DE3838718A1

DE3838718A1 - Verfahren zum aufspueren einer krankheit, die mit einer stoffwechselabnormalitaet von l-fucose in verbindung steht

Info

Publication number: DE3838718A1
Application number: DE3838718A
Authority: DE
Inventors: Takeshi Sakai; Hiroko Yokota; Kazuki Yamamoto; Sadaji Yokoyama; Susumu Matsui; Ikunoshin Kato; Akira Obayashi
Original assignee: TAKARA SHUZO CO Ltd KYOTO JP; Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1987-11-19
Filing date: 1988-11-15
Publication date: 1989-06-01
Anticipated expiration: 2008-11-16
Also published as: JPH01244741A; DE3838718C2; JP2613085B2; US4927767A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Aufspüren von Krankheiten, die mit Stoffwechselabnormalitäten oder -störungen von L-Fucose in Verbindung stehen, wie Magengeschwüren, Leberzirrhose und Karzinomen in Menschen.

Verschiedene Formen von komplexen Glykoketten, das heißt Glykoproteinen und Glykolipiden, liegen in dem lebenden Körper von höheren Tieren vor. Die meisten dieser komplexen Glykoketten enthalten als Bestandteil L-Fucose. Die kom plexen Glykoketten, welche L-Fucose in der Kette enthalten, werden beispielsweise durch ein Mucoglykoprotein, das die Magenschleimhaut schützt, ein Mucoglykoprotein, das aus den Unterkieferdrüsen ausgeschieden wird, saures alpha₁-Glyko protein und beta₂-Glykoprotein, das durch die Leber synthetisiert und von ihr ausgeschieden wird, ein Glyko protein an der Oberfläche der Erythrocytenmembran und gamma-Globulin, das in dem Knochenmark gebildet wird, sowie andere Glykoproteine und Colipide, die sich auf der Oberfläche der Zellmembran finden, repräsentiert. Wie vorstehend erwähnt, gibt es eine Vielzahl von komplexen Glykoketten, welche L-Fucose in dem lebenden Körper enthalten. Andererseits ist es bekannt, daß sich die Struktur der Zuckerketten in den komplexen Glykoketten, welche L-Fucose enthalten, ändert, oder daß die Menge dieser Glykoketten in der Körperflüssigkeit sich bei einigen Krankheiten verändert. Die berichteten Fälle betreffen beispielsweise die verminderte Sekretion von Mucoglykoprotein bei Magengeschwüren oder -krebs, die verminderte Sekretion von Glykoproteinen, wie saurem alpha₁-Glykoprotein, im Falle von Leberzirrhose und Primärtumoren der Leber und Veränderungen der Zuckerkettenstruktur von Glykoproteinen und Glykolipiden auf der Zelloberflächenmembran, welche auf die Karzinogenese der Zellen zurückgehen.

Diese Berichte beschreiben jedoch nur einfach die Veränderungen der Struktur von Glykoketten oder der Menge der Glykoketten und erläutern nicht jeweils die einzelnen Stoffwechselveränderungen in den Sacchariden dieser Glykoketten im Krankheitszustand. Darüber hinaus findet sich kein Bericht über die Beziehung zwischen dem Stoffwechsel von L-Fucose und einer spezifischen Krankheit.

Gegenstand der Erfindung ist die Schaffung eines neuen Verfahrens zur Aufspürung von spezifischen Krankheiten, die im Zusammenhang stehen mit L-Fucose-Stoffwechselabnormali täten, durch Verwendung von L-Fucose als Markierungssubstanz.

Die Erfindung betrifft ganz allgemein ein Verfahren zum Aufspüren von Krankheiten, die im Zusammenhang mit Stoffwechselabnormalitäten von L-Fucose in Verbindung stehen, und ist charakterisiert durch den Vergleich der freien L-Fucose-Konzentration in Proben, die aus dem Objekt entnommen werden, mit ihrem normalen Wert. Die Krankheit, welche mit Stoffwechselabnormalitäten von L-Fucose in Verbindung stehen, sind die nachfolgenden (1), (2) und (3).

(1) Krankheiten von viszeralen Organen mit relativ großer Menge an L-Fucose,
(2) Krankheiten von viszeralen Organen, welche Substanzen erzeugen oder ausscheiden, die eine relativ große Menge an L-Fucose enthalten,
(3) Krankheiten, welche Veränderungen in der L-Fucosemenge in komplexen Glykoketten an der Zelloberfläche verursachen.

Die vorstehenden Krankheiten (1), (2) und (3) werden nachfolgend näher erläutert: Die Beispiele von (1) sind Magengeschwüre oder Magenkrebs. Beispiele von (2) sind Leberzirrhose, Primärtumore der Leber, Brustkrebs und myelogene Tumore. Beispiele von (3) sind Lungenkrebs, Darmkrebs sowie andere Krebse.

Es wurde festgestellt, daß höhere Konzentrationen an freier L-Fucose in Proben vorliegen, die aus Patienten mit Magengeschwüren, Magenkrebs, Leberzirrhose, Primärtumoren der Leber und anderen Krebsen vorliegen als im Falle von Proben, die aus gesunden Individuen entnommen worden sind, wobei gefunden wurde, daß die Konzentration an freier L-Fucose als Index für die Krankheiten verwendet werden kann, die mit Stoffwechselabnormalitäten von L-Fucose in Verbindung stehen.

Die Proben, die erfindungsgemäß geeignet sind, sind beispielsweise Urin, Blut etc., wobei Urin bevorzugt wird, da er einfach zu sammeln und zu verwenden ist.

Erfindungsgemäß unterliegen die Methoden zum Messen der freien L-Fucose in den Proben keinerlei Einschränkungen, beispielsweise kommen enzymatische Methoden und die HPL-Chromatographie (high performance liquid chromatography) in Frage.

Die enzymatischen Methoden sind diejenigen, die L-Fucose- Dehydrogenase (nachfolgend als FDH bezeichnet) verwendet. Wie in der japanischen Patentanmeldung Kokai No. 1 75 197/87 ausgeführt wird, bestimmt dann, wenn FDH verwendet wird, eine Methode die freie L-Fucosekonzentration an Hand der Extinktion von NADH bei 340 nm, während eine andere die Konzentration an Hand der Extinktion von Formazanfarbstoff bei einer Wellenlänge im sichtbaren Spektrum berechnet.

Die FDH, die zur quantitativen Analyse verwendet wird, ist beispielsweise eine solche, wie sie in der japanischen Patentanmeldung Kokai No. 1 55 085/87 aufgeführt wird, während eine andere auf Schweineleber zurückgeht. Darüber hinaus ist es dann, wenn FDH verwendet wird, vorzuziehen, die Proben mit Bilirubinoxidase zu behandeln, da diese Methode den Blindwert herabsetzt.

Ferner kann die Konzentration an freier L-Fucose durch HPL-Chromatographie gemessen werden. Die Mengenbestimmung durch HPL-Chromatographie erfolgt beispielsweise durch den Einsatz von im Handel verfügbaren Instrumenten, wie sie von der Shimadzu Seisakusho Co. und Dionex Corporation hergestellt werden.

Die Erfindung wird an Hand der beigefügten Zeichnungen sowie der folgenden Beispiele näher erläutert. Die Erfindung ist jedoch nicht auf Einzelheiten der Beschreibung der folgenden Beispiele beschränkt.

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung, die durch Auftragen der Urinkonzentration an freier L-Fucose, gemesssen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, durch einen Patienten angefertigt worden ist.

Die Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der Eichkurve zur Messung der Urinkonzentration nach dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Beispiel 1

Die Konzentrationen an freier L-Fucose wurden unter Verwendung von Urinproben aus 21 gesunden Individuen, 7 Patienten mit Magengeschwür, 5 Patienten mit Leberzirr hose, 35 Patienten mit Magenkrebs, 12 Patienten mit Primärtumoren der Leber, 5 Patienten mit Lungenkrebs, 6 Patienten mit Brustkrebs, 5 Patienten mit Darmkrebs und einem Patient mit einem Kropf ermittelt.

Die L-Fucose wurde wie folgt gemessen:

Urin\|0,1 ml
1 Einheit/ml Bilirubinoxidase (Takara Shuzo Co., Ltd.), inkubiert bei 37°C während 15 Min.	0,1 ml
300 mM Glycin-Natriumhydroxid gepufferte Lösung (pH 8,2), enthaltend 10 mM Natriumazid	0,25 ml
2 mM Iodnitrotetrazolium	0,15 ml
0,1 ml 1-Methoxyphenazinmethosulfat	0,05 ml
20 mM NAD⁺	0,05 ml
70 Einheiten/ml FDH (Takara Shuzo Co., Ltd.), inkubiert bei 37°C während 15 Min.	0,1 ml
0,2 M Chlorwasserstoffsäure	2,0 ml

Man ließ die Reaktion in der vorstehenden Reihenfolge ablaufen, die Extinktion wurde bei 492 nm gemessen und die Ablesung war OD _t. Zur gleichen Zeit wurden Reaktionen in dem vorstehenden Reaktionssystem unter Verwendung von Wasser an Stelle von 70 Einheiten/ml FDH ablaufen gelassen, um eine Extinktion bei 492 nm zu messen. Die Ablesung war OD _b.

OD _t - OD _b = delta-OD

Wurde die Konzentration an freier L-Fucose aus dem delta-OD- Wert berechnet, dann ließ man die Reaktionen in dem vorstehenden Reaktionssystem unter Verwendung von Wasser und 1 mM L-Fucose anstatt Urin ablaufen, wobei die Extinktion bei 492 nm gemessen wurde, um eine graphische Darstellung der Eichkurve durch Auftragen der Extinktion bei 492 nm auf der Ordinate und der freien L-Fucosekonzentration auf der Abszisse aufzuzeichnen. Die Urinkonzentration der L-Fucose wurde auf der Basis der Eichkurve und des delta-OD-Wertes berechnet. Die Fig. 2 zeigt die Eichkurve (Abszisse: L-Fucosekonzentration (mM) und Ordinate: Extinktion bei 492 nm).

Untersuchungsergebnisse von freier Urin-L-Fucose gehen aus der Fig. 1 hervor. Diese Figur ist eine graphische Darstellung, auf welcher die Konzentration des Urins an freier L-Fucose, gemessen gemäß vorliegender Erfindung, durch einen Patienten aufgetragen wurden.

Wie aus der Fig. 1 hervorgeht, besteht ein Unterschied in der Verteilung der Konzentration einer L-Fucose in dem Urin zwischen gesunden Individuen und Patienten mit Magengeschwür, Leberzirrhose, Magenkrebs, Primärtumoren der Leber und anderen Krebsen. Es wurde gefunden, daß höhere Konzentrationen an freier L-Fucose im Urin bei Patienten mit Magenkrebs, Leberzirrhose und einer Vielzahl von Krebsen vorliegen, und zwar im Vergleich zu gesunden Individuen.

Beispiel 2

Mengenbestimmung an freier L-Fucose durch HPL-Chromato graphie (HPLC):

Werden die Konzentrationen an freier L-Fucose im Urin quantitativ unter den nachfolgend angegebenen Testbe dingungen gemessen, dann werden praktisch die gleichen Konzentrationen wie im Falle des Beispiels 1 erhalten.

Testbedingungen
Säule:
Shim-pack CLC-NH₂, 6×150 mm (Shimadzu Seisakusho Co.)
Mobile Phase:	75% Acetonitril
Temperatur:	30°C
Detektor:	Brechungsindex des Detektors Shodex RI SE-51 (Showa Denko Co.)

Wie vorstehend beschrieben, dient erfindungsgemäß die Urinkonzentration an freier L-Fucose als Markierungs mittel für Krankheiten, die im Zusammenhang mit Stoffwechselabnormalitäten von L-Fucose stehen, wie Magengeschwüren, Leberzirrhose, Magenkrebs, Primärtumoren der Leber und anderen Krebsen. Folglich wurde eine neue Methode zur Aufspürung der vorstehenden Krankheiten entwickelt. Insbesondere ermöglicht dieses Verfahren die Aufspürung von Magengeschwüren, Magenkrebs, Leberzirrhose und Primärtumoren der Leber auf billige Weise und ohne Schmerzverursachung, wodurch sich die Ausbeute bei Massenuntersuchungen verbessern läßt.

Claims

1. Verfahren zum Aufspüren einer Krankheit, die mit einer Stoffwechselabnormalität von L-Fucose in Verbindung steht, gekennzeichnet durch den Vergleich der Kon zentration an freier L-Fucose mit ihrem normalen Wert in einer Probe aus dem Subjekt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe Urin ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Krankheit ein Magengeschwür, eine Leberzirrhose und/ oder ein Krebs im Menschen ist.