DK171799B1

DK171799B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af fedtsyreestere eller til omlejring af fedtstoffer og vegetabilske olier

Info

Publication number: DK171799B1
Application number: DK714888A
Authority: DK
Inventors: Alasdair Robin Macrae; John Anthony Bosley; Alan David Peilow
Original assignee: Unilever Nv
Priority date: 1987-12-22
Filing date: 1988-12-21
Publication date: 1997-06-02
Also published as: DK714888D0; JPH02138986A; EP0322213A3; CA1333370C; JPH0458958B2; GB8729890D0; DE3889088T2; DE3889088D1; AU614563B2; ZA889591B; ATE104354T1; AU2703488A; EP0322213B1; EP0322213A2; ES2050715T3; DK714888A

Description

i DK 171799 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af fedtsyreestere eller til omlejring af fedtstoffer og vegetabilske olier, ved hvilken fremgangsmåde reaktanter, som giver fedtsyre- og alkoholradikaler, omsættes 5 i en praktisk talt ikke-vandig, homogen, flydende fase indeholdende maksimalt 1 vægt% vand i nærværelse af en båret lipasekatalysator, som er opnået, ved at lipasen ved adsorption er fysisk bundet til bærermaterialet,

Ved omlejringen af fedtstoffer og vegetabilske olier 10 omlejres deres fedtsyrebestanddele i større eller mindre grad på triglyceriderne, som fedtstofferne og olierne overvejende er sammensat af, efter den katalysator, der vælges til reaktionen. Under indvirkning af alkalimetaller eller hydroxider og alkoxider deraf er omlejringen altid tilfældig.

15 Ved en nyudviklet fremgangsmåde beskrevet i US-A-4275081, ved hvilken der anvendes lipasekatalysatorer, kan amlejringen være tilfældig eller selektiv efter den lipase, der vælges, og yderligere fedtsyreradikaler, der er til stede som fri syre eller alkylestere i reaktantsammensætningerne, kan 20 deltage. Som beskrevet her og i andre referencer er enzymet fortrinsvis fikseret på et indifferent bærermateriale, som kan være uorganisk og/eller organisk, og reaktionen kan gennemføres batchvis eller kontinuerligt i nærvær eller fravær af opløsningsmidler for reaktanten og ved temperaturer 25 og andre betingelser, ved hvilke reaktanterne er i flydende, homogen, vandublandbar fase, og katalysatoren er aktiv.

Medens omlejringsprocesser under indvirkning af al-kalimetalkatalysatorer skal gennemføres under absolut vandudelukkelse for at undgå sidereaktion med produktion af 30 sæbe og tab af katalytisk aktivitet, kræver enzymkatalysatorer en lille smule vand til aktivering under reaktionen.

Den tilstrækkelige mængde vand kan tilvejebringes i føde-materialet ved kontinuerlige reaktioner, hvor enzymet er fikseret på en katalysatorbærer i et leje, hvorigennem føde-35 materialet passerer, idet mængden af vand sædvanligvis er mindre end 1 vægt% og endog kan være så lille som 0,1 vægt% 2 DK 171799 B1 baseret på fødematerialet. I nærværelse af væsentligt større mængder vand end denne forbliver katalysatoren aktiv, men reaktionen giver hydrolyseprodukter med tab af triglycerider.

På den anden side resulterer forsøg på at formindske mængden 5 af tilstedeværende vand i en sænkning af katalysatoraktivitet.

Tilsvarende betragtninger med hensyn til de tilladte, begrænsede mængder vand gælder ved forestringsreaktioner, der udføres under indvirkning af lipaseenzymer som kataly-10 sator (inklusive alkoholysereaktioner) , hvor alkoholradikalet fra en ester - som naturligvis kan være en glyceridester, såsom et triglycerid - erstattes af et alkoholradikal fra en anden alkohol. Det gælder både for disse reaktioner og for omlejringsprocesserne, at det er nødvendigt, at det 15 tilstedeværende vand forekommer i meget små mængder i reaktionssystemet for at undgå, at der produceres uønskede hydrolyseprodukter.

Ved beskrevne omlejringsprocesser og beslægtede processer, som gennemføres i nærværelse af meget begrænsede 20 mængder vand under indvirkning af et båret lipaseenzym som katalysator, er enzymet afsat på bærermateriale, som giver et stort overfladeareal, og som kan være uorganisk, f.eks. siliciumdioxid og derivater deraf, inklusive især "Celite®" (varemærke for diatoméjord), eller organisk, f.eks. ionbyt-25 terharpikser med en makronetstruktur, i hvis porer enzymet kan huses. Hidtil er bindingen af enzymet til bærermaterialet ved disse reaktioner sket fysisk ved udfældning af enzymet på en hydrofil bæreroverflade eller som beskrevet i EP-A-147914 ved anvendelse af en organometallisk koblingsforbin-30 delse til binding af enzymet kemisk til bæreren under dannelse af et hydrofobt miljø eller ved ionbinding til ionbyt-termateriale som beskrevet i EP-A-140542. Ionbinding af enzymer til modificeret polystyrenpolymer er beskrevet i US-A-4551482. Præparering af en polymeroverflade, som ind-35 ledningsvis er hydrofob, ved gennemvædning i en fortyndet 3 DK 171799 B1 opløsning af et langkædet, kationisk, overfladeaktivt middel inden enzymimmobilisering er beskrevet i US-A-4539294.

Den foreliggende opfindelse har til formål at tilvejebringe en forbedret fremgangsmåde til fremstilling af 5 fedtsyreestere eller til omlejring af fedtstoffer og vegetabilske olier.

Dette formål er opnået med den her omhandlede fremgangsmåde, som er af den indledningsvis angivne art, og som er ejendommelig ved, at bæreren for lipasen er udvalgt fra 10 den gruppe, som består af 1) polyalkylener udvalgt fra den gruppe, som består af homo- eller copolymere af ethylen, styren, butadien eller isopren og homopolymerer af propylen, og 2) uorganiske, porøse materialer, hvis overflader er blevet behandlet således, at de er gjort hydrofobe, hvorhos 15 bærermaterialet har en gennemsnitlig porestørrelse fra 0,05 til 5 μιη.

Den her omhandlede reaktion sker i en praktisk talt ikke-vandig fase, men det er imidlertid nødvendigt med noget vand i forbindelse med enzymet. Denne mængde vand er næsten 20 umåleligt lille. F.eks. er mætning af den ikke-vandige fase med vand tilstrækkelig, og en mætning på 50% eller mere kan også være tilstrækkelig. Der er ikke nogen vandig fase til stede.

Bærermaterialet skal være porøst, og dette kan opnås 25 ved anvendelse af opblæringsmidler under polymerisation.

Der kan også anvendes uorganiske, porøse materialer, f.eks. glas og ildfast materiale, f.eks. siliciumdioxid, hvis overflade er gjort hydrofob ved f.eks. behandling med silan.

For at opnå en god immobilisering af enzymet er den gen-30 nemsnitlige porestørrelse i bærermaterialet fra 0,05 til 5 Mm. Ved gennemsnitlig porestørrelse menes den gennemsnitlige porediameter som målt ved gængse kviksø lvporøsimetritek-nikker. Partikelstørrelsen af egnet materiale er fortrinsvis 0,01 til 5 mm, især 0,1 til 1,5 mm, for polyolefiner og 0,5 35 til 3 mm for ildfaste materialer, såsom siliciumdioxid.

4 DK 171799 B1

Enzymer båret på hydrofobt materiale er beskrevet i US-A-4629742, hvor de anvendes til hydrolyse af fedtstoffer. Særligt anvendelige syntetiske polymerer ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er polystyrener, f.eks. fremstillet 5 ved højinderfaseemulsionsteknikken beskrevet i EP-A-60138.

I EP-A-195311 er der beskrevet en fremgangsmåde, ved hvilken sterolestere eller specifikke, aliphatiske alkoholestere kan fremstilles ved en enzymatisk proces. Enzymmaterialet er anbragt på en bærer.

10 Den i ovennævnte system anvendte mængde vand er imid lertid betragtelig.

Enzymet på bærer kan fremstilles ved fire metoder, herunder en adsorptionsmetode. Det er imidlertid angivet, at adsorptionsmetoden kun kan anvendes på hydrofile bærere, 15 som er blevet modificeret, såsom modificerede polysacchari-der.

Det er ligeledes nævnt, at uorganiske bærere kan anvendes ved adsorptionsmetoden. Alle de omtalte, uorganiske materialer er imidlertid hydrofile materialer. Det har vist 20 sig, at disse bærermaterialer er uegnede til den foreliggende opfindelses formål.

Bærermaterialet udgøres derfor fortrinsvis af et porøst, polymert materiale med et samlet porevolumen på mindst 50% og indeholdende et stort antal hulrum, der er ind-25 byrdes forbundet via huller, hvilke hulrum har en gennemsnitlig diameter på 1 til 150 μτα. Det samlede porevolumen er fortrinsvis mindst 75%, f.eks. 90% eller derover.

Yderligere detaljer om egnede porøse materialer til brug ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan findes i den 30 ovenfor anførte EP-A-60138 og deuden i EP-A-105634, EP-A-156541, EP-A-157504, GB-A-2155481, EP-A-200528, EP-A-223574, EP-A—239360, EP-A-240342, EP-A-264268, EP-A-289238, EP-A- 288310 og EP-patentansøgning nr. 88306447.9.

Disse offentliggørelsesskrifter beskriver alle et 35 porøst materiale, som opfylder de ifølge opfindelsen stillede porøsitetskrav. I alle tilfælde kan materialet fremstilles 5 DK 171799 B1 ved polymerisering af udgangsmaterialer i form af en højin-derfaseemulsion, som enten kan være en vand-i-olieemulsion, en olie-i-vandemulsion eller en emulsion dannet mellem to vilkårlige opløsninger, der er tilstrækkeligt ublandbare.

5 Ved "vand" menes vandbaseret, og ved "olie" menes ublandbar med vandige systemer. De materialer, der er beskrevet i de forskellige skrifter, afviger sig i deres udgangsmaterialer og/eller slutegenskaber.

JP-offentliggørelsesskrift J84091883 beskriver frem-10 stillingen af enzymer på bærere, ved hvilken fremgangsmåde en enzymopløsning bringes i kontakt med styren eller meth-acrylsyreestere. styrenpolymerer er foreslået som enzymbæ-rermateriale i SU-offentliggørelsesskrift SU-804647. Hoq et al. (JAOCS 61, (4) april 1984, side 776-781) beskriver gly-15 ceridsyntese under indvirkning af en katalysator, der er lipase immobiliseret på et hydrofobt, porøst bærermateriale, f.eks. polypropylen, i en heterogen reaktionsmasse, som udgøres af ublandbare, vandige og ikke-vandige faser.

Eksempler på andre bærere, som kan anvendes ved frem-20 gangsmåden ifølge opfindelsen, er uorganiske, ildfaste materialer, f.eks. siliciumdioxid eller glas. Sådanne materialer skal være behandlet, således at deres overflade er gjort hydrofob, f.eks. ved behandling med en hydrofob, organisk siliciumdioxidpolymerbelægning.

25 Eksempler på anvendelige enzymer til brug ifølge opfindelsen er lipaser fra lipasearter af slægterne Mucor, Aspergillus, Rhizopus, Pseudomonas, Candida, Humicola, Thermomyces og Penicillium.

Reaktanterne, som anvendes ved fremgangsmåden ifølge 30 opfindelsen til tilvejebringelse af fedtsyre- og alkoholradikaler, er fortrinsvis glyceridestere, f.eks. mindst ét fedtstof og/eller en olie.

Der foretrækkes et reaktantsystem, som indeholder glyceridestere sammen med mindst én fri fedtsyre eller en al-35 kylester deraf.

6 DK 171799 B1

De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

I eksemplerne er der anvendt forskellige bærere for lipaserne. Disse kan karakteriseres som følger: 5 ttEP-100*>. ,lEP-40011.

Leverandør: Enka, Holland.

Type: makroporøse partikler af polypropylen ("ΕΡ-100», »EP-400») med store celler (hulrum), som er indbyrdes forbundet via huller.

10 Varemærke: »Accurel®».

"EP-IOO” »EP-400«

Partikelstørrelse (mm) 0,2-0,4 0,2-0,4

Porevolumen (ml/g) 3,2 0,6 15 Overfladeareal (m2/g) 92 2

Bulkdensitet (g/ml) 0,15 0,20

Gennemsnitlig porediameter (nm) 139 1207

Cellestørrelse (/xm) 0,5-5,0 1,0-5,0 20 Hulstørrelse (μτπ) 0,05-0,5 0,1-0,5

Hulrumsvolumen (%) 75 75 »S.980G11

Leverandør: Shell.

25 Type: porøse, kugleformede siliciumdioxidpartikler.

Partikelstørrelse 1,5 mm

Porevolumen 1,2 ml/g

Overfladeareal 63 m2/g 30 Bulkdesitet 0,4 g/ml

Gennemsnitlig porediameter 60 nm »5693-93». »78-7300»

Leverandør: National Starch & Chemical Ltd., England.

35 Type: Makroporøse polystyrenpartikler med store celler (hulrum) indbyrdes forbundet via huller frem- 7 DK 171799 B1 stillet ved emulsionspolymerisation med monomererne i yder fasen og et højt inderfasevolumen.

Det samlede porevolumen er mere end 90%.

5 "5693-93" "78-7300"

Overfladeareal (BET) 11,3 m2/g 6,3 m2/g

Porestørrelsesfordeling 500-7000 nm 1000-6000 nm

Gennemsnitlig porediameter 1686 nm 3360 nm

Samlet porevolumen 4,7 ml/g 5,1 ml/g 10 "Amberiite® XE-305"

Leverandør: Rohm & Haas.

Type: makroporøse polystyrenpartikler.

15 Overfladeareal (BET) 43,7 m2/g

Porestørrelsesfordeling 30-200 nm

Gennemsnitlig porediameter 55 nm "PG-2000-120" 20 Leverandør: Sigma Chemical Co. Ltd.

Type: glaskugler med kontrolleret porestørrelse. Overfladeareal 11,1 m2/g

Gennemsnitlig porediameter 205,9 nm.

25 Eksempel 1 i) Immobilisering.

8 g "EP-100" sættes til 100 ml ethanol og omrøres kraftigt for at sikre, at alt pulver befugtes. 60 ml over-skudsethanol afdekanteres, og der tilsættes 200 ml 0,1 M

30 phosphatpuffer, pH-værdi 7,0, og der omrøres for at sikre en fuldstændig sammenblanding. Overskudspuffer fjernes ved let sugning på en sintret glastragt. Det befugtede pulver sættes derpå til 100 ml 0,1 M phosphat, pH-værdi 7,0, som indeholder 10,0 g 1,3-selektivt Mucor miehei lipasepulver (leverandør: 35 Novo, Danmark) og omrøres langsomt. Polymerens lipaseadsorp-tion bedømmes ved tab af lipaseaktivitet i opløsningen. Efter 28 timer har bæreren adsorberet 93% af lipaseaktivi- DK 171799 B1 s teten, hvilket giver en teoretisk fyldning på 16000 LE/g (lipaseenheder/g). Katalysatoren fjernes ved filtrering, vaskes to gange med 200 ml 0,1 M phosphat med en pH-værdi på 7,0 og tørres under vakuum ved stuetemperatur.

5 ii) Interesterificering.

2,0 g katalysator pakkes som en forsøgle i en søjle med en diameter på 15 mm sammen med 4 g fugtigt "ID"-sili-cagel (leverandør: Crosfields, England), som indeholder 3,2 g vand. Fødemateriale, der er mættet med vand, og som in-10 deholder 1 vægtdel solsikkeolie med stort oleatindhold, 0,7 vægtdele laurinsyre og 4 vægtdele petroleumsether (kogepunkt 100 til 120*C), pumpes gennem søjlen med en gennemstrømningshastighed på 25,0 ml/time, og søjlen holdes ved 50*C ved anvendelse af en vandkappe. Laurinsyremængden, der er ind-15 arbejdet i triglyceridet, bestemmes ved fedtsyremethylester-gas/chromatografianalyse.

Der udføres et kontrolforsøg under lignende betingelser ved anvendelse af en kommerciel katalysator "Lipozyme®" (Novo) baseret på Mucor miehei lipase på en ionbytterharpiks 20 (hydrofil). Resultaterne er sammenlignet i tabel I, som giver triglyceridanalysen af fødeolien samt reaktionsproduktet.

Tabel I

25 Fedtsyre i Fødeolie Produkt triglycerider "EP-IOO" "Lipozyme®" CIO:0 0,0 0,0 0,3 C12:0 0,0 26,2 17,2 30 C14:0 0,0 0,0 0,6 C16:0 3,7 1,6 2,6 C18:0 4,7 2,2 3,6 C18:1 84,9 65,5 69,3 C18:2 6,3 4,5 6,0 35 C20:0 0,4 0,0 0,4 9 DK 171799 B1

Eksempel 2

Eksempel 1 gentages tre gange ved anvendelse af pulvere af henholdsvis "EP-100" og "EP-400" som katalysatorbærere og med en anden lipase. Den anvendte lipase er 5 Rhizopus niveus ("Amano® N" leveret fra Armåno, Japan). Fremstillingen sker på samme måde som beskrevet i eksempel 1, idet der dog fås teoretiske lipasefyldninger på 10.000 LE/g. Resultaterne fremgår af tabel II.

10 Tabel II

Fedtsyre i Fødeolie Produkt triglycerider "EP-100" "EP-400" C10:0 0,0 0,0 0,0 15 C12:0 0,0 28,5 29,0 C14:0 0,0 0,9 0,5 C16:0 3,7 1,6 1,6 C18:0 4,7 2,2 2,0 C18:1 84,9 62,3 61,6 20 C18:2 6,3 4,5 '4,4 C20:0 0,4 0,0 0,0

Af tabel I ses det klart, at udskiftning med laurinsyre er væsentlig større ved den hydrofobe katalysatorbærer 25 sammenlignet med virkningen af det hydrofile materiale, og af tabel II ses det, at der også opnås gode resultater med andre bærere og et andet enzym.

Eksempel 3 30 i) Bærerfremstilling og immobilisering af enzym.

5 g siliciumdioxidkugler "S.980G" gøres hydrofobe ved 1/2 times forsigtig omrystning i 100 ml 1,1,1-trichlor-ethan, som indeholder lo g dimethyldichlorsilan. Efter filtrering og vaskning to gange med 100 ml trichlorethan tørres 35 kuglerne ved stuetemperatur under formindsket tryk. De si-laniserede kugler omrystes let i 50 ml ethanol for at sikre 10 DK 171799 B1 en fuldstændig befugtning, og der tilsættes 100 ml 0,1 M natriumphosphatpuffer med en pH-værdi på 7 under let omrystning for at sikre en fuldstændig sammenblanding. Efter afdekandering af overskud af puffer tilsættes der 50 ml vandig 5 lipaseopløsning (Mucor miehei roed en aktivitet på 1000 LE/ml), og opløsningen omrystes med kuglerne i 16 timer. Derpå skilles kuglerne fra ved filtrering, hvorpå de vaskes to gange med en pufferopløsning og tørres som tidligere anført.

10 ii) Interesterificering.

Den resulterende katalysator anvendes ved en omlejringsmetode som beskrevet i eksempel 1, idet der som fødemateriale anvendes 0,53 dele laurinsyre og 0,27 dele myri-stinsyre pr. del solsikkeolie.

15 Resultaterne af triglyceridanalysen fremgår af tabel III.

Tabel III

Fedtsyre i Fødeolie Produkt "S980G" 20 triglycerider CIO:0 0,0 0,1 C12:0 0,0 14,6 C14:0 0,0 6,6 25 C16:0 3,7 2,3 C18:0 4,7 3,1 C18:1 84,9 68,4 C18:2 6,3 4,9 C20:0 0,4 0,0 30

Resultaterne i tabel III viser, at der sker en meget markant udskiftning af de umættede syrer i solsikkeolien med laurinsyre og myristinsyre under indvirkning af det understøttede enzym.

35 11 DK 171799 B1

Eksempel 4 i) Fremstilling af pores bærer.

Der formes en vand-i-olieemulsion med en høj inder-fase, hvor oliefasen udgøres af styren, divinylbenzen og det 5 overfladeaktive middel "Span® 80" (henholdsvis 4,42 kg, 0,44 kg og 0,88 kg), og den vandige fase indeholder vand, natriumpersulfat og calciumchlorid (henholdsvis 44,25 kg, 0,097 kg og 9,0 kg). "Span® 80" er sorbitanmonooleat. Emulsionen underkastes en efterformningsforskydning i 30 minutter 10 ved 85 omdr./minut. Polymerisationen udføres derpå ved 60*C over et tidsrum på 40 timer. Den fremkomne polymer formales, hvorpå den sigtes til den ønskede partikelstørrelse og eks-traheres i et Soxhlet apparat med isopropanol for at fjerne "Span® 80" efterfulgt af vaskning med afioniseret vand og 15 til slut tørring. Mikroskopiundersøgelse viser, at polystyrenmaterialet har en porøsitet på 90%, en celle (hulrums)-størrelse på mindst 30 Mm, og de huller, som forbinder hulrummene, har en størrelse på mindst 10 Mm, og endelig er partikelstørrelsen 1,0 til 2,0 mm.

20 ii) Immobilisering.

2,0 g polymer anbringes i 135 ml absolut ethanol for at gennemfugte polymeren. 120 ml overskudsethanol afdekan-teres, og der tilsættes 200 ml 0,1 M natriumphosphatpuffer med en pH-værdi på 7,0, hvorefter der omrøres let i 2 timer 25 for at sikre en fuldstændig sammenblanding. 195 ml overskudsopløsning afdekanteres, og der tilsættes yderligere 200 ml puffer, hvorefter der omrøres i 10 minutter. 200 ml overskudsopløsning afdekanteres igen. Der tilsættes 100 ml 0,1 M natriumphosphat med en pH-værdi på 7, som indeholder 7,4 30 g af lipasen Rhizopus niveus ("Amano®"), og der omrøres let. Lipaseadsorptionen følges ved analyse af tab af aktivitet i opløsningen. Efter 24 timer har polymeren adsorberet 92,7% af lipaseaktiviteten, hvilket giver en teoretisk fyldning på 9270 LE/g polymer. Polymeren fjernes ved filtrering, vaskes 35 to gange med 200 ml phosphatpuffer og tørres under vakuum ved stuetemperatur.

12 DK 171799 B1 iii) Interesterificering.

Den ovenfor fremstillede katalysator bedømmes for interesterificeringsaktivitet som følger: 100 mg prøve anbringes i et hætteglas, og der tilsættes en opløsning, der 5 indeholder 0,5 g olivenolie, 0,129 g myristinsyre og 10,0 ml petroleumsether (kogepunkt 100 til 120*C). Glasset forsegles og anbringes i et vandbad (med omryster) ved 40 *C.

Der udtages prøver efter 1 time, og mængden af myristinsyre indarbejdet i triglyceridet bestemmes ved fedtsyremethyΙ-ΙΟ ester/gaschromatografianalyse.

Resultaterne fremgår af den følgende tabel IV, som også viser resultater med "Lipozyme®"-katalysator (Mucor miehei lipase på en ionbytterharpiks fra Novo). Novo-LE-analysen er en gængs standardanalyse til bestemmelse af 15 enzymaktivitet.

Tabel IV

Katalysator Interesterificering Novo-LE-analyse (% myristinsyre indarbejdet) (μιηοΐ/min./g) 20 -:-

Polystyren 7,9 2238 "Lipozyme®" 10,6 557

Eksempel 5 25 i) Immobilisering.

Til 2,0 g hydrofobe, makroporøse polystyrenpartikler "5693-93" sættes der 30 ml ethanol under omrøring for at sikre, at alle polymerpartiklerne befugtes. Derpå tilsættes der 200 ml 0,1 M natriumphosphatpuffer med en pH-værdi på 7 30 under omrøring for at sikre en fuldstændig sammenblanding. Overskudsopløsning dekanteres fra, og der tilsættes yderligere 200 ml puffer, som indeholder 47,5 ml Mucor miehei lipaseopløsning ("Lipozyme®", Novo). Opløsningen omrøres let.

Den porøse polymers lipaseadsorption følges ved tab i ak-35 tivitet fra opløsningen. Efter 167 timer har bæreren adsor-beret 68% af lipaseaktiviteten, hvilket giver en teoretisk fyldning på 173.100 LE/g. Katalysatoren fjernes ved filtre- 13 DK 171799 B1 ring, vaskes to gange med 200 ml 0,1 M phosphatpuffer og tørres under vakuum ved stuetemperatur.

ii) Interesterificering.

En blanding af 0,25 g katalysator og 0,705 g af den 5 samme bærer uden lipase pakkes som en forsøjle i en søjle med en diameter på 15 mm sammen med 4 g fugtet "ID"-silicagel (Crosfields), som indeholder 3,2 g vand. Fødemateriale mættet med vand og indeholdende 1 vægtdel solsikkeolie med højt indhold af oleat, 0,7 vægtdele laurinsyre og 4 vægtdele petro-10 leumsether (kogepunkt 100 til 120'C) pumpes gennem søjlen, som holdes ved 50'C ved anvendelse af en vandkappe. Laurin-syremængden, som er indarbejdet i triglyceriderne, bestemmes ved fedtsyremethylester/gaschromatografianalyse. Begyndelsesaktiviteten beregnes ud fra gennemstrømningshastigheden 15 og omdannelsesgraden og viser sig at være 8,5 g oparbejdet triglycerid/time/g katalysator (denne beregning er forklaret senere).

Eksempel 6 20 i) Immobilisering.

Til 2,0 g hydrofobe, makroporøse polystyrenpartikler "78-7300" sættes der 35 ml ethanol under omrøring for at sikre, at alle polymerpartiklerne befugtes. Der tilsættes 200 ml 0,1 M natriumphosphatpuffer med én pH-værdi på 7 25 under omrøring for at sikre en fuldstændig sammenblanding. Overskudsopløsningen dekanteres fra, og der tilsættes yderligere 200 ml puffer, som indeholder 20 ml Mucor miehei lipaseopløsning ("Lipozyme®", Novo). Opløsningen omrøres let. Den porøse polymers lipaseadsorption følges ved tab i 30 aktivitet fra opløsningen. Efter 47,5 timer har bæreren adsorberet 85% af lipaseaktiviteten, hvilket giver en teoretisk fyldning på 92.600 LE/g. Katalysatoren fjernes ved filtrering, vaskes to gange med 200 ml 0,1 M phosphatpuffer og tørres under vakuum ved stuetemperatur.

35 ii) Interesterificering.

DK 171799 Bl 14

En blanding af 0,25 g katalysator og 0,69 g af den samme bærer uden lipase pakkes som en forsøjle i en søjle med en diameter på 15 mm sammen med 4 g befugtet "ID"-sili-cagel (Crosfields), som indeholder 3,2 g vand. Fødematerialet 5 mættet med vand og indeholdende 1 vægtdel solsikkeolie med højt oleatindhold, 0,7 vægtdele laurinsyre og 4 vægtdele petroleumsether (kogepunkt 100 til 120°C) pumpes gennem søjlen, som holdes ved 50®C ved anvendelse af en vandkappe. Laurinsyremængden indarbejdet i triglyceriderne bestemmes 10 ved fedtsyremethylester/gaschromatografianalyse. Betyndel-sesaktiviteten normaliseres for gennemstrømningshastighed og omdannelsesgrad og viser sig at være 7,5 g oparbejdet tri-glycerid/time/g katalysator.

15 Eksempel 7 i) Immobilisering.

Til 2,0 g hydrofobe, makroporøse polypropylenpartikler "EP-IOO'· sættes der 20 ml ethanol under omrøring for at sikre, at alle polymerpartiklerne fugtes. Der tilsættes 200 20 ml 0,1 M natriumphosphatpuffer med en pH-værdi på 7 under omrøring for at sikre en fuldstændig sammenblanding. Overskudsopløsning dekanteres fra, og der tilsættes yderligere 500 ml puffer indeholdende Mucor miehei lipaseopløsning ("Lipozyme®", Novo), og opløsningen omrøres let. Den porøse 25 polymers lipaseadsorption følges ved tab i aktivitet fra opløsningen. Dette gennemføres for tre forskellige mængder lipaseopløsning. Tilsat enzymmængde og de teoretiske fyldninger, der opnås, fremgår af nedenstående tabel V. Katalysatoren fjernes ved filtrering, vaskes to· gange med 200 ml 30 0,1 M phosphatpuffer og tørres under vakuum ved stuetempera tur.

ii) Interesterificering.

En blanding af katalysatoren og den samme bærer uden lipase (i forskellige forhold afhængig af aktiviteten af 35 det understøttede enzym - jfr. tabel V) pakkes som en forsøjle i en søjle med en diameter på 15 mm sammen med 4 g 15 DK 171799 B1 fugtet "IDM-silicagel (Crosfields), som indeholder 3,2 g vand. Fødemateriale mættet med vand og indeholdende 1 vægtdel solsikkeolie med hejt indhold af oleat, 0,7 vægtdele laurinsyre og 4 vægtdele petroleumsether (kogepunkt 100 til 5 120*C) pumpes gennem søjlen, som holdes ved 50"C ved anven delse af en vandkappe. Laurinsyremængden indarbejdet i tri-glyceriderne bestemmes ved fedtsyremethylester/gaschromato-grafianalyse. Begyndelsesaktiviteten normaliseres for gennemstrømningshastighed og omdannelsesgrad. Resultaterne 10 fremgår af nedenstående tabel V (under A).

iii) Esterificering.

50 mg katalysator anbringes i et hætteglas, og en med vand mættet blanding indeholdende oleinsyre (5,88 g 92%, fra BDH, England) og octan-l-ol (2,70 g, GPR, fra BDH) 15 tilsættes. Hætteglasset forsegles og anbringes i et vandbad ved 50"C og henstår i 1 time under fortsat omrystning (200 slag/minut). Der udtages en prøve på 0,20 ml, som øjeblikkeligt elueres ned igennem en lille aluminiumoxidsøjle (basisk, aktivitet 2) med diethylether sammen med en opløs-20 ning af 0,20 ml petroleumsether (kogepunkt 60 til 80eC) indeholdende 5 mg methylstearat som indre standard. Diethyl-etheren fjernes derpå ved afdampning og erstattes af petroleumsether (kogepunkt 60 til 80°C, 6 ml). Forholdet mellem octyloleat og methylstearat bestemmes derpå ved gas/væs-25 kechromatografi. Ud fra dette forhold beregnes esterdannelseshastigheden, og resultaterne fremgår at tabel V (under B).

Tabel V

30 Lipaseopløsning Teoretisk fyldning Aktivitet

(ml) (% adsorberet) (LE/g) A B

6,6 98,5 35.700 2,3 66 48,0 92,2 244.800 34,0 330 35 308,0 80,0 1.188.000 63,6 546 DK 171799 B1 16 A = Interesterificeringsaktivitet, g triglycerid/time/g katalysator.

B = Esterificeringsaktivitet, μτηοΐ ester/time/mg katalysator.

5 Eksempel 8 i) Immobilisering.

Til 2,0 g hydrofobe, makroporøse polymerpartikler af "Amberlite® XE-305" sættes der 20 ml ethanol under omrøring for at sikre, at alle polymerpartiklerne befugtes. Der til-10 sættes 200 ml 0,1 M natriumphosphatpuffer med en pH-værdi på 7 under omrøring for at sikre fuldstændig sammenblanding. Overskudsopløsning dekanteres fra, og der tilsættes yderligere 100 ml puffer indeholdende 5,5 ml Mucor miehei lipa-seopløsning ("Lipozyme®", Novo), og opløsningen omrøres let.

15 Den porøse polymers lipaseadsorption følges ved tab i aktivitet fra opløsningen. Efter 2 timer har bæreren adsorberet 75,7% af lipaseaktiviteten, hvilket giver en teoretisk fyldning på 21.600 LE/g. Katalysatoren fjernes ved filtrering, vaskes to gange med 200 ml 0,1 M phosphatpuffer og tørres 20 under vakuum ved stuetemperatur.

ii) Interesterificering.

En blanding af 1,0 g katalysator og 1,0 g af den samme bærer uden lipase pakkes som en forsøjle i en søjle med en diameter på 15 mm sammen med 4 g fugtet ,,ID,,-silicagel 25 (Crosfields) , som indeholder 3,2 g vand. Fødemateriale mættet med vand og indeholdende 1 vægtdel solsikkeolie med højt oleatindhold, 0,7 vægtdele laurinsyre og 4 vægtdele petro-leumsether (kogepunkt 100 til 120'C) pumpes gennem søjlen, som holdes ved 50'C ved anvendelse af en vandkappe. Laurin-30 syremængden indarbejdet i triglyceriderne bestemmes ved fedtsyremethylester/gaschromatografianalyse. Begyndelsesaktiviteten normaliseres for gennemstrømningshastighed og omdannelsesgrad og viser sig at være 2,0 g oparbejdet triglycerid/time/g katalysator.

35 17 DK 171799 B1

Eksempel 9 i) Immobilisering.

Til 2,0 g hydrofobe, makroporøse polymerpartikler "EP-100" sættes der 20 ml ethanol under omrøring for at 5 sikre, at alle polymerpartiklerne fugtes. Der tilsættes 200 ml 0,1 M natriumphosphatpuffer med en pH-værdi på 7 under omrøring for at sikre en fuldstændig sammenblanding. Overskudsopløsning dekanteres fra, og der tilsættes yderligere 200 ml puffer indeholdende 37,0 g Rhizopus niveus lipaseop-10 løsning ("Lipase N", "Amano®"). Opløsningen omrøres let. Den porøse polymers lipaseadsorption følges ved tab i aktivitet fra opløsningen. Efter 22 timer har bæreren adsorberet 90% af lipaseaktiviteten, hvilket giver en teoretisk fyldning på 38.400 LE/g. Katalysatoren fjernes ved filtrering, vaskes 15 to gange med 200 ml 0,1 M phosphatpuffer og tørres under vakuum ved stuetemperatur.

ii) Interesterificering.

En blanding af 0,25 g katalysator og 0,36 g af den samme bærer uden lipase pakkes som en forsøjle i en søjle 20 med en diameter på 15 mm sammen med 4 g fugtet "ID"-silicagel (Crosfields) indeholdende 3,2 g vand. Fødemateriale mættet med vand og indeholdende 1 vægtdel solsikkeolie med højt ole-atindhold, 0,7 vægtdele laurinsyre og 4 vægtdele petroleums-ether (kogepunkt 100 til 120*C) pumpes gennem søjlen, som 25 holdes ved 50*C ved anvendelse af en vandkappe. Laurinsyre-mængden indarbejdet i triglyceriderne bestemmes ved fedtsy-remethylester/gaschromatografianalyse. Begyndelsesaktiviten normaliseres for gennemstrømningshastighed og omdannelsesgrad og viser sig at være 35,0 g oparbejdet triglycerid/time/g 30 katalysator.

Eksempel 10 i) Immobilisering.

Til 2,0 g hydrofobe, makroporøse polyroerpartikler 35 "EP-IOO" sættes der 20 ml ethanol under omrøring for at sikre, at alle polymerpartikler fugtes. Der tilsættes 200 18 DK 171799 B1 ml 0,1 M natriumphosphatpuffer med en pH-værdi på 7 under omrøring for at sikre en fuldstændig sammenblanding. Overskudsopløsning dekanteres fra, og der tilsættes yderligere 200 ml puffer indeholdende 2 ml Humicola sp. lipaseopløsning 5 ("SP398/PPW2542", Novo). Opløsningen omrøres let. Den porøse polymers lipaseadsorption følges ved tab i aktivitet fra opløsningen. Efter 2 timer har bæreren adsorberet 97% af lipaseaktiviteten, hvilket giver en teoretisk fyldning på 61.700 LE/g. Katalysatoren fjernes ved filtrering, vaskes 10 to gange med 200 ml 0,1 M phosphatpuffer og tørres under vakuum ved stuetemperatur.

ii) Interesterificering.

En blanding af 0,5 g katalysator og 0,465 g af den samme bærer uden lipase pakkes som en forsøjle i en søjle 15 med en diameter på 15 mm. Fødemateriale mættet med vand og indeholdende 1 vægtdele solsikkeolie med højt oleatindhold, 0,7 vægtdele laurinsyre og 4 vægtdele petroleumsether (kogepunkt 100 til 120°C) pumpes gennem søjlen, som holdes ved 50°C ved anvendelse af en vandkappe. Laurinsyremængden ind-20 arbejdet i triglyceriderne bestemmes ved fedtsyremethyl-ester/gaschromatografianalyse. Begyndelsesaktiviteten normaliseres for gennemstrømningshastighed og omdannelsesgrad og viser sig at være 5,8 g oparbejdet triglycerid/time/g katalysator.

25 iii) Esterificering.

50 mg af den samme katalysator anbringes i et hætteglas, og en med vand mættet blanding indeholdende oleinsyre (5,88 g, 92%, BDH) og octan-l-ol (2,70 g, GPR, BDH) tilsæt tes. Hætteglasset forsegles og anbringes i et vandbad ved 30 50*C og henstår i 1 time under fortsat omrystning (200 slag/- minut). Der udtages en prøve på 0,20 ml, som øjeblikkeligt elueres ned igennem en lille aluminiumoxidsøjle (basisk, aktivitet 2) med diethylether sammen med en opløsning af 0,20 ml petroleumsether (kogepunkt 60 til 80°C) indeholdende 35 5 mg methylstearat som indre standard. Diethyletheren fjernes derpå ved afdampning og erstattes af petroleumsether (ko- 19 DK 171799 B1 gepunkt 60 til 80*C, 6 ml). Forholdet mellem octyloleat og methylstearat bestemmes derpå ved gas/væskechromatografi.

Ud fra dette forhold beregnes esterdannelseshastigheden, og den viser sig at være 20 μιηοΐ/time/rog katalysator.

5

Eksempel 11 i) Silanisering.

3,0 g glasperler roed kontrolleret porestørrelse "PG-1200-120” tørres i en ovn ved 105*C i.15 minutter. Når 10 perlerne er afkølet, tilsættes der en opløsning af 6,7 ml dimethyldichlorsilan i 27 ml 1,1,1-trichlorethah, og perlerne omrøres. Efter 1,25 timer frafiltreres perlerne, hvorpå de vaskes med 1,1,1-trichlorethan og tørres under vakuum ved stuetemperatur.

15 ii) Immobilisering.

De silaniserede perler (3,0 g) får lov at henstå i 100 ml ethanol i 16 timer for at sikre, at bæreren er fugtet.

50 ml ethanol fjernes og erstattes med 50 ml 0,1 M natrium-phosphatpuffer med en pH-værdi på 7. Efter omrøring i nogle 20 få minutter fjernes 50 ml af puffer/ethanolopløsningen, og der tilsættes yderligere 50 ml phosphatpufferopløsning. Omrøringen fortsættes i yderligere nogle få minutter, inden overskudsgas i porerne i bæreren fjernes ved at anvende vakuum på væskeoverfladen. Endelig fjernes .der 50 ml puffer/-25 ethanolopløsning, hvorpå der tilsættes yderligere 250 ml pufferopløsning indeholdende 3,5 ml Mucor miehei lipaseop-løsning ("Lipozyme®", Novo). Opløsningen omrøres let. De porøse glasperlers lipaseadsorption følges ved tab i aktivitet fra opløsningen. Efter 25,75 timer har perlerne 30 adsorberet 91,7% af lipaseaktiviteten, hvilket giver en teoretisk enzymfyldning på 11.774 LE/g. Katalysatoren isoleres ved filtrering, vaskes med 400 ml 0,1 M natriumphos-phatpufferopløsning og tørres derpå under vakuum ved stuetemperatur.

35 iii) Interesterificering.

20 DK 171799 B1 3,0 g katalysator pakkes som en forsøjle i en søjle med en diameter på 15 mm sammen med 4 g fugtet "ID"-silicagel (Crosfields) indeholdende 3,2 g vand. Fødemateriale mættet med vand og indeholdende 1 vægtdel solsikkeolie med højt 5 oleatindhold, 0,7 vægtdele laurinsyre og 4 vægtdele petro-leumsether (kogepunkt 100 til 120*C) pumpes gennem søjlen, som holdes ved 50*C ved anvendelse af en vandkappe. Laurin-syremængden indarbejdet i triglyceriderne bestemmes ved fedtsyremethylester/gaschromatografianalyse. Begyndelsesak-10 tiviteten normaliseres for gennemstrømningshastighed og omdannelsesgrad og viser sig at være 1,3 g oparbejdet tri-glycerid/time/g katalysator.

Aktitivitetsberegning (anvendt i eksempel 5-11) 15 -ln(l-OG) x gennemstrømningshastighed

Aktivitet = - katalysatormængde (g) 20 Gennemstrømningshastighed = g triglycerid/time gennem søjlen

Omdannelsesgrad (OG) = % indarbejdet laurinsyre - % startindhold 25 % ligevægtsindhold - % startindhold I nærværende eksempler er det oprindelige laurin-syreindhold 0, og ligevægtsindholdet er 31,3%.

Claims

1. Fremgangsmåde til fremstilling af fedtsyreestere eller til omlejring af fedtstoffer og vegetabilske olier, 5 ved hvilken fremgangsmåde reaktanter, som giver fedtsyre-og alkoholradikaler, omsættes i en praktisk talt ikke-vandig, homogen, flydende fase indeholdende maksimalt 1 vægt% vand i nærværelse af en båret lipasekatalysator, som er opnået, ved at lipasen ved adsorption er fysisk bundet til bærer- 10 materialet, kendetegnet ved, at bæreren for lipasen er udvalgt fra den gruppe, som består af 1) polyalky-lener udvalgt fra den gruppe, som består af homo- eller copolymere af ethylen, styren, butadien eller isopren og homopolymerer af propylen, og 2) uorganiske, porese materia- 15 ler, hvis overflader er blevet behandlet således, at de er gjort hydrofobe, hvorhos bærermaterialet har en gennemsnitlig porestørrelse fra 0,05 til 5 jum.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at reaktanterne udgøres af glyceridestere.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at glyceridesterne udgøres af et fedtstof og/- 25 eller en olie.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2 eller 3, kendetegnet ved, at reaktanterne inkluderer mindst én fri fedtsyre eller mindst én alkylester af en fri fedtsyre. 30

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at det porøse polymere materiale har et samlet porevolumen på mindst 90%.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendete g- n e t ved, at bærermaterialet udgøres af siliciumdioxid DK 171799 B1 eller glas med en overflade af en hydrofob, organisk sili-ciumdioxidpolymer, opnået efter behandling af bærermaterialet med en silan.