DE3728810C2 - In 3-Stellung tritiummarkierte 2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthyl)-6-benzo-[b]-thiophencarbonsäure, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft tritiummarkierte 2-(5,6,7,8-Tetrahydro- 5,8,8-tetramethyl-2-naphthyl)-6-benzo-[b]-thiophen­ carbonsäure, die in 3-Stellung der Tetrahydronaphthalingruppe markiert ist, ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung und ihre Verwendung.

Bekanntlich stellen Retinoide eine Verbindungsklasse dar, die insbesondere bei der Proliferation und der Differenzierung von zahlreichen Zelltypen eine Rolle spielen, man vergleiche beispielsweise B.A. Pawson et Coll., Journal of Medicinal Chemistry, Vol. 25, Nr. 11, Seiten 1269-1277 (1982).

Die Retinoide wurden insbesondere bei der Behandlung von verschiedenen dermatologischen Erkrankungen eingesetzt, bei denen eine Deregulierung der Kontrollmechanismen der Proliferation und der Differenzierung der Zellen der Epidermis auftritt, man vergleiche beispielsweise: "Update: Dermatology in General Medicine", herausgegeben von Thomas B. Fitzpatrick et al., (McGraw-Hill Book Company), ver­ öffentlicht 1983, und insbesondere das Kapitel von D.B. Windhorst et al., The Retinoides, Seiten 226-237.

Der Wirkungsmechanismus der Retinoiden ist noch kaum be­ kannt. Es konnte jedoch gezeigt werden, daß in den Zellen ein Rezeptor existiert, der cRABP (cellular Retinoic Acid-Binding Protein) genannt wird und für Retinoide spezifisch ist, die eine Säuregruppe besitzen.

Die Bestimmung der Affinitätskonstante (Kd) eines Reti­ noids mit einer Säuregruppe für cRABP stellt ein Mittel dar, um die potentielle biologische Aktivität dieses Retinoids äußerst schnell zu bestimmen.

Es gibt verschiedene experimentelle Verfahren, die es er­ möglichen, die Affinitätskonstante eines Liganden für seinen Rezeptor zu bestimmen. Man kann insbesondere ein "Direktverfahren" zur Anwendung bringen, wenn der be­ treffende Ligand radioaktiv markiert ist. Man kann auch einen Wettbewerb mit einem radioaktiven Liganden stattfinden lassen, falls der betreffende Ligand nicht radioaktiv markiert ist.

Ein guter radioaktiver Ligand muß einerseits eine erhöhte Affinität für seinen Rezeptor besitzen und darf sich anderer­ seits an jegliches andere Molekül nur schwach binden. Außerdem muß er ausreichend stabil sein, damit er "bequem" eingesetzt werden kann.

Im Fall der Retinoesäuren handelt es sich bei dem im allgemeinen eingesetzten radioaktiven Liganden sehr häufig um Retinoesäure, die entweder in 2-Stellung (J. Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals XVIII, S. 1099 (1980)) oder in 4-Stellung (DE-OS 31 42 975) tritiummarkiert ist.

Retinoesäure besitzt mit Sicherheit eine ausgezeichnete Affinität für cRABP und bindet sich nur in geringem Maße in nicht-spezifischer Weise. Dieses Molekül weist jedoch den Nachteil auf, daß es sich durch Radiolyse, Oxidation und Photolyse sehr schnell zersetzt.

Es wurde nun gefunden, daß tritiummarkierte 2-(5,6,7,8-Tetra­ hydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthyl)-6-benzo-[b]-thio­ phencarbonsäure einen neuen radioaktiven Liganden darstellt, der eine ausgezeichnete Affinität für cRABP besitzt und dessen nicht-spezifische Fixierung äußerst gering ist. Dieser neue Ligand ist außerdem äußerst stabil und kann mit einer hohen spezifischen Aktivität erhalten werden, so daß er ins­ besondere zur Bestimmung der Affinität von Retinoiden für cRABP eingesetzt werden kann.

Gegenstand der Erfindung ist somit tritierte 2-(5,6,7, 8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthyl)-6-benzo-[b]-thio­ phencarbonsäure, deren Methylidengruppe in 3-Stellung der Tetrahydronaphthalingruppe tritiummarkiert ist.

Gegenstand der Erfindung ist insbesondere ein neuer radio­ aktiver Ligand der oben beschriebenen Art mit einer spezifischen Aktivität höher als 1 Ci/mMol und vorzugsweise mit mindestens 2 Ci/mMol (entspricht etwa 75 GBq/mMol).

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Her­ stellung dieses wie oben beschriebenen radioaktiven Liganden. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise eine 2-(3-Halogen-5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthyl)- 6-benzo-[b]-thiophencarbonsäure herstellt und der Einwirkung eines tritiummarkierten Reduktionsmittels unterwirft.

Das Reduktionsmittel kann beispielsweise tritierter Wasserstoff sein, das in Gegenwart eines geeigneten Katalysators, insbesondere eines Katalysators auf Basis von Palladium, eingesetzt wird.

Die Reduktion des in 3-Stellung halogenierten Derivats führt man vorzugsweise bei Umgebungstemperatur und Umgebungsdruck durch, beispielsweise bei 15 bis 30°C und einem Druck von 1 bar (entspricht etwa 10⁵ Pa).

Das als Ausgangsprodukt eingesetzte Halogenderivat ist vorzugsweise das Bromderivat.

Man kann die 2-(3-Halogen-5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetra­ methyl-2-naphthyl)-6-benzo-[b]-thiophencarbonsäure aus­ gehend von 2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2- naphthyl)-6-benzo-[b]-thiophencarbonsäure durch Umsetzen mit einem Halogenierungsmittel (insbesondere mit einem Bromierungsmittel) herstellen. So kann man beispielsweise das bromierte Derivat durch Umsetzen mit einem Bromierungs­ mittel, beispielsweise N-Bromsuccinimid, in Dimethylformamid bei einer Reaktionstemperatur von 0 bis 50°C und vorzugs­ weise von 0 bis 20°C herstellen.

Die 2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthyl)- 6-benzo-[b]-thiophencarbonsäure ist ein bekanntes Produkt und wird nachstehend Verbindung A genannt. Diese Verbindung kann beispielsweise nach dem in der französischen Patent­ anmeldung 85.13747 (2.570.377) beschriebenen Verfahren hergestellt werden.

Den erfindungsgemäßen radioaktiven Liganden kann man auch ausgehend von 2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2- naphthyl)-6-benzo-[b]-thiophencarbonsäure in an sich bekannter Weise durch Isotopen­ austausch mit überschwerem Wasser in Anwesenheit von Platin und Essigsäure bei einer Temperatur von vorzugsweise 20 bis 150°C herstellen. In diesem Fall findet der Isotopen­ austausch hauptsächlich mit den aromatischen Protonen des Liganden statt.

Die erfindungsgemäße markierte Verbindung kann auch nach Verfahren er­ halten werden, bei denen an sich bekannte Methoden zur Markierung chemischer Verbindungen mit Tritium Anwendung finden. Dazu gehört bei­ spielsweise ein Verfahren, das zu demjenigen analog ist, welches in "Journal of Labelled Compounds and Radiopharmacueticals", Band XXII, Seiten 843-850 beschrieben ist.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von in 3-Stellung der Tetrahydronaphthalingruppe tritiummarkierter 2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl- 2-naphthyl)-6-benzo-[b]-thiophencarbonsäure als radioaktiver Marker, insbesondere bei der Bestimmung der Affinität, der Anwesenheit oder des Ge­ halts von Retinoiden mit einer Carbonsäuregruppe und/oder bei der Quantifizierung des Rezeptors cRABP für diese Retinoide.

Der erfindungsgemäße radioaktive Marker kann beispielsweise bei der Reinigung des Rezeptors cRABP mittels klassischer Ionenaustausch- oder Ausschlußchromatographieverfahren bei niedrigem oder hohem Druck eingesetzt werden: Dazu ist es ausreichend, dem eingesetzten Gewebeextrakt als Ausgangs­ produkt eine bestimmte Menge des radioaktiven Liganden einzuverleiben. Dadurch wird der cRABP-Rezeptor selbst markiert. Man kann dann ohne Schwierigkeiten feststellen, ob er sich in einer gegebenen Fraktion befindet oder nicht.

Die Kenntnis der Kurven der Fixierung an dem Rezeptor er­ möglicht auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Markers bei der Quantifizierung des Rezeptors.

Der erfindungsgemäße Marker kann auch bei der Charakterisierung von Antikörpern gegen die Verbindung A eingesetzt werden. Diese Antikörper (erhalten nach klassischen Anti-Hapten-Anti­ körper-Verfahren) können dann als solche bei der Be­ stimmung des Produkts A eingesetzt werden, das an seinen Rezeptor fixiert ist oder auch nicht.

Der erfindungsgemäße Marker kann auch bei Untersuchungen des intracellulären Wirkungsmechanismus und des allgemeinen Metabolismus der Verbindung A Anwendung finden.

Die erfindungsgemäße tritiummarkierte Verbindung kann auch in Mischung mit derselben, allerdings nicht markierten Verbindung vorliegen, bzw. eingesetzt werden.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1 2-(3-³H-5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthyl)-6-benzo-[-b]-thiophencarbonsäure

• a) Ein Gemisch aus dieser nicht-tritiummarkierten Säure (500 mg: 1,37 mMol) und aus N-Bromsuccinimid (302 mg, 1,70 mMol) in 15 ml DMF rührt man 24 h bei Raum­ temperatur unter einer Stickstoffatmosphäre. Man gibt das erhaltene Gemisch dann zu 30 ml 1 N Chlorwasser­ stoffsäure und extrahiert das Produkt mit 130 ml Ethyl­ ether. Man trennt die Etherphase ab, wäscht sie mit Wasser, trocknet sie über wasserfreiem Magnesiumsulfat und zieht die Lösungsmittel bei vermindertem Druck ab. Man erhält so einen schwachbraunen Feststoff , den man 2 × aus einer Mischung aus Isooct-Tetrahydrofuran (50 : 50) umkristallisiert, wobei man 380 mg (63%) 2-(3-Brom-5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2- naphthyl)-6-benzo-[b]-thiophencarbonsäure mit einem Schmp. von 272 bis 275°C erhält.
  Elementaranalyse für:
  berechnet: C 62,30, H 5,23, Br 18,02, O 7,22, S 7,23;
  gefunden: C 62,49, H 5,06, Br 17,94, O 7,44, S 7,77.
  Die Stellung des Bromatoms wird durch Analyse des H-NMR-Spektrums der Verbindung und durch Vergleich dieses NMR-Spektrums mit dem nicht-bromierten Produkt be­ stätigt.
• b) Man löst die erhaltene Bromverbindung (25 mg: 0,05 mMol) in 2 ml trockenem Dioxan. Man gibt 10 mg Palladium-auf- Kohle (10%) und 20 µl (0,14 mMol) Triethylamin zu. Man rührt das erhaltene Gemisch bei Raumtemperatur 20 h unter unter Tritiumwasserstoffatmosphäre (Druck etwa 1 bar). Man filtriert den Katalysator ab und zieht die Lösungsmittel im Vakuum ab.
  Den Rückstand löst man in einer Mischung aus Methanol und Ethylacetat. Anschließend zieht man die Lösungs­ mittel bei vermindertem Druck ab. Dieses Verfahren wiederholt man 2 ×. Den erhaltenen Rückstand löst man in einer minimalen Menge Tetrahydrofuran und reinigt chromatographisch mit Hilfe einer präparativen Platte (Silicumdioxidplatte 0,2 × 20 × 20 cm; Eluierungs­ mittel: Gemisch aus Dichlormethan/Methanol 9 : 1). Man sammelt die bei UV-Bestrahlung bei 366 nm fluoreszierende Bande.
  Man löst das Endprodukt in 10 ml Methanol. Die Reinheit dieses Produkts verifiziert man dünnschicht­ chromatographisch (Siliciumdioxidplatte, Eluierungs­ mittel wie oben beschrieben). Unter UV-Bestrahlung (254 und 366 nm) und bei β-Zählung ist nur ein Fleck sichtbar. Im HPLC (Umkehrphase, Zorbax ODS-Säule, Eluierungsmittel:Gemisch aus Acetonitril/0,02%ige Essigsäurelösung in Wasser 95 : 5) detektiert man mittels UV oder bei Verwendung eines β-Detektors nur einen einzigen Peak.
  Die massenspektrometrisch bestimmte spezifische Aktivität beträgt etwa 300 GBq/mMol (8,0 Ci/mMol).
  Die erhaltene Gesamtaktivität, bestimmt durch Zählen im Flüssigkeitsszintillator, beträgt 4,3 mCi.

Charakteristika der Fixierung der Verbindung des Beispiels 1 an den löslichen Rezeptor cRABP

Die Fixierung der beanspruchten Verbindung an cRABP wurde mit Hilfe von Sättigungsversuchen charakterisiert. Die Gesamtfixierung (nicht spezifisch + spezifisch) (Kurve a) wurde durch Inkubation zunehmender Konzentrationen (bis zu einem Maximum von 50 nM) der beanspruchten Verbindung mit einer konstanten Menge (0,3 ml) eines Homogenisats von Rattenhoden (an cRABP reiches Organ) erhalten. Die nicht­ spezifische Fixierung der tritiummarkierten Verbindung wurde parallel durch die Messung der Fixierung mit zu­ nehmenden Konzentrationen des radioaktiven Liganden in Anwesenheit eines großen Überschusses (1 µm) Retinoesäure (Kurve c) bestimmt. Eine Inkubationszeit von 2 h ist er­ forderlich, um Gleichgewichtsbedingungen zu erzielen.

Ist das Gleichgewicht einmal erreicht, trennt man den Komplex cRABP-tritiummarkierter Ligand vom nicht-gebundenen Liganden durch Filtrieren über eine Gelausschlußsäule Sephadex G 25 (Säulen-Bio-Rad econo, 0,5 × 20 cm) ab:
Der Komplex wird eluiert (Elutionspeak bei 2,5 ml), während der nicht-gebundene Ligand insgesamt auf der Säule bleibt. Es ergibt sich eine völlige Trennung des gebundenen Produkts vom nicht-gebundenen Produkt. Es wird direkt in Szintillationsröhrchen eluiert. Die Radioaktivität wird durch Auszählen bestimmt.

Die so erhaltenen Ergebnisse werden durch nicht-lineare Regression analysiert, wobei als Modell die Gleichung von Clark Anwendung findet (A.J. Clark, The mode of action of drugs on cells, A. Arnold and Co., London, 1933).

In der Fig. 4 sind auf der Abszisse die anfänglichen Konzentrationen des untersuchten Liganden und auf der Ordinate die Konzentrationen im Gleichgewicht des Komplexes Ligand-Rezeptor aufgetragen.

Die Differenz zwischen der Kurve a (gesamte Fixierung) und c (nicht-spezifische Fixierung) gibt die Kurve der spezifischen Fixierung (Kurve b). Durch Analyse dieser Kurve kann man die Dissoziationskonstante im Gleichgewicht (Kd), welche die Konzentration des Produkts darstellt, die erforderlich ist, um 50% des löslichen Rezeptors zu sättigen. Diese Konstante ist ein Maß für die Affinität des Liganden für seinen Rezeptor. Der Kd-Wert ist umgekehrt proportional zur Affinität (je geringer Kd ist, desto größer ist die Affinität). Die Kurve für die gesamte Fixierung (a) wird nach Einführung einer linearen Komponente (die nicht-spezifische Fixierung) ins Regressionsmodell auf dieselbe Weise analysiert die auf diese Weise erhaltene Kurve für die spezifische Fixierung (Kurve b) stimmt mit derjenigen perfekt überein, die durch Differenzbildung erhalten wurde.

Diese Analyse gibt einen Wert für Kd von 2,7 ± 0,5 nM. Die spezifische Fixierung ist sättigbar und reversibel. Die nicht-spezifische Fixierung ist linear und nicht sättig­ bar im Bereich der eingesetzten Konzentrationen und stellt weniger als 10% der gesamten Fixierung dar. Bei den­ selben Bedingungen beträgt der Wert Kd für die Retinoesäure 2 ± 0,8 nM. Die nicht-spezifische Fixierung macht etwa 25% der gesamten Fixierung aus.

Vergleich mit tritiummarkierter Retinoesäure

Die Fig. 2 bis 7 zeigen die Ergebnisse von kompetitiven Untersuchungen und belegen die Ähnlichkeit der Fixierungs­ charakteristika von Retinoesäure und von der Verbindung des Beispiels 1.

Diese kompetitiven Untersuchungen führt man auf folgende Weise durch: Man vermischt eine feste Menge des radioaktiven Liganden (entspricht im wesentlichen der halben Sättigung der festen Menge des Rezeptors, die eingesetzt wird) mit zunehmenden Mengen des nicht-radioaktiven Liganden (ligand froid). Dann gibt man den Rezeptor zu. Man bestimmt an­ schließend die Menge des fixierten radioaktiven Liganden im Gleichgewicht (als % der anfänglichen Fixierung in Ab­ wesenheit des nicht-radioaktiven Liganden, bezogen auf die Menge des untersuchten Rezeptors).

In den Fig. 2 bis 7 sind auf der Abszisse die zunehmenden Konzentrationen des untersuchten nicht-radioaktiven Liganden (in Mol/l) und auf der Ordinate die Fixierung des radio­ aktiven Liganden (in % bezogen auf das Maximum) aufgetragen. Folgende Liganden wurden untersucht:

Fig. 2 radioaktiver Ligand:
Verbindung des Beispiels 1
nicht-radioaktiver Ligand:
Retinoesäure

Fig. 3 radioaktiver Ligand:
tritiummarkierte Retinoesäure
nicht-radioaktiver Ligand:
der gleiche wie bei Fig. 2

Fig. 4 radioaktiver Ligand:
tritiummarkierte Verbindung des Beispiels 1
nicht-radioaktiver Ligand:
die gleiche Verbindung, jedoch nicht-markiert (Verbindung A)

Fig. 5 radioaktiver Ligand:
tritiummarkierte Retinoesäure
nicht-radioaktiver Ligand:
der gleiche wie bei Fig. 4

Fig. 6 radioaktiver Ligand:
Verbindung des Beispiels 1
nicht-radioaktiver Ligand:
p-[(E(-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetra­ methyl-2-naphthyl)-propenyl]-benzoesäure (Hoffmann-La Roche), nachstehend Ver­ bindung B genannt, und

Fig. 7 radioaktiver Ligand:
tritiummarkierte Retinoesäure
nicht-radioaktiver Ligand:
der gleiche wie bei Fig. 6.

Ausgehend von den kompetitiven Kurven der Fig. 2 bis 7 wird in jedem Fall der IC₅₀-Wert bestimmt (Konzentration an nicht-radioaktivem Liganden, bei der die Anknüpfung des tritiummarkierten Liganden um 50% reduziert wird). Dieser IC₅₀-Wert ermöglicht es, die Dissoziationskonstante im Gleichgewicht (Kd) für jeden nicht-reaktiven Liganden zu berechnen.

Es wurden folgende Werte gefunden:

Fig. 2: Kd = 4 nM ± 19%

Fig. 3: Kd = 4 nM ± 44%

Fig. 4: Kd = 6 nM ± 30%

Fig. 5: Kd = 6 nM ± 19%

Fig. 6: Kd =16 nM ± 58%

Fig. 7: Kd =20 nM ± 24%.

Die Fig. 2 und 3 zeigen die Kurven des "Wettbewerbs" von nicht-radioaktiver Retinoesäure mit der Verbindung des Bei­ spiels 1 (Fig. 2) und mit tritiummarkierter Retinoesäure (Fig. 3). Die in beiden Fällen berechneten Dissoziations­ konstanten sind die gleichen, woraus geschlossen werden kann, daß die beiden radioaktiven Liganden ähnliche Fixierungs­ spezifitäten besitzen.

Aus den Fig. 4 und 5 geht auf gleiche Weise hervor, daß die für die Verbindung A erhaltenen Kd-Werte die gleichen sind, wenn man den einen oder den anderen markierten Liganden zum Einsatz bringt.

Dies trifft auch für den Fall der Verbindung B (Fig. 6 und 7) zu.

Folglich sind die berechneten Kd-Werte in allen untersuchten Fällen unabhängig vom eingesetzten tritiummarkierten Liganden. Dies zeigt, daß sich diese Liganden an denselben Rezeptor mit ähnlichen Spezifitäten binden und daß man bei der Bestimmung der Fixierung von Retinoiden an cRABP den einen durch den anderen ersetzen kann.

Claims (3)

1. Tritiummarkierte 2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8- tetramethyl-2-naphthyl)-6-benzo-(b)-thiophencarbon­ säure, die in 3-Stellung der Tetrahydronaphthalin­ gruppe markiert ist.

2. Verfahren zur Herstellung der tritiummarkierten Säure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise entweder eine 2-(3-Halogen-5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8- tetramethyl-2-naphthyl)-6-benzo-[b]-thiophencarbon­ säure herstellt und mit einem tritiummarkierten Reduktionsmittel behandelt,
oder 2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2- naphthyl)-6-benzo-[b]-thiophencarbonsäure einer Isotopenaustauschumsetzung mit überschwerem Wasser in Anwesenheit von Platin und Essigsäure bei einer Temperatur von 20 bis 150°C unterwirft.

3. Verwendung der tritiummarkierten 2-(5,6,7,8-Tetra­ hydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthyl)-6-benzo-[b]-thio­ phencarbonsäure nach Anspruch 1 als radioaktiver Marker bei der Be­ stimmung der Affinität, der Anwesenheit oder des Ge­ halts von Retinoiden mit einer Carboxylgruppe und/oder bei der Charakterisierung von gegen diese Säure ge­ richteten Antikörpern und/oder bei der Quantifizierung des Rezeptors cRABP dieser Retinoide.