CA1293733C - Compose marque au tritium, sa preparation et son application notamment dans la determination de l'affinite des retinoides pour leur recepteur cellulaire - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un acide 2-(5,6,7,8-tétra-hydro-5,5,8,8-tétraméthylnaphtyl)-6-benzo ¦b¦ thiophènecarboxylique marqué au tritium; sa préparation et son utilisation notamment comme marqueur radioactif dans la détermination de l'affinité, de la présence ou de la teneur des rétinoîdes des possédant un groupement carboxylique et/ou dans la caractérisation d'anticorps dirigés contre cet acide et/ou dans la quantification du récepteur cRABP desdits rétinoîdes.

Description

~'r2~33'733 , La présente invention a pour objet un nouveau composé marqué au tritium apparenté aux rétinoldes, sa préparatlon et son application notamment dans la détermination de l'affinité des rétino~des pour leur recepteur cellulaire et/ou dans la déterminatlon de la teneur cellulaire en récepteur correspondant.
On sait que les rétinoides constituent une classe connue de composés qui agissent notamment sur la prolifération et la différenciation de nombreux types de cellules ; voir par exemple B.A. Pawson et Coll., Journal of ~ledicinal Chemistry, Vol.25, n11 pages 1269-1277 (1982).
Les rétinoIdes ont été utilisés en particulier dans le traitement de diverses maladies dermatologiques dans lesquelles un déréglement des mécanismes de contrôle de la prolifération et de la différentiation des cellules épidermiques est impliqué ; voir par exemple l'ouvrage "Update :
Dermatology in General ~ediclne", Edited by Thomas B. Fitzpatrick et al., (McGraw-Hill Book Company), publié en 1983, en particulier le chapitre de D.B. Windhorst et al., The Retinoids, pages 226-237.
Le mode d'action des rétino;des est encore mal connu. Il a toutefois été montré qu'il existe dans les cellulas un récepteur appelé c~RABP (cellular Retino;c Acid-Binding Protein) spécifique des rétino~des possédant un groupement acide.
Ia détermination de la constante d'affinlté (Kd) pour la cRABP, d'un rétino~de possédant un groupement acide, constitue un moyen particulièrement rapide d'évaluation de l'activité biologique potentielle dudit rétino~de.
Plusieurs méthodes expérimentales permettent de déterminer la constante d'affinité d'un ligand pour son récepteur. On peut en particulier opérer par une méthode directe si le ligand considéré est marqué
radioactivement, ou encore par compétition avec un ligand radioactif si le ligand considéré n'est pas marqué radioactivement.
Un bon ligand radioactif doit d'une part présenter une affinité
élevée pour son récepteur et d'autre part, présenter une faible fixation sur toute autre molécule. En outre, il doit être suffisamment stable pour permettre une utilisation co Dode.
Dans le cas des rétinoIdes acides, le ligand radioactif généralement utilisé est le plus souvent l'acide rétino;que tritié, soit en position 2 (J.Labelled Compounds and Radiophar~aceuticals XVIII, p.1099, (1980) soit en position 4 (demande de brevet allemand n3.142.975).
L'acide rétino~que présente certes une excellente affinité pour le cRABP, avec une fixation non spécifique faible, mais la molécule présente l'inconvénient de se dégrader rapidement, par radiolyse, oxydation et photolyse.
JT/AA - BR.74924 . ~, .

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- 2 -On a maintenant découvert que l'acide 2-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)~6-benzo [b~ -thio-phène-carboxylique tritié constitue un nouveau ligand radioactif qui présente une excellente affinité pour la cR~BP, avec une fixation non spécifique faible. De plus, ce nouveau ligand est très stable et peut etre obtenu avec une haute activité spécifique, ce qui le rend particulièrement utile pour la mesure de l'affinité des rétinoides pour le cRABP.
La présente invention a ~onc pour ob3et l'acide 2-(5,6,7,8 tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl -2-naphtyl)-6-benzo [b] thiophène-carboxylique marqué au tritium et en particulier dont le groupement méthylidyne en position 3 du groupement tétrahydronaphtalène est marqué au tritium.
Le produit marqué au tritium décrit peut, en outre, etre sous la forme de mélanges avec le même produit non marqué.
~ 'invention a notamment pour objet un nouveau ligant radioactif, tel que défini ci-dessus, ayant une activité spécifique supérieure à 1 Ci~mmole et de préférence au moins egale à 2 Ci/mmole, soit environ 75 GBq/mmole.
D'une ~açon générale, le produit marqué peut être obtenu selon tout procédé utilisant les méthodes connues en soi pour marquer les composés chimiques avec le tritium, comme par e~emple un procédé analogue à celui décrit dans le Journal of Labelled ~ompounds and Radiopharmaceuticals, vol.
XXII, pp 843-850 (1985).
L'invention a également pour objet un procédé de préparation du nouveau ligand radioactif tel que défini ci-dessus. Ce procédé est principalement caractérisé par lefait que l'on prépare un acide 2-(3-halogéno-5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo Cb] thio-phène-carboxylique e-t qu'on le soumet à l'action d'un agent réducteur tritié.

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- : .'.:. ' : ' ' ' ` . ~Z~37~3 L'agent reducteur est par exemple de l'hydrogène tritié utilise en présence d'un catalyseur convenable, notamment un catalyseur à base de palladium.
La reduction du dérivé 3-halogéné est effectuée de preference à température et sous pressiorl ambiantes, par exemple à 15-30 C sous une pression de 1 bar (soit environ 105 Pa).
Le dérivé halogéné utilisé comme produit de départ est de préférence le dérivé bromé.
L'acide 2-(3-halogéno-5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo ~b~ thiophène-carboxylique peut lui-même êtxe préparé à partir de l'acide 2-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo ~b] thio-phene-carboxyli~ue par l'action d~'un agent d'halogén~tion (en particulier de bromation). Par exemple, le dérivé bromé
peut être obtenu par l'action d'un agent de bromation tel que la N-bromo-succinimide dans le diméthylformamide à une température réactionnelle pouvant aller de 0 à 50 C et de preference de 0 à 20 C.
L'acide 2-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl~-6-benzo Cb~ thiophène-carboxylique est un produit connu (appelé ci-après composé A) et peut être obtenu selon le procédé décrit par exemple dans la demande de brevet français n 85.13747 (2.570.377) déposée le 17 septembre 25 1985.
L'invention a également pour objet, à titre de produit intermédiaire .. _, , .. , . . .... , . .. ._ . . . .. , _ _ _ . _ . _ . . . . . . ... . .... _ . . .

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'733 obtenu dar.s le procédé décrit ci-dessus, l'acide 2-(3-halogéno-5,6~7,8-tétra-hydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo [b~ thiophène-carboxylique, et en particulier le dérivé bromé.
Le ligand radio-actif de l'invention peut également etre obtenu au départ de l'acide 2-(5,~,7,8-tétrahydro-5,5,~,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo ~b] thiophène carboxylique par échange isotopique avec de l'eau tritiée en présence de ~latine et d'acide acétique à une température allant de préférence de 2~ à 150C. Dans ce cas, l'échange isotopique se fait préférentiellement avec les protons aromatiques du ligand.
L'invention a également pour obJet l'utilisation de l'acide 2-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo ~b~ thiophène-carboxylique tritié, en particulier tritié en position 3 du groupement tétrahydronaphtalène comme marqueur radioactif notamment dans la détermination de l~affinité, de la présence ou de la teneur des rétino~des à groupement carboxylique et/ou dans la quantification du récepteur cRABP desdits rétino;des.
Par exemple, le marqueur radioactif de l'invention peut être utilisé
lors de la purification du récepteur cRABP par les méthodes classiques de chromatographie d'échange d'ions ou d'exclusion sous basse ou haute pression:
il suffit d'ajouter à l'extrait tissulaire utilisé comme produit de départ une quantité déterminée du ligand radioactif. Le récepteur cRABP se trouve ainsi lui-même marqué et on peut facilement repérer sa présence ou son absence dans une fraction donnée.
La connaissancé des courbes de fixation sur le récepteur permet également l'utilisation du marqueur de l'invention dans la quantification du récepteur.
Le marqueur radioactif de l'invention peut également etre utilisé
dans la caractérisation d'anticorps contre le composé A, ces anticorps ~obtenus selon les méthodes classiques d'anticorps anti-haptènes) étant eux-memes utilisables dans la détermination du produit A fixé ou non sur son récepteur.
Le marqueur radioactif de l'invention peut aussi être utilisé dans l'étude du mécanisme d'action intracellulaire et du métabolisme général du composé A.

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3~33 - 3a -La présente invention sera mieux comprise a la lecture de la description qui va suivre faite avec référence aux dessins suivants:
- la figure 1 est un,graphique où sont représentées en abscisses les concentrations initiales du ligand étudié, et en ordonnées, les concentrations à l'équilibre du complexe ligand-récepteur;
- les figures 2 à 7 sont des graphiques où sont représentées en abscisses les concentrations croissantes du ligand froid étudié (en moles/litre), et en ordonnées la , fixation du ligand radioactif ~en ~ du maximum).
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.

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-4 - ~Z93 ~3~

Acide 2-t3- H -5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo ~b~ thiophènecarboxylique.
a) Un mélange dudit acide non tritié (500 mg ; 1,37 mmole) et de N-bromosuccinimide (302 mg ; 1,70mmole) dans 15 ml de DMF est agité à
température ambiante pendant 24 heures, sous atmosphère d'azote. Le mélange obtenu est ajouté à 30ml d'acide chlorhydrique N et le produit est extrait avec de l'éther éthylique (130ml). La phase éthérée est séparée, lavée à
l'eau, séchée sur sulfate de magnésium anhydre, et les solvants évaporés sous pression réduite. On obtient ainsi un solide brun pâle que l'on recristallise deux fois dans un mélange iso-octane/tétrahydrofuranne (50:50) pour obtenir 380mg (63%) d'acide 2-(3-bro~o-5,6,7,8J-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo ~b~ thiophènecarboxylique qui fond à 272-275C.
Analyse élémentaire:
Calculé: C: 62,30 H: 5,23 Br: 18,02 0: 7,22 S: 7,23 Trouvé: 62,49 5,06 17,9h 7,44 7,77 La position de l'atome de brome est confirmée par analyse du spectre de proton du composé ci-dessus, et comparaison avec le spectre RM~ du produi~ non bromé.
b) Le composé bromé obtenu (25mg ; 0,05mmole) est dissous dans 2ml de dioxanne sec. IOmg de palladium sur charbon (10%) et 20 microlitres (0,14mmole) de triéthylamine sont a~outés. Le mélange résultant est agité à
température ambiante, sous atmosphère de tritium (pression environ 1 bar), pendant 20 heures. Le catalyseur est éliminé par ~iltration et les solvants évaporés sous vide.
Le résidu est dissous dans un mélange de méthar.ol et d'acétate d'éthyle, puis les solvants sont évaporés sous pression réduite. Cette procédure est répétée deux fois. Le résidu obtenu est alors dissous dans un minimum de tétrahydrofuranne et purlfié par chromatographie sur plaque préparative (plaque de silice 0,2 x 20 x 20cm, éluant : mélange dichloromé-thane/méthanol 9:1). La bande fluorescente sous irradiation UV à 366nm est recueillie.
Ie produit final est dissous dans 10ml de méthanol. Sa pureté est vériflée par chromatographie sur couche mince (plaque de silice, éluant comme ci-dessus). Une seule tache est apparente sous irradiation UV (254 et 366nm) et lors du comptage bêta. Par HPLC (phase inverse, colonne Zorbax* ODS, éluant : mélange acétonitrile/solutlon d'acide acétique à 0,02% dans l'eau 95:5), un seul pic est détecté par UV ou en utilisant un détecteur bêta.
L'activitë spécifique déterminée par spectrométrie de masse est environ 300GBq/mmole (8,0 Ci/m~ole).
* (marque de commerce) , - , . .~ ., : : , . .

`~` _5 _ ~ ~ ~3 7~3 L'activité totale obtenue, mesurée par comptage a~1 scintillateur liquide est 4.3mCi.
Caractéristiques de la fixation du composé de l'exemple 1 sur le récepteur soluble cRABP.
.
La fixation du composé revendiqué avec la c~BP a été caractérisée par des expériences de saturation. La fixation totale (non spécifique +
spéciflque) ~cou~be a), est obtenue par incubation de concentrations croissantes (jusqu'à un maximum de 50nM) du composé revendiqué avec une quantité constante (0,3ml) d'un homogénat de test:Lcules de rat (organe riche en cRABP). La fixation non spécifique du composé tritié est déterm~née en parallèle, par la mesure de la fixation avec des concentrations croissantes du ligand radioactif en présence d'un large excès (1~M) d'acide rétino~que (courbe c). Un temps d'incubation de deux heures est nécessaire à
l'établissement de conditions ~léquilibre.
Une fois l'équilibre atteint, le complexe cRABP-ligand tritié est séparé du ligand non lié par filtratlon sur colcnne de gel d'exclusion Sephadex G 25 (colonnes Bio-Rad*econo, 0,5x20cm): 18 complexe est élué (pic d'élution à 2,5ml), tandis que le ligand non lié est retenu en totalité sur la colonne. Il en résulte une séparation totale entre produit lié et non lié.
L'éluticn est faite directement dans des tubes à scintillation et la radioactivité est mesurée par comptage.
Les résultats ainsi obtenus sont analysés par régression non-linéaire utilisant comme modèle lléquation de Clark: (A.J. Clark, The mode of action of drugs on cells; A. Arnold and Co., London, 1933).
Sur la figure 1, on a représenté ren abscisses les concentrations initiales du ligar.d étudié, et en ordonnées, les concentrations à l'équilibre du complexe ligand-récepteurl.
La différence entre les courbes a (fixa~ion totale~ et c (fixation non spécifique) donne la courbe de fixation spécifique (courbe b). L'analyse de cette courbe permet d'obtenir la constante de dissociation à l'équilibre, (Kd) qui est la concentration de produit nécessaire pour saturer 507 du récepteur soluble. Cette constante est une mesure de l'affinité du ligand pour son récepteur, le Kd étant inversement proportionnel à l'affinité, (plus le Kd est faible, plus l'affinlté est grande). La courbe de fixation totale (a) est analysée de la même manière, après introduction d'une composante linéaire (la fixation non spécifique) au modèle de regression; la courbe de fixat~on spécifique obtenue de cette manière (courbe b) est en parfait accord avec celle obtenue par différence.
Cette analyse donne une valeur de Kd de 2,7+0,5nM. La fixation spécifique est saturable et réversible. La fixation non spécifique est ~A~ ~ * ( marque de commerce) .
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-6 - ~ 3~

linéalre et non saturable dans la gamme de concentrations utilisées, et représente moins de 10% de la fixation totale. Dans les mêmes conditions, la valeur du Kd de l'acide rétinolque est 2+0,8nM, la fixation non spécifique représentant approximativement 25% de la fixation totale.
Compar on avec l'acide rétinoIque tritié.
Les figures 2 à 7 correspondent à des expériences de compétition et montrent la similitude des caractéristiques de la ~ixation de l'acide rétino~que9 et du composé de l'exemple 1.
Ces expériences de compétition sont effectuées de la façon suivante:
on mélange une quantité fixe de ligand radioactif (correspondant sensiblement à la demi-saturation de la quantité fixe de récepteur qui sera utilisée), avec des quantités croissantes de ligand froid ~non rad:Loactif). Puis on a~oute le récepteur; et on détermine la quantité de ligand radioactif fixée à
l'équilibre (en % de la fixation initlale en l'absence de ligand froid, pour la quantité de récepteur considéré).
Dans les figures 2 à 7, on a porté en abscisses les concentrat-lons croissantes du ligand froid étudié (en moles/litre), et en ordonnées la fixation du ligand radioactif (en % du maximum). Les ligands étudiés sont les suivants:
Figure 2: ligand radioactif: composé de l'exemple 1 ligand froid: acide r~tino~que Figure 3: ligand radioactif: acide rétinoique tritié
ligand froid: le même que pour la figure 2 Figure 4: ligand radioactif: composé tritié de l'exemple 1 ligand froid: meme composé mais non marqué (composé A) Figure 5: ligand radioactif: acide rétinolque trltié
ligand froid: le même que pour la figure 4 Figure 6: ligand radioactif: composé de l'exemple 1 ligand froid: acide p- ~ E)-2-(5 9 6,7,8-tétrahydro-

5,5,8z8~tétraméthyl-2-naphtyl)-propèny~ -benzoïque (Hoffmann-La Roche), appelé ci-après composé B
Figure 7: ligand radioactif: acide rétinoique tritié
ligand froid: le même que pour la figure 6.
A partir des courbes de compétition des figures 2 à 7, on détermine dans chaque cas la IC50 (concentration de ligand froid réduisant l'attachement du ligand tritié de 50%). Cette valeur IC50 permet de calculer dans chaque cas la constante de dissociation à l'équilibre (Kd) pour le ligand froid.
On a trouvé les valeurs suivantes:
Figure 2: Kd=4nM+19%
Figure 3: Kd=4nM+44%
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_7 - ~9~33 Figure 4: Kd=6nM+30%
Figure 5: Kd=6nM~19%
Figure 6: Kd=16nM+58%
figure 7: Kd=20nM+24%
Les figures 2 et 3 montrent les courbes de compétition de l'acide rétinolque froid avec le composé de l'exemple 1 (figure 2) et avec l'acide rétino;que tritié (figure 3). Les constantes de dissociation calculées dans l'un et l'autre cas sont les mêmes, ce qui suggère que les deux ligands radioactifs ont des spécificités de fixation similaires.
De la même manière, on voit (figures 4 et 5) que les valeurs de Kd obtenues pour le composé A, en utilisant l'un ou l'autre ligand marqué, sont les mêmes.
Cela est également vérifié dans le cas du composé B (figures 6 et 7).
En conclusion, dans tous les cas étudiés ci-dessus, les Kd calculés sont indépendants du ligand tritié utilisé, ce qui montre que ces ligands se lient au même récepteur avec des spécificités semblables, et que l'on peut remplacer l'un par l'autre pour la détermination de la fixation des rétino~des sur la cRABP.

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Claims (10)

1. Acide 2-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétra-méthyl-2-naphtyl)-6-benzo [b] thiophène-carboxylique marqué
au tritium.

2. Acide 2-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétra-méthyl-2-naphtyl)-6-benzo [b] thiophène-carboxylique selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il est marqué
en position 3 du groupement tétrahydronaphtalène.

3. Acide 2-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétra-méthyl-2-naphtyl)-6-benzo [b] thiophène-carboxylique tritié, tel que défini dans la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait qu'il possède une activité spécifique d'au moins 75GBq/mmole.

4. Procédé de préparation d'un produit tritié tel que défini dans la revendication 1, caractérisé par le fait que:
- soit l'on prépare un acide 2-(3-halogéno-

5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo [b] thiophène-carboxylique et le soumet à l'action d'un agent réducteur tritié;
- soit l'on soumet l'acide 2-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo [b] thiophène car-boxylique à une réaction d'échange isotopique avec de l'eau tritiée en présence de platine et d'acide acétique à une température de 20 à 150°C.

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé
par le fait que l'agent réducteur est l'hydrogène tritié.

6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé par le fait que le produit halogéné de départ est lui-même obtenu par l'action d'un agent d'halogénation sur l'acide 2-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo [b] thiophène-carboxylique.

7. Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé par le fait que l'agent d'halogénation est un agent de bromation.

8. L'acide 2-(3-halogéno-5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo [b] thiophène-carboxylique.

9. L'acide 2-(3-bromo-5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo [b] thiophène-carboxylique.

10. Marqueur radioactif pour la détermination de l'affinité, de la présence ou de la teneur des rétinoîdes possédant un groupement carboxylique et/ou dans la caractérisation d'anticorps dirigés contre cet acide et/ou dans la quantification du récepteur cRABP desdits réti-noîdes, caractérisé en ce qu'il renferme au moins de l'acide 2-(5,6,7,8-tétrahydro-5,5,8,8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo [b] thiophènecarboxylique tritié.