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Nouveau composé marqué au tritium, sa préparation et son application notamment dans la détermination de l'affinité des rétinoldes pour leur récepteur cellulaire
La présente invention a pour objet un nouveau composé marqué au tritium apparenté aux rétinoldes, sa préparation et son application notamment dans la détermination de l'affinité des rétinoldes pour leur récepteur cellulaire et/ou dans la détermination de la teneur cellulaire en récepteur correspondant.
On sait que les rétinoldes constituent une classe connue de composés qui agissent notamment sur la prolifération et la différenciation de nombreux types de cellules ; voir par exemple B. A.
Pawson et Coll., Journal of Médicinal Chemistry, Vol. 25, n011 pages 1269-1277 (1982).
Les rétinoldes ont été utilisés en particulier dans le traitement de diverses maladies dermatologiques dans lesquelles un déréglement des mécanismes de contrôle de la prolifération et de la différentiation des cellules épidermiques est impliqué ; voir par exemple l'ouvrage"Update : Dermatology in Général Medicine", Edited by Thomas B. Fitzpatrick et al., (McGraw-Hill Book Company), publié en 1983, en particulier le chapitre de D. B. Windhorst et al., The Retinoids, pages 226-237.
Le mode d'action des rétinoldes est encore mal connu. Il a toutefois été montré qu'il existe dans les cellules un récepteur appelé cRABP (cellular Retinoic Acid-Binding Protein) spécifique des rétinoldes possédant un groupement acide.
La détermination de la constante d'affinité (Kd) pour la cRABP, d'un rétinoide possédant un groupement acide, constitue un moyen particulièrement rapide d'évaluation de l'activité biologique potentielle dudit rétinolde.
Plusieurs méthodes expérimentales permettent de déterminer la constante d'affinité d'un ligand pour son récepteur. On peut en particulier opérer par une méthode directe si le ligand considéré est marqué radioactivement, ou encore par compétition avec un ligand
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radioactif si le ligand considéré n'est pas marqué radioactivement.
Un bon ligand radioactif doit d'une part présenter une affinité élevée pour son récepteur et d'autre part, présenter une faible fixation sur toute autre molécule. En outre, il doit être suffisamment stable pour permettre une utilisation commode.
Dans le cas des rétinoldes acides, le ligand radioactif généralement utilisé est le plus souvent l'acide rétinoique tritié, soit en position 2 (J. Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals XVIII, p. 1099, (1980) soit en position 4 (demande de brevet allemand n 3. 142.975).
L'acide rétinoique présente certes une excellente affinité pour le cRABP, avec une fixation non spécifique faible, mais la molécule présente l'inconvénient de se dégrader rapidement, par radiolyse, oxydation et photolyse.
. On a maintenant découvert que l'acide 2- (5, 6,7, 8-tétrahydro- 5,5, 8, 8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo fbl thiophène-carboxylique tritié constitue un nouveau ligand radioactif qui présente une excellente affinité pour la cRABP, avec une fixation non spécifique faible. De plus, ce nouveau ligand est très stable et peut être obtenu avec une haute activité spécifique, ce qui le rend particulièrement utile pour la mesure de l'affinité des rétinoides pour le cRABP.
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La présente invention a donc pour objet l'acide 2- (5, 6, 7, 8-tétrahydro-5, 5, 8, 8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo f b1 thiophène-carboxylique marqué au tritium et en particulier dont le groupement méthylidyne en position 3 du groupement tétrahydro-, naphtalèné est marqué au tritium.
L'invention a notamment pour objet un nouveau ligand radioactif, tel que défini ci-dessus, ayant une activité spécifique supérieure à 1 Ci/mmole et de préférence au moins égale à 2 Ci/mmole, soit environ 75 GBq/mmole.
D'une façon générale, le produit marqué peut-être obtenu selon tout procédé utilisant les méthodes connues en soi pour marquer les composés chimiques avec le tritium comme par exemple un procédé analogue à celui décrit dans le journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, vol. XXII, pp. 843-850 (1985).
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L'invention a également pour objet un procédé de préparation du nouveau ligand radioactif tel que défini ci-dessus. Ce procédé est principalement caractérisé par le fait que l'on prépare un acide 2- (3-halogéno-5, 6,7, 8-tétrahydro-5, 5,8, 8-tétraméthyl-2-naphtyl)- 6-benzo fbl thiophène-carboxylique et qu'on le soumet à l'action d'un agent réducteur tritié.
L'agent réducteur est par exemple de l'hydrogène tritié utilisé en présence d'un catalyseur convenable, notamment un catalyseur à base de palladium.-
La réduction du dérivé 3-halogéné est effectuée de préférence à température et sous pression ambiantes, par exemple à 15-30 C sous une pression de 1 bar (soit environ 105 Pa).
Le dérivé halogéné utilisé comme produit de départ est de préférence le dérivé bromé.
L'acide 2- (3-halogéno-5, 6,7, 8-tétrahydro-5,5, 8,8
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- tétraméthyl-2-naphtyl) -6-benzo (bJ thiophène-carboxylique peut lui-même être préparé à partir de l'acide 2- (5, 6, 7, 8-tétrahydro- 5, 5, 8, 8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo [b) thiophènecarboxylique par l'action d'un agent d'halogénation (en particulier de bromation).
Par exemple, le dérivé bromé peut être obtenu. par l'action d'un agent de bromation tel que la N-bromo-succinimide dans le diméthylformamide à une température réactionnelle pouvant aller de 0 à 50"C et de préférence de 0 à 20OC.
L'acide 2- (5, 6,7, 8 tétrahydro-S, S, g, 8-tétraméthyl-2-naphtyl) - 6-benzo [bj thiophènecarboxylique est un produit connu (appelé ci-après composé A) et peut être obtenu selon le procédé décrit par exemple dans la demande de brevet français ne85. 13747 (2.570. 377) déposée le 17 Septembre 1985.
L'invention a également pour objet, à titre de produit intermédiaire obtenu dans le procédé décrit ci-dessus, l'acide 2- (3-halogéno-5, 6,7, 8-tétrahydro-5, 5,8, 8-tétraméthyl-2-naphtyl) - 6-benzo [b] thiophène-carboxylique, et en particulier le dérivé bromé.
Le ligand radio-actif de l'invention peut également être obtenu au départ de l'acide 2- (5, 6,7, 8-tétrahydro-5,5, 8,8-tétraméthyl - 2-naphtyl)-6-benzo [bJ thiophène carboxylique par échange isotopique avec de l'eau tritiée en présence de platine et d'acide acétique à une température allant de préférence de 20 à 150 C. Dans ce cas, l'échange
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isotopique se fait préférentiellement avec les protons aromatiques du ligand.
L'invention a également pour objet l'utilisation de l'acide 2- (5, 6,7, 8-tétrahydro-5,5, 8, 8-tétraméthyl-2-naphtyl)-6-benzo Fbl thiophènecarboxylique tritié, en particulier tritié en position 3 du groupement tétrahydronaphtalène comme marqueur radioactif notamment dans la détermination de l'affinité, de la présence ou de la teneur des rétinoldes à groupement carboxylique et/ou dans la quantification du récepteur cRABP desdits rétinoldes.
Par exemple, le marqueur radioactif de l'invention peut être utilisé lors de la purification du récepteur cRABP par les méthodes classiques de chromatographie d'échange d'ions ou d'exclusion sous basse ou haute pression : il suffit d'ajouter à l'extrait tissulaire utilisé comme produit de départ une quantité déterminée du ligand radioactif. Le récepteur cRABP se trouve ainsi lui-même marqué et on peut facilement repérer sa présence ou son absence dans une fraction donnée.
La connaissance des courbes de fixation sur le récepteur permet également l'utilisation du marqueur de l'invention dans la quantification du récepteur.
Le marqueur radioactif de l'invention peut également être utilisé dans la caractérisation d'anticorps contre le composé A, ces anticorps (obtenus selon les méthodes classiques d'anticorps anti-haptènes) étant eux-mêmes utilisables dans la détermination du produit A fixé ou non sur son récepteur.
Le marqueur radioactif de - l'invention peut aussi être utilisé dans l'étude du mécanisme d'action intracellulaire et du métabolisme général du composé A.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
EXEMPLE 1
Acide 2- (3-3H -5, 6,7, 8-tétrahydro-5,5, 8, 8-tétraméthyl- 2-naphtyl)-6-benzo fb] thiophènecarboxylique. a) Un mélange dudit acide non tritié (500 mg ; 1,37 mmole) et de N-bromosuccinimide (302 mg ; 1, 70mmole) dans 15 ml de DMF est
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agité à température ambiante pendant 24 heures, sous atmosphère d'azote. Le mélange obtenu est ajouté à 30ml d'acide chlorhydrique N
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et le produit est extrait avec de l'éther éthylique (130ml). La phase éthérée est séparée, lavée à l'eau, séchée sur sulfate de magnésium anhydre, et les solvants évaporés sous pression réduite.
On obtient ainsi un solide brun pâle que l'on recristallise deux fois dans un mélange iso-octane/tétrahydrofuranne (50 : 50) pour obtenir 380mg (63%) d'acide 2- (3-bromo-5, 6,7, 8,-tétrahydro-5, 5,8, 8-tétraméthyl-2 - naphtyl) -6-benzo (] thiophènecarboxylique qui fond à 272-275 C.
Analyse élémentaire :
Calculé : C : 62,30 H : 5,23 Br : 18,02 0 : 7,22 S : 7,23
Trouvé : 62,49 5,06 17,94 7,44 7,77
La position de l'atome de brome est confirmée par analyse du spectre RMN de proton du composé ci-dessus, et comparaison avec le spectre RMN du produit non bromé. b) Le composé bromé obtenu (25mg ; 0,05mmole) est dissous dans 2ml de dioxanne sec. 10mg de palladium sur charbon (10%) et 20 microlitres (0,14mmole) de triéthylamine sont ajoutés. Le mélange résultant est agité à température ambiante, sous atmosphère de tritium (pression environ 1 bar), pendant 20 heures. Le catalyseur est éliminé par filtration et les solvants évaporés sous vide.
Le résidu est dissous dans un mélange de méthanol et d'acétate d'éthyle, puis les solvants sont évaporés sous pression réduite. Cette procédure est répétée deux fois. Le résidu obtenu est alors dissous dans un minimum de tétrahydrofuranne et purifié par chromatographie sur plaque préparativ-e (plaque de silice 0, 2x20x20cm, éluant : mélange dichlorométhane/méthanol 9 : 1). La bande fluorescente sous irradiation UV à 366nm est recueillie.
Le produit final est dissous dans 10ml de méthanol. Sa pureté est vérifiée par chromatographie sur couche mince (plaque de silice, éluant comme ci-dessus). Une seule tache est apparente sous irradiation UV (254 et 366nm) et lors du comptage bêta. Par HPLC (phase inverse, colonne Zorbax ODS, éluant : mélange acétonitrile/solution d'acide acétique à 0, 02% dans l'eau 95 : 5), un seul pic est détecté par UV ou en utilisant un détecteur bêta.
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L'activité spécifique déterminée par spectrométrie de masse est environ 300GBq/mmole (8,0 Ci/mmole).
L'activité totale obtenue, mesurée par comptage au scintillateur liquide est 4.3mCi.
Caractéristiques de la fixation du composé de l'exemple 1 sur le récepteur soluble cRABP.
La fixation du composé revendiqué avec la cRABP a été caractérisée par des expériences de saturation. La fixation totale (non spécifique + spécifique) (courbe a), est obtenue par incubation de concentrations croissantes (jusqu'à un maximum de 50nM) du composé revendiqué avec une quantité constante (0,3ml) d'un homogénat de testicules de rat (organe riche en cRABP). La fixation non spécifique du composé tritié est déterminée en parallèle, par la mesure de la fixation avec des concentrations croissantes du ligand radioactif en présence d'un large excès (lui) d'acide rétinoique (courbe c). Un temps d'incubation de deux heures est nécessaire à l'établissement de conditions d'équilibre.
Une fois l'équilibre atteint, le complexe cRABP-ligand tritié est séparé du ligand non lié par filtration sur colonne de gel d'exclusion Sephadex G 25 (colonnes Bio-Rad econo, 0, 5x20cm) : le complexe est élué (pic d'élution à 2,5ml), tandis que le ligand non lié est retenu en totalité sur la colonne. Il en résulte une séparation totale entre produit lié et non lié. L'élution est faite directement dans des tubes à scintillation et la radioactivité est mesurée par comptage.
Les résultats ainsi obtenus sont analysés par régression non-linéaire utilisant comme modèle l'équation de Clark : (A. J. Clark, The mode of action of drugs on cells ; A. Arnold and Co., London, 1933).
Sur la figure 1, on a représenté en abscisses les concentrations initiales du ligand étudié, et en ordonnées, les concentrations à l'équilibre du complexe ligand-récepteur.
La différence entre les courbes a (fixation totale) et c (fixation non spécifique) donne la courbe de fixation spécifique (courbe b). L'analyse de cette courbe permet d'obtenir la constante de
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dissociation à l'équilibre, (Kd) qui est la concentration de produit nécessaire pour saturer 50% du récepteur soluble. Cette constante est une mesure de l'affinité du ligand pour son récepteur, le Kd étant inversement proportionnel à l'affinité, (plus le Kd est faible, plus l'affinité est grande). La courbe de fixation totale (a) est analysée de la même manière, après introduction d'une composante linéaire (la fixation non spécifique) au modèle de regression ; la courbe de fixation spécifique obtenue de cette manière (courbe b) est en parfait accord avec celle obtenue par différence.
Cette analyse donne une valeur de Kd de 2,7+0, 5nM. La fixation spécifique est saturable et réversible. La fixation non spécifique est linéaire et non saturable dans la gamme de concentrations utilisées, et représente moins de 10% de la fixation totale. Dans les mêmes conditions, la valeur du Kd de l'acide rétinoique est 2+0, 8nM, la fixation non spécifique représentant approximativement 25% de la fixation totale.
Comparaison avec l'acide rétinoique tritié.
Les figures 2 à 7 correspondent à des expériences de compétition et montrent la similitude des caractéristiques de la fixation de l'acide rétinoique, et du composé de l'exemple 1.
Ces expériences de compétition sont effectuées de la façon suivante : on mélange une quantité fixe de ligand radioactif (correspondant sensiblement à la demi-saturation de la quantité fixe de récepteur qui sera utilisée), avec des quantités croissantes de ligand froid (non radioactif). Puis on ajoute le récepteur ; et on, détermine la quantité de ligand radioactif fixée à l'équilibre (en % de la fixation initiale en l'absence de ligand froid, pour la quantité de récepteur considéré).
Dans les figures 2 à 7, on a porté en abscisses les concentrations croissantes du ligand froid étudié (en moles/litre), et en ordonnées la fixation du ligand radioactif (en % du maximum). Les ligands étudiés sont les suivants :
Figure 2 : ligand radioactif : composé de l'exemple 1 ligand froid : acide rétinoique
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Figure 3 : ligand radioactif : acide rétinoique tritié ligand froid : le même que pour la figure 2
Figure 4 : ligand radioactif : composé tritié de l'exemple 1 ligand froid : même composé mais non marqué (composé A)
Figure 5 : ligand radioactif : acide rétinoique tritié ligand froid : le même que pour la figure 4
Figure 6 : ligand radioactif : composé de l'exemple 1 ligand froid :
acide p-f (E)-2- (5, 6,7, 8-tétrahydro-
5, 5,8, 8-tétraméthyl-2-naphtyl)-propènyl] -benzolque (Hoffmann-La Roche), appelé ci-après composé B
Figure 7 : ligand radioactif : acide rétinoique tritié ligand froid ; le même que pour la figure 6.
A partir des courbes de compétition des figures 2 à 7, on détermine dans chaque cas la Il 50 (concentration de ligand froid réduisant l'attachement du ligand tritié de 50%). Cette valeur Il 50 permet de calculer dans chaque cas la constante de dissociation à l'équilibre (Kd) pour le ligand froid.
On a trouvé les valeurs suivantes : Figure 2: : Kd=4nM ! 19% Figure 3: : Kd=4nM44% Figure 4: : Kd=6nM+30% Figure 5: : Kd=6nM19% Figure 6: : Kd=16nMtS8% figure 7: : Kd=20nM+24%
Les figures 2 et 3 montrent les courbes de compétition de l'acide rétinoique froid avec le composé de l'exemple 1 (figure 2) et avec l'acide rétinoique tritié (figure 3). Les constantes de dissociation calculées dans l'un et l'autre cas sont les mêmes, ce qui suggère que les deux ligands radioactifs ont des spécificités de fixation similaires.
De la même manière, on voit (figures 4 et 5) que les valeurs de Kd obtenues pour le composé A, en utilisant l'un ou l'autre ligand marqué, sont les mêmes.
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Cela est également vérifié dans le cas du composé B (figures 6 et 7).
En conclusion, dans tous les cas étudiés ci-dessus, les Kd calculés sont indépendants du ligand tritié utilisé, ce qui montre que ces ligands se lient au même récepteur avec des spécificités semblables, et que l'on peut remplacer l'un par l'autre pour la détermination de la fixation des rétinoides sur la cRABP.