NL8702007A - Nieuwe met tritium gemerkte verbinding, haar bereiding en haar toepassing in het bijzonder bij de bepaling van de affiniteit van de retinoiden voor hun celreceptor. - Google Patents

Description

ï N034682 1 <*

Nieuwe met tritium gemerkte verbinding, haar bereiding en haar toepassing in het bijzonder bij de bepaling van de affiniteit - van de retinolden voor hun cel receptor.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een nieuwe met tritium gemerkte verbinding verwant met de retinolden, haar bereiding en haar toepassing in het bijzonder bij de bepaling van de affiniteit van de retinolden voor hun cel receptor en/of bij de bepaling van het 5 cel gehal te aan de overeenkomstige receptor.

Het is bekend, dat de retinolden een bekende klasse verbindingen vormen, die in het bijzonder inwerken op de proliferatie en de differentiatie van talrijke celtypen; zie bijvoorbeeld B.A. Pawson et al,

Journal of Medicinal Chemistry, 25, nr. 11 (1982) 1269-1277.

10 De retinolden worden in het bijzonder gebruikt bij de behandeling van verschillende dermatologische ziekten, waarbij een deregulering van de controlemechanismen van de proliferatie en van de differentiatie van de epidermiscellen veroorzaakt wordt; zie bijvoorbeeld "Update: Dermatology in General Medicine", geredigeerd door Thomas B, 15 Fitzpatrick et al, (McGraw-Hill Book Company), gepubliceerd in 1983, in het bijzonder het hoofstuk van D.B. Windhorst et al, The Retinoids, bladzijden 226-237.

De wijze van werking van de retinolden is nog slecht bekend. Er is evenwel aangetoond, dat er in de cellen een receptor bestaat, die 20 cRABP (cellular Retinoic Acid-Binding Protein) wordt genoemd, die specifiek is voor de retinolden, die een zure groep bevatten.

De bepaling van de affiniteitsconstante (Kd) voor het cRABP, van een retinolde, dat een zure groep bevat, vormt een bijzonder snel middel voor de evaluatie van de potentiële biologische activiteit van 25 het retinolde.

Verschillende experimentele methoden maken het mogelijk de affiniteitsconstante van een ligand voor zijn receptor vast te stellen. Men kan in het bijzonder door middel van een direkte methode werken, wanneer het beoogde ligand-radioactief gemerkt is ofwel door concurrentie 30 met een radioactief ligand, wanneer het beoogde ligand niet radioactief gemerkt is.

Een goed radioactief ligand moet enerzijds een verhoogde affiniteit voor zijn receptor hebben en anderzijds een geringe fixatie op elk ander molecuul hebben. Bovendien moet het voldoende stabiel zijn on een 35 praktisch gebruik mogelijk te maken.

8702007 * 2 *

In het geval van de zure retinoïden is het algemeen gebruikte radioactieve ligand meestal tritiumhoudend retinoëzuur, hetzij op plaats 2, (J. Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals XVIII, blz. 1099, (1980) hetzij op plaats 4 (Duitse octrooiaanvrage 5 3.142.975).

Het retinoëzuur heeft inderdaad een uitstekende affiniteit voor het cRABP, met een zwakke niet-specifieke fixatie, maar het molecuul heeft het nadeel snel door radiolyse, oxydatie en fotolyse te worden afgebroken.

10 Gevonden werd, dat het tritiumhoudende 2-(5,6,7,8-tetrahydro- 5,5,8,8-tetramethyl-2-naftyl)-6-benzo[b]thiofeencarbonzuur een nieuw radioactief ligand vormt, dat een uitstekende affiniteit voor het cRABP heeft, met een zwakke niet-specifieke fixatie. Bovendien is dit nieuwe ligand zeer stabiel en kan met een grote specifieke activiteit verkre-15 gen worden, die het bijzonder geschikt maakt voor het meten van de affiniteit van de retinolden voor het cRABP.

De onderhavige uitvinding heeft dus betrekking op het met tritium gemerkte 2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naftyl)-6-benzo-[b]thiofeencarbonzuur en in het bijzonder waarvan de methylidinegroep 20 op de plaats 3 van de tetrahydronaftaleengroep met tritium gemerkt is.

De uitvinding heeft in het bijzonder betrekking op een nieuw radioactief ligand, zoals hiervoor gedefinieerd, met een specifieke activiteit groter dan 1 Ci/mmol en bij voorkeur tenminste gelijk aan 2 Ci/mmol, hetgeen ongeveer 75 GBq/mmol is.

25 De met tritium gemerkte verbinding kan ook in de vorm zijn van mengsels met dezelfde niet gemerkte verbinding.

De uitvinding heeft eveneens betrekking op een werkwijze ter bereiding van het nieuwe radioactieve ligand zoals hiervoor gedefinieerd. Deze werkwijze wordt in principe gekenmerkt door het feit, dat men een 30 2-(3-halogeen-5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naftyl)-6-benzo[b]thiofeencarbonzuur bereidt en dit aan de inwerking van een tritiumhoudend reduktiemiddel onderwerpt.

De gemerkte verbinding kan in het algemeen verkregen worden volgens werkwijzen onder toepassing van op zichzelf bekende methoden voor 35 het merken van chemische verbindingen, zoals een werkwijze analoog aan de in The Journal of labelled compounds and radiopharmaceuticals, deel XXII, blz. 843-850 (1985) beschreven werkwijze.

Het reduktiemiddel is bijvoorbeeld tritiumhoudende waterstof toegepast bij aanwezigheid van een geschikte katalysator, in het bijzonder 40 een katalysator op basis van palladium.

870200? 3 4

De reduktie van het op de plaats 3 halogeen bevattende derivaat wordt bij voorkeur uitgevoerd bij omgevingstemperatuur en -druk, bijvoorbeeld bij 15-30°C onder een druk van 1 bar (ongeveer 10^ Pa).

Het als halogeenderivaat gebruikte uitgangsprodukt is bij voorkeur 5 het broomderivaat.

2-(3-halogeen-5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naftyl)- 6-benzo[b]thiofeencarbonzuur kan zelf bereid worden uit 2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naftyl)-6-benzoCb]thiofeencarbonzuur door de inwerking van een halogeneringsmiddel (in het bijzonder een 10 bromeringsmiddel). Bijvoorbeeld kan het broomderivaat verkregen worden door de inwerking van een bromeringsmiddel zoals N-broomsuccinimide in dimethylfonnamide bij een reaktietemperatuur, die van 0 tot 50eC en bij voorkeur van 0 tot 20°C kan gaan.

2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naftyl)-6-benzo[b]-15 thiofeencarbonzuur is een bekend produkt, (hierna verbinding A genoemd) en kan verkregen worden volgens de bijvoorbeeld op 17 september 1985 ingediende Franse octrooiaanvrage 2.570.377 beschreven werkwijze.

De uitvinding heeft eveneens betrekking op het bij de hierboven beschreven werkwijze verkregen tussenprodukt 2-(3-halogeen-5,6,7,8-20 tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naftyl)-6-benzo[b]thiofeencarbonzuur en in het bijzonder het broomderivaat.

Het radioactieve ligand van de uitvinding kan eveneens uit 2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naftyl)-6-benzo[b])-thiofeencarbonzuur verkregen worden door isotoopuitwisseling met tri-25 tiumhoudend water bij aanwezigheid van platina en azijnzuur bij een temperatuur, die bij voorkeur van 20 tot 150°C kan gaan. In dit geval wordt de isotoopuitwisseling bij voorkeur uitgevoerd met de aromatische protonen van het ligand.

De uitvinding heeft eveneens betrekking op de toepassing van het 30 tritiumhoudend 2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naftyl-6-benzo[b]thiofeencarbonzuur, in het bijzonder op de plaats 3 van de naf-taleengroep tritiumhoudend, als radioactieve merker in het bijzonder bij de bepaling van de affiniteit, van de aanwezigheid of van het gehalte retinofden met carbonzuurgroep en/of de kwantificering van de 35 cRABP receptor van de retinofden.

Bijvoorbeeld kan de radioactieve merker van de uitvinding gebruikt worden tijdens de zuivering van de cRABP receptor door de gebruikelijke methoden van ionenuitwisselingschromatografie of van uitsluiting onder lage of hoge druk: het is voldoende aan het als uitgangsprodukt ge-40 bruikte weefselextrakt een bepaalde hoeveelheid van het radioactieve 8702007 4 t ligand toe te voegen. De receptor cRABP blijkt dus zelf gemarkeerd en men kan gemakkelijk zijn aanwezigheid of zijn afwezigheid in een gegeven fractie opsporen.

Kennis van de fixatiekrommen op de receptor maakt eveneens het ge-5 bruik van de merker van de uitvinding bij de kwantificering van de receptor mogelijk.

De radioactieve marker van de uitvinding kan eveneens gebruikt worden bij het karakteriseren van antilichamen tegen de verbinding A, waarbij deze antilichamen (verkregen volgens de gebruikelijke methoden 10 van anti-hapteenantilichamen) zelf bruikbaar zijn bij de bepaling van het al of niet op zijn receptor gefixeerde produkt A.

De radioactieve merker van de uitvinding kan ook gebruikt worden bij de studie van het intracellulaire werkingsmechanisme en van het algemene metabolisme van de verbinding A.

15 De volgende voorbeelden lichten de uitvinding toe zonder deze te beperken.

VOORBEELD I

2-(3-3H-5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naftyl)-6-benzo-20 [b]thiofeencarbonzuur.

a) Een mengsel van het niet tritiumhoudende zuur (500 mg; 1,37 mmol) en N-broomsuccinimide (302 mg; 1,70 mmol) in 15 ml DMF wordt bij omgevingstemperatuur gedurende 24 uur onder een stikstofatmosfeer geroerd. Het verkregen mengsel wordt aan 30 ml ln zoutzuur toegevoegd 25 en het produkt wordt met diethyl ether (130 ml) geëxtraheerd. De etherfase wordt afgescheiden, met water gewassen, boven watervrij mag-nesiumsulfaat gedroogd en de oplosmiddelen worden onder verminderde druk verdampt. Met verkrijgt aldus een lichtbruine vaste stof, die men tweemaal herkristalliseert uit een 50:50 mengsel van isoöctaan/tetra-30 hydrofuran voor het verkrijgen van 380 mg (63¾) 2-(3-broom-5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethy1-2-naftyl)-6-benzo[b]thiofeencarbonzuur, dat bij 272-275°C smelt.

Elementairanalyse: berekend: C: 62,30 H: 5,23 Br: 18,02 0: 7,22 S: 7,23 35 gevonden: 62,49 5,06 17,94 7,44 7,77

De plaats van het broomatoom wordt door NMR spectrumanalyse van het proton van de bovengenoemde verbinding bevestigd en vergeleken met het NMR spectrum van het niet-gebromeerde produkt.

b) De verkregen gebromeerde verbinding (25 mg; 0,05 mmol) wordt in 40 2 ml droog dioxaan opgelost. 10 mg palladium op kool (10¾) en 20 micro- 8702007 » 5 Λ.

liter (0,14 mmol} triëthylamine worden toegevoegd. Het verkregen mengsel wordt bij omgevingstemperatuur onder een tritiumatmosfeer (druk ongeveer 1 bar) gedurende 20 uur geroerd. De katalysator wordt door filtratie verwijderd en de oplosmiddelen worden onder verminderde druk 5 verdampt.

Het residu wordt in een mengsel van methanol en ethyl acetaat opgelost, daarna worden de oplosmiddelen onder verminderde druk verdampt.

Deze methode wordt tweemaal herhaald. Het verkregen residu wordt vervolgens in een miniman hoeveelheid tetrahydrofuran opgelost en door 10 preparatieve plaatchromatografie gezuiverd (siliciumdioxideplaat 0,2 x 20 x 20 cm, elueermiddel: mengsel van diehloormethaan/methanol 9:1). De fluorescentieband onder UV-bestraling bij 366 nm wordt verzameld.

Het eindprodukt wordt in 10 ml methanol opgelost. De zuiverheid 15 ervan wordt bevestigd door dunne-laag-chromatografie (siliciumdioxideplaat, elueermiddel zoals hierboven). Een enkele vlek is zichtbaar onder UV-straling (254 en 366 nm) en tijdens de B-telling. Door HPLC (omgekeerde fase, kolom Zorbax ODS, elueermiddel: mengsel van aceto-nitril/0,02-procents oplossing van azijnzuur in water 95:5) wordt een 20 enkele piek door UV of onder toepassing van een B-detector opgespoord.

De specifieke activiteit bepaald door massaspectrometrie is ongeveer 300 GBq/mmol (8,0 Ci/mmol).

De totaal verkregen activiteit, gemeten door telling met de vloeistof scintillator is 4,3 mCi.

25

Kenmerken van de fixatie van de verbinding van voorbeeld I op de oplosbare cRABP-drager.

De fixatie van de verbinding waarvoor rechten worden gevraagd met het cRABP wordt gekenmerkt door verzadigingsexperimenten. De totale 30 fixatie (niet-specifiek + specifiek) (kromme a), wordt verkregen door incubatie van toenemende concentraties (tot een maximum van 50 nmol) van de verbinding, waarvoor rechten worden gevraagd, met een constante hoeveelheid (0,3 ml) van een gehomogeniseerd produkt van rattentestikels (orgaan rijk aan cRABP). De niet-specifieke fixatie van de 35 tritiumhoudende verbinding wordt parallel bepaald door het meten van de fixatie met toenemende concentraties van het radioactieve ligand bij aanwezigheid van een grote overmaat (1 /urn) retinoëzuur (kromme c).

Een incubatietijds van 2 uur is noodzakelijk voor het instellen van de evenwichtstoestanden.

40 Wanneer eenmaal het evenwicht is bereikt, wordt het met tritium 8702007 t 6 behandelde complex van cRABP-ligand van het niet door filtratie over de uitsluitingsgelkolom Sephadex G 25 (Bio-Rad kolommen, 0,5 x 20 cm) gebonden ligand gescheiden: het complex wordt geëlueerd (elutiepiek bij 2,5 ml), terwijl het niet gebonden ligand totaal op de kolom wordt 5 vastgehouden. Er resulteert een totale scheiding tussen gebonden en niet gebonden produkt. De elutie wordt direkt in de scintillatiebuizen gedaan en de radioactiviteit wordt door telling gemeten.

De aldus verkregen resultaten worden door niet lineaire regressie onder toepassing van het vergelijkingsmodel van Clark geanalyseerd: 10 (A.J. Clark, The mode of action of drugs on cells; A. Arnold and Co., London, 1933).

In figuur 1 heeft men op de abscis de oorspronkelijke concentraties van het bestuurdeerde ligand en op de ordinaten de evenwichtscon-centraties van het complex ligand-receptor voorgesteld.

15 Het verschil tussen de krommen a (totale fixatie) en c (niet- specifieke fixatie) geeft de specifieke fixatiekromme (kromme b). De analyse van deze kromme maakt het mogelijk de evenwichtsdissociatie-constante (Kd) te verkrijgen, die de produktconcentratie noodzakelijk om 50¾ van de oplosbare receptor te verzadigen is. Deze constante is 20 een maat van de affiniteit van het ligand voor zijn receptor, waarbij de Kd omgekeerd evenredig is met de affiniteit (hoe geringer de Kd hoe groter de affiniteit). De totale fixatiekromme (a) wordt op dezelfde wijze geanalyseerd, na toevoeging van een lineaire component (de niet-specifieke fixatie) aan het regressiemodel; de op deze wijze verkregen 25 specifieke fixatiekromme (kromme b) is volmaakt in overeenstemming met die verkregen door verschil.

Deze analyse geeft een waarde van Kd van 2,7 +_ 0,5 nmol. De specifieke fixatie is verzadigbaar en omkeerbaar. De niet-specifieke fixatie is lineair en niet verzadigbaar in het traject toegepaste concentraties 30 en stelt minder dan 10¾ van de totale fixatie voor. Onder dezelfde omstandigheden is de waarde van de Kd van het retinoëzuur 2 + 0,8 nmol, waarbij de niet specifieke fixatie ongeveer 25¾ van de totale fixatie voorstelt.

35 Vergelijking met met tritium behandeld retinoëzuur

De figuren 2 tot 7 komen overeen met concurrentie-experimenten en laten de gelijksoortigheid van de eigenschappen van de fixatie van het retinoëzuur en van de verbinding van voorbeeld I zien.

Deze concurrentie-experimenten worden op de volgende wijze uitge-40 voerd: Men mengt een vaste hoeveelheid radio-actief ligand (zo ongeveer 8702007 7 overeenkomende met de halfverzadigdheid van de vaste hoeveelheid receptor, die zal worden gebruikt), met toenemende hoeveelheden koud (niet radioactief) ligand. Daarna voegt men de receptor toe en bepaalt men de hoeveelheid bij het evenwicht gefixeerd radioactief ligand (in % van de 5 initiële fixatie bij afwezigheid van het koude ligand betrokken op de hoeveelheid beoogde receptor).

In de figuren 2 tot 7 heeft men op de abscis de toenemende concentraties van het onderzochte koude ligand (in mol/liter) en op de ordinaat de fixatie van het radioactieve ligand (in % van het maximum) af-10 gezet. De onderzochte liganden zijn de volgende: figuur 2: radioactief ligand: verbinding van voorbeeld I koud ligand: retinoëzuur figuur 3: radioactief ligand: tritiumhoudend retinoëzuur 15 koud ligand: hetzelfde als voor figuur 2 figuur 4: radioactief ligand: tritiumhoudende verbinding van

voorbeeld I

koud ligand: dezelfde verbinding maar niet gemerkt (verbinding A) 20 figuur 5: radioactief ligand: tritiumhoudend retinoëzuur koud ligand: hetzelfde als voor figuur 4

figuur 6: radioactief ligand: verbinding van voorbeeld I

koud ligand: p-[(E)-2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8- tetramethyl-2-naftyl)-propenyl]-25 benzoëzuur (Hoffmann-La Roche), hierna verbinding B genoemd figuur 7: radioactief ligand: tritiumhoudend retinoëzuur koud ligand: hetzelfde als voor figuur 6.

30 Uitgaande van de concurrentiekrommen van de figuren 2 tot 7 bepaalt men in elk geval de IC50 (concentratie van het koude ligand, die de aanhechting van het tritiumhoudende ligand met 50% vermindert). Deze waarde ICgQ maakt het mogelijk in elk geval de evenwichts-dissociatieconstante (Kd) voor het koude ligand te berekenen.

35 Men heeft de volgende waarden gevonden: figuur 2: Kd = 4nM + 19% figuur 3: Kd = 4nM + 44% figuur 4: Kd = 6nM + 30% figuur 5: Kd = 6nM + 19% 40 figuur 6: Kd = 16nM + 58% 8702007 8 figuur 7: Kd = 20nM + 24¾.

De figuren 2 en 3 tonen de concurrent!ekrommen van het koude retinoëzuur met de verbinding van voorbeeld 1 (figuur 2) en met het tritiumhoudend retinoëzuur (figuur 3). De in het ene en het andere 5 geval berekende dissociatieconstanten zijn dezelfde, hetgeen suggereert, dat de twee radioactieve liganden soortgelijke fixatiespecifici-teiten hebben.

Op dezelfde wijze ziet men (figuren 4 en 5), dat de verkregen Kd-waarden voor de verbinding A, onder toepassing van het ene of het 10 andere gemerkte ligand, dezelfde zijn.

Dit wordt eveneens bevestigd in het geval van verbinding B (figuren 6 en 7).

Concluderend zijn in alle hierboven onderzochte gevallen de berekende Kd's onafhankelijk van het gebruikte tritiumhoudende ligand, het-15 geen laat zien, dat deze liganden zich aan dezelfde receptor binden met identieke specificiteiten en dat men de ene door de andere voor de bepaling van de fixatie van de retinolden aan het cRABP kan vervangen.

8702007

Claims (10)

1. Met tritium gemerkt 2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl -2-naftyl}-6-benzo[b]thi ofeencarbonzu ur.

2. 2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naftyl)-6-benzo-5 [b]thiofeencarbonzuur volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat op de plaats 3 van de tetrahydronaftaleengroep gemerkt is.

3. Tritiumhoudend 2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naftyl)-6-benzo[b]thio-feencarbonzuur als gedefinieerd in een van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het een specifieke activi- 10 teit van tenminste 75 GBq/mmol bezit.

4. Werkwijze ter bereiding van een tritiumhoudend produkt als gedefinieerd in een van de voorafgaande conclusies, met het kenmerk, dat men - een 2-(3-halogeen-5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2- 15 naftyl)-6-benzo[b]thiofeencarbonzuur bereidt en het aan de inwerking van een tritiumhoudend reduktiemiddel onderwerpt, of - het 2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naftyl)-6-benzo(b]thiofeencarbonzuur aan een isotoopuitwisselingsreactie met tritiumhoudend water bij aanwezigheid van platina en azijnzuur bij een 20 temperatuur van 20 tot 150eC onderwerpt.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat men als reduktiemiddel tritiumhoudende waterstof toepast.

6. Werkwijze volgens een van de conclusies 4 en 5, met het kenmerk, dat het halogeen bevattende uitgangsprodukt zelf verkregen is 25 door inwerking van een halogeneringsmiddel op 2-(5,6,7,8-tetrahydro- 5,5,8,8-tetramethyl-2-naftyl)-6-benzo[b]thiofeencarbonzuur.

7. Werkwijze volgens een van de conclusies 4 tot 6, met het kenmerk, dat men als halogeneringsmiddel een bromeringsmiddel toepast.

8. 2-(3-halogeen-5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2- 30 naftyl)-6-benzo[b]thiofeencarbonzuur als tussenprodukt verkregen bij de werkwijze volgens een van de conclusies 4 tot 7.

9. Tussenprodukt volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat het halogeenderivaat het broomderivaat is.

10. Toepassing van het tritiumhoudend 2-(5,6,7,8-tetrahydro- 35 5,5,8,8-tetramethyl-2-naftyl)-6-benzo[b]thiofeencarbonzuur als radioactieve merker bij de bepaling van de affiniteit, van de aanwezigheid of van het gehalte retinoTden, die een carboxyl groep bevatten en/of in het kenmerken van een antilichaam, dat tegen dit zuur is gericht en/of in het kwantificeren van de cRABP-receptor van de retionolden. 40 ===== 8702007