JP2001512032A - アルツハイマー病の診断方法およびキット - Google Patents
アルツハイマー病の診断方法およびキットInfo
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract
(57)【要約】
本発明によるアルツハイマー病の診断方法は、血液試料と、ＰＫＣまたはＰＫＡと直接または別の蛍光プローブを介して相互作用しうる蛍光プローブとをインキュベートすること、および蛍光強度を種々の条件下で測定することを含む。
Description
【０００１】 本発明は、アルツハイマー病の診断方法およびキットを対象とするものである
。
。
【０００２】 寿命が一般的に延長された結果アルツハイマー病の頻度が増加し、この疾患は
現代社会の大きな経済問題を構成している。研究上大きな努力が払われてこの疾
患の成立過程の理解がもたらされたが、しかし初期のマーカーを発見する試みは
成果がないかまたは十分でなかった。臨床検査は多くの場合単独で使用され、信
頼できる診断は大脳の生検または剖検後にしか提示されなかった。
現代社会の大きな経済問題を構成している。研究上大きな努力が払われてこの疾
患の成立過程の理解がもたらされたが、しかし初期のマーカーを発見する試みは
成果がないかまたは十分でなかった。臨床検査は多くの場合単独で使用され、信
頼できる診断は大脳の生検または剖検後にしか提示されなかった。
【０００３】 最近、アメリカの研究チームが、検診用試験としての瞳孔拡大の測定において
コリン作動系アンタゴニストの使用を提案した（シント(Scinto)ら、１９９４年
、サイエンス(Science)２６６巻１０５１−１０５４頁）。しかしながら、この 試験はアルツハイマー病に罹患している患者の完全な識別を可能にするものでは
ない。その診断上の利点は、極めて最近複数の研究中で強い疑問がもたれている
。
コリン作動系アンタゴニストの使用を提案した（シント(Scinto)ら、１９９４年
、サイエンス(Science)２６６巻１０５１−１０５４頁）。しかしながら、この 試験はアルツハイマー病に罹患している患者の完全な識別を可能にするものでは
ない。その診断上の利点は、極めて最近複数の研究中で強い疑問がもたれている
。
【０００４】 最後に、最近、アルツハイマー病に罹患している患者に由来する血清が、マウ
スの小膠細胞により発現された抗原を認識できる抗体を含むこともまた示されて
いる。この特性の原因および診断上の価値は現在確認されていない。
スの小膠細胞により発現された抗原を認識できる抗体を含むこともまた示されて
いる。この特性の原因および診断上の価値は現在確認されていない。
【０００５】 本発明者は、アルツハイマー病に罹患している患者における種々の異常を観察
して、これらの異常とある種の酵素における活性水準の修飾との関係を研究する
に至った。
して、これらの異常とある種の酵素における活性水準の修飾との関係を研究する
に至った。
【０００６】 また、先に確認されたアルツハイマー病に罹患している患者の赤血球における
塩素の輸送異常とプロテインキナーゼC（略号ＰＫＣ）活性の異常との関係を考 慮して、彼らの研究は最初このような患者の赤血球上におけるＰＫＣ活性化水準
の測定に向けられた。
塩素の輸送異常とプロテインキナーゼC（略号ＰＫＣ）活性の異常との関係を考 慮して、彼らの研究は最初このような患者の赤血球上におけるＰＫＣ活性化水準
の測定に向けられた。
【０００７】 そして、本発明者は、測定条件を変化させると、疾患に罹患している患者と正
常対象を識別しうるデータを提示することが可能なことを見出した。
常対象を識別しうるデータを提示することが可能なことを見出した。
【０００８】 彼らの研究の発展により、ＰＫＡに適用したこのような測定またさらにはＰＫ
ＣまたはＰＫＡと相互作用できる一連の化合物の使用がまた、アルツハイマー患
者の識別に役立ちうることの確認が可能になった。
ＣまたはＰＫＡと相互作用できる一連の化合物の使用がまた、アルツハイマー患
者の識別に役立ちうることの確認が可能になった。
【０００９】 したがって、本発明は、信頼性が高く、迅速で、低コストの試験法を作成する
ことが可能な、アルツハイマー病の診断方法を提供することを目的とするもので
ある。
ことが可能な、アルツハイマー病の診断方法を提供することを目的とするもので
ある。
【００１０】 またそれは、このような方法を容易に使用することを可能にするキットの提供
を企図するものである。
を企図するものである。
【００１１】 本発明によるアルツハイマー病の診断方法は、 ・血液試料と１または複数の蛍光プローブとを、そのプローブまたはそれらの
プローブとＰＫＣまたはＰＫＡとの特異的結合が可能な条件下でインキュベート
すること、 ・得られた調製品の蛍光強度、および場合により当該酵素に対する阻害剤およ
び／または活性化剤の添加によるその変動、アルツハイマー病とは識別される正
常対象で得られたそれらのスペクトルに対する発光スペクトルデータの変動を測
定すること、 を含むことを特徴とする。
プローブとＰＫＣまたはＰＫＡとの特異的結合が可能な条件下でインキュベート
すること、 ・得られた調製品の蛍光強度、および場合により当該酵素に対する阻害剤およ
び／または活性化剤の添加によるその変動、アルツハイマー病とは識別される正
常対象で得られたそれらのスペクトルに対する発光スペクトルデータの変動を測
定すること、 を含むことを特徴とする。
【００１２】 本発明によると、蛍光強度を調査するために、得られた発光スペクトルのデコ
ンボリューション(deconvolution)を実施して、それらを基本的な正規分布に分 解してプローブとＰＫＣまたはＰＫＡ間の直接または間接相互作用に特徴的な発
光ピークを決定する。種々の条件下における蛍光の総強度に対する各正規分布の
相対的寄与を定量することにより、診断実施のために採用する基準(criteria)を
選択することが可能となる。例えば、正常対象で得られた結果に対する相対的強
度の差またはピークのシフトが重要である。
ンボリューション(deconvolution)を実施して、それらを基本的な正規分布に分 解してプローブとＰＫＣまたはＰＫＡ間の直接または間接相互作用に特徴的な発
光ピークを決定する。種々の条件下における蛍光の総強度に対する各正規分布の
相対的寄与を定量することにより、診断実施のために採用する基準(criteria)を
選択することが可能となる。例えば、正常対象で得られた結果に対する相対的強
度の差またはピークのシフトが重要である。
【００１３】 このようにして、アルツハイマー病に罹患している患者と正常対象の１００％
識別を達成することが可能な手段が提示される。
識別を達成することが可能な手段が提示される。
【００１４】 本発明の方法に使用できる蛍光プローブは、インキュベーション条件下におい
て酵素の触媒部位またはその調節ドメインと相互作用しうる、蛍光団(fluoropho
re)と連結された化合物を含む。
て酵素の触媒部位またはその調節ドメインと相互作用しうる、蛍光団(fluoropho
re)と連結された化合物を含む。
【００１５】 本発明の条件下においてＰＫＣの触媒部位と反応しうる蛍光プローブは、ビス
インドールマレイミド誘導体のような合成有機化合物を含む。特に、チェン(Che
n)およびポエニ(Poenie)がジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J
. Biol. Chem.)、１９９３年、２６８巻１５８１２−１５８２２頁に記載したｆ
ｉｍ−１およびｒｉｍ−１を挙げることができる。
インドールマレイミド誘導体のような合成有機化合物を含む。特に、チェン(Che
n)およびポエニ(Poenie)がジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J
. Biol. Chem.)、１９９３年、２６８巻１５８１２−１５８２２頁に記載したｆ
ｉｍ−１およびｒｉｍ−１を挙げることができる。
【００１６】 別の蛍光プローブが、本発明の条件下においてＰＫＣの調節ドメインと相互作
用しうる化合物を標識(mark)することができる。
用しうる化合物を標識(mark)することができる。
【００１７】 特に、膜構成燐脂質もしくはこのような燐脂質の誘導体から調製されたものの
ような脂質プローブが重要である。
ような脂質プローブが重要である。
【００１８】 変形としては、蛍光プローブは膜性もしくは細胞骨格性のまたは酵素ＰＫＣも
しくはＰＫＡの基質から誘導される蛋白質もしくはペプチド性プローブである。
しくはＰＫＡの基質から誘導される蛋白質もしくはペプチド性プローブである。
【００１９】 このような脂質、蛋白質またはペプチド性プローブは、酵素ＰＫＣの触媒ドメ
インを認識するプローブと同時に使用される。こうして、プローブの脂質、蛋白
質またはペプチド性化合物と相互作用しうるＰＫＣまたはＰＫＡ以外の酵素また
は蛋白質測定の特異性が保証される。
インを認識するプローブと同時に使用される。こうして、プローブの脂質、蛋白
質またはペプチド性化合物と相互作用しうるＰＫＣまたはＰＫＡ以外の酵素また
は蛋白質測定の特異性が保証される。
【００２０】 これらのプローブは、例えば酵素の触媒ドメインと相互作用するプローブの励
起ドメインにおける発光を保証する化合物を含む。
起ドメインにおける発光を保証する化合物を含む。
【００２１】 それらの励起は、次に触媒部位を認識するプローブのそれを引き起こすが、そ
れは、２種のプローブの近傍（約５０オングストローム未満）を暗示させるもの
であり、その酵素は膜または細胞骨格または基質の元素と直接相互作用するもの
である。
れは、２種のプローブの近傍（約５０オングストローム未満）を暗示させるもの
であり、その酵素は膜または細胞骨格または基質の元素と直接相互作用するもの
である。
【００２２】 このようにして、検査すべき試料を脂質プローブの吸収波長で励起すること、
および触媒プローブの発光波長におけるシグナルを観察することにより、酵素に
特異的であり識別を確認できるシグナルが提示される。
および触媒プローブの発光波長におけるシグナルを観察することにより、酵素に
特異的であり識別を確認できるシグナルが提示される。
【００２３】 「血液試料」の語は、患者から採取された全体試料、またはこのような試料の
フラクション、または構成要素、例えば赤血球と解釈される。
フラクション、または構成要素、例えば赤血球と解釈される。
【００２４】 一般的に、本発明の方法を使用するために、新鮮な血液試料が使用される。
【００２５】 インキュベーション段階は、検査すべき試料と一定量のプローブを仕込み、所
期の相互作用が得られる時間に応じて、室温で実施される。
期の相互作用が得られる時間に応じて、室温で実施される。
【００２６】 本発明の好ましい実施態様において、試料の一部が１つまたは複数のプローブ
のみとインキュベートされ、別の一部がまず最初にＰＫＣまたはＰＫＡの阻害剤
と、次いで１つまたは複数のプローブとインキュベートされ、さらに別の一部が
あらかじめＰＫＣまたはＰＫＡの活性化剤と、次いで１つまたは複数のプローブ
とインキュベートされる。
のみとインキュベートされ、別の一部がまず最初にＰＫＣまたはＰＫＡの阻害剤
と、次いで１つまたは複数のプローブとインキュベートされ、さらに別の一部が
あらかじめＰＫＣまたはＰＫＡの活性化剤と、次いで１つまたは複数のプローブ
とインキュベートされる。
【００２７】 例としては、ＰＫＣの阻害剤としてスタウロスポリン(staurosporine)が挙 げられ、活性化剤としてホルボールミリスタートアセタート（ＰＭＡまたはＴＰ
Ａ）のようなホルボールエステルが挙げられる。
Ａ）のようなホルボールエステルが挙げられる。
【００２８】 得られたスペクトルのデコンボリューションにより、相互作用に特徴的なピー
クの同定が可能となる。酵素活性化剤または阻害剤の存在下または不存在下にお
けるスペクトルの比較により、正常対象と較べたアルツハイマー病に罹患してい
る患者の変動を明らかにし、これらのグループ間の明確な識別を迅速に達成する
ことができる。
クの同定が可能となる。酵素活性化剤または阻害剤の存在下または不存在下にお
けるスペクトルの比較により、正常対象と較べたアルツハイマー病に罹患してい
る患者の変動を明らかにし、これらのグループ間の明確な識別を迅速に達成する
ことができる。
【００２９】 本発明はまた、上に定義した試験を使用するための診断用キットまたはセット
の提供を目的とする。これらのキットは、上に定義したような蛍光プローブと、
必要ならば容器および試薬、特に診断試験実施用のＰＫＣおよび／またはＰＫＡ
の活性化剤および／または阻害剤、および／または緩衝剤、並びに使用説明書を
含むことを特徴とする。
の提供を目的とする。これらのキットは、上に定義したような蛍光プローブと、
必要ならば容器および試薬、特に診断試験実施用のＰＫＣおよび／またはＰＫＡ
の活性化剤および／または阻害剤、および／または緩衝剤、並びに使用説明書を
含むことを特徴とする。
【００３０】 したがって、本発明はアルツハイマー病の診断を迅速および経済的に実施する
ことができる、信頼性が極めて高く非侵食性の手段を提供する。
ことができる、信頼性が極めて高く非侵食性の手段を提供する。
【００３１】 記録されたスペクトルの分析のためのコンピュータの発展により、疾患が進行
しやすい対象の大きなグループに対して、およびある構成員が遺伝形質を示す家
族に対して非常に迅速に測定を実施することが可能である。
しやすい対象の大きなグループに対して、およびある構成員が遺伝形質を示す家
族に対して非常に迅速に測定を実施することが可能である。
【００３２】 本発明の別の特徴および利点は、以下の図１ないし６を参照する実施例により
説明される。
説明される。
【００３３】 実施例１：ｆｉｍ−１の蛍光特性の調査 脳の脂質抽出物から調製したリポソームおよび精製αＰＫＣの市販品を使用し
、これに赤血球を加える。
、これに赤血球を加える。
【００３４】 この調製品を、ＰＢＳ緩衝液（１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１０ｍＭ−ＮａＨＰＯ ４ 、５ｍＭ−Ｄ−グルコース、５００μＭ−ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）中ｆｉｍ
−１（５００ｎＭ）の存在下、室温で２０分間インキュベートする。
−１（５００ｎＭ）の存在下、室温で２０分間インキュベートする。
【００３５】 洗浄、遠心分離および１／１５０−ＰＢＳ中に再懸濁後、励起波長４８５ｎｍ
で５０５ないし６５０ｎｍ間の蛍光発光スペクトルを記録する。
で５０５ないし６５０ｎｍ間の蛍光発光スペクトルを記録する。
【００３６】 得られたスペクトルをプローブのみで測定した蛍光強度に対して標準化し、次
いで図１に示す３種の基本的な正規分布に分解する。それぞれ５１８、５３５お
よび５８６分に極大発光が認められる。ｆｉｍ−１と膜性脂質並びにＰＫＣ間の
相互作用は、脂質の５３０ないし５７０ｎｍ間のスペクトルにおけるわずかなシ
フト、およびＰＫＣの５１０ないし５３０ｎｍ間さらには５７０ｎｍにおける蛍
光増強に表れる。
いで図１に示す３種の基本的な正規分布に分解する。それぞれ５１８、５３５お
よび５８６分に極大発光が認められる。ｆｉｍ−１と膜性脂質並びにＰＫＣ間の
相互作用は、脂質の５３０ないし５７０ｎｍ間のスペクトルにおけるわずかなシ
フト、およびＰＫＣの５１０ないし５３０ｎｍ間さらには５７０ｎｍにおける蛍
光増強に表れる。
【００３７】 ＡＴＰ部位における競合的阻害剤であるスタウロスポリンの添加は、蛍光強度
の抑制に表れる。逆に、ホルボールエステルの存在下ではかなりの蛍光増強（量
子収量は５０００倍増加する）が認められる。
の抑制に表れる。逆に、ホルボールエステルの存在下ではかなりの蛍光増強（量
子収量は５０００倍増加する）が認められる。
【００３８】 実施例２：アルツハイマー病診断試験 ・プロトコール 新鮮な血液１ないし３ｍｌをヘパリン上に採取し、冷蔵（＋４℃）して保存す
る。その後２時間以内に、試料を室温においてＰＢＳ中で３回洗浄し遠心分離す
る。
る。その後２時間以内に、試料を室温においてＰＢＳ中で３回洗浄し遠心分離す
る。
【００３９】 次いで３系統のインキュベーションを行う： ・細胞の第１分割量は、ｆｉｍ−１蛍光プローブ（５００ｎＭ）の存在下に２
０分間インキュベートし、 ・細胞の第２分割量は、まず５００ｎＭスタウロスポリンの存在下に２０分間
予備インキュベートし、次いで蛍光プローブの存在下に行い、 ・細胞の第３分割量は、まず蛍光プローブの存在下に予備インキュベートし、
次いでＴＰＡ５００ｎＭの存在下に２０分間インキュベートする。
０分間インキュベートし、 ・細胞の第２分割量は、まず５００ｎＭスタウロスポリンの存在下に２０分間
予備インキュベートし、次いで蛍光プローブの存在下に行い、 ・細胞の第３分割量は、まず蛍光プローブの存在下に予備インキュベートし、
次いでＴＰＡ５００ｎＭの存在下に２０分間インキュベートする。
【００４０】 これらのインキュベーション後に、細胞を洗浄し、遠心分離（２回）し、次い
でＰＢＳ（１／１５０）中に再懸濁する。
でＰＢＳ（１／１５０）中に再懸濁する。
【００４１】 それぞれの蛍光発光スペクトルを、室温において、単光（励起光４８５ｎｍ、
スリット幅２ｎｍ）分光蛍光計ＳＬＭ４８００により、約２００μｌの容量につ
いて測定する。各測定を２連で少なくとも３回実施し、その後数値の平均値を作
成する。
スリット幅２ｎｍ）分光蛍光計ＳＬＭ４８００により、約２００μｌの容量につ
いて測定する。各測定を２連で少なくとも３回実施し、その後数値の平均値を作
成する。
【００４２】 次いで、プローブのみで測定した蛍光強度に対してスペクトルを規格化し、そ
の後３種の基本的な正規分布に分解する。最後に各正規分布の積分を計算し、各
スペクトルの正規分布積分値の合計に関係づける（総蛍光強度に対する各正規分
布の相対的な寄与）。
の後３種の基本的な正規分布に分解する。最後に各正規分布の積分を計算し、各
スペクトルの正規分布積分値の合計に関係づける（総蛍光強度に対する各正規分
布の相対的な寄与）。
【００４３】 ・アルツハイマー病患者と正常対象の識別 ３５名のアルツハイマー病に罹患している患者に由来する赤血球におけるｆｉ
ｍ−１による蛍光発光スペクトルの測定、および相当する年齢の３５名の正常志
願者に由来する赤血球から得たそれらとの比較により、２種の基準：スペクトル
をスタウロスポリンの存在下または不存在下で測定した５１８ｎｍにおける蛍光
ピークの強度の差（図２）、並びに５４５ｎｍにおけるピークの最大のシフトに
よって、２群間の１００％識別が可能であった。
ｍ−１による蛍光発光スペクトルの測定、および相当する年齢の３５名の正常志
願者に由来する赤血球から得たそれらとの比較により、２種の基準：スペクトル
をスタウロスポリンの存在下または不存在下で測定した５１８ｎｍにおける蛍光
ピークの強度の差（図２）、並びに５４５ｎｍにおけるピークの最大のシフトに
よって、２群間の１００％識別が可能であった。
【００４４】 これらの図において、▲および■はアルツハイマー病患者に、○および□は正
常対象に対応する。これらの記号は、ホルボールエステルの存在下または不存在
下で得られた結果を示す図４でも同じ意味を有する。
常対象に対応する。これらの記号は、ホルボールエステルの存在下または不存在
下で得られた結果を示す図４でも同じ意味を有する。
【００４５】 ・パーキンソン病に罹患している患者について実施した測定 他の神経変性疾患に対するアルツハイマー病測定の特異性を確認する方法とし
て、１５名のパーキンソン病に罹患している患者または相当する年齢の正常志願
者に由来する試料について測定を行った。採り上げられた２種の測定指数は正常
志願者と患者間の差の認定を可能とするものではなかった（スタウロスポリンの
効果：図５、およびＴＰＡの効果：図６。ここで、「○」は正常志願者に対応し
、「▲」はパーキンソン病患者に対応する）。この結果は、アルツハイマー病の
診断のための本発明に係る試験の特異性に関する良好な指標である。
て、１５名のパーキンソン病に罹患している患者または相当する年齢の正常志願
者に由来する試料について測定を行った。採り上げられた２種の測定指数は正常
志願者と患者間の差の認定を可能とするものではなかった（スタウロスポリンの
効果：図５、およびＴＰＡの効果：図６。ここで、「○」は正常志願者に対応し
、「▲」はパーキンソン病患者に対応する）。この結果は、アルツハイマー病の
診断のための本発明に係る試験の特異性に関する良好な指標である。
【図１】ｆｉｍ−１の発光スペクトルのデコンボリューションを示す。
【図２】スタウロスポリンと予備インキュベートし、次いでｆｉｍ−１を添
加した赤血球調製品の５１８、５３５、５４７および５８５ｎｍにおける蛍光発
光ピークの相対強度の差を示す。
加した赤血球調製品の５１８、５３５、５４７および５８５ｎｍにおける蛍光発
光ピークの相対強度の差を示す。
【図３】アルツハイマー病患者と正常志願者の試料を比較した第２ピークの
シフトを示す。
シフトを示す。
【図４】ｆｉｍ−１と予備インキュベートし次いでＴＰＡを添加した赤血球
調製品の５１８、５３５、５４７および５８５ｎｍにおける蛍光発光ピークの相
対強度の差を示す。
調製品の５１８、５３５、５４７および５８５ｎｍにおける蛍光発光ピークの相
対強度の差を示す。
【図５】スタウロスポリンと予備インキュベートし次いでｆｉｍ−１を添加
した、正常患者およびパーキンソン病に罹患している患者の赤血球調製品蛍光発
光ピークの相対強度の差を示す。
した、正常患者およびパーキンソン病に罹患している患者の赤血球調製品蛍光発
光ピークの相対強度の差を示す。
【図６】ｆｉｍ−１と予備インキュベートし次いでＴＰＡを添加した、正常
患者およびパーキンソン病に罹患している患者の赤血球調製品蛍光発光ピークの
相対強度の差を示す。
患者およびパーキンソン病に罹患している患者の赤血球調製品蛍光発光ピークの
相対強度の差を示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年１月３１日（２０００．１．３１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３６】 得られたスペクトルをプローブのみで測定した蛍光強度に対して標準化し、次
いで図１に示す３種の基本的な正規分布に分解する。それぞれ５１８、５３５お
よび５８６ｎｍに極大発光が認められる。ｆｉｍ−１と膜性脂質並びにＰＫＣ間
の相互作用は、脂質の５３０ないし５７０ｎｍ間のスペクトルにおけるわずかな
シフト、およびＰＫＣの５１０ないし５３０ｎｍ間さらには５７０ｎｍにおける
蛍光増強に表れる。
いで図１に示す３種の基本的な正規分布に分解する。それぞれ５１８、５３５お
よび５８６ｎｍに極大発光が認められる。ｆｉｍ−１と膜性脂質並びにＰＫＣ間
の相互作用は、脂質の５３０ないし５７０ｎｍ間のスペクトルにおけるわずかな
シフト、およびＰＫＣの５１０ないし５３０ｎｍ間さらには５７０ｎｍにおける
蛍光増強に表れる。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年１月３１日（２０００．１．３１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項４
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項８
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項９
【補正方法】変更
【補正内容】
【請求項９】 一方がＰＫＣまたはＰＫＡの触媒ドメインを認識し、他方が その調節ドメインを認識する２つの蛍光プローブの少なくとも一組を含むことを 特徴とする、アルツハイマー病の診断用キットまたはケース 。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１４】 本発明の方法に使用できる蛍光プローブは、対応するプローブが使用されるとき 、 インキュベーション条件下において酵素の触媒部位またはその調節ドメインと それぞれ 相互作用しうる、蛍光団(fluorophore)と連結された化合物を含む。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１６】 本発明の実施態様によると、加えて、本発明の条件下においてＰＫＣの調節ド
メインと反応しうる蛍光プローブを使用することができる。
メインと反応しうる蛍光プローブを使用することができる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２９】 本発明はまた、上に定義した試験を使用するための診断用キットまたはセット
の提供を目的とする。これらのキットは、使用説明書と共に、上に定義したよう
な１つまたは複数の蛍光プローブと、必要ならば容器および試薬を含み、これら の試薬は、 ＰＫＣおよび／またはＰＫＡの活性化剤および／または阻害剤から選 択される ことを特徴とする。変形として、本発明によるキットは、一方がＰＫＣ またはＰＫＡの触媒部位を認識し、他方がその調節ドメインを認識する２つの蛍 光プローブの少なくとも一組を含む 。
の提供を目的とする。これらのキットは、使用説明書と共に、上に定義したよう
な１つまたは複数の蛍光プローブと、必要ならば容器および試薬を含み、これら の試薬は、 ＰＫＣおよび／またはＰＫＡの活性化剤および／または阻害剤から選 択される ことを特徴とする。変形として、本発明によるキットは、一方がＰＫＣ またはＰＫＡの触媒部位を認識し、他方がその調節ドメインを認識する２つの蛍 光プローブの少なくとも一組を含む 。
Claims (8)
- 【請求項１】 ・血液試料と１つまたは複数の蛍光プローブとを、そのまた
はそれらのプローブとＰＫＣまたはＰＫＡとの特異的結合が可能な条件下でイン
キュベートすること、 ・得られた調製品の蛍光強度、および場合により当該相互作用に対する阻害剤
および／または活性化剤の添加による変動、アルツハイマー病と識別される正常
対象で得られたそれらのスペクトルに対する蛍光発光スペクトルデータの変動を
測定すること、 を含むことを特徴とする、アルツハイマー病の診断方法。 - 【請求項２】 蛍光プローブが、インキュベーション条件下においてその酵
素の触媒部位またはその調節ドメインと相互作用しうる、蛍光団と連結された化
合物を含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 ビスインドールマレイミド誘導体のような合成有機化合物か
ら選択された、本発明の条件下においてＰＫＣの触媒部位と反応しうる蛍光プロ
ーブを使用することを特徴とする、請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 本発明の条件下においてＰＫＣの調節ドメインと相互作用し
うる化合物の標識が可能な蛍光プローブ、特に、膜構成燐脂質もしくはこのよう
な燐脂質の誘導体を基にして調製されたもののような脂質プローブ、または膜性
もしくは細胞骨格性のまたは酵素ＰＫＣもしくはＰＫＡの基質から誘導される蛋
白質もしくはペプチド性プローブを使用することを特徴とする、請求項２記載の
方法。 - 【請求項５】 蛍光プローブが、酵素ＰＫＣの触媒ドメインを直接認識する
プローブと同時に使用されることを特徴とする、請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 インキュベーション段階が室温で実施されることを特徴とす
る、請求項１ないし５のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項７】 試料の一部が１つまたは複数のプローブのみとインキュベー
トされ、別の一部がまず最初にＰＫＣまたはＰＫＡの阻害剤と、次いで１つまた
は複数のプローブとインキュベートされ、別の一部があらかじめ１つまたは複数
のプローブと、次いでＰＫＣまたはＰＫＡの活性化剤とインキュベートされるこ
とを特徴とする、前期請求項のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項８】 請求項１ないし５のいずれか１項記載の方法に用いるような
１つまたは複数の蛍光プローブと、必要ならば診断試験実施用の容器および試薬
、特にＰＫＣおよび／またはＰＫＡの活性化剤および／または阻害剤、および／
または緩衝剤、並びに使用説明書を含むことを特徴とする、アルツハイマー病の
診断用キットまたはケース。
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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| DE69604298T2 (de) * | 1995-09-22 | 2000-05-18 | Bioimage A/S, Soeborg | Varianten des grünen fluoreszenzproteins, gfp |
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- 1997-07-31 FR FR9709823A patent/FR2766927B1/fr not_active Expired - Lifetime
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1998
- 1998-07-27 DE DE69838722T patent/DE69838722T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-07-27 JP JP2000505330A patent/JP4235763B2/ja not_active Expired - Fee Related
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- 1998-07-27 CA CA002296042A patent/CA2296042C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1998-07-27 EP EP98941461A patent/EP1003907B9/fr not_active Expired - Lifetime
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| CA2296042A1 (fr) | 1999-02-11 |
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