SE463714B - Ny tritium-maerkt foerening, dess framstaellning och dess anvaendning, speciellt foer bestaemning av retinoiders affinitet till deras cellreceptor - Google Patents

Description

463 714 2 10 15 20 25 30 Det finns flera experimentella metoder som möjliggör bestäm- ning av affinitetskonstanten för en ligand gentemot dess re- ceptor. Man kan speciellt arbeta med en direkt metod, om den betraktade liganden är radioaktivt märkt eller också genom tävlan med en radioaktiv ligand, om den betraktade liganden ej är radioaktivt märkt.

En bra radioaktiv ligand bör å ena sidan uppvisa hög affinitet gentemot sin receptor och ä andra sidan uppvisa en ringa bind- ning till varje annan molekyl. Dessutom bör den vara tillräck- ligt stabil för att möjliggöra en bekväm användning.

Beträffande sura retinoider är den vanligen använda radioakti- va liganden som oftast dels i läget 2 (J. Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals XVIII, sid. 1099, (1980) och dels i läget 4 (tyska patentet nr 3 142 975) tritierad retinsyra (= vitamin A-syra = Tretinoin) Retinsyran uppvisar visserligen en utmärkt affinitet gentemot cRABP, med en ringa ej specifik bindning, nen molekylen uppvi- sar olägenheten att snabbt nedbrytas genom radiolys, oxidation och fotolys.

Man har upptäckt att 2-(5.6.7.8-tetrahydro-5.5.8.8-tetramety1- -2-naftyl)-2-benso[b]tiofen-karboxylsyra. son har tritiumbe- handlats, utgör en ny radioaktiv ligand. som uppvisar utmärkt affinitet gentemot cRABP, med en ringa specifik bindning. Den- na nya ligand är dessutom mycket stabil och kan erhållas med hög specifik aktivitet, vilket gör den speciellt användbar för mätning av retinoiders affinitet gentemot cRABP.

Föreliggande uppfinning avser således 2-(5,6.7.8-tetrahydro- -5,5,8,8-tetrametyl-2-naftyl)-6-benso[b]-tiofen-karboxylsyra, märkt med tritium och varvid speciellt metylidyngruppen i lä- get 3 hos tetrahydronaftalengruppen är tritiunmärkt.

Uppfinningen avser speciellt en ny radioaktiv ligand enligt ovanstående definition, vilken har en specifik aktivitet över 10 15 20 25 30 35 s 463 714 l Ci/mmol och företrädesvis minst 2 Ci/mmol, samt ca 75 GBq/mmol.

Uppfinningen omfattar även ett sätt att framställa den nya ra- dioaktiva liganden enligt ovanstående definition. Detta för- farande kännetecknas i huvudsak av att man framställer en 2- -(3-halogen-5,6.7.8-tetrahydro-5.5.8,8-tetrametyl-2-naftyl)-6- -benso[b]tiofen-karboxylsyra och denna syra underkastas inver- kan av ett tritiumbehandlat reduktionsmedel.

Reduktionsmedlet är t.ex. tritierat väte, som används i närva- ro av en lämplig katalysator. speciellt en katalysator på ba- sis av palladium.

Reduktionen av 3-halogen-derivatet utföres företrädesvis vid omgivande tryck och temperatur, exempelvis vid 15 - 30°C under ett tryck av l bar (ca 105 Pa).

Det som utgångsprodukt använda halogenderivatet är företrädes- vis bromderivatet. 2-(3-halogen-5,6.7.8-tetrahydro-5,5,8,8-tetrametyl-2-naftyl)- -6-benso[b]tiofen-karboxylsyran kan framställas utgående från 2-(5,6,7,8-tetrahydro-5.5,8,8-tetrametyl-2-naftyl)-6-benso[b]- tiofenkarboxylsyra genom inverkan av ett halogeneringsmedel (speciellt bromeringsmedel). Bromderivatet kan exempelvis er- hållas genom inverkan av ett bromeringsmedel såsom N-brom- -succinimid i dimetylformamid vid en reaktionstemperatur av mellan 0 och 50°C och företrädesvis mellan 0 och 20°C. 2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetrametyl-2-naftyl)-6-benso- [b}tiofenkarboxy1syran är en känd förening (benämnes i fort- sättningen förening A) och kan erhållas enligt det förfarande som beskrives exempelvis i franska patentansökningen nr 85.l3747 (2.570.377), inlämnad 17 september 1985.

Uppfinningen omfattar även, såsom mellanprodukt, vilken erhål- les enligt det ovan beskrivna förfarandet, 2-(3-halogen- 465 714 4 10 15 20 25 30 35 -5.6.7,8-tetrahydro-5,5.8.8-tetrametyl-2-naftyl)-6-benso[b]- tiofen-karboxylsyra och speciellt bromderivatet.

Den radioaktiva liganden enligt uppfinningen kan även erhållas utgående från 2-(5,6.7.8-tetrahydro-5.5.8.8-tetrametyl-2- -naftyl)-6-benso[b]tiofen-karboxylsyra genom isotoputbyte med tritierat vatten i närvaro av platina och ättiksyra vid en temperatur av företrädesvis mellan 20 och l50°C. I detta fall utföres isotoputbytet företrädesvis med ligandens aromatiska protoner.

Den tritium-märkta föreningen kan även föreligga i form av blandningar med motsvarande omärkta förening.

Den märkta föreningen kan generellt erhållas enligt förfaran- den. vid vilka man använder i och för sig kända metoder för märkning av kemiska föreningar med tritium och speciellt för märkning av föreningarna vid de aromatiska H-haltiga kolato- merna, t.ex. ett förfarande analogt med det som beskrives i 'Journal of labelled compounds and radiopharnaceutica1s', vol.

XXII. pp. 843-850 (1985).

Uppfinningen avser även användning av 2-(5,6,7.8-tetrahydro- -5.5.8,8-tetrametyl-2-naftyl)-6-benso[b]tiofen-karboxylsyra. som tritiumbehandlats, speciellt tritierad i läget 3 hos tetrahydronaftalengruppen, såsom radioaktiv narkör, speciellt vid bestämning av affiniteten, närvaron eller halten av karb- oxylgrupper hos retinoider och/eller vid kvantifiering av cRABP-receptor för nämnda retinoider.

Den radioaktiva markören enligt uppfinningen kan exempelvis användas under reningen av cRABP-receptorn medelst klassiska kromatograferingsmetoder för jonbyte eller jonuteslutning un- der lågt eller högt tryck: det räcker att till det som ut- gängsprodukt använda vävnadsextraktet sätta en förutbestämd mängd av den radioaktiva liganden. cRABP-receptorn blir säle- des själv märkt och man kan lätt påvisa dess närvaro eller dess frånvaro i en given fraktion. 10 15 20 25 30 35 s 463 714 Med utgångspunkt från kurvor över bindningen till receptorn kan man även använda markören enligt uppfinningen för kvanti- fiering av receptorn.

Den radioaktiva markören enligt uppfinningen kan även användas för karakterisering av antikroppar mot föreningen A. vilka an- tikroppar (som erhållas enligt klassiska antikropp-anti-hap- ten-metoder) själva kan användas för bestämning av produkten A, bunden eller ej till dess receptor.

Den radioaktiva markören enligt uppfinningen kan även användas vid studium av mekanismen för den intracellulära processen och den allmänna metabolismen för föreningen A.

Nedan följande exempel belyser uppfinningen utan att därvid begränsa densamma.

EXEMPEL l 2-(3-3H-5,6,7,8-tetrahydro-5.5.8.8-tetrametyl-2-naftyl)-6- -benso[b]-tiofenkarboxylsyra. a) En blandning av nämnda ej tritierade syra (500mg;l.37mmol) och N-bromsuccinimid (302mg;l,70mmol) i l5ml DNF omröres vid omgivande temperatur under 24 timmar, under kväveatmosfär. Den erhållna blandningen sättes till 30 ml lN klorvätesyra och produkten extraheras med 130 ml etyleter. Eterfasen avskiljes, tvättas med vatten och torkas över vattenfritt magnesiumsulfat och lösningsmedlet indunstas vid minskat tryck. Han erhåller således en ljusbrun fast substans som kristalliseras två gånger från en blandning av isooktan och tetrahydrofuran (50:50), varvid man erhåller 380 mg (63 2) 2-(3-brom-5,6.7,8-tetra- hydro-5,5,8,8-tetrametyl-2-naftyl)-6-benso[b]-tiofenkarboxyl- syra med smältpunkt 272 - 27S°C. ' Elementaranalysz Beräknat: C 62.30 H; 5.23 Br: 18,02 0: 7,22 S: 7,23 Erhållett 62,49 5,06 17,94 7,44 7,77. 10 15 20 25 30 465 714 6 Bromatomens läge bekräftas medelst RHN-spektralanalys av pro- tonen hos ovanstående förening och jämförelse med RM-spektret för den ej bromerade produkten. b) Den erhållna bromerade föreningen (25 mg;0,05 mmol) löses i 2 ml torr dioxan. Han tillsätter 10 mg palladium på kol (10 2) och 20 mikroliter (0,l4 mmol) trietylanin. Den erhållna blandningen omröres vid omgivande temperatur under tritium- atmosfär (tryck ca 1 bar) under 20 timmar. Katalysatorn av- lägsnas genom filtrering och lösningsmedlen indunstas i vakuum. återstoden löses i en blandning av metanol och etylacetat och därefter avdrives lösningsmedlen vid minskat tryck. Denna pro- cedur upprepas tvâ gånger. Den erhållna återstoden löses sedan i minsta möjliga mängd tetrahydrofuran och renas medelst pre- parativ skivkromatografering (kiseldioxidskiva 0,2 x x20 x 20 cm, elueringsmedel: blandning av diklormetanl- metanol 9 : l). Fluorescensbandet under UV-bestrâlning vid 366 nm uppsamlas.

Slutprodukten löses i 10 ml metanol. Dess renhet verifieras genom tunnskiktskromatografi (kiselplatta, elueringsmedel sâ- som ovan). En enda fläck uppträder vid UV-bestrålning (254 och 366 nm) och under beta-räkningen. Hedelst HPLC (invers fas, Zorbax ODS-kolonn, elueringsmedel: blandning av acetonitril och ättiksyralösning 0,02 2 i vatten 95:5) detekteras en enda topp medelst UV eller med användning av en beta-detektor.

Den specifika aktiviteten, bestämd medelst masspektrometri. är ca 300GBq/mmol (8,0 Ci/mmol).

Den totala erhållna aktiviteten, uppmätt genom räkning i vätskescintillator, är 4q,3mCi.

Utmärkande kännetecken för bindningen av föreningen enligt exempel l till den lösliga receptorn cRABP Bindningen av föreningen enligt uppfinningen med CRABP har karakteriserats medelst mättnadsexperiment. Den totala bind- 10 15 20 25 30 35 v 4763- 714 ningen (ej specifik + specifik) (kurva a), erhålles genom in- kubering av ökande koncentrationer (upp till maximum 50nH) av föreningen enligt uppfinningen med en konstant mängd (0,3 ml) av ett homogenat från testiklar hos råtta (organ rikt på CRABP). ningen bestämmes parallellt genom mätning av bindningen med Den ej specifika bindningen av den tritierade före- ökande koncentrationer av den radioaktiva liganden i närvaro av ett stort överskott (luM) retinsyra (kurva c). En inkuba- tionstid av 2 timmar erfordras för upprättande av jämviktsbe- tingelser.

Sedan jämvikt en gång nåtts avskiljes det tritiumbehandlade komplexet cRABP-ligand från den ej bundna liganden genom filt- rering över en geluteslutningskolonn Sephadex G 25 (Bio-Rad econo-kolonner, 0,5 x 20 cm). Komplexet elueras (elueringstopp vid 2.5 ml) under det att den ej bundna liganden kvarhålles i sin helhet i kolonnen. Han uppnår en total separering mellan bunden produkt och ej bunden produkt. Elueringen genomföres direkt i scintillationsrör och radioaktiviteten mätes genom räkning.

De således erhållna resultaten analyseras medelst icke-linjär regression, varvid som modell används ekvationen enligt Clark: (A.J. Clark; The mode of action of drugs on cells; A. Arnold och Co., London. 1933).

I fig. 1 har längsmed abskissan avsatts ursprungliga koncent- rationerna av den studerade liganden och längsmed ordinatan har avsatts jämviktskoncentrationerna för komplexet ligand-re- ceptor.

Skillnaden mellan kurvorna a (total bindning) och c (ej speci- fik bindning) ger den specifika bindningskurvan (kurva b).

Analys av denna kurva gör det möjligt att erhålla dissocia- tionskonstanten vid jämvikt (Kd) som är den nödvändiga kon- centrationen av produkten för 50 % mättnad av den lösliga re- ceptorn. Denna konstant är ett mått på ligandens affinitet till dess receptor, varvid Kd är omvänt proportionell mot af- 463 714 8 10 15 20 25 30 finiteten (ju lägre Kd desto högre affinitet). Den totala bindningskurvan (a) analyseras på samma sätt efter införande av en linjär komposant (ej specifik bindning) enligt regres- sionsmodellen. Den pâ detta sätt erhållna specifika bindnings- kurvan (kurva b) är i fullständig överensstämmelse med den som erhålles genom differentiering .

Denna analys ger ett värde på Kd av 2,7 ¿ 0.5 nH. Den specifi- ka bindningen kan mätas och är reversibel. Den ej specifika bindningen är linjär och ej mätbar inom ramen för de använda koncentrationerna och representerar mindre än 10 2 av totala bindningen. Under samma betingelser är storleken av Kd för re- tinsyran 2 ¿ 0.8 nM, varvid den ej specifika bindningen repre- senterar ungefär 25 % av den totala bindningen.

Jämförelse med tritiumbehandlad retinsyra Fig. 2 - 7 hänför sig till jämförelseexperiment och visar lik- heten i bindningskarakteristika för retinsyran och komplexet enligt exempel l.

Dessa jämförelseexperiment utfördes pâ följande sätt: man blandar en bestämd mängd av den radioaktiva liganden (i huvud- sak motsvarande halva mättnadsmängden bunden till den använda receptorn) med ökande mängder 'neutral' ligand (ej radioak- tiv). Man tillsätter därefter receptorn och bestämmer mängden bunden radioaktiv ligand vid jämvikt (i procent av ursprunglig bindning i frånvaro av neutral ligand, för ifrågavarande mängd receptor).

I fig. 2 - 7 har längsmed abskissan avsatts ökande koncentra- tioner av den undersökta 'neutrala' liganden (i mol/liter) och längsmed ordinatan har avsatts bindning av radioaktiv ligand (i % av maximum). De undersökta liganderna är följande: ¶ 10 15 20 25 30 35 9 463 714 Fig. 2 radioaktiv ligand: förening enligt exempel l ”neutral” ligand: retinsyra fig. 3: radioaktiv ligand: tritiumbehandlad retinsyra 'neutral' ligand: samma som enligt fig. 2 fig. 4 radioaktiv ligand: tritiumbehandlad förening enligt exempel l 'neutral' ligand: samma förening men ej märkt (före- ning A) fig. 5: radioaktiv ligand: tritiumbehandlad retinsyra "neutral" ligand: samma som för fig. 4. fig. 6: radioaktiv ligand: förening enligt exempel 1 'neutral' ligand: på[(E)-2-(5,6,7,8-tetrahydro- 5.5.8.8-tetrametyl-2-naftyl)-propenyl]-bensoesyra (Hoffmann-La Roche). i det följande benämnd förening B radioaktiv ligand: tritiumbehandlad retinsyra 'neutral' ligand: samma som för fig. 6. fig. 7: Utgående från 'tävlings'-kurvorna i fig. 2 - 7 bestämmer man i varje enskilt fall IC50 (koncentrationen av neutral ligand som minskar bindningen av tritierad ligand med 50 %). Detta värde IC50 gör det möjligt att i varje enskilt fall beräkna dissociationskonstanten vid jämvikt (Kd) för den neutrala li- ganden.

Man fann följande värden: Fig. 2: Kd = 4nM ¿ 19 2 Fig. 3: Kd = 4nm i 44 % Fig. 4: Kd = 6nM ¿ 30 % Fig. 5: Kd = 6nm ¿ 19 % Fig. 6: Kd = l6nm i 58 %.

Fig. 7: Kd = 20nm ¿ 24 %.

Fig. 2 och 3 visar 'tävlings'-kurvorna för neutral retinsyra i förhållande till föreningen enligt exempel 1 (fig. 2) och i förhållande till tritierad retinsyra (fig. 3). De i de olika fallen beräknade dissociationskonstanterna är desamma, vilket antyder att de två radioaktiva liganderna uppvisar likartad hindningsspecifikation. 463 714 10 10 Pâ samma sätt ser man (fig. 4 och 5) att de med användning av den ena eller andra märkta liganden erhållna Kd-värdena för föreningen A är desamma.

Detta verifieras även för fallet med föreningen B (fig. 6 och 7).

Sammanfattningsvis kan sägas att för samtliga enligt ovan stu- derade fall de beräknade Kd-värdena är oberoende av den använ- da tritierade liganden, vilket visar att dessa ligander före- nas med samma receptor med likartad specificitet och att man kan utbyta den ena mot den andra för bestämning av bindningen av retinoider till CRABP. 'l

Claims (10)

10 15 20 25 30 35 11 463 714 Patentkrav

1. Med tritíum märkt 2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetra- metyl-2-naftyl)-6-benso[b]tiofen-karboxylsyra.

2. 2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetrametyl-2-naftyl)-6- -benso[b]tiofen-karboxylsyra enligt krav 1, k ä n n e - t e c k n a d av att den är märkt i läge 3 hos tetrahydronaf- talen-gruppen.

3. Tritiummärkt 2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetrametyl-2- -naftyl)-6-benso[b]tiofen-karboxylsyra enligt något av före- gående krav, cifik aktivitet av minst 75GBq/mmol. k ä n n e t e c k n a d av att den har en spe-

4. Sätt att framställa en tritiumbehandlad produkt enligt nâ- got av föregående krav, k ä n n e t e c k n a t av att: - man antingen framställer en 2-(3-halogen-5,6.7,8-tetrahydro- -5,5,8,8-tetrametyl-2-naftyl)-6-benso[b]tiofen-karboxylsyra och underkastar denna inverkan av ett tritiumbehandlat reduk- tionsmedel, eller att - man underkastar 2-(5,6.7.8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramety1-2- -naftyl)-6-benso[b]-tiofen-karboxylsyra en isotopisk utbytes- reaktion med tritiumbehandlat vatten i närvaro av platina och ättiksyra vid en temperatur av 20 - 150°C.

5. Sätt enligt krav 4. k ä n n e t e c k n a t av att re- duktionsmedlet är tritiumbehandlat väte.

6. Sätt enligt något av kraven 4 och 5, k ä n n e- t e c k n a t av att utgângs-halogenföreningen är en som er- hållits genom inverkan av ett halogeneringsmedel på 2- -(5,6.7.8-tetrahydro-5,5,8,8-tetrametyl-2-naftyl)-6-benso[b]- tiofen-karboxylsyra.

7. Sätt enligt något av kraven 4 - 6, k ä n n e t e c k - 463 714 12 10 15 n a t av att halogeneringsmedlet är ett bromeringsmedel.

8. Hellanprodukt, erhâllen enligt förfarandet enligt något av kraven 4 - 7, k ä n n e t e c k n a t av att den är 2-(3- -halogen-5.6,7.8-tetrahydro-5.5.8,8-tetrametyl-2-naftyl)-6- -benso[b]tiofen-karboxylsyra.

9. Hellanprodukt enligt krav 8, k ä n n e t e c k n a d av att halogenderivatet är bromderivatet.

10. Användning av tritiummärkt 2-(5.6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8- -tetrametyl-2-naftyl)-6-benso[b]tiofen-karboxylsyra som radio- aktiv märksubstans för bestämning av affinitet. närvaro av el- ler halt av retinoider, som uppvisar en karboxylgrupp och/e1- ler för karakterisering av antikroppar riktade mot denna syra och/eller för kvantifiering av receptorn CRABP för nämnda re- tinoider.