DE3886332T2

DE3886332T2 - Inaktivierung von Viren und Bakterien.

Info

Publication number: DE3886332T2
Application number: DE88308908T
Authority: DE
Inventors: Dale Bordt; Hans Draayer
Original assignee: Beecham Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1987-09-28
Filing date: 1988-09-26
Publication date: 1994-03-31
Anticipated expiration: 2008-09-27
Also published as: ZA887195B; JP2715114B2; ES2067474T3; EP0310317B1; EP0310317A2; DK175379B1; DK534188D0; KR890004728A; DK534188A; DK175308B1; ES2061673T3; PT88590A; PT88591B; DK534288A; NZ226332A; AU624339B2; KR890004725A; EP0310317A3; ATE98680T1; EP0310316B1

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, das im wesentlichen keine lebenden Viren oder Bakterien enthält. Die Erfindung betrifft auch durch das Verfahren hergestellte Arzneimittel und deren Verwendung in der Therapie. Die Erfindung ist auf dem Gebiet der inaktivierten Impfstoffe zur Verwendung in der Prophylaxe von besonderem Wert.
In der Medizin ist es häufig erforderlich oder wünschenswert, Arzneimittel zur Verabreichung an Tiere, einschließlich Menschen, bereitzustellen, die keine lebenden, potentiell schädlichen Viren oder Bakterien aufweisen. Ein derartiger Inaktivierungsschritt kann besonders wichtig sein, wenn ein inaktivierter (oder "abgetöteter") Impfstoff gewünscht wird.
Es sind mehrere Verfahren zur Inaktivierung von Viren oder Bakterien bekannt, beispielsweise die Behandlung mit β- Propiolacton, Formaldehyd oder Ethylenimin. Die Handhabung derartiger Reagenzien ist jedoch potentiell gefährlich, und sicherere Verfahren wären wünschenswert.
Es gibt eine Veröffentlichung über die Inaktivierung von bestimmten zur Diagnose verwendbaren Virus-Antigenen durch eine von Kupfersulfat katalysierte Autooxidation durch Ascorbinsäure (White, L. A. et al., J. Clinical Microbiology 24 (1986), 527-531). Turner (J. Gen. Microbiol. 35 (1964), 75-80) beschreibt, daß das Vaccinia-Virus in Gegenwart eines Kupfersalzes durch Ascorbinsäure unter Autooxidation inaktiviert wird. Murata et al. (Agric. Biol. Chem. 51(3) (1987), 933-4) beschreiben die Inaktivierung von Phagen durch Ascorbinsäure in Gegenwart von Sauerstoff und/oder Schwermetallionen.
Überraschenderweise wurde von den Erfindern festgestellt, daß Viren und Bakterien in Arzneimitteln durch eine ähnliche Behandlung inaktiviert werden können.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Arzneimittel, das im wesentlichen keine lebenden Viren oder Bakterien enthält und ein inaktiviertes Virus oder Bakterium zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthält, dadurch gekennzeichnet, daß das inaktivierte Virus oder Bakterium durch Inaktivierung eines lebenden Virus oder Bakteriums mit Ascorbinsäure und/oder einem Salz davon in Gegenwart von Sauerstoff und einer Schwermetallionenquelle hergestellt wurde.
Die Erfindung liefert auch eine Zusammensetzung zur Verwendung in der Therapie, die im wesentlichen keine lebenden Viren oder Bakterien enthält und durch ein Verfahren hergestellt wird, das die Inaktivierung eines lebenden Virus oder Bakteriums mit Ascorbinsäure und/oder einem Salz davon in Gegenwart von Sauerstoff und einer Metallionenquelle umfaßt.
Der Begriff "Therapie" schließt, wie hier verwendet, eine Prophylaxe ein.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, wobei das Verfahren das Vermischen eines inaktivierten Virus oder Bakteriums mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt und dadurch gekennzeichnet ist, daß das inaktivierte Virus oder Bakterium durch Inaktivierung eines lebenden Virus oder Bakteriums mit Ascorbinsäure und/oder einem Salz davon in Gegenwart von Sauerstoff und einer Schwermetallionenquelle hergestellt wurde.
Der Vorteil der Erfindung ist, daß karzinogene oder andere gefährliche, auf dem Fachgebiet zur Inaktivierung von Viren bekannte Reagenzien, beispielsweise β-Propiolacton, Formaldehyd und Ethylenimin, nicht mehr erforderlich sind, wodurch das Inaktivierungsverfahren sicherer wird.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann jedes zur Verabreichung auf jedem geeigneten Weg, beispielsweise durch parenterale oder topische Anwendung, formulierte Arzneimittel sein.
Unter einem bevorzugten Gesichtspunkt ist das Arzneimittel ein inaktivierter Impfstoff gegen virale oder bakterielle Infektionen, beispielsweise ein inaktivierter Impfstoff gegen das übertragbare Gastroenteritisvirus vom Schwein ("TGEV"), Parvovirus, Mitglieder der Herpes-Virusgruppe, beispielsweise Pseudorabies-Virus (PRV) und infektiöse Rinderrhinotracheitis ("IBR")-Virus, Paramyxo-, Parainfluenza-3-, Rindercoronavirus und Rinder-"respiratory- syncytial"-Virus.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt ist dementsprechend die Verwendung einer Zusammensetzung bei der Herstellung einer inaktivierten Impfstoff-Zusammensetzung zur Prophylaxe von viralen oder bakteriellen Infektionen, wobei die Zusammensetzung im wesentlichen frei von lebenden Viren oder Bakterien ist und durch ein Verfahren hergestellt wird, das die Inaktivierung eines lebenden Virus oder Bakteriums mit Ascorbinsäure und/oder einem Salz davon in Gegenwart von Sauerstoff und einer Schwermetallionenquelle umfaßt.
Unter einem bevorzugten Gesichtspunkt ist der inaktivierte Impfstoff ein Impfstoff gegen das übertragbare Gastroenteritisvirus vom Schwein.
Unter einem weiteren bevorzugten Gesichtspunkt ist der inaktivierte Impfstoff ein Kombinations-Impfstoff gegen mehr als ein Virus, beispielsweise gegen bis zu 5, vorzugsweise bis zu 3 Viren. Ein bevorzugter Impfstoff dieser Art ist der gegen das infektiöse Rinder-Rhinotracheitis-Virus- Diarrhoe-Parainfluenza-3.
Es versteht sich, das weitere aktive Wirkstoffe im erfindungsgemäßen Arzneimittel vorhanden sein können.
Der inaktivierte Impfstoff kann gegebenenfalls Adjuvantien enthalten, einschließlich beispielsweise Aluminiumhydroxid (beispielsweise 2-25 Gewichts-%, vorzugsweise 5-25 %), Saponin (beispielsweise 0,5-1,5 mg/Dosis) und inkomplettes Freundsches-Adjuvans (übliche Wasser-in-Öl-Emulsion).
Der Impfstoff kann in einer Dosis von mindestens 1,9 log inaktivierter Virus-Partikel pro Dosis, vorzugsweise von mindestens 1000 Virus-Partikeln (3 log Virus-Partikel) pro Dosis verabreicht werden. Üblicherweise wird der inaktivierte Impfstoff in mindestens 4 log inaktivierter Virus- Partikel pro Dosis verabreicht.
Zu geeigneten Formen der Ascorbinsäure gehören die Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze, beispielsweise die Natrium-, Kalium- oder Calciumsalze oder die Ascorbinsäure selber.
Ein bevorzugtes Salz ist das Natriumsalz.
Eine geeignete Ascorbat-Konzentration zur Verwendung im Inaktivierungsschrjtt ist im Bereich von 1 bis 10 mM, vorzugsweise 2,0 mM bis 6,0 mM, beispielsweise 2,5 mM.
Zu den geeigneten Quellen von Schwermetallionen gehören Kupfer-, Eisen- und Zinksalze und Quecksilber-enthaltende Verbindungen.
Ein bevorzugtes Schwermetallion ist das Kupfer (Cu²&spplus;)-Ion, wofür Kupfersulfat die geeignete Quelle ist.
Ein weiteres bevorzugtes Schwermetallion ist Quecksilber, wofür organische Quecksilberverbindungen, besonders das Natriumsalz von Ethylmercurithiosalicylsäure (Thiomersal), die geeigneten Quellen sind.
Das Schwermetallion ist in einer katalytischen Menge vorhanden, eine geeignete Konzentration zur Verwendung im Inaktivierungsschritt ist im Bereich von 0,01 mM bis 0,1 mM vorzugsweise 0,015 mM bis 0,05 mM, beispielsweise 0,022 mM.
Die Gegenwart von Sauerstoff ist essentiell und wird zweckmäßigerweise durch eine entsprechende Belüftung zugeführt.
Der Inaktivierungsschritt erfolgt üblicherweise bei 1 bis 54ºC, vorzugsweise bei etwa 37ºC, bis der Inaktivierungstest zufriedenstellend ist. Der zur Inaktivierung erforderliche Zeitraum ist üblicherweise im Bereich von 10 bis 100 Stunden, üblicherweise von etwa 48 bis 72 Stunden.
Zur Inaktivierung von bestimmten Viren, beispielsweise Parvovirus und Rotavirus, kann zur Vervollständigung des Inaktivierungsverfahrens ein weiterer Zusatz von Ascorbinsäure erforderlich sein.
Ferner können wahlweise weitere, für die Inaktivierung von Viren bekannte Wirkstoffe zugesetzt werden, um das Inaktivierungsverfahren zu vervollständigen. Ein solches Reagenz ist Saponin, wie es beispielsweise von Motovski, A. et al., Vet. Med. Nauki 17(3) (1980), 45-55, beschrieben wurde, das beispielsweise etwa 72 Stunden nach dem Ascorbinsäure-Zusatz in einer Konzentration von 0,5 mg/ml zugesetzt werden kann. Ein solches Verfahren erwies sich zur Inaktivierung von Hüllen-tragenden Viren, beispielsweise Viren der Herpes-Gruppe, einschließlich PRV und IBR, als besonders nützlich.
Das Fortschreiten des Inaktivierungsverfahrens kann zweckmäßigerweise durch in zeitlichen Abständen durchgeführte Messungen der Lebensfähigkeit des Virus unter Verwendung jedes geeigneten Verfahrens überwacht werden, beispielsweise durch einen indirekten Test mit fluoreszierenden Antikörpern zur Bestimmung des verbliebenen Virus-Titers.
Bei der Herstellung von inaktivierten Impfstoffen können stabilisierende Wirkstoffe vorteilhaft vor, während oder nach dem Inaktivierungsverfahren zugesetzt werden, um die Antigen-Stabilität zu erhöhen. Zu den geeigneten stabilisierenden Wirkstoffen gehören Rinderserumalbumin oder andere Serumarten.
Ein bevorzugter stabilisierender Wirkstoff ist Rinder (fötales)-Kälberserum.
Der stabilisierende Wirkstoff wird vorzugsweise vor oder während des Inaktivierungsverfahren zugesetzt.
Der stabilisierende Wirkstoff ist zweckmäßigerweise in einer Konzentration von 0,5 bis 5 % (Vol./Vol.), vorzugsweise von 1 bis 3 %, mehr bevorzugt etwa von 2 % (Vol./Vol.), vorhanden.
Die nachstehend beschriebenen Beispiele veranschaulichen die Erfindung.

Beispiele

In den nachstehend beschriebenen Beispielen wurden die Stammlösungen von L-Ascorbinsäure und Kupfersulfat in der nachstehend beschriebenen Weise hergestellt.

Präparation 1

Die Arbeitslösung von L-Ascorbinsäure (AS) wird durch Auflösen von 100 Gramm AS pro 1 Liter destilliertes Wasser (100 mg/ml) hergestellt. Das Reagenz wird unter Verwendung eines 0,20 u Micron-Filter-Sets sterilisiert und in gefrorenem Zustand aufbewahrt.

Präparation 2

Die Arbeitslösung von Kupfersulfat (0,5 mg/ml) wird durch Auflösen von 0,5 g Kupfersulfat in 1 Liter destilliertem Wasser und 10- bis 15-minütiges Autoclavieren bei 121ºC hergestellt. Die Lösung wird bei 4ºC aufbewahrt.

Beispiel 1

Inaktivierung von infektiösem Rinderrhinotracheitis ("IBR")- Virus

Unter konstantem Schütteln wurde das Natriumsalz der L-Ascorbinsäure (100 mg/ml) zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml den Virus-Flüssigkeiten langsam zugesetzt, wonach sofort Kupfersulfat (0,5 mg/ml Stammlösung) zu einer Endkonzentration von 0,55 ug/ml zugesetzt wurde. Die Flüssigkeiten wurden 72 bis 80 Stunden bei 37ºC konstant geschüttelt und belüftet.
Nach der ersten Phase der Inaktivierung wurden die Flüssigkeiten in eine Kühlvorrichtung (1,5 bis 7ºC) gegeben und auf 1,5 bis 7ºC temperiert. Der pH-Wert wurde auf 7,2 bis 7,4 eingestellt und Saponin (20 mg/ml) langsam unter konstantem Schütteln den Virus-Flüssigkeiten zu einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml zugesetzt, und danach Thimerosal (2,5 %) zu einer Endkonzentration von 0,01 %. Die Flüssigkeiten wurden unter konstantem Schütteln drei Tage bei 1,5 bis 7ºC gehalten. Die inaktivierten Flüssigkeiten wurden bei 1,5 bis 7ºC aufbewahrt.

Beispiel 2

Inaktivierung des Parainfluenza-3 (PI-3)-Virus

Thimerosal (2,5 %) wurde zu einer Endkonzentration von 0,01 % zugesetzt und der pH-Wert der Flüssigkeiten mit 10 N NaOH auf 7,2 bis 7,4 eingestellt. Unter konstantem Schütteln wurde den Virus-Flüssigkeiten langsam L-Ascorbinsäure (100 mg/ml) zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml zugesetzt. Die Flüssigkeiten wurden unter konstantem Schütteln und Belüften 40 bis 48 Stunden bei 37ºC gehalten.
Nach der ersten Phase der Inaktivierung wurden die Flüssigkeiten in eine Kühlvorrichtung (1,5 bis 7ºC) gegeben und auf 1,5 bis 7ºC temperiert. Der pH-Wert wurde auf 7,2 bis 7,4 eingestellt und unter konstantem Schütteln den Virus-Flüssigkeiten langsam Saponin (20 mg/ml) zu einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml zugesetzt. Die Flüssigkeiten wurden unter konstantem Schütteln drei Tage bei 1,5 bis 7ºC gehalten. Die inaktivierten Flüssigkeiten wurden bei 1,5 bis 7ºC aufbewahrt.

Beispiel 3

Effizienz des inaktivierten IBR/BVD/PI-3-Impfstoffs

1. Materialien und Verfahren

A. Tiere

Es wurden vierundzwanzig 300 bis 500 Pfund schwere, zusammen untergebrachte Rinder verwendet, die keine Impfgeschichte im Hinblick auf eine der im Impfstoff enthaltenen Komponenten aufwiesen. Die Rinder waren gegen IBR, BVD und PI-3 empfindlich mit einer Serum-Neutralisierung oder einem Plaque-Reduktionstiter u 1:2 falls nicht angegeben.
Die Zusammensetzung von zwei experimentellen IBR/BVD/PI-3-Impfstoffen war gemäß Tabelle 1.
Die IBR- und PI-3-Fraktionen wurden wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben inaktiviert. Tabelle 1 IBR/BVD/PI-3 Formulierung der Serie A und B (log&sub1;&sub0; TCID&sub5;&sub0;/ml) Bestandteil Vor-Inakt. Chargen-Titer Berechneter Serie A Titer/Dosis Serie B
24 Kälber wurden in dieser Untersuchung verwendet. Zehn Kälber wurden intramuskulär mit einer 5 ml Dosis der Serie A geimpft; 9 Kälber wurden in einer ähnlichen Weise mit der Serie B geimpft; 5 Kälber waren empfindliche, nichtgeimpfte Kontrollen. Alle geimpften Kälber wurden in ähnlicher Weise 21 Tage nach der ersten Impfung erneut geimpft. Die Kälber wurden täglich auf ungünstige Folgesymptome der Impfung untersucht.

B. Serologie

Die Antikörper-Titer der Kälber wurden zur Zeit der Impfung, des Immunitätstests und 14 Tage nach dem Immunitätstest bestimmt.

C. Immunitätstest

Mit den Kälbern- wurde mit IBR intranasal ein Immunitätstest durchgeführt, worauf nach 3 Wochen ein Immunitätstest mit PI-3 folgte.
Die Kälber wurden drei Tage lang vor dem Immunitätstest (ein Tag bei PI-3) und 14 Tage lang nach jedem Immunitätstest täglich auf starke klinische Symptome und rektale Temperaturen überprüft. Die Virus-Entwicklung wurde nach dem Immunitätstest 10 Tage überwacht. Nasale Abstriche wurden zur Isolierung des Virus zweimal nacheinander auf EBK-Zellen passagiert. Zwei Kälber wurden vor dem Immunitätstest mit PI-3 von der Untersuchung ausgeschlossen; ein Kalb entwickelte nach Behandlung mit einem Sulfonamid-Bolus eine Belastung der oberen Atemwege und 1 Kalb zeigte einen fortgeschrittenen Befund von Klauenfäule. Das nachstehend beschriebene Bewertungssystem wurde zur Beur-teilung von klinischen Symptomen nach dem Immuntest verwendet. Wertung Symptome Punkt Klare nasale Absonderungen, Niesen, Nasenschleimhautentzündung, Husten, Tränenfluß, überhöhte Speichelbildung, nasale Wunden. Nasale, schleimig-eitrige Absonderungen

2. Ergebnisse

Sämtliche Kälber blieben während des Beobachtungszeitraums nach der Impfung gesund.

A. Serologische Antworten

Die serologischen Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.
Es wurde festgestellt, daß vier mit Serie B geimpfte Kälber schon vorher existierende IBR-Antikörper-Titer aufwiesen. Diese Kälber wurden aufgrund ihrer Empfindlichkeit gegen PI-3 in die Untersuchung einbezogen. Die Kontakt- Kontrollen blieben während der ganzen Untersuchung gegen IBR Serum-negativ, wodurch die Abwesenheit einer IBR-Infektion gezeigt wurde. Neun von zehn Kälbern, die mit Serie A geimpft worden waren, waren zur Zeit der zweiten Impfung gegen IBR Serum-negativ, wobei das verbliebene Kalb einen Titer von 1:3 aufwies. Die Kälber hatten einen geometrischen Mittelwert des Antikörper-Titers (GMAT) von ≥ 1:16 drei Wochen nach der zweiten Impfung (Bereich 1:7 bis ≥ 1:32) entwickelt. Die geimpften Kälber zeigten nach dem Immuntest eine anamnestische Antwort.
Üblicherweise zeigten Kälber, die sowohl mit der Serie A als auch mit B geimpft worden waren, bei der zweiten Impfung eine schwache oder keine PI-3-Antikörper-Antwort. Zur Zeit des PI-3-Immuntests sechs Wochen nach der zweiten Impfung wiesen die Kälber, die mit Serie A geimpft worden waren, einen GMAT von ≥ 1:273,5 auf und die mit Serie B geimpften einen GMAT von ≥ 356 (Bereich 1:21 bis ≥ 1:512).
Die Kälber zeigten BVD-GMATs von ≥ 1:5106 und ≥ 18023 bei der Serie A bzw. B (Bereich 1:915 bis ≥ 1:62500). Tabelle 2 Reziproker geometrischer Mittelwert der Antikörper-Titer bei der Untersuchung der IBR/BVD/PI-3(KV) Immunantwort Wochen nach der Impfung Fraktion Impfstoff Nach dem Immuntest Kontrolle N.b. = Nicht bestimmt

B. IBR-Ermittlung nach dem Immuntest

Doppelte Titrationen vom zum Immuntest verwendeten IBR-Virus, die unmittelbar nach dem Immuntest durchgeführt wurden, zeigten, daß die Kälber mit 108,0 TCID&sub5;&sub0; einer Antigenexposition ausgesetzt worden waren.
Kälber, die mit Serie A geimpft worden waren, zeigten bei einem Vergleich mit der Kontrollgruppe eine signifikante (p < 0,05) Erniedrigung der rektalen Temperaturen am Tag 3 und 4 nach dem Immuntest.
IBR-Virus-Isolate wurden 10 Tage nach dem Immuntest untersucht. Sämtliche Kälber wiesen vor dem Immuntest kein IBR-Virus auf. Das IBR-Virus wurde während des Zeitraums von 10 Tagen aus sämtlichen nicht-geimpften Kontrollen gewonnen (Ausbeute 100 %). Eine signifikante Verringerung in der Virus-Ausbeute zeigte sich bei den Geimpften am Tag 9 (p < 0,05) und am Tag 10 (p < 0,01) bei einem Vergleich mit nicht-geimpften Kontrollen.
Die klinischen Symptome nach dem Immuntest mit IBR in der Impfgruppe A und B und den Kontrollen waren schwächer als erwartet; signifikante Unterschiede zwischen den geimpften Gruppen und den Kontrollgruppen zeigten sich nicht. Es gab jedoch eine Verringerung der Punktzahl klinischer Symptome bei den geimpften Tieren.

C. PI-3-Bewertung nach dem Immuntest

Die Ergebnisse von doppelten Titrationen, die unmittelbar nach dem Immuntest durchgeführt worden waren, zeigten, daß die Kälber mit 107,8 TCID&sub5;&sub0; von PI-3 exponiert worden waren.
Die klinischen Symptome der PI-3-Infektion waren schwach bis unscheinbare.
Sämtliche Kälber wiesen vor dem Immunitätstest kein PI-3-Virus auf. Das PI-3-Virus wurde durchschnittlich nach 7,4 Tagen/Kuh aus den nicht-geimpften Kontrollen isoliert, während das Virus durchschnittlich nach 2,9 und 4,3 Tagen/Kuh aus Kälbern, die mit der Serie A bzw. B geimpft worden waren, isoliert wurde. Eine Dosiswirkung zeigt sich, wenn die Ergebnisse, die mit der Serie A erhalten wurden, mit denen der Serie B verglichen werden. Die Verringerung der Virus-Entwicklung bei Kälbern, die sowohl mit der Serie A als auch mit B geimpft worden waren, war signifikant, wenn sie mit nicht-geimpften Kontrollen (p < 0,01) verglichen wurden.

Beispiel 4

Inaktivierung des Rinder-"respiratory syncytial"-Virus

Die Inaktivierung wurde durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren durchgeführt.

Beispiel 5

Impfstoffe aus inaktiviertem übertragbarem Gastroenteritisvirus vom Schwein ("TGEV")

Das TGE-Virus (ATCC VR-763) wurde 4 Mal auf Zellen von Schweinenieren (mit der Bezeichnung PK0809) passagiert, um eine Master-Viruskultur herzustellen, die anschließend 3 Mal auf Zellen von Schweinenieren und zweimal auf Zellen von Crandell-Katzennieren (ATCC CCL 94) passagiert wurden. Das Virus wurde bei 35 bis 38ºC auf der Crandell-Katzennieren- Zelliasie (ATCC CCL 94) in nicht mehr als 10 % Rinderserum enthaltendem Eagles MEM vermehrt.
Zwei kleine Roller-Flaschen, die konfluente einzellige Schichten von Crandell-Katzennieren (ATCC CCL 94) enthielten, wurden mit 1 ml unverdünnter TGE-Master-Viruskultur beimpft. Nach einem 1 bis 2-stündigen Adsorptions- Zeitraum wurde das Virus-Nährmedium (nicht mehr als 2 % Rinderserum enthaltendes Eagles MEM) zugesetzt und das Virus bei 35 bis 38ºC gezüchtet.
Eine Roller-Flasche, die das wie vorstehend beschrieben hergestellte TGE-Virus enthielt, wurde eingefroren, aufgetaut (Entnahme von Titer-proben) und wie nachstehend beschrieben inaktiviert (die zur Produktion verwendeten Viren sollten vor der Inaktivierung einen Titer von mindestens 105,5 pro Dosis aufweisen):
Die zur produktion verwendeten Viren wurden in eine 1 Liter Glasflasche gegeben und auf 37ºC erwärmt. Die Natriumascorbat-Stammlösung (1 % Gew./Vol.) und die Kupfersulfat-Stammlösung (1,1 % Gew./Vol.) wurden anschließend zugesetzt, um eine Ascorbat-Endkonzentration von 5,05 mM und eine Kupferionen-Endkonzentration von 0,022 mM zu erreichen. Der Inhalt der Flasche wurde 72 Stunden bei 37ºC unter ausreichender Belüftung vermischt und anschließend auf 4ºC abgekühlt.
Nachdem die Inaktivierung überprüft worden war, wurden die zur Produktion verwendeten Viren aufgeteilt und mit Adjuvans versetzt, um zwei inaktivierte Impfstoffe, wie nachstehend beschrieben, zu erhalten:

Impfstoff A

Eine Hälfte der inaktivierten zur Produktion verwendeten Viren wurde mit 10 % Aluminiumhydroxid behandelt, wobei 15 bis 20 Stunden bei 4ºC gerührt wurde.

Impfstoff B

Die andere Hälfte der inaktivierten zur Produktion verwendeten Viren wurde, wie nachstehend beschrieben, mit einem Adjuvans versetzt:
Lösung 1 besteht aus 5 ml Emulsionsmittel, das zu 95 ml Drakoil 6 VR zugesetzt wurde. (Drakoil ist ein Warenzeichen.)
Lösung 2 besteht aus 2,5 ml Tween 80, das zu 47,5 ml abgetötetem TGE-Virus zugesetzt worden ist.
Lösung 1 (21 ml) wird der Lösung 2 (7 ml) zugesetzt und vor der Impfung unter Verwendung einer Perfektum- Emulgier-Nadel vermischt.

Claims

1. Arzneimittel, das im wesentlichen frei von lebenden Viren oder Bakterien ist und ein inaktiviertes Virus oder Bakterium zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthält, dadurch gekennzeichnet, daß das inaktivierte Virus oder Bakterium durch Inaktivierung eines lebenden Virus oder Bakteriums mit Ascorbinsäure und/oder einem Salz davon in Gegenwart von Sauerstoff und einer Schwermetallionenquelle hergestellt wurde.

2. Mittel nach Anspruch 1, das eine prophylaktisch wirksame Menge eines inaktivierten Virus umfaßt und ein inaktivierter viraler Impfstoff ist.

3. Mittel nach Anspruch 2, wobei der inaktivierte Impfstoff ein Impfstoff gegen Viren ist, die ausgewählt sind aus übertragbarem Gastroenteritisvirus vom Schwein, Parvovirus, Mitgliedern der Herpes-Virusgruppe, Paramyxo-, Parainfluenza-3-, Rindercoronavirus und Rinder-RS ("respiratory syncytial")-Virus.

4. Mittel nach Anspruch 3, wobei der inaktivierte Impfstoff ein Kombinationsimpfstoff gegen infektiöse Rinderrhinotracheitis-Diarrhoe-Virus-Parainfluenza-3 ist.

5. Mittel nach Anspruch 1, das eine prophylaktisch wirksame Menge eines inaktivierten Bakteriums umfaßt und ein Impfstoff gegen Bakterien ist.

6. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, hergestellt nach einem Verfahren, in dem die Metallionenquelle ausgewählt ist aus Salzen von Kupfer, Eisen, Zink und quecksilberhaltigen Verbindungen.

7. Mittel nach Anspruch 6, wobei die Metallionenquelle die quecksilberhaltige Verbindung Thimerosal umfaßt.

8. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das lebende Virus oder Bakterium in einem Medium inaktiviert wurde, das zusätzlich Saponin enthielt.

9. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das lebende Virus oder Bakterium in Gegenwart eines Stabilisierungsmittels inaktiviert wurde, das zur Erhöhung der Antigen-Stabilität fähig ist.

10. Mittel nach Anspruch 9, wobei das Stabilisierungsmittel fötales Kälberserum vom Rind ist.

11. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, umfassend das Mischen eines inaktivierten Virus oder Bakteriums mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, dadurch gekennzeichnet, daß das inaktivierte Virus oder Bakterium durch Inaktivierung eines lebenden Virus oder Bakteriums mit Ascorbinsäure und/oder einem Salz davon in Gegenwart von Sauerstoff und einer Schwermetallionenquelle hergestellt wurde.

12. Mittel, das im wesentlichen frei von lebenden Viren oder Bakterien ist und durch ein Verfahren hergestellt wurde, das die Inaktivierung eines lebenden Virus oder Bakteriums mit Ascorbinsäure und/oder einem Salz davon in Gegenwart von Sauerstoff und einer Schwermetallionen- Stickstoffquelle umfaßt, zur Verwendung in der Therapie.

13. Verwendung eines Mittels für die Herstellung einer inaktivierten Impfstoffzusammensetzung für die Prophylaxe viraler oder bakterieller Infektionen, wobei die Zusammensetzung im wesentlichen frei von lebenden Viren oder Bakterien ist und durch ein Verfahren hergestellt wurde, welches die Inaktivierung eines lebenden Virus oder Bakteriums mit Ascorbinsäure und/oder einem Salz davon in Gegenwart von Sauerstoff und einer Schwermetallionenquelle umfaßt.