangsaktivität wurde aus der Fließgeschwindigkeit und dem Umwandlungsgrad berechnet und betrug, wie gefunden wurde, 8,5 g behändeltes Triglycerid/h/g Katalysator (diese Berechnung wird am Ende dieser Beschreibung erläutert).
    • Beispiel 6 i) Immobilisierung
  • Zu hydrophoben makroporösen Polystyrolteilchen 78-7300 (2,0 g) wurden 35 ml Ethanol unter Rühren zugefügt, um sicherzustellen, daß alle Polymerteilchen benetzt waren. Hierzu wurden 200 ml 0,1M Natriumphosphatpuffer (pH 7) unter Rühren zur Gewährleistung eines völligen Mischens zugefügt. Die überschüssige Lösung wurde abdekantiert, und eine weitere Menge von 200 ml Puffer, enthaltend 20 ml Mucor miehei-Lipaselösung (Lipozyme, Novo), wurde zugefügt. Die Lösung wurde vorsichtig gerührt. Die Lipaseadsorption durch das poröse Polymer wurde durch den Aktivitätsverlust aus der Lösung verfolgt. Nach 47,5 h hatte der Träger 85 % der Lipaseaktivität adsorbiert, was eine theoretische Beladung von 92 600 LU/g ergab. Der Katalysator wurde abfiltriert, zweimal mit 0,1M Phosphatpuffer (200 ml) gewaschen und unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet.
    • ii) Gegenseitige Veresterung
  • Eine Mischung des Katalysators (0,25 g) und des gleichen Trägers (0,69 g) ohne Lipase wurde in eine Säule von 15 mm Durchmesser zusammen mit 4 g nassem ID Silicagel (Crosfields), enthaltend 3,2 g Wasser als Vorsäule, gepackt. Die mit Wasser gesättigte Beschickung, die 1 Gew.-Teil Sonnenblumenöl mit hohem Oleatgehält, 0,7 Gew.-Teile Laurinsäure und 4 Gew.-Teile Petrolether (Kp. 100-120ºC) umfaßte, wurde durch die Säule gepumpt, die durch Verwendung eines Wasseimantels auf 50ºC gehalten wurde. Die den Triglyceriden einverleibte Laurinsäuremenge wurde durch FAME/GC-Analyse bestimmt. Die Anfangsaktivität wurde auf Fließgeschwindigkeit und Umwandlungsgrad normalisiert und betrug, wie gefunden wurde, 7,5 g behandeltes Triglycerid/h/g Katalysator.
    • Beispiel 7 i) Immobilisierung
  • Zu hydrophoben makroporösen Polypropylenteilchen EP-100 (2,0 g) wurden 20 ml Ethanol unter Rühren zugefügt, um sicherzustellen, daß alle Polymerteilchen benetzt waren. Hierzu wurden 200 ml 0,1M Natriumphosphätpuffer (pH 7) unter Rühren zur Gewärleistung des völligen Mischens zugefügt. Die überschüssige Lösung wurde abdekantiert, und eine weitere Menge von 500 ml Puffer, die Mucor miehei-Lipaselösung enthielt (Lipozyme, Novo), wurde zugefügt, und die Lösung wurde vorsichtig gerührt. Die Lipaseadsorption durch das poröse Polymer wurde durch den Aktivitätsverlust aus der Lösung verfolgt. Die zugefügte Enzymmenge und die erzielten theoretischen Beladungen sind in der Tabelle 5 unten angegeben.
  • Der Katalysator wurde abfiltriert, zweimal mit 0,1M Phosphätpuffer (200 ml) gewaschen und unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet.
    • ii) Gegenseitige Veresterung
  • Eine Mischung des Katalysators und dem gleichen Trägers ohne Lipase (in unterschiedlichen Verhaltnissen, was von der Aktivität des Enzyms auf dem Träger abhangt - vgl. Tabelle 5) wurde in eine Säule von 15 mm Durchmesser zusammen mit 4 g nassem ID Silicagel (Crosfields), enthaltend 3,2 g Wasser als Vorsäule, gepackt. Eine mit Wasser gesättigte Beschickung von 1 Gew.- Teil Sonnenblumenöl mit hohem Oleatgehalt, 0,7 Gew.-Teilen Laurinsäure und 4 Gew.-Teilen Petrolether (Kp. 100-120ºC) wurde durch die Säule gepumpt, die durch Verwendung eines Wassermantels auf 50ºC gehalten wurde. Die den Triglyceriden einverleibte Laurinsäuremenge wurde durch FAME/GC-Analyse bestimmt. Die Anfangsaktivität wurde auf Fließgeschwindigkeit und Umwandlungsgrad normalisiert.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 unten (unter A) angegeben.
    • iii) Veresterung
  • Der Katalyator (50 g) wurde in ein Röhrchen gegeben, und eine mit Wasser gesättigte Mischung von Ölsäure (5,88 g, 92 %, von BDH, UK) und Octan-1-ol (2,70 g, GPR, von BDH) wurde zugefügt. Das Röhrchen wurde verschlossen und in ein Wasserbad von 50ºC gegeben und mit ständigem Schütteln (200 Schläge/min) 1 h darin belassen. Eine Probe (0, 20 ml) wurde entnommen und sofort eine kleine Aluminiumoxidsäule hinunter (basisch, Aktivität 2) mit Diethylether zusammen mit einer Lösung (0,20 ml) von Petrolether (Kp. 60- 80ºC), enthaltend Methylstearat (5 mg) als inneren Standard, eluiert. Dann wurde der Diethylether abgedampft und durch Petrolether (Kp. 60-80ºC, 6 ml) ersetzt. Das Verhälthis von Octyloleat zu Methylstearat wurde dann durch Gas/Flüssigkeits-Chromatographie bestimmt. Aus diesem Verhältnis wurde die Geschwindigkeit der Esterbildung berechnet; die Ergebnisse sind in Tabelle 5 (unter B) angegeben. Tabelle 5 Lipaselösung Aktivität theoret. Beladung A = Veresterungsaktivität, g Triglycerid/h/g Katalysator B = Veresterungsaktivität, Mikromol Ester/h/mg Katalysator
    • Beispiel 8 i) Immobilisierung
  • Zu hydrophoben makroperösen Polymerteilchen von Amberlite XE-305 (2,0 g) wurden 20 ml Etnanol unter Rühren zugefügt, um sicherzustellen, daß alle Polymerteilchen benetzt waren. Hierzu wurden 200 ml 0,1M Natriumphosphatpuffer (pH 7) unter Rühren zur Gewährleistung des völligen Mischens zugefügt. Die überschüssige Lösung wurde abdekantiert, und ein weiteres Aliquot von 100 ml Puffer, enthaltend 5,5 ml Mucor miehei-Lipaselösung (Lipozyme, Novo), wurde zugefügt, und die Lösung wurde vorsichtig gerührt. Die Lipaseadsorption durch das poröse Polymer wurde durch den Aktivitätsverlust aus der Lösung verfolgt. Nach 2 h hatte der Träger 75,7 % der Lipaseaktivität adsorbiert, was eine theoretische Beladung von 21 600 LU/g ergab. Der Katalysator wurde abfiltriert, zweimal mit 0,1M Phosphatpuffer (200 ml) gewachen und unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet.
    • ii) Gegenseitige Veresterung
  • Eine Mischung des Katalysators (1,0 g) und des gleichen Trägers (1,0 g) ohne Lipase wurde in eine Säule von 15 mm Durchmesser zusammen mit 4 g nassem ID Silicagel (Crosfields), enthaltend 3,2 g Wasser als Vorsäule, gepackt. Die mit Wasser gesättigte Beschickung, die 1 Gew.-Teil Sonnenblumenöl mit hohem Oleatgehalt, 0, 7 Gew.-Teile Laurinsäure und 4 Gew.- Teile Petrolether (Kp. 100-120ºC) enthielt, wurde durch die Säule gepumpt, die durch Verwendung eines Wassermantels auf 50ºC gehalten wurde. Die den Triglyceriden einverleibte Laurinsäuremenge wurde durch FAME/GC-Analyse bestimmt. Die Anfangsaktivität wurde auf Fließgeschwindigkeit und Umwandlungsgrad normalisiert und betrug, wie gefunden wurde, 2, 0 g behandeltes Triglycerid/h/g Katalysator.
    • Beispiel 9 i) Immobilisierung
  • Zu hydrophoben makroporösen Polymerteilchen EP-100 (2,0 g) wurden 20 ml Ethanol wurde Rühren zugefügt, um sicherzustellen, daß alle Polymerteilchen benetzt waren. Hierzu wurden 200 ml 0,1M Natriumphosphatpuffer (pH 7) unter Rühren zur Gewährleistung des völligen Mischens zugefügt. Die überschüssige Lösung wurde abdekantiert, und eine weitere Menge von 200 ml Puffer, enthaltend 37,0 g Rhizopus niveus-Lipaselösung (Lipage N, Amano), wurde zugefügt. Die Lösung wurde vorsichtig gerührt. Die Lipaseadsorption durch das poröse Polymer wurde durch den Aktivitätsverlust aus der Lösung verfolgt. Nach 22 h hatte der Träger 90 % der Lipaseaktivität adsorbiert, was eine theoretische Beladung von 38 400 LU/g ergab. Der Katalysator wurde abfiltriert, zweimal mit 0,1M Phosphatpuffer (200 ml) gewachen und unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet.
    • ii) Gegenseitige Veresterung
  • Eine Mischung des Katalysators (0,25 g) und des gleichen Trägers (0,36 g) ohne Lipase wurde in eine Säule von 15 mm Durchmesser zusammen mit 4 g nassem ID Silicagel (Crosfields), enthaltend 3,2 g Wasser, als Vorsäule, gepackt. Die mit Wasser gesättigte Beschickung, die 1 Gew.-Teil Sonnenblumenöl mit hohem Oleatgehalt, 0,7 Gew.-Teile Laurinsäure und 4 Gew.- Teile Petrolether (Kp. 100-120ºC) enthielt, wurde durch die Säule gepumpt, die durch Verwendung eines Wassermantels auf 50ºC gehalten wurde. Die den Triglyceriden einverleibte Laurinsäuremenge wurde durch FAME/GC-Analyse bestimmt. Die Anfangsaktivität wurde auf Fließgeschwindigkeit und Umwandlungsgrad normalisiert und betrug, wie gefunden wurde, 35,0 g behendeltes Triglycerid/h/g Katalysator.
    • Beispiel 10 i) Immobilisierung
  • Zu hydrophoben makroporösen Polymerteilchen EP-100 (2, 0 g) wurden 20 ml Ethenol unter Rühren zugefügt, um sicherzustellen, daß alle Polymerteilchen benetzt waren. Hierzu wurden 200 ml 0,1M Natriumphosphatpuffer (pH 7) unter Rühren zur Gewährleistung des völligen Mischens zugefügt. Die überschüssige Lösung wurde abdekantiert, und ein weiteres Aliquot von 200 ml Puffer, enthaltend 2 ml Humicola sp.-Lipaselösung (SP398/PPW2542, Novo), wurde zugefügt. Die Lösung wurde vorsichtig gerührt. Die Lipaseadsorption durch das poröse Polymer wurde durch den Aktivitätsverlust aus der Lösung verfolgt. Nach 2 h hatte der Träger 97 % der Lipaseaktivität adsorbiert, was eine theoretische Beladung von 61 700 LU/g ergab. Der Katalysator wurde abfiltriert, zweimal mit 0,1M Phosphatpuffer (200 ml) gewaschen und unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet.
    • ii) Gegenseitige Veresterung
  • Eine Mischung des Katalysators (0,5 g) und des gleichen Trägers (0,465 g) ohne Lipase wurde in eine Säule von 15 mm Durchmesser als Vorsäule gepackt. Die mit Wasser gesättigte Beschickung, die 1 Gew.-Teil Sonnenblumenöl mit hohem Oleatgehalt, 0,7 Gew.-Teile Laurinsäure und 4 Gew.- Teile Petrolether (Kp. 100-120ºC) enthielt, wurde durch die Säule gepumpt, die durch Verwendung eines Wassermantels auf 50ºC gehalten wurde. Die den Triglyceriden einverleibte Laurinsäuremenge wurde durch FAME/GC-Analyse bestimmt. Die Anfangsaktivität wurde auf Fließgeschwindigkeit und Umwandlungsgrad normalisiert und betrug, wie gefunden wurde, 5,8 g behandeltes Triglycerid/h/g Katalysator.
    • iii) Veresterung
  • Der gleiche Katalysator (50 mg) wurde in ein Röhrchen gegeben, und eine mit Wasser gesättigte Mischung von Ölsäure (5,88 g, 92 %ig, BDH) und Octan-1-ol (2,70 g, GPR, BDH) wurde zugefügt. Das Röhrchen wurde verschlossen und in ein Wasserbad von 50ºC gegeben und mit ständigem Schütteln (200 Schläge/min) 1 h darin belassen. Eine Probe (0,20 ml) wurde entnommen und mit Diethylether zusammen mit einer Lösung (0, 20 ml) von Petrolether (Kp. 60-80ºC), die Methylstearat (5 mg) als inneren Standard enthielt, sofort eine kleine Aluminiumoxidsäule (basisch, Aktivität 2) hinab eluiert. Dann wurde der Diethylether abgedampft und durch Petrolether (Kp. 60-80ºC, 6 ml) ersetzt. Das Verhältnis von Octyloleat zu Methylstearat wurde dann durch Gas/Flüssigkeits-Chromatographie bestimmt. Aus diesem Verhältnis wurde die Geschwindigkeit der Esterbildung berechnet; sie betrug, wie gefunden wurde, 20 Mikromol/h/mg Katalysator.
    • Beispiel 11 i) Silanisierung
  • Glasperlen geregelter Poren PG-2000-120 (3,0 g) wurden 15 min in einem Ofen bei 105ºC getrocknet. Nach dem Abkühlen wurde eine Lösung von Dimethyldichlorsilan (6,7 ml) in 1,1,1-Trichlorethnn (27 ml) zugefügt, und die Perlen wurden gerührt. Nach 1,25 h wurden die Perlen abfiltriert, mit 1,1,1-Trichlorethän gewaschen und unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet.
    • ii) Immobilisierung
  • Man ließ die silanisierten Perlen (3,0 g) 16 h in Ethanol (100 ml) stehen, um sicherzustellen, daß der Träger benetzt war. Ein Aliquot (50 ml) Ethanol wurde entnommen und durch 0,1 M Natriumpshophatpuffer (50 ml ) bei pH 7 ersetzt. Nach einigen Minuten Rühren wurde ein Aliquot (50 ml) der Puffer/Ethanol-Lösung entnommen, und ein weiteres Aliquot (50 ml) Phosphatpufferlösung wurde zugefügt. Es wurde einige Minuten weitergerührt, bevor das überschüssige Gas in den Poren des Trägers durch Anlegen eines Vakuums auf die Flüssigkeitsoberfläche entfernt wurde. Dann wurde ein abschließendes Aliquot (50 ml) der Puffer/Ethanol-Lösung entnommen, gefolgt von der Zugabe eines weiteren Aliquots (250 ml) der Pufferlösung, die Mucor miehei-Lipaselösung enthielt, (3,5 ml) (Lipozyme, Novo). Die Lösung wurde vorsichtig gerührt. Die Lipaseadsorption durch die porösen Glasperlen wurde durch den Aktivitätsverlust aus der Lösung verfolgt. Nach 25,75 h hatten die Perlen 91,7 % der Lipaseaktivität adsorbiert, was eine theoretische Enzymbeladung von 11 774 LU/g ergab. Der Katalysator wurde abfiltriert, mit einem Aliquot (400 ml) 0,1M Phosphatpufferlösung gewaschen und dann unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet.
    • iii) Gegenseitige Veresterung
  • Der Katalysator (3,0 g) wurde in eine Säule von 15 mm Durchmesser zusammen mit 4 g nassem ID Silicagel (Crosfields), enthaltend 3,0 g Wasser als Vorsäule, gepackt. Die mit Wasser gesättigte Beschickung, die 1 Gew.-Teil Sonnenblumenöl mit hohem Oleatgehalt, 0,7 Gew.-Teile Laurinsäure und 4 Gew.-Teile Petrolether (Kp. 100-120ºC) enthielt, wurde durch die Säule gepumpt, die durch Verwendung eines Wassermantels auf 50ºC gehalten wurde. Die den Triglyceriden einverleibte Laurinsäuremenge wurde durch FAME/GC- Analyse bestimmt. Die Anfangsaktivität wurde auf Fließgeschwindigkeit und Umwandlungsgrad normalisiert und betrug, wie gefunden wurde, 1,3 g behandeltes Triglycerid/h/g Katalysator.
  • Aktivitätsberechnung (in den Beispielen 5 bis 11 angewendet): Aktivität= -1n(1-DC) x Fließgeschwindigkeit/Katalysatorgewicht (g)
  • Fließgeschwindigkeit = g Triglycerid/h durch die Säule
  • Umwandlungsgrad (DC) = % Einverleibung von Laurin - % Anfangsgehalt/% Gleichgewichtsgehalt - % Anfangsgehalt
  • In dieser Arbeit ist der Laurinanfangsgehält = 0
  • der Gleichgewichtsgehalt = 31,3 %.

Claims (6)

1. Verfahren zur Herstellung von Fettsäureestern oder zur Umlagerung von Fetten und pflanzlichen Ölen, wonach die Fettsäure- und Alkoholreste liefernden Reaktanten in einer im wesentlichen nichtwäßrigen homogenen flüssigen Phase, die maximal 1 Gew.-% Wasser enthält, in Gegenwart eines Lipaseträgerkatalysators umgesetzt werden, der durch physikalisches Binden der Lipase durch Adsorption an den Träger erhalten ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger für den Lipasekatalysator aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 1) Polyalkylenen, ausgewählt aus der aus Homo- oder Copolymeren von Ethylen, Styrol, Butadien oder Isopren und Homopolymeren von Propylen bestehenden Gruppe, und 2) anorganischen porösen Materialien, deren Oberflächen zwecks Hydrophobierung behandelt worden sind, besteht, und das Trägermaterial eine durchschnittliche Porengröße von 0,05 bis 5 um hat.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wonach die Reaktanten Glyceridester umfassen.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wonach die Glyceridester mindestens einen eines Fettes und eines Öles umfassen.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wonach die Reaktanten mindestens eine freie Fettsäure oder mindestens einen Alkylester einer freien Fettsäure umfassen.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wonach das poröse polymere Material ein Porengesamtvolumen von mindestens 90 % aufweist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, wonach das Trägermaterial Siliciumdioxid oder Glas mit einer Oberfläche aus einem hydrophoben organischen Siliciumdioxidpolymer umfaßt, erhalten nach Behandlung des Trägers mit einem Silan.
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