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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren und Kits zur Diagnose der Alzheimer-Krankheit.
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Die
allgemeine Zunahme der Langlebigkeit begünstigt die Häufigkeit
der Alzheimer-Krankheit, und diese Krankheit stellt für die modernen
Gesellschaften ein größeres ökonomisches
Problem dar. Ein großer
Forschungsaufwand wird betrieben, um die Entstehung dieser Krankheit
zu verstehen, aber die Versuche, einen frühzeitigen Marker zu finden, waren
erfolglos oder unvollständig.
Der klinische Test wird meistens allein verwendet, und eine sichere
Diagnose wird erst nach der Hirnbiopsie oder Autopsie gestellt.
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Im
Jahre 1991 veröffentlichten
Masliah et al. (J. Neuroscience, 11, 2759–2767) Elemente, die vermuten
ließen,
dass Anomalien der enzymatischen Aktivität der Proteinkinase C (PKC)
ausschließlich
im Zentralnervensystem festgestellt wurden und mit Anfangsstadien
der Alzheimer-Krankheit verbunden waren. Diese Arbeiten nehmen keinen
Bezug auf Anomalien der PKC, die in Blutzellen festgestellt werden.
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Im
Jahre 1989 schlugen Gandy und Greengard (
US 4,874,694 ) vor, neurodegenerative
Krankheiten und insbesondere die Alzheimer-Krankheit nachzuweisen,
indem man durch radioaktive Markierung und Elektrophorese die in
den Liquorproben vorhandenen Proteine analysiert. Diese invasive
Technik ist schwierig durchzuführen.
Sie verwendet PKC als Reagens. Sie beweist keine Anomalie der PKC, die
mit der Alzheimer-Krankheit verbunden ist. Sie verwendet außerdem eine
Probe, die aus dem Zentralnervensystem stammt und trägt kein
Element bei, das die peripheren Organe betrifft, und insbesondere nicht
die im Blut vorhandenen Elemente.
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Vor
kurzem hat eine amerikanische Forschergruppe die Verwendung von
cholinergischen Antagonisten bei der Messung der Pupillenerweiterung
als Nachweistest vorgeschlagen (Scinto et al., 1994, Science 266:
1051–1054).
Dieser Test erlaubt jedoch keine absolute Unterscheidung der Patienten, die
unter der Alzheimer-Krankheit leiden. Sein diagnostisches Interesse
wurde in mehreren neueren Studien stark in Frage gestellt.
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Schließlich wurde
vor kurzem auch gezeigt, dass das Serum, das von Alzheimer-Patienten stammt,
Antikörper
enthält,
die von Maus-Mikrogliazellen exprimierte Antigene erkennen können. Die Gründe für diese
Eigenschaft und ihr diagnostischer Wert sind bisher noch nicht bekannt.
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Die
Beobachtung verschiedener Anomalien bei Alzheimer-Patienten führte die
Erfinder dazu, die Beziehungen zwischen diesen Anomalien und den Modifikationen
der Aktivierungsniveaus bestimmter Enzyme zu untersuchen. Unter
Berücksichtigung
der zuvor festgestellten Beziehungen zwischen einer Anomalie des
Chlortransports in Erythrocyten bei Alzheimer-Patienten und einer
Anomalie der Aktivität der
Proteinkinase C (abgekürzt
PKC) beruhten ihre Arbeiten somit in erster Linie auf der Messung
des Aktivierungsniveaus der PKC an Erythrocyten von solchen Patienten.
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Die
Erfinder haben dabei festgestellt, dass es durch Variation der Messbedingungen
möglich
ist, Daten zu erhalten, die es erlauben, eine Unterscheidung zwischen
Alzheimer-Patienten und gesunden Probanden zu treffen.
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Die
Entwicklung ihrer Arbeiten erlaubte es, zu überprüfen, dass solche Messungen,
die auf die PKA angewendet werden oder auch eine Menge von Verbindungen
einsetzen, die mit der PKC oder der PKA Wechselwirken können, auch
genutzt werden konnten, um eine Unterscheidung von Alzheimer-Patienten
zu treffen.
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Ziel
der Erfindung ist es also, ein Verfahren zur Diagnose der Alzheimer-Krankheit anzugeben, das
es erlaubt, einen zuverlässigen,
schnellen und kostengünstigeren
Test zu etablieren.
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Sie
zielt auch darauf ab, Kits bereitzustellen, die eine leichte Ausführung eines
solchen Verfahrens erlauben.
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Das
Verfahren zur Diagnose der Alzheimer-Krankheit gemäß der Erfindung
ist dadurch gekennzeichnet, dass es Folgendes umfasst:
- – die
Inkubation einer Blutprobe mit einer fluoreszierenden Sonde, welche
das katalytische Zentrum der Proteinkinase C (PKC) oder der Proteinkinase
A (PKA) erkennt, oder mit zwei fluoreszierenden Sonden, welche das
katalytische Zentrum bzw. die regulierende Domäne eines der beiden Enzyme
(PKC oder PKA) erkennen, unter Bedingungen, welche die spezifische
Bindung der Sonde oder der Sonden an PKC oder PKA ermöglichen,
wobei
die Sonde, welche die regulierende Domäne der PKC oder der PKA erkennt,
Verbindungen umfasst, welche eine Emission im Erregungsbereich der
mit der katalytischen Domäne
des Enzyms interagierenden Sonde gewährleisten können,
- – das
Messen der Intensität
der Fluoreszenz des erhaltenen Präparats und deren eventueller
Variationen durch Hinzufügen
eines Hemmstoffs und/oder eines Aktivators für PKC oder PKA, wobei eine
Variation der Daten der Fluoreszenzemissionsspektren gegenüber denjenigen
der bei gesunden Patienten erhaltenen Spektren eine Unterscheidung
in Bezug auf Morbus Alzheimer ermöglicht,
wobei das Messen
der Intensität
der Fluoreszenz des erhaltenen Präparats im Falle einer Inkubation
einer Blutprobe mit den beiden fluoreszierenden Sonden, welche das
katalytische Zentrum bzw. die regulierende Domäne der PKC oder der PKA erkennen,
erfolgt, indem die Probe mit der Absorptionswellenlänge der
das katalytische Zentrum des Enzyms erkennenden flureszierenden Sonde
erregt wird und anschließend
das bei der Emissionswellenlänge
der katalytischen Sonde erhaltene Signal beobachtet wird, welches
eine Unterscheidung in Bezug auf Morbus Alzheimer ermöglicht.
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Gemäß der Erfindung
führt man
zur Untersuchung der Fluoreszenzintensitäten eine Dekonvolution der
erhaltenen Emissionsspektren durch, um sie in elementare Gauss-Funktionen
zu zerlegen und die charakteristischen Emissionsmaxima der direkten oder
indirekten Wechselwirkung der Sonde mit der PKC oder PKA zu bestimmen.
Die Bestimmung des relativen Beitrags jeder Gauss-Funktion zur Gesamtintensität der Fluoreszenz
unter verschiedenen Bedingungen ermöglicht es, die Kriterien auszuwählen, die
beizubehalten sind, um die Diagnose durchzuführen. Es handelt sich zum Beispiel
um eine relative Intensitätsdifferenz
oder eine Verschiebung eines Maximums in Bezug auf die Ergebnisse,
die man mit gesunden Probanden erhält.
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Man
verfügt
somit über
Mittel, die es erlauben, eine Unterscheidung von 100% zwischen den Alzheimer-Patienten
und gesunden Probanden zu etablieren.
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Die
fluoreszierenden Sonden, die bei dem Verfahren der Erfindung verwendet
werden können, umfassen,
an ein Fluorophor gekoppelt, eine Verbindung, die unter den Inkubationsbedingungen
mit dem katalytischen Zentrum des Enzyms oder seiner regulierenden
Domäne
Wechselwirken kann.
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Fluoreszierende
Sonden, die unter den Bedingungen der Erfindung mit dem katalytischen
Zentrum der PKC reagieren können,
umfassen organische Syntheseverbindungen, wie Derivate von Bisindolylmaleinimid.
Genannt seien insbesondere die Sonden fim-1 und rim-1, die von Chen
und Poenie in 3. Biol. Chem., 1993, 268, 15812–15822, beschrieben wurden.
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Andere
fluoreszierende Sonden erlauben die Markierung von Verbindungen,
die unter den Bedingungen der Erfindung mit der regulierenden Domäne der PKC
Wechselwirken können.
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Es
handelt sich insbesondere um lipidische Sonden, wie sie ausgehend
von Phospholipiden, die Bestandteile der Membran sind, oder Derivaten
solcher Phospholipide entwickelt wurden.
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Alternativ
dazu sind die fluoreszierenden Sonden Protein- oder Peptidsonden
des Membran- oder Cytoskeletttyps oder Derivate der Substrate der Enzyme
PKC oder PKA.
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Solche
lipidischen Sonden, Protein- oder Peptidsonden werden gleichzeitig
mit den Sonden verwendet, die die katalytische Domäne der PKC-Enzyme
erkennen. So gewährleistet
man die Spezifität der
Messungen, da auch andere Enzyme oder Proteine als PKC oder PKA
mit den lipidischen, Protein- oder Peptidverbindungen der Sonden
Wechselwirken können.
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Diese
Sonden umfassen zum Beispiel Verbindungen, die eine Emission im
Anregungsbereich der Sonden gewährleisten,
die mit der katalytischen Domäne
der Enzyme Wechselwirken.
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Ihre
Anregung führt
ihrerseits zur Anregung der Sonde, die das katalytische Zentrum
erkennt, was eine Nähe
der beiden Sonden (ungefähr
weniger als 50 Å)
impliziert, wobei das Enzym dann direkt mit den Elementen der Membran
oder des Cytoskeletts oder des Substrats wechselwirkt.
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Indem
man die zu untersuchende Probe bei der Absorptionswellenlänge der
lipidischen Sonde anregt und indem man das Signal bei der Emissionswellenlänge der
katalytischen Sonde beobachtet, verfügt man somit über ein
spezifisches Signal in Bezug auf das Enzym, das es erlaubt, eine
Unterscheidung zu treffen.
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Unter "Blutprobe" versteht man die
Gesamtprobe, die dem Patienten entnommen wurde, oder eine Fraktion
dieser Probe oder konstituierende Elemente, zum Beispiel Erythrocyten.
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Allgemein
verwendet man für
die Durchführung
des Verfahrens der Erfindung eine frische Blutprobe.
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Der
Schritt der Inkubation wird bei Umgebungstemperatur durchgeführt, indem
man die zu untersuchende Probe mit einer solchen Menge der Sonde
und während
einer solchen Zeitspanne inkubiert, dass man die gewünschte Wechselwirkung
erhalten kann.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird ein Teil der Probe nur mit der Sonde inkubiert,
ein anderer Teil wird zuerst mit einem Inhibitor der PKC oder der
PKA und dann mit der Sonde inkubiert, und ein weiterer Teil wird
zuvor mit einem Aktivator der PKC oder der PKA und dann mit der Sonde
inkubiert.
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Als
Inhibitor der PKC sei beispielsweise Staurosporin und als Aktivator
ein Phorbolester, wie Phorbolmyristatacetat (PMA oder TPA), genannt.
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Die
Dekonvolution der erhaltenen Spektren erlaubt es, für die Wechselwirkungen
charakteristische Maxima zu identifizieren. Der Vergleich der Spektren
in An- oder Abwesenheit
des Aktivators und oder des Inhibitors des Enzyms erlaubt es, Variationen
bei den Alzheimer-Patienten in bezug auf die gesunden Probanden
nachzuweisen und schnell eine saubere Unterscheidung zwischen diesen
Gruppen zu treffen.
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Die
Erfindung betrifft auch diagnostische Kits oder Testsätze für die Durchführung des
oben definierten Tests.
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Diese
Kits oder Testsätze
für die
Diagnose der Alzheimer-Krankheit sind dadurch gekennzeichnet, dass
sie Folgendes aufweisen:
- – eine Gebrauchsanleitung,
- – zwei
fluoreszierende Sonden, welche das katalytische Zentrum bzw. die
regulierende Domäne eines
der Enzyme PKC oder PKA erkennen,
mit dem katalytischen
Zentrum des Enzyms oder seiner regulierenden Domäne.
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Diese
Kits sind dadurch gekennzeichnet, dass die fluoreszierenden Sonden,
die eine Verbindung umfassen, die mit der regulatorischen Domäne der PKC
Wechselwirken kann, ausgehend von Phospholipiden, Protein- oder
Peptidsonden des Membran- oder Cytoskeletttyps oder Derivaten der
Substrate der Enzyme PKC oder PKA entwickelt sind.
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So
stellt die Erfindung sehr zuverlässige nichtinvasive
Mittel bereit, die es erlauben, eine schnelle und ökonomische
Diagnose der Alzheimer-Krankheit durchzuführen.
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Durch
die Entwicklung von Informatikwerkzeugen für die Analyse der aufgezeichneten
Spektren ist es möglich,
sehr schnell Messungen an großen
Gruppen von Probanden, die die Krankheit entwickeln können, und
an Familien, von denen gewisse Mitglieder erbliche Formen aufweisen,
durchzuführen.
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Weitere
Merkmale und Vorteile der Erfindung sind in den folgenden Beispielen
genannt, wobei Bezug auf die 1 bis 6 genommen
wird.
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Dabei
zeigen:
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1 die
Dekonvolution des Emissionsspektrums von fim-1;
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2 die
relativen Intensitätsunterschiede der
Fluoreszenzemissionsmaxima bei 518, 535, 547 und 585 nm von Erythrocytenpräparaten,
die mit Staurosporin vorinkubiert und dann mit fim-1 versetzt wurden;
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3 die
Verschiebung des zweiten Maximums bei Vergleich der Proben von Alzheimer-Patienten
und von gesunden Freiwilligen;
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4 die
relativen Intensitätsunterschiede der
Fluoreszenzemissionsmaxima bei 518, 535, 545 und 585 nm von Erythrocytenpräparaten,
die mit fim-1 vorinkubiert und dann mit TPA versetzt wurden;
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die 5 und 6 die
relativen Intensitätsunterschiede
der Fluoreszenzemissionsmaxima von Erythrocytenpräparaten
von gesunden Patienten und von Parkinson-Patienten, die mit Staurosporin
vorinkubiert und dann mit fim-1 versetzt (5) oder
mit fim-1 vorinkubiert und dann mit TPA versetzt (6) wurden.
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Beispiel 1: Untersuchung der Fluoreszenzeigenschaften
von fim-1
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Man
verwendet Liposomen, die ausgehend von Hirnlipidextrakten und einem
kommerziellen gereinigten PKC-α-Präparat hergestellt
wurden, und dann fügt
man Erythrocyten hinzu.
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Dieses
Präparat
wird 20 min lang bei Umgebungstemperatur in Gegenwart von fim-1
(500 nM) in einem PBS-Puffer (150 mM NaCl, 10 mM NaHPO4,
5 mM D-Glucose,
500 mM CaCl2, pH 7,4) inkubiert.
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Nach
dem Waschen, Zentrifugieren und Resuspendieren in 1/150 PBS wird
das Fluoreszenzemissionsspektrum zwischen 505 und 650 nm mit einer
Anregungswellenlänge
von 485 nm aufgenommen.
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Das
erhaltene Spektrum wird in Bezug auf die mit der Sonde allein gemessene
Fluoreszenzintensität
normiert, dann in 3 elementare Gauss-Funktionen zerlegt, die in 1 dargestellt
sind. Man bemerkt ein Emissionsmaximum bei 518, 535 bzw. 586 nm.
Die Wechselwirkungen zwischen fim-1 und den Membranlipiden sowie
der PKC spiegeln sich in einer leichten Verschiebung des Spektrums
zwischen 530 und 570 nm für
die Lipide und eine Erhöhung
der Fluoreszenz zwischen 510 und 530 nm und jenseits von 570 nm
für die
PKC wider.
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Die
Zugabe von Staurosporin-Inhibitor, der kompetitiv an die ATP-Stelle
bindet, spiegelt sich in einer Hemmung der Fluoreszenzintensität wider. Umgekehrt
bemerkt man eine beträchtliche
Erhöhung
der Fluoreszenz (die quantitative Ausbeute steigt um einen Faktor
5000) in Gegenwart von Phorbolester.
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Beispiel 2: Diagnostischer Test der Alzheimer-Krankheit.
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Vorschrift
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1
bis 3 ml frisches Blut werden auf Heparin entnommen und in der Kälte (+4°C) konserviert.
In den beiden folgenden Stunden wird die Probe bei Umgebungstemperatur
dreimal in PBS gewaschen und zentrifugiert.
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Dann
geht man zu 3 Inkubationsreihen über:
- – ein
erstes Aliquot von Zellen, die 20 min lang in Gegenwart der fluoreszierenden
Sonde (500 nM) fim-1 inkubiert werden;
- – ein
zweites Aliquot, das zuerst 20 min lang in Gegenwart von 500 nM
Staurosporin vorinkubiert und dann in Gegenwart der fluoreszierenden
Sonde inkubiert wird; und
- – ein
drittes Aliquot, das zuerst in Gegenwart der fluoreszierenden Sonde
vorinkubiert und dann 20 min lang in Gegenwart von 500 nM TPA inkubiert wird.
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In
der Folge dieser Inkubationen werden die Zellen gewaschen, zentrifugiert
(zweimal) und dann in PBS (1/150) resuspendiert.
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Die
jeweiligen Fluoreszenzemissionsspektren werden bei Umgebungstemperatur
mit einem Einzelstrahl-Spektrofluorimeter SLM 4800 (Anregung 485
nm, Schlitzbreite 2 nm) an einem Volumen von ungefähr 200 μl gemessen.
Jede Messung wird wenigstens dreimal doppelt durchgeführt und
dann wird ein Mittelwert der Werte berechnet.
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Dann
werden die Spektren in Bezug auf die mit der Sonde allein gemessene
Fluoreszenzintensität
normiert, dann in 3 elementare Gauss-Funktionen zerlegt. Schließlich wird
das Integral jeder Gauss-Funktion gemessen und auf die Summe der Integrale
der Gauss-Funktionen für
jedes Spektrum bezogen (relativer Beitrag jeder Gauss-Funktion zur Gesamtintensität der Fluoreszenz).
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Unterscheidung zwischen Alzheimer-Patienten
und gesunden Probanden
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Die
Messung der Fluoreszenzemissionsspektren von fim-1 bei roten Blutkörperchen,
die von 35 Alzheimer-Patienten stammen, und ihr Vergleich mit Zellen,
die ausgehend roten Blutkörperchen
erhalten wurden, die von 35 gesunden Freiwilligen im vergleichbaren
Alter stammen, erlaubte eine Unterscheidung von 100% zischen den
2 Gruppen anhand von zwei Kriterien: Der Unterschied der Intensität des Fluoreszenzmaximums
bei 518 nm, wenn das Spektrum in Anwesenheit oder Abwesenheit von
Staurosporin gemessen wird (2), und
die Verschiebung des Peakmaximums bei 545 nm.
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In
diesen Figuren entsprechen
und ∎ den Alzheimer-Patienten,
und o und ☐ entsprechend den gesunden Probanden. Diese
Symbole haben in
4, die die in An- oder Abwesenheit
von Phorbolester erhaltenen Ergebnisse darstellt, dieselben Bedeutungen.
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An Parkinson-Patienten durchgeführte Messungen
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Um
die Spezifität
der Messungen für
die Alzheimer-Krankheit gegenüber
anderen neurodegenerativen Krankheiten festzustellen, wurden Messungen
an Proben, die von 15 Patienten stammen, die an der Parkinson-Krankheit
leiden, oder an gesunden Freiwilligen im vergleichbaren Alter durchgeführt. Die
zwei erhaltenen Messungsindices erlaubten es nicht, einen Unterschied
zwischen den gesunden Freiwilligen und den Patienten zu beobachten (Wirkung
von Staurosporin:
5, und Wirkung von TPA:
6,
wo "o" den gesunden Freiwilligen
und
den
Parkinson-Patienten entspricht). Dieses Ergebnis ist ein guter Hinweis
auf die Spezifität
des Tests der Erfindung als Diagnose für die Alzheimer-Krankheit.
