DE3878866T2

DE3878866T2 - 3-indolpyruvsaeure-derivate und deren verwendung als arznemittel.

Info

Publication number: DE3878866T2
Application number: DE8888904984T
Authority: DE
Inventors: Luca Giovanna De; Stazio Giovanni Di; Andrea Margonelli; Mario Materazzi; Vincenzo Politi
Original assignee: Polifarma SpA
Current assignee: Polifarma SpA
Priority date: 1987-06-03
Filing date: 1988-06-01
Publication date: 1993-09-02
Anticipated expiration: 2008-06-02
Also published as: EP0321516A1; AU609500B2; FI92055C; US5002963A; EP0321516B1; NO890408L; AU1943388A; IT8748014A0; FI92055B; FI890508A; KR960016522B1; CA1328658C; DK46789D0; DK46789A; WO1988009789A2; FI890508A0; KR890701559A; WO1988009789A3; ATE86247T1; DK170438B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen, die Derivate in Form von Salzen, Estern und Amiden, von 3-Indolbrenztraubensäure sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung von 3-Indolbrenztraubensäure und ihrer oben erwähnten Derivate als pharmazeutisch wirksame Mittel zur Behandlung von Störungen des Zentralnervensystems, die im Gehirn durch die Anwesenheit einer großen Menge von Peroxidanionen oder freien Radikalen hervorgerufen werden. Beispiele für solche Störungen sind Epilepsie, Hirnischämie, Ictus und die Alzheimer'sche Krankheit.
Es ist gezeigt worden, daß eine pharmazeutische Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindung im Bereich des Gehirns eine Zunahme von Kynurensäure hervorruft, die als natürlicher Antagonist der erregenden Aminosäuren erkannt worden ist.

Beschreibung des Standes der Technik

3-Indolbrenztraubensäure ist eine bekannte Verbindung.
In der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung Nr. 106813, entsprechend dem US-Patent Nr. 4551471, ist ein Verfahren zur enzymatischen Synthese von 3-Indolbrenztraubensäure beschrieben, welches Aspartat-Aminotransferase als Enzym verwendet.
In der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung Nr. 0227787 ist ein Verfahren zur chemischen Synthese von 3-Indolbrenztraubensäure beschrieben, welches eine Kupplungsreaktion, ausgehend von L-Tryptophan verwendet.
GB-A-1,550,993 beschreibt die Herstellung des Na-Salzes von 3- Indolbrenztraubensäure.
Chemical Abstract, Band 91: 21026g beschreibt die Synthese von 3-Indolbrenztraubensäuremethyl- und -ethylestern.
Chemical Abstract, Band 75: 85992w offenbart, daß 3-Indolbrenztraubensäuremethylester als Additiv zu Hühnerfutter verwendet wird.
EP-A-48,159 und EP-A-46,291 beziehen sich auf blutdrucksenkende oder hypotonische pharmazeutische Mittel.
Das erste Dokument offenbart ein Jod-substituiertes Prolinamid von 3-Indolbrenztraubensäure.
Darüberhinaus ist seit mehreren Jahren bekannt, daß Tryptophanderivate in Säugern mit den Rezeptoren von sogenannten "erregenden Aminosäuren", namentlich Glutamat, N-Methylaspartat, Ibotensäure, Kainsäure usw. wechselwirken können.
Insbesondere ist beobachtet worden, daß Chinolinsäure und Kynurenin starke Antagonisten von erregenden Aminosäuren sind, die in dem zentralen Nervensystem von Säugern vorhanden sind (als Beispiel siehe: Science 219, 316-8, 1983; Neuropharmacology 23, 333-7, 1984), und daß sie zu einem raschen neuronalen Zerfall, ähnlich dem, der bei Epilepsie und Chorea Huntington beobachtet wird, führen können (TIPS 1984, Seite 215).
Die klinische Bedeutung der erregenden Aminosäuren hat erhebliches Interesse gefunden, so daß die Organisation von regelmäßigen Symposien, um auf dem neuesten Stand zu sein, wie etwa dem in London am 13. und 14. April 1987 abgehaltenen ("Excitatory aminoacids in health and disease") und die Veröffentlichung von vollständigen monographischen Ausgaben in wissenschaftlichen Magazinen (siehe TINS, Band 10, Nr. 7, 1987) dadurch veranlaßt wurden. Entsprechend den allerneuesten Erkenntnissen können die Hemmer von anregenden Aminosäuren zum Blockieren von Tremor und spastischen Zuständen, Epilepsie, neurodegenerativen Störungen, Hirnischämie, Psychose und den Folgen von zerebralem Ictus verwendet werden (Scrip 1198, 27, 1987)
Kürzlich ist entdeckt worden, daß ein weiteres Derivat von Tryptophan, nämlich Kynurensäure, ein starker Hemmer der erregenden Wirkungen ist, die von Chinolinsäure, N-Methyl-D- Aspartat und anderen Aminosäuren hervorgerufen werden (J. Pharmacol. Exptl. Ther. 236, 293-9, 1986) und es deshalb den neuronalen Zerfall im Gehirn hemmen könnte, der durch die oben erwähnten Verbindungen während epileptischen Anfällen, Ictus, Hirnischämie und ganz allgemein bei neuronalen Veränderungen, die während des Alterns auftreten, hervorgerufen wird.
Es ist jedoch nicht möglich, eine Zunahme von Kynurensäure im Bereich des Gehirns durch Verabreichung von Kynurensäure selbst zu erreichen, da die Blut-Hirn-Schranke verhindert, daß die Verbindung das Gehirn von außen erreicht. Folglich kann es weder oral noch über eine normale Injektion in nützlicher Weise verabreicht werden, um den zerebralen Gehalt von Kynurensäure zu erhöhen.
Es ist darüberhinaus aus dem Stand der Technik bekannt, daß Kynurensäure eine endogene Verbindung ist. Sie rührt in sehr kleinen Mengen aus Tryptophan der Nahrung her. Doch kann selbst Tryptophan nicht als Medikament für diesen Zweck verabreicht werden, da es auch zu Kynureninen umgewandelt wird, die eine Wirkung haben, die der von Kynurensäure entgegengesetzt ist.
Es ist zuvor gezeigt worden (veröffentlichte europäische Anmeldung Nr. 106813), daß 3-Indolbrenztraubensäure ein bevorzugter Vorläufer von zerebralem Serotonin ist und als solche pharmakologisch bei all den Erkrankungen verwendet werden könnte, die durch einen Mangel eines solchen endogenen Amins gekennzeichnet sind.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist nun überraschenderweise gefunden worden, daß 3-Indolbrenztraubensäure, ebenso wie manches einfache Derivat davon, leicht "in vivo" in Säugern in Kynurensäure umgewandelt werden kann, und daß der zerebrale Gehalt dieser Säure wesentlich erhöht werden kann.
In der Tat ist es überraschend und ist es ein äußerst nützliches Ergebnis, entsprechend den vorstehend dargelegten Überlegungen, daß der Gehalt an Kynurensäure im Gehirn durch Verabreichung von 3-Indolbrenztraubensäure oder einer erfindungsgemäßen Verbindung erhöht werden kann.
Auf der Grundlage von pharmakologischen Tests, die im folgenden beschrieben werden, welche eine Zunahme von Kynurensäure in Bereich des Gehirns infolge einer Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen bezeugen, wird eine Erläuterung des möglichen Wirkungsmechanismus im folgenden gegeben.
Die Tatsache, daß 3-Indolbrenztraubensäure in allen von uns untersuchten Organen leicht in Kynurensäure umgewandelt wird, wogegen andere Derivate der Kynureninklasse nicht vorhanden sind, legt nahe, daß die Ketosäure die folgenden Umwandlungen in dem Säugerorganismus durchmacht: 3-Indolbrenztraubensäure Kynurensäure
Die Öffnung des Indolrings von 3-Indolbrenztraubensäure könnte durch das Enzym Indolamin-Dioxygenase hervorgerufen werden, welches dafür bekannt ist, daß es in allen Säugergeweben vorkommt und nur in Gegenwart von Peroxidanionen wirkt (siehe z.B.: J. Biol. Chem. 250, 5960-6, 1975). Jedoch kann eine direkte Ringöffnung selbst in Abwesenheit von Enzymen nicht ausgeschlossen werden, da bekannt ist, daß die Peroxidanionen und die freien Radikale extrem aktive Verbindungen sind und die Bildung von Kynurensäure aus 3-Indolbrenztraubensäure auch in "in vitro"-Systemen ohne das Vorhandensein von Säugergeweben nachgewiesen worden ist (siehe Untersuchung Nr. 1, die im folgenden beschrieben ist).
Da allgemein bewiesen ist, daß die Peroxidanionen und die freien Radikale an der Hervorbringung einer Vielzahl von Situationen des neuronalen Zerfalls beteiligt sind (siehe "Free radicals in medicine and bioiogy", Acta Physiol. Scand. suppl. 492, 1980), scheinen 3-Indolbrenztraubensäure und ihre Derivate selektive Mittel zum Erhöhen der Gehalte von Kynurensäure im Gehirn zu sein, hauptsächlich in Situationen von zerebralen Störungen, und folglich können sie als Medikamente bei krankhaften Zuständen wie Epilepsie, Ictus, Hirnischämie und Dementia senilis vom Alzheimer'schen Typ verwendet werden.
Ein Verfahren zur Herstellung von 3-Indolbrenztraubensäure kann ausgehend von L-Tryptophan ausgeführt werden, welches das Umsetzen von L-Tryptophan mit dem Enzym L-Aminosäureoxydase in einem sauerstoffhaltigen wäßrigen Medium bei einem pH von etwa 7,5 umfaßt.
Aufgabe der Erfindung sind neue Derivate von 3-Indolbrenztraubensäure der Formel
worin X -OR, -NHR, -NR&sub2; oder
ist,
worin R Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, tert.-Butyl, Cyclohexyl oder Benzyl oder ein Metall aus der Gruppe, die aus Mg, Ba besteht, das mit 3-Indolbrenztraubensäure ein Salz bildet, bedeutet, R' eine Gruppe ist, die zusammen mit der Gruppe -NH-CH-COO- ein L-ALA, L- oder D-PHE, L- oder D-TYR oder L- oder D-PRO-Radikal bildet, und R'' H oder Methyl bedeutet.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung sind pharmazeutische Formulierungen, welche die oben erwähnten neuen Verbindungen enthalten, zur Behandlung von Störungen des Zentralnervensystems, welche durch die Anwesenheit einer großen Menge von Peroxidanionen oder freien Radikalen im Gehirn hervorgerufen werden, und die Verwendung von 3-Indolbrenztraubensäure und ihren Derivaten der Formel 1 zur Herstellung von Medikamenten für die oben erwähnte therapeutische Indikation.

Beschreibung des Verfahrens zur Herstellung von 3-Indolbrenztraubensäure

3-Indolbrenztraubensäure kann hergestellt werden ausgehend von L-Tryptophan, wobei ein neues Verfahren der enzymatischen Synthese benützt wird. Tatsächlich wird die Aminosäure mit L-Aminosäureoxydase, einem Enzym, welches in einer großen Zahl von Schlangengiften in großer Menge vorhanden ist, in einem kontinuierlich mit Sauerstoff versorgten wäßrigen Medium reagieren gelassen.
3-Indolbrenztraubensäure wird gemäß der folgenden Reaktion gebildet:
L-Tryptophan + O&sub2; T 3-Indolbrenztraubensäure + NH&sub3; + H&sub2;O&sub2;.
Um den Abbau der gebildeten Ketosäure durch H&sub2;O&sub2; zu vermeiden wird Katalase, ein Enzym, welches H&sub2;O&sub2; in H&sub2;O und O&sub2; umwandelt, ebenfalls der Lösung zugegeben.
Eine erhebliche Menge an 3-Indolbrenztraubensäure kann in einem kontinuierlichen Flußreaktor erhalten werden, welcher eine erste Säule umfaßt, die mit Harz gefüllt ist, an das eine geeignete Menge der Enzyme L-Aminosäureoxydase und Katalase gebunden worden ist.
Das Enzym L-Aminosäureoxydase kann aus dem Gift verschiedener Schlangenarten wie Ankistrodon, Bitis, Crotalus, Dendroaspis, Naja, Pseudechis, Trimeresurus, Viper und dergleichen erhalten werden.
Katalase kann z.B. aus Rinderleber erhalten werden.
Es ist gezeigt worden, daß eine Vielzahl von Harzen in der Lage sind, die Enzyme in einer solchen Weise zu binden, daß ihre katalytische Aktivität nicht beeinträchtigt wird. Unter diesen sind Harz vom Eupergit C-Typ (hergestellt von Rohm Pharma), Aminoaril CPG (hergestellt von Pearce), Michroprep silica (hergestellt von E. Merck) und mit quaternisiertem Polyethylenimin überzogenes Natriumalginat besonders brauchbar.
In der zweiten Säule ist ein Ionenaustauscherharz (wie Amberlite X AD-4) eingefüllt, welches in der Lage ist die gebildete 3-Indolbrenztraubensäure festzuhalten und Tryptophan, das wiederverwertet werden soll, hindurchzulassen.
Das System wurde durch zwei peristaltische Pumpen mit der gleichen Flußrate, die an die erste Säule und die Reagenzienzufuhr, die aus einer gepufferten L-Tryptophanlösung (wie einem Phosphatpuffer mit einem pH von 7 bis 8) besteht, angeschlossen sind, in Betrieb gesetzt.
Im folgenden wird ein Beispiel zur Herstellung von 3-Indolbrenztraubensäure beschrieben.
500 mg des Enzyms L-Aminosäureoxydase aus dem Gift von Crotalus Atrox wurden in Phosphatpuffer 1M pH 7,5 gelöst.
6 g Eupergit C-Harz wurden unter leichtem Rühren zugegeben und 24 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Zur gleichen Zeit wurden 10 mg Katalase aus Rinderleber zu 10 ml eines 1M Phosphatpuffers vom pH 7,5 zugegeben.
3 g Eupergit C-Harz wurden dann unter leichtem Rühren zugegeben und 24 Std. lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Harze wurden in einen porösen Filter vereinigt und die Lösung wurde durch Schwerkraft eluiert. Nach dem Waschen mit 300 ml eines 0,1M Phosphatpuffers vom pH 7,5 wurde das Harz in eine erste Säule gepackt. Eine zweite Säule wurde mit 5 g Amberlite X AD-4-Harz, welches zuvor mit 0,1M Phosphatpuffer vom pH 7,5 eingestellt worden war, beschickt. 500 mg L-Tryptophan in 100 ml 0,1M Phosphatpuffer pH 7,5 wurden zu der Lösungszufuhr gegeben. Die Flußrate wurde auf 1 ml/min festgesetzt. Nach 22 Std. wurde die zweite Säule abgetrennt und die Lösung wurde mit Methanol eluiert.
Die so erhaltene 3-Indolbrenztraubensäure wurde getrocknet und gewogen (etwa 200 mg).

Herstellung der Derivate von 3-Indolbrenztraubensäure

Die 3-Indolbrenztraubensäurederivate wurden mit dem Ziel synthetisiert, es den Verbindungen zu ermöglichen, leichter die Blut-Hirn-Schranke zu passieren und folglich die Gehalte an Kynurensäure, die im Zentralnervensystem gebildet wird, zu erhöhen.
Für diese Synthese wurden im wesentlichen vier Wege befolgt:
a) die Salze wurden durch die Alkoholate der entsprechenden Metalle in wasserfreiem Ether erhalten;
b) der Methylester von 3-Indolbrenztraubensäure wurde durch Umsetzen der Säure mit Diazomethan hergestellt;
c) der Methylester und andere Ester wurden durch Umsetzen des Carboxylions mit Alkylhalogeniden mit entsprechender nukleophiler Substitution des Halogens hergestellt. Da die Säure sehr instabil ist, wurde zu Beginn eine Salzbildungsreaktion mit DBU (1,8-Diazabicyclo-[5.4.0]-undec- 7-en) bewirkt, was einen Komplex mit einer großen Ladungsverschiebung bildet. Dieser Komplex, der stark nukleophil und eine schwache Base ist, kann primäre, sekundäre, tertiäre Alkyl- und Benzylhalogenide angreifen, ohne gleichzeitig zu Eliminationsreaktionen zu führen. Auf diese Weise wurden Methyl-, Ethyl-, Isopropyl-, tert.-Butyl-, Benzylester synthetisiert und in einer ähnlichen Weise können Propyl-, Butyl-, Cyclohexylester und dergleichen synthetisiert werden;
d) Verbindungen vom Amidtyp wurden erhalten durch eine Reaktion, welche die Carboxylgruppe von 3-Indolbrenztraubensäure mittels eines Carbodiimids in Gegenwart von Hydroxybenzotriazol unter Bildung des entsprechenden aktivierten Esters aktiviert. Dieser wird durch eine Amingruppe unter Bildung der entsprechenden Amidbindung (wenn es sich um ein Amin handelte) oder einer Peptidbindung (wenn es sich um eine geschützte Aminosäure handelte) angegriffen. Im folgenden werden einige Beispiele zur Herstellung der 3-Indolbrenztraubensäurederivate beschrieben.

Beispiel 1

Herstellung des Mg-Salzes von 3-Indolbrenztraubensäure

Die Verbindung wurde durch Umsetzen der Ketosäure mit Magnesiumoxid in einem wasserfreien Ethermedium hergestellt: wasserfrei
Eine wasserfreie Etherlösung von 3-Indolbrenztraubensäure (IPA) (200 mg) wird mit 40 mg MgO unter Rühren in einer Argonatmosphäre bei 20 bis 25ºC versetzt. Die Suspension wurde eine Nacht lang gerührt. Eine große Menge eines flockigen wasserlöslichen Niederschlags wurde gewonnen, welcher sorgfältig mit Et&sub2;O gewaschen wurde. Der Niederschlag wurde unter Vakuum eine Nacht lang getrocknet. Die Umwandlung in das Salz erfolgte zu etwa 90%. Dieses Salz weist einen Schmelzpunkt von 215ºC mit Zersetzung auf.

Beispiel 2

Natrium, Kalium, Calcium und Barium-3-Indolpyruvate werden in der gleichen Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt.

Beispiel 3

Herstellung von 3-Indolbrenztraubensäuremethylester

1,0 g 3-Indolbrenztraubensäure wurde in 50 ml wasserfreiem Benzol unter Argonatmosphäre suspendiert. 1,5 ml DBU wurde bei Raumtemperatur unter starkem Rühren zugegeben. Dann wurde zu Erwärmen begonnen, um das Benzol zu refluxieren.
Beinahe sofort verwandelt sich die gelbe Suspension in einen dunkelgelben kautschukartigen Feststoff, welcher das Rühren erschwert. Bei einer Temperatur von etwa 50 bis 60ºC wurden 1,0 ml CH&sub3;I, verdünnt in 5 ml wasserfreiem Benzol, zugegeben. Beim Refluxieren des Benzols wurde festgestellt, daß der kautschukartige Feststoff in eine braunrote Verbindung umgewandelt wurde.
Nach einer Nacht Refluxieren unter Argonatmosphäre wurde die Benzollösung abgegossen und der rötliche Feststoff wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; aufgenommen, bis er aufgelöst war. Die organischen Lösungen wurden vereinigt und der Niederschlag wurde abfiltriert. Die organische Lösung wurde nacheinander mit einer 5%igen NaHCO&sub3;-Lösung (10 x 50 ml), gesättigter NaCl-Lösung bis zur Neutralität, einer 5%igen KHSO&sub4;-Lösung (10 x 50 ml) und gesättigter NaCl-Lösung bis zur Neutralität gewaschen. Nachdem sie eine Nacht lang über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; gelassen wurde, wurde sie abfiltriert und der Rückstand wurde durch Blitzchromatographie auf Silicagel (Elutionsmittel CH&sub2;Cl&sub2;90/Aceton 10) gereinigt, wobei so ein leicht gelber chromatographisch reiner Feststoff erhalten wurde (1 Fleck bei der Dünnschichtchromatographie und ein Peak bei der HPLC).
Die Struktur wurde durch IR- und NMR-Spektroskopie bestätigt. Die Ausbeute betrug etwa 60%.

Beispiel 4

Herstellung von 3-Indolbrenztraubensäuremethylester

Unter Befolgung des gleichen Verfahrens wie zuvor beschrieben, wurde 1,0 g 3-Indolbrenztraubensäure mit 1,5 ml DBU und 790 ul Ethylbromid umgesetzt. In diesem Fall erschien die Benzollösung rotorange. Nach der Blitzchromatographiereinigung wurde der Ethylester mit einer Ausbeute von etwa 70% erhalten.

Beispiel 5

Herstellung von 3-Indolbrenztraubensäurebenzylester

Unter Befolgung des gleichen Verfahrens wie zuvor beschrieben, wurden 1,0 g 3-Indolbrenztraubensäure mit 1,5 ml DBU und 850 ul Benzylchlorid umgesetzt. Die Benzollösung vor den Extraktionen erschien rotorange. Die Blitzchromatographiereinigung wies eine 65%ige Ausbeute an Benzylester auf.

Beispiel 6

In einer ähnlichen Weise wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben werden die Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, tert. -Butyl- und Cyclohexylester hergestellt.

Beispiel 7

Herstellung von N-N-Dimethyl-3-indolpyruvamid

Eine Lösung von 500 mg 3-Indolbrenztraubensäure in 25 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran auf einem Eis-Salz-Bad wurde unter Argonatmosphäre und unter Rühren in rascher Abfolge versetzt mit: 400 mg Hydroxybenzotriazol (HOBt) und 570 mg 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid.HCl (EDC.HCl). Nach dem Auflösen und unter Beibehaltung des Eis-Salz-Bades wurden 240 mg Dimethylamin.HCl, gelöst in 10 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran, und 325 ul 4-Methylmorpholin (NMM) zugegeben. Die gelbgoldene Lösung wurde unter Rühren eine Nacht lang gehalten, wobei die Badtemperatur auf Raumtemperatur ansteigen gelassen wurde. Das Volumen wurde dann durch Zugabe von CH&sub2;Cl&sub2; verdreifacht und die organische Lösung wurde in der Reihenfolge mit 5% NaHCO&sub3; (10 x 25 ml), gesättigter NaCl-Lösung (3 x 25 ml), 5% KHSO&sub4; (10 x 25 ml) und gesättigter NaCl-Lösung bis zur Neutralität gewaschen. Nachdem sie eine Nacht lang über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; gestanden hatte, wurde sie abfiltriert, das Gemisch wurde durch Blitzchromatographie (Silicagel, Elutionsmittel CH&sub2;Cl&sub2;- 25/n-Propanol 1,5) gereinigt.
Ein stark hygroskopischer Feststoff wurde erhalten, der sich in der Dünnschichtchromatographie und bei der HPLC als rein erwies. Das Amid wurde durch IR- und NMR-Spektren charakterisiert (Ausbeute etwa 35%).

Beispiel 8

Herstellung von N-Cyclohexyl-3-indolpyruvamid

Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 7 beschrieben, wurde zur Herstellung von N,N-Dimethylamid befolgt. 500 mg 3-Indolbrenztraubensäure wurden mit 400 ml HOBt und 570 ml EDC.HCl umgesetzt. 340 ul frisch destilliertes Cyclohexylamin und 325 ul NMM wurden zu der Lösung zugegeben, die 5 Std. lang reagieren gelassen wurde.
Nach der Blitzchromatographiereinigung wurde eine Ausbeute von 50% nachgewiesen.

Beispiel 9

Herstellung von N-Benzyl-3-indolpyruvamid

Unter Befolgung des gleichen Verfahrens wie zuvor in Beispiel 7 beschrieben, wurden 500 mg 3-Indolbrenztraubensäure mit 400 mg HOBt und 570 mg EDC.HCl umgesetzt. 425 mg Benzylamin und 325 ul NMM wurden dann zugegeben. Nachdem sie eine Nacht lang reagieren gelassen wurden, wurde es durch Blitzchromatographie gereinigt.
Die Endausbeute scheint etwa 55% zu sein.

Beispiel 10

Unter Befolgung des gleichen Verfahrens wie in den Beispielen 7 bis 9 beschrieben, werden N,N-Diethyl-, N,N-Dipropyl-, N,N- Dibutyl-, N-Methyl-, N-Ethyl-, N-Propyl-, N-Isopropyl-, N-Butyl-, N-tert.-Butyl-3-indolpyruvamid hergestellt.
Pseudo-Dipeptide sind durch Reaktion von 3-Indolbrenztraubensäure (IPA) und Methylestern von Aminosäuren hergestellt worden.

Beispiel 11

Herstellung von IPA-L-ALA-OMe

400 mg HOBt und 570 mg EDC.HCl wurden in rascher Abfolge zu einer Lösung von 500 mg 3-Indolbrenztraubensäure in 30 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran unter Rühren auf einem Eis-Salz-Bad und unter Argonatmosphäre zugegeben. Nach dem Auflösen und unter Beibehaltung des Eis-Salz-Bades wurde eine kalte Lösung von 415 mg L-Alanin-Methylester.HCl in 10 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran und 325 ul NNM zugegeben. Die gelbliche Lösung wurde 3 Std. lang gerührt, wobei die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen gelassen wurde. Dann wurde das Volumen mit CH&sub2;Cl&sub2; verdreifacht und das Reaktionsgemisch wurde nacheinander mit 5% NaHCO&sub3; (10 x 20 ml), gesättigter NaCl-Lösung (3 x 50 ml), 5% KHSO&sub4; (10 x 20 ml) und gesättigter NaCl-Lösung bis zur Neutralität behandelt. Die gelbliche Lösung wurde eine Nacht lang über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; stehen gelassen, dann wurde dieses abfiltriert und das Pseudo-Dipeptid wurde durch Blitzchromatographie gereinigt.
Ein hygroskopischer gelblicher Feststoff wurde erhalten, der in der Dünnschichtchromatographie und in der HPLC rein erschien. Die Struktur wurde durch IR- und NMR-Spektren bestätigt. Die Ausbeute betrug 40%.
Unter Befolgung des gleichen Verfahrens wurde die Verbindung IPA-D-ALA-OMe hergestellt, wobei offensichtlich von D-Alanin ausgegangen wurde.
Beide Ester wurden dann verseift, um die freien Säuren zu erhalten.

Beispiel 12

Herstellung von IPA-L-PHE-OMe, IPA-D-PHE-OMe und der entsprechenden freien Säuren

Durch das gleiche Verfahren wie vorstehend beschrieben wurden 500 mg 3-Indolbrenztraubensäure mit 400 mg HOBt und 570 mg EDC.HCl umgesetzt. 640 mg Phenylalaninmethylesterhydrochlorid (L oder D) und 325 ul NNM wurden dann zugegeben. Nach 5-stündiger Reaktion und Reinigung wurden hygroskopische gelbliche Feststoffe mit einer Ausbeute von etwa 55% gewonnen.

Beispiel 13

Herstellung von IPA-L-TYR-OMe, IPA-D-TYR-OMe und der entsprechenden freien Säuren

Unter Befolgung des gleichen Verfahrens wie vorstehend beschrieben wurden 500 mg 3-Indolbrenztraubensäure mit 400 mg HOBt und 570 mg EDC.HCl umgesetzt. 690 mg Tyrosinmethylester (L oder D) und 325 ul NNM wurden zugegeben. Nach 5-stündiger Reaktion und Reinigung wurden hygroskopische gelblich-goldene Feststoffe mit einer Ausbeute von 65% erhalten.

Beispiel 14

Herstellung von IPA-L-PRO-OMe, IPA-D-PRO-OMe und der entsprechenden freien Säuren

Unter Befolgung des gleichen Verfahrens wie vorstehend beschrieben wurden 500 mg 3-Indolbrenztraubensäure mit 400 mg HOBt und 570 mg EDC.HCl umgesetzt. 370 mg Prolinmethylesterhydrochlorid (L oder D) und 270 ul NNM wurden zugegeben. Nach der eine Nacht dauernden Reaktion und der Reinigung wurden hygroskopische gelbliche Feststoffe mit einer Ausbeute von 40% erhalten.

Beispiel 15

Unter Befolgung des gleichen Verfahrens wie in den Beispielen 10 bis 14 beschrieben werden die anderen Pseudo-Dipeptide durch Umsetzen von 3-Indolbrenztraubensäure mit dem entsprechenden Aminosäuremethylester erhalten.

Pharmakologische Untersuchungen

Pharmakologische Untersuchungen sind durchgeführt worden, um die Gehalte und die Aktivität von Kynurensäure in verschiedenen tierischen Organen zu bestimmen.
Zur Messung solcher Gehalte nach der Verabreichung von 3-Indolbrenztraubensäure oder einem Derivat davon wurde ein System aufgebaut, das auf dem Ultraviolettnachweis der durch Hochdruck-Flüssigchromatographie aufgetrennten Verbindungen beruhte.
Kurz gesagt wurden nach der Tötung des Tieres einige der hauptsächlichen Organe entnommen und mit alkalischem Ethanol homogenisiert. Proteine und Zellrückstände wurden durch Zentrifugation entfernt, wogegen der Überstand an Bio-Rad AG 1x8-Harz adsorbiert wurde. Nach dem Waschen mit Wasser wurde er mit Ameisensäure eluiert. Dann wurde er auf Bio-Rad AG 50W-x8-Harz überführt, mit 3%igem Ammoniak eluiert, getrocknet und mit einer kleinen Menge Wasser wieder aufgenommen.
Die so erhaltene Probe wurde in ein Waters-Gerät für Hochdruck-Flüssigchromatographie injiziert, wobei eine C18 10um-Säule verwendet und mit 0,02 m Zitronensäure, welche 10% Methanol enthielt, eluiert wurde. Die Kynurensäuregehalte wurden durch die Kalibrationslinie der Säure und Ablesung bei 234 nm extrapoliert.
Die im folgenden beschriebenen Untersuchungen haben das Ziel, die Wirkung der Verabreichung von TPA und ihren Derivaten der Formel 1 auf die Produktion von Kynurensäure im Gehirn zu erläutern. Die Untersuchungen zeigen auch, daß die Substanz, die eine solche Wirkung hervorruft eher IPA als Tryptophan ist.
Es ist in der Tat gut bekannt, wie vorstehend erwähnt, daß Tryptophan (kurz TRP) innerhalb der peripheren Gewebe in Kynurenine umgewandelt wird und es könnte vermutet werden, daß diese Kynurenine für die Produktion von Kynurensäure im Gehirn verantwortlich sein könnten. Dies ist jedoch nicht der Fall, wie die folgenden Untersuchungen zeigen. Die Untersuchungen bestätigen, daß nur eine Verabreichung von IPA dazu führt, daß der Gehalt von Kynurensäure in Gehirn wesentlich ansteigt.

Untersuchung 1

Umwandlung von 3-Indolbrenztraubensäure in Kynurensäure "in vitro", in einem nicht-enzymatischen System.
Wenn 3-Indolbrenztraubensäure oder ein Derivat davon der Formel 1 in einer leicht sauren Lösung (HCl 0,1M) in Gegenwart von Oxidationsmitteln (O&sub2;) und Licht inkubiert wird, wird mit der Zeit die Bildung von kleinen Mengen von Kynurensäure beobachtet. Im einzelnen werden ausgehend von 2 mg 3-Indolbrenztraubensäure, 0,5 ug nach 2 Std. und 0,7 ug nach 4 Std. erhalten.
Diese Untersuchung zeigt, daß 3-Indolbrenztraubensäure selbst ohne Enzyme in Kynurensäure umgewandelt wird, sogar "in vitro".

Untersuchung 2

Umwandlung von 3-Indolbrenztraubensäure in Kynurensäure in Gewebehomogenaten

Männliche Ratten, die 16 Std. gefastet hatten, wurden getötet und ihre Organe wurden entnommen und in 5 Volumina von 0,05M Phosphatpuffer, pH 7,4 + 0,14 M KCl homogenisiert.
Kleine Mengen an Homogenat (0,8 ml) wurden mit verschiedenen Mengen 3-Indolbrenztraubensäure oder den Derivaten davon, gelöst in einer Pufferlösung, und mit einem System zu Erzeugung von freien Radikalen, welches aus Ascorbinsäure (Endkonzentration 10&supmin;&sup5; M), FeCl&sub3; (Endkonzentration 10&supmin;&sup6; M) und H&sub2;O&sub2; (Endkonzentration 10&supmin;&sup4; M) bestand, versetzt. Es wurde bei 37ºC gerührt, dann wurde die Reaktion blockiert. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten. Tabelle 1 Nierenhomogenat Menge der gebildeten Kynurensäure 3-Indolbrenztraubensäure Tryptophan Endmenge Tabelle 2 Hirnhomogenat Menge der gebildeten Kynurensäure 3-Indolbrenztraubensäure Tryptophan TPA-Methylester IPA = 3-Indolbrenztraubensäure IPA-TYR-Ome = 3-Indolbrenztraubensäuretyrosinmethylester IPA-PHE-Ome = 3-Indolbrenztraubensäurephenylalaninmethylester
Die Ergebnisse zeigen, daß Kynurensäure mit der Zeit gebildet wird, wenn 3-Indolbrenztraubensäure mit Homogenaten von verschiedenen Organen inkubiert wird.
Tryptophan im Gehirn wird niemals in Kynurensäure umgewandelt, wie in Tabelle 2 gezeigt ist, und dies beweist, daß die Umwandlung in Kynurensäure nur direkt aus der IPA-Ketosäure heraus erfolgt.
In der Niere, wo Kynurenintransaminase vorhanden ist, ist es möglich, daß Kynurensäure auch aus Kynurenin gebildet wird. Es ist jedoch bekannt, daß diese Kynurensäure das Gehirn nicht erreichen kann, in dem dies durch die Blut-Hirn-Schranke verhindert wird.
Darüberhinaus zeigt Tabelle 2, daß die Derivate von IPA auch in der Lage sind, Kynurensäure zu erzeugen, wenn sie in Gehirnhomogenat inkubiert werden.
Zusammengefaßt zeigt diese Untersuchung, daß IPA in der Lage ist, sich im Gehirn in Kynurensäure umzuwandeln, wogegen Tryptophan dies nicht kann.

Untersuchung 3

Auswirkung auf den Gehalt an Kynurensäure nach der Verabreichung von IPA in Ratten

Männliche Ratten wurden mit Salzlösung (Kontrollen) oder mit verschiedenen Dosen von IPA behandelt, welche 3 Std. vor der Tötung injiziert wurden. Jede Gruppe umfaßte 10 Tiere.
Die Ergebnisse sind in Picomol/g Gewebe (oder ml Blut) ± Standardfehler angegeben. Tabelle 3 Leber Blut Gehirn Salzlösung
Die Ergebnisse zeigen, daß die Verabreichung von IPA einen Anstieg der Gehalte von Kynurensäure in den untersuchten Geweben herbeiführt. Ein solcher Anstieg ist dosisabhängig. Diese Tatsache ist insbesondere wichtig im Gehirn, wo für eine 500 mg/ kg-Dosis von IPA Kynurensäure-Werte erhalten werden, die sechsmal höher sind als die Kontrollen.
Diese Untersuchung zeigt, daß eine Verabreichung von IPA dazu führt, daß der Gehalt an Kynurensäure im Gehirn in einem von der Dosis abhängigen Maß ansteigt. Es sollte beachtet werden, wie vorstehend erläutert, daß eine Verabreichung von Tryptophan keine solche Wirkung hervorruft.

Untersuchung 4

Wirkungen auf den Gehalt von Tryptophan und Kynurensäure im Gehirn von Ratten, durch Behandlung mit IPA oder Tryptophan.

Männliche Ratten wurden mit Salzlösung (Kontrollen), IPA oder Tryptophan i.p. 1 Std. vor der Tötung behandelt. Jede Gruppe bestand aus 6 Tieren.
Die angegebenen Werte sind in Picomol/g für Kynurensäure und Picomol/mg für Tryptophan. Tabelle 4 Kynurensäure Tryptophan Salzlösung
Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigen, daß im Gehirn Kynurensäure vorzugsweise eher durch direkte Öffnung des Indolrings von IPA als über die Kynurenine gebildet wird.
Folglich kann IPA als selektiver Vorläufer der Kynurensäure im Gehirn angesehen werden.
In der Tat sollte, da in Untersuchung Nr. 2 gezeigt wurde, daß TRP im Gehirn sich nicht in Kynurensäure umwandelt, die Anwesenheit von Kynurensäure aufgrund der Verabreichung von TRP auf die Umwandlung von Kynureninen, die aus peripheren Organen kommen, in Kynurensäure zurückzuführen sein.
Andererseits schließt das Verhältnis des Gehalts an Kynurensäure zu dem von Tryptophan den gleichen Syntheseweg für 3-Indolbrenztraubensäure aus.
Dies bewies, daß 3-Indolbrenztraubensäure im Gehirn sich direkt in Kynurensäure umwandelt.

Untersuchung 5

Zeitlicher Verlauf der Kynurensäuregehalte nach der Verabreichung von IPA.

Männliche Ratten in Gruppen von jeweils 5 Tieren wurden i.p. mit 250 mg/kg IPA behandelt und zu verschiedenen Zeiten getötet, wobei die Gehalte an Kynurensäure, die in verschiedenen Organen vorhanden ist, bestimmt wurden.
Die Ergebnisse sind in Picomol/g ± Standardfehler angegeben. Tabelle 5 Kontrolle Stunde Stunden Gehirn Leber Niere Herz
Die Ergebnisse zeigen eine hohen Anstieg von Kynurensäure in allen untersuchten Organen (Maximum in der Niere). Die Gehalte bleiben selbst nach 4 Stunden nach der Verabreichung hoch.

Untersuchung 6

Wirkung der Verabreichung von IPA oder Derivaten davon auf audiogene Krämpfe in DBA2-Mäusen.
Um zu bestimmen, ob ein Anstieg der Kynurensäure im Gehirn nach Verabreichung von IPA eine Schutzwirkung auf Neuronen haben könnte, die durch erregende Aminosäuren gestreßt sind, wurde das experimentelle Schema befolgt, welches Krämpfe in einem besonderen Mäusestamm (DBA2) durch ausgewählte Schallstimulierung hervorruft. In einem solchen Schema schützt Kynurensäure gegen Krämpfe.
Die Substanzen wurden intravenös 1 Stunde vor dem Test injiziert. Dann wurde die Anzahl der Tiere, die tonische Krämpfe aufwiesen, gemessen. Tabelle 6 Tiere mit Krämpfen % Kontrollen Tryptophan 200 mg/kg Mg&spplus;&spplus; IPA-Salz
Die Ergebnisse zeigen eine gute Schutzwirkung von IPA und seinem Mg&spplus;&spplus;-Salz gegen tonische Krämpfe, die durch Schallstimulationen bei DBA2-Mäusen hervorgerufen werden. Im Gegensatz dazu wies Tryptophan keine Wirkung auf.

Untersuchung 7

Wirkung der Verabreichung von IPA auf NMDA-induzierte Krämpfe.

N-Methyl-D-asparaginsäure (NMDA) ist eine Verbindung mit einer starken neurotoxischen Wirkung aufgrund der Aktivierung von spezifischen Rezeptoren der erregenden Aminosäuren. Da gut bekannt ist, daß Kynurensäure gegen die Toxizität von NMDA schützt, wurde die Wirkung von IPA als Vorläufer von Kynurensäure gegen die Toxizität einer solchen Verbindung bestimmt.
Mäuse vom Albino Swiss-Stamm wurden mit Salzlösung (Kontrollen) oder mit IPA (1 g/kg i.p.) 1 Stunde, bevor sie eine toxische Dosis von NMDA (154 mg/kg i.p.) erhielten, behandelt. Tabelle 7 Tonische Krämpfe Todesfälle Kontrollen behandelt
Aus den obigen Ergebnissen kann abgeschätzt werden, daß IPA in der Lage ist, Mäuse sowohl gegen Krämpfe als auch Todesfälle, die durch NMDA hervorgerufen werden, zu schützen.
Daraus folgt, daß 3-Indolbrenztraubensäure und die oben beschriebenen Derivate davon zur Behandlung von menschlichen und tierischen Erkrankungen, die auf einen Mangel an Kynurensäure im Bereich des Gehirns zurückzuführen sind und allgemeiner zur Behandlung von Störungen des Zentralnervensystems, die durch die erregenden Aminosäuren hervorgerufen werden, verwendet werden können.
Die Verabreichung kann mittels pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die aktive Substanz in einer Dosis von etwa 2 bis 20 mg/kg Körpergewicht für eine "per os"-Verabreichung enthalten, und in einer Dosis von etwa 1 bis 10 mg/kg Körpergewicht für eine parenterale Verabreichung vorgenommen werden.
Für die orale, parenterale oder rektale Verabreichung können die üblichen pharmazeutischen Formen wie Pillen, Kapseln, Lösungen, Suspensionen, Injektionen, Suppositorien, in Verbindung mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmittels und Exzipienzien verwendet werden.

Claims

1. 3-Indolbrenztraubensäurederivate der Formel:

worin X -OR, NHR, -NR&sub2;, oder

worin R Propyl, Isopropyl, Butyl, tert. Butyl, Cyklohexyl oder Benzyl oder ein Metall aus der Gruppe mit Mg, Ba, das mit einer 3-Indolbrenztraubensäure ein Salz bildet, bedeutet,

R' eine Gruppe ist, die zusammen mit der -NH-CH-COO- Gruppe ein L-ALA, L- oder D-PHE, L- oder D-TYR oder L- oder D-PRO Radikal bildet, und

R" H oder Methyl bedeutet.

2. Verwendung einer Verbindung der Formel

worin X -OH, -OR, -NHR, -NR&sub2; oder

und

R Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, tert. Butyl, Cyklohexyl oder Benzyl oder ein Metall aus der Gruppe die aus Na, K, Mg, Ca, Ba besteht, das mit einer 3-Indolbrenztraubensäure ein Salz bildet, bedeutet,

R' eine Gruppe ist, die zusammen mit der -NH-CH- COO- Gruppe ein L-ALA, L- oder D-PHE, L- oder D-TYR oder L- oder D-PRO Radikal bildet, und

R" H oder Methyl bedeutet,

zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Störungen des zentralen Nervensystems, die durch Anwesenheit eines überschüssigen Anteils von erregenden Aminosäuren im Gehirn hervorgerufen werden.

3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Störungen Epilepsie, Hirnischämie, Ictus und die Alzheimer Krankheit sind.

4. Verwendung nach Anspruch 2, zur Herstellung eines Arzneimittels, das fähig ist den Kynurensäurespiegel im Gehirn zu erhöhen.

5. Arzneimittelzusammensetzungen, die als aktive Wirkstoffe 3-Indolbrenztraubensäurederivaten wie in der Formel (1) nach Anspruch 1 beschrieben, in einem therapeutisch wirksamen Anteil und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünner enthalten, zur Behandlung von Störungen des zentralen Nervensystems, die durch die Anwesenheit eines überschüssigen Anteils von erregenden Aminosäuren in Gehirn hervorgerufen werden.