DE3142975A1

DE3142975A1 - Verfahren zur herstellung von mit tritium markierterretinsaeure

Info

Publication number: DE3142975A1
Application number: DE19813142975
Authority: DE
Inventors: Peter Dr.-Chem. 8000 München Prehm
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1981-10-29
Filing date: 1981-10-29
Publication date: 1983-05-11

Description

Beschreibung
Vitamin A1 (Retinol) uncl einige seiner Derivate spielen eine zentrale Rolle bei der Steuerung des Sehvermögens; ein Mangel an Vitamin A1 führt zur sogenannten Nachtblindheit. Die Steuerung des Sehvermögens ist jedoch nicht die einzige physiologische Aufgabe des Vitamin A1. Es spielt auch eine generelle Rolle im Zellstoffwechsel, insbesondere im Stoffwechsel der Epithelzellen der Atmungswege und des Magen-Darm-Trakts, die sich bei Vitamin A1-Mangel tiefgreifend verändern. Hinsichtlich der Wirkung auf den Zellstoffwechsel (Gewebewachstum und seine Erhaltung) verhält sich die Vitamin A1-S.iure (Retinsäure) in einigen Fällen wie der Alkohol (Vitamin A1). In der Funktion beim Sehvorgang kann die Vitamin A1-Säure das Vitamin jedoch nicht ersetzen.
Der Einfluß und die Wirkungsweise des Vitamin A1 und seiner Derivate, wie z. B. der Retinsäure, beim Sehvorgang und beim Zellstoffwechsel ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Zur Aufklärung des Ablaufs der komplizierten physiologischen Vorgänge werden insbesondere radioaktiv markierte Verbindungen, wie z.B. die 3H-Retinsäure, eingesetzt. Die bekannten Verfahren zur Herstellung von 3H-Retinsäure sind allerdings sehr umständlich und aufwendig (vgl. J. Labelled Compounds and Radiopharm. 13 (1977), 123 und 16 (1979), 791.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist deshalb die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von radioaktiv markierter Retinsäure, das leicht durchführbar ist und eine 3H-Retinsäure mit ausreichender spezifischer Aktivität liefert. Diese Aufgabe wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gelöst.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von mit Tritium markierter Retinsäure, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man Retinsäure bromiert und das Bromierungsprodukt mit einem mit Tritium markierten Reduktionsmittel reduziert.
Vorzugsweise geht man von der all-trans-Retinsäure aus, die in ihrer Konfiguration dem natürlichen Vitamin A1 entspricht. Es ist aber möglich, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren auch alle anderen Stereoisomeren, z. B. die 9-cis-,ll-cis-oder 13-cis-Verbindung oder Gemische davon, mit Tritium zu markieren.
Als Bromierungsmittel eignen sich z. B. Bromimide und Bromamide. Vorzugsweise wird Bromacetamid und insbesondere N-Brom-succinimid verwendet. Als Lösungsmittel für die Bromierungsstufe kann ein inertes, insbesondere unpolares organisches Lösungsmittel verwendet werden, wie z.B.
Tetrachlorkohlenstoff, Benzol oder Cyclohexan, und vorzugsweise Chloroform, zweckmäßigerweise ein frisch über Phosphorpentoxid destilliertes Chloroform. Die Reaktion wird vorzugsweise unter Kühlen durchgeführt, wie z. B. bei einer Temperatur von -400C bis +100C, und insbesondere bei -50C bis 0°C. Nach dem Abdestillieren des Lösungsmittels kann das Bromierungsprodukt ohne weitere Aufarbeitung und Reinigung reduziert werden.
Die Reduktion des Bromierungsprodukts erfolgt vorzugsweise mit einem durch Tritium markierten komplexen Metallhydrid, wie z. B. mit31i-Tributylzinnhydrid, und vorzugsweise mit einem 3H-Alkalimetallborhydrid, wie Kaliumborhydrid, und insbesondere mit Natriumborhydrid.
Die Wahl des geeigneten Lösungsmittels hängt insbesondere von dem verwendeten Reduktionsmittel ab. Die Reduktion kann in einem nichtionisierenden, inerten organischen Lösungsmittel durchgeführt werden. Bei Verwending von Al- kalimetall-borhydrid, insbesondere Natriumborhydrid, hat es sich zur Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit und Ausbeute als zweckmäßig erwiesen, in einem solvatisierenden Medium zu arbeiten, was z. B. durch einen Zusatz von Wasser, vorzugsweise in einer Menge von 10 bis 40 Gew.-%, und insbesondere von 20 bis 30 Gew.-%, zum organischen Lösungsmittel erreicht werden kann. Als organische Lösungsmittel können z. B. Äthanol oder ein Glykoläther, wie Diäthylenglykol-diäthyläther, eingesetzt werden. Um dabei die Hydrolyse des Alkalimetall-borhydrids möglichst gering zuhalten, ist außerdem ein Zusatz von Alkalimetallhydroxid, wie z. B. Natriumhydroxid, zweckmäßig, z. B.
im Verhältnis 4 Mol Alkalimetall-borhydrid zu 1 Mol Alkalimetall-hydroxid. Die Reaktionstemperatur kann in weiten Grenzen variiert werden. Es kann unter Kühlung, bei Raumtemperatur oder auch bei erhöhter Temperatur gearbeitet werden, zweckmäßigerweise zwischen 0 und 75° C, und insbesondere -bei Raumtemperatur.
Das erfindungsgemäße Verfahren, und insbesondere die Bromierung, wird zweckmäßigerweise in einer Inertgasatmosphäre, wie z. B. unter Stickstoff, durchgeführt.
Es wurde gefunden, daß sich das für die Reduktion einfacher Alkylhalogenide bekannte Reduktionsverfahren (vgl.
H. M. Bell und H.C. Brown, J. Am. Chem. Soc. 88 (1966), 1473) auch auf die Reduktion der in der ersten Verfahrensstufe erhaltenen bromierten Retinsäure anwenden läßt, ohne daß dabei in nennenswertem Umfang eine Abspaltung von Halogenwasserstoff oder eine Stereoisomerisierung eintritt. Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich deshalb unter weitgehender Erhaltung der Stereoisomerie der als Ausgangsprodukt verwendeten Retinsäure durchführen. Beimengungen anderer Stereoisomerer können nach den dafür bekannten Methoden, z. B. mittels Chromatographie, abgetrennt werden.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es daher möglich, radioaktiv markierte Retinsäure auf einfache Weise in einer zweistufigen Reaktion herzustellen. Die erhaltene Retinsäure besitzt eine für ihre Verwendung ausreichende spezifische Aktivität (etwa 3,7 x 10 Bq/mMol = 1 Ci/ mMol).
Das nachfolgende Beispiel erläutert die Erfindung näher, ohne sie darauf zu beschränken.
Beispiel In einem kleinen "Quickfit"-Schliffkolben (1 ml) wurden 1,2mgall-trans-Retinsäure in 100 Cil Chloroform gelöst und im Eisbad mit einem kleinen Magnetrührer gerührt. Das Gefäß war mit einem Calciumchlorid-Trockenrohr verschlossen. Es wurden 0,7 mg N-Bromsuccinimid, das aus heißem Wasser umkristallisiert war, zugegeben und bei 0° C 15 Minuten lang weiter gerührt. Am Rotationsverdampfer wurde das Lösungsmittel abgedampft, ohne das Gefäß zu erwärmen.
Der Rückstand wurde bei 0" C zunächst mit 160 >1 einer Lösung von 0,5 N Natronlauge, Wasser und Diäthylenglykol-diäthyläther (3/3/2) und dann mit 0,8 mg 3H-Natriumborhydrid (spezifische Aktivität 36,36 x 1010 Bq/mMol = 9,8 Ci/mMol) versetzt und über Nacht gerührt.
Die Mischung wurde in 5 ml kalte Salzsäure überführt (wobei radioaktiver Wasserstoff entweicht) und zweimal mit 2 ml kaltem Chloroform extrahiert. Das Chloroform wurde vorsichtig am Rotationsverdampfer eingeengt, und der Rückstand in 0,5 ml Heptan/n-Butanol/Benzol (5/1/2) gelöst. Diese Lösung wurde auf eine Kieselgelsäule (5 x 1 cm) aufgetragen und mit dem obigen Lösungsmittelgemisch eluiert. Es wurden 1 ml-Fraktionen gesammelt, von denen je 5 p1 zur Radioaktivitätsbestimmung verwendet wurden.
Die Fraktionen 9 bis 12 wurden gesammelt, eingedampft und in 5 ml Äthanol gelöst. Die Konzentration von all-trans-(4-3H)-Retinsäure wurde durch Absorption bei 325 nm bestimmt. Die Ausbeute betrug 0,54 mg (1,8 pMol, 34 %). Die spezifische Aktivität der markierten Retinsäure betrug 10 3,7 x 10 Bq/mMol (1 Ci/mMol).

Claims

Verfahren zur Herstellung von mit Tritium markierter Retinsäure Patentansprüche Verfahren zur Herstellung von mit Tritium markierter Retinsäure, d a d u r c h g e k e n n z e i c h -n e t , daß man Retinsäure bromiert und das Bromierungsprodukt mit einem mit Tritium markierten Reduktionsmittel reduziert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e -k e n n z e i c h n e t , daß man die Bromierung mit N-Bromsuccinimid in einem inerten organischen Lösungsmittel durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, d a d u r c h g e -k e n n z e i c h n e t , daß man als Lösungsmittel Chloroform verwendet.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, d a -d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man äls Reduktionsmittel ein mit Tritium markiertes komplexes Metal lhydrid verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 4, d a d u r c h g e -k e n n z e i c h n e t , daß man als Reduktionsmittel ein mit Tritium markiertes Alkalimetallborhydrid verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 5, d a d u r c h g e -k e n n z e i c h n e t , daß man als Reduktionsmittel ein mit Tritium markiertes Natriumborhydrid verwendet.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, d a -d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man von all-trans-Retinsäure ausgeht.
8. Das im Beispiel beschriebene Verfahren zur Herstellung von mit Tritium markierter Retinsäure.