DE3624301A1 - Gehaertete reagenzschichten und verfahren zu deren herstellung - Google Patents

Gehaertete reagenzschichten und verfahren zu deren herstellung

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DE3624301A1
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    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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    • C08H1/00—Macromolecular products derived from proteins
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Description

Die Erfindung betrifft gehärtete Reagenzschichten und Verfahren zu deren Herstellung. Anwendung finden die Reagenzschichten in sogenannten "trockenchemischen" Testmitteln die auch unter der Bezeichnung Teststreifen bekannt sind. Die Reagenzschichten besitzen eine Matrix auf Protein und/oder Polymerbasis die durch Carboxylgruppen- aktivierende Vernetzungsmittel, nachfolgend auch Härter genannt, gehärtet sind. Die erfindungsgemäßen Reagenzschichten sind so hart, daß sie ohne Schaden zu erleiden abgewischt werden können.
Wenn die erfindungsgemäßen Reagenzschichten mit der zu analysierenden Probe, die normalerweise eine biologische Flüssigkeit (z. B. Blut, Plasma, Serum, Urin) ist, in Kontakt gebracht werden, saugen sie die Probe auf, wobei sie in einem vorgegebenen, kontrollierbaren Maße quellen.
In den letzten Jahren hat die Einführung der "trockenchemischen" Testmittel auch Teststreifen genannt die klinisch-chemischen Messungen revolutioniert und wesentlich vereinfacht. Im Gegensatz zu den "naß-chemischen" Verfahren bei denen es notwendig ist Lösungen zu mischen und in bisweilen recht teuren Meßgeräten die Farb- oder Floureszenzänderung zu messen, ist es bei den "trocken- chemischen" Verfahren meist nur notwendig die Probe mit dem Teststreifen in Kontakt zu bringen.
In einigen Fällen ist eine vorherige Verdünnung der Probe notwendig.
Die Literatur ist reich an Beispielen von "trockenchemischen" Testmitteln.
In allen Fällen sind die Reagenzien und Hilfsmittel in einer Trägermatrix enthalten. Die Probe die die nachzuweisende Substanz enthält wird aufgetragen.
Innerhalb der Trägermatrix findet dann eine Reaktion statt, die ein meßbares Signal (z. B. Farbe oder Fluoreszenz) erzeugt.
Es sind eine Vielzahl von Materialien bekannt, die sich als Trägermatrix eignen, wie z. B. Filterpapier (US-Patente 30 92 463; 42 79 993; 43 18 985; 43 61 648; 42 73 868; 43 18 709; 41 90 419; 42 15 157; 40 38 031) oder auch Proteine natürlichen Ursprungs (US-Patente 39 83 005; 40 42 335; 40 98 594; 41 66 093; 42 74 832; 42 55 384; 44 52 887; 43 40 565).
Auch der Einsatz von künstlich hergestellten Polymeren ist beschrieben (US-Patente 36 30 957; 43 12 834).
Die Messung des Blutzuckergehalts im Vollblut ist besonders wichtig bei der Behandlung von Diabetes. Kann ein Patient eine solche Analyse selbst durchführen, so hat er die Möglichkeit einer eigenen Therapiekontrolle und die medikamentöse Therapie und auch Diät kann besser überwacht und eingestellt werden. Von einem solchen Test ist zu fordern, daß er einfach in der Durchführung ist, d. h. die Probe (z. B. Vollblut) wird auf den Teststreifen aufgetragen und nach einer vorgegebenen Zeit wird der Überschuß an Probe durch abwischen oder abtupfen entfernt.
Eine der Voraussetzungen die ein solches Testmittel erfüllen muß ist, daß die Matrix (Reagenzschicht(en)) nur eine bestimmte und reproduzierbare Menge an Probenflüssigkeit aufnehmen darf. Außerdem muß die Matrix physikalisch so hart sein, daß sie nicht durch das Abwischen oder Abtupfen des Probenüberschusses beschädigt wird.
Bei der Suche nach einer geeigneten Trägermatrix die diese Bedingungen erfüllt wurde von einem in Wasser löslichen Polymer ausgeganen welches bei der Herstellung der Reagenzschichten durch vernetzende Substanzen gehärtet wird. Als lösliches Polymer wurde beispielhaft Gelatine verwendet.
Die meisten der bekannten und geprüften Vernetzungsmittel sind für die Herstellung von Reagenzschichten unbrauchbar.
Einige reagieren mit den Indikatorfarbstoffen und führen dadurch zu Farbänderungen. Andere setzen während der Reaktion Mineralsäuren frei oder inaktivieren die für die Nachweisreaktion notwendigen Enzyme. Wiederum andere führen zu wenig flexiblen Schichten oder auch zu Schichten mit ungenügender Abriebfestigkeit. Manche reagieren zu schnell oder zu langsam oder sind in wäßriger Umgebung zu instabil.
Überraschenderweise wurden nun vernetzende Substanzen gefunden, die die für Reagenzschichten geforderten Eigenschaften erfüllen.
Die vorliegende Erfindung betrifft gehärtete Reagenzschichten mit einer Matrix auf Polymer und/oder Proteinbasis die mit einem Carboxylgruppen-aktivierenden Vernetzungsmittel gehärtet sind. Carboxylgruppen aktivierende Vernetzungsmittel sind solche Vernetzungsmittel die in einer Initialreaktion mit Carboxylgruppen des als Bindemittel fungierenden Polymers oder Proteins reagieren und so die Carboxylgruppen aktivieren.
Diese aktivierten Carboxylgruppen sind in der Lage mit anderen funktionellen Gruppen des Bindemittels wie z. B. Aminogruppen, SH-Gruppen oder Hydroxylgruppen weiter zu reagieren wodurch die Vernetzung der Matrix erfolgt.
Geeignete Bindemittel (Matrixmaterial) sind Proteine und deren Derivate die natürlicherweise Carboxlgruppen enthalten die aktiviert werden können. Proteine enthalten auch die anderen für die Vernetzung notwendigen funktionellen Gruppen.
Als geeignete Proteine sind zu nennen Gelatine, Gelatinederivate, Casein oder auch Zein wobei die Gelatine und deren Derivate bevorzugt sind. Ebenso als Bindemittel (Matrixmaterial) sind Polymere geeignet die die oben genannten Gruppierungen enthalten wie z. B. ampholytische Polymere.
Für die vorliegende Erfindung geeignete Carboxlgruppen- aktivierende Vernetzungsmittel sind Carbamoylammoniumverbindungen der allgemeinen Formel I
worin bedeuten:
R1 = eine Alkylgruppe vorzugsweise mit 1-3 C-Atomen, eine gegebenenfalls mit einem Niederalkylrest oder mit Halogen substituierte Arylgruppe, z. B. Phenyl, gegebenenfalls substituiert mit Methyl, Ethyl oder Propyl, Cl oder Br, eine Aralkylgruppe, z. B. Benzyl, die in gleicher Weise wie die Arylgruppe substituiert sein kann,
R2 = hat die gleiche Bedeutung wie R1 oder stellt einen zweibindigen, gegebenenfalls substituierten Alkylen-, Arylen-, Aralkylen- oder Alkyl-Aryl-Alkyl-Rest dar, z. B. einen Ethylen-, Propylen-, Phenylen- oder Xylylen-Rest, der über seine zweite Bindung mit einer weiteren Carbamoylammoniumgruppierung obiger allgemeiner Formel verbunden ist, oder
R1 und R2 bilden zusammen die zur Vervollständigung eines gegebenenfalls substituierten Piperidin-, Piperazin- oder Morpholinringes erforderliche Atomgruppe, wobei der Ring z. B. mit einer Alkylgruppe mit 1-3 C-Atomen oder mit Halogen wie Cl oder Br substituiert sein kann,
R3 = -NR4-CO-R5
R4 = H, Alkyl (1-4 C)
R5 = H, Alkyl (1-4 C)
   = NR6R7
R6, R7 = H, Alkyl (C1-C4)
R3 = -(CH2) m -NR8R9
R8 = -CO-R10
R9 = H, Alkyl, (C1-C4)
R10 = NR11R12
R11 = Alkyl (C1-C4), Aryl
R12 = H, Alkyl, Aryl
m = 1-3
R3 = -(CH2) n -CONR13R14
R13 = H, Alkyl (C1-C4), Aryl
R14 = H, Alkyl (C1-C4) oder
R13 und R14 bilden zusammen die zur Vervollständigung eines 5- oder 6-gliedrigen aliphatischen Ringes erforderliche Atomgruppe
n = 0-3
R15 = H, Alkyl (C1-C4) gege benenfalls substituiert durch Halogen
Y = -O-, -NR17-,
R16 = H, Alkyl, -CO-R18, -CO-NHR19
R17, R18, R19 = H, Alkyl (C1-C4)
p = 2-3
Z die zur Vervollständigung eines 5- oder 6-gliedrigen aromatischen heterocyclischen Ringes, gegebenenfalls mit anelliertem Benzolring, erforderlichen C-Atome und
X⊖ ein Säureanion.
Als bevorzugt zu nennen sind Carbamoylammoniumverbindung der allgemeinen Formel II
worin R1 und R2 die bei den Carbamoylammoniumverbindungen der Formel I angegebene Bedeutung haben und
R20 für Methylen, Ethylen, Propylen, oder eine einfache chemische Bindung,
R21 für Wasserstoff, Methyl oder Ethyl,
X⊖ für ein Säureanion wie Halogen⊖, BF4⊖, NO3⊖, SO4⊖, ClO4⊖, CH3OSO3⊖ und
Me⊕ für ein Alkalimetallkation steht.
Weiterhin geeignet als Vernetzungsmittel sind Verbindungen der allgemeinen Formel III und IV.
In den Verbindungen der Formel III
bedeuten R1 und R2 (die gleich oder verschieden sein können) jeweils eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen (z. B. Methyl, Ethyl, 2-Ethylhexyl usw.), eine Arylgruppe mit 6 bis 15 Kohlenstoffatomen (z. B. Phenyl, Naphthyl usw.), oder eine Aralkylgruppe mit 7 bis 15 Kohlenstoffatomen (z. B. Benzyl, Phenethyl usw.), oder sie können miteinander kombiniert sein unter Bildung eines heterocyclischen Rings zusammen mit dem Stickstoffatom (z. B. ein Pyrrolidinring, ein Piperazinring, eine Morpholinring usw.); R3 bedeutet ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine Carbamoylgruppe, eine Sufogruppe, ein Halogenatom, eine Carbamoylgruppe, eine Sulfogruppe, eine Ureidogruppe, eine Alkoxygruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen usw. Wenn R3 eine Alkyl- oder eine Alkoxygruppe, wie vorstehend beschrieben, darstellt, können diese Gruppen jeweils weiter substituiert sein mit einem Halogenatom, einer Carbamoylgruppe, einer Sulfogruppe, einer Ureidogruppe usw. X- stellt in der vorstehenden Formel ein Anion dar und wirkt als ein Gegenion für das N-Carbamoylpyridiniumion unter Bildung eines Salzes, oder es kann darin abwesend sein, wenn R3 eine Sulfogruppe als Bestandteil enthält, und so ein intramolekulares Salz gebildet wird. Geeignete Beispiele für ein durch X- dargestelltes Anion umfassen Halogenidionen, das Sulfonsäureion, Sulfonation, ClO4 -, BF4 -, PF6 - usw., sowie Carbamoylammoniumverbindungen der Formel IV
in der
R1, R2, R3 und X- die gleichen Bedeutungen haben wie in der Formel III angegeben.
In den Vernetzungsmitteln der Formel V
bedeuten R1, R2, R3 und R4 (die gleich oder verschieden sein können) jeweils eine Alkylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen (z. B. Methyl, Ethyl, Butyl, 2-Ethylhexyl, Dodecyl usw.), eine Aralkylgruppe mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen (z. B. Phenyl, Phenethyl, 3-Pyridylmethyl usw.), oder eine Arylgruppe mit 5 bis 20 Kohlenstoffatomen (z. B. Phenyl, Naphthyl, Pyridyl usw.). Diese Gruppen können jeweils eine Substituentengruppe umfassen (z. B. ein Halogenatom, eine Sulfogruppe, eine Alkoxygruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, eine Alkoxygruppe mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, eine N,N-disubstituierte Carbamoylgruppe usw.).
Es ist auch möglich, daß jegliche zwei Gruppen, ausgewählt aus R1, R2, R3 und R4, miteinander unter Bildung eines Ringes kombiniert sind. Beispielsweise ist es möglich, daß R1 und R2 oder R3 und R4 miteinander kombiniert sind unter Bildung eines Ringes zusammen mit einem Stickstoffatom. Spezielle Beispiele für einen in einem solchen Falle gebildeten Ring umfassen einen Pyrrolidinring, einen Piperazinring, eine Perhydroazepinring, einen Morpholinring, usw. In einem anderen Falle können R1, und R3 oder R2 und R4 miteinander kombiniert sein unter Bildung eines Ringes zusammen mit zwei Stickstoffatomen, und einem dazwischen befindlichen Kohlenstoffatom. Spezielle Beispiele für einen auf solche Weise gebildeten Ring umfassen einen Imidazolinring, einen Tetrahydropyrimidinring, einen Tetrahydrodiazepinring usw.
X bedeutet in der Formel V eine Gruppe, die von der Verbindung der Formel V durch Reaktion mit einem nukleophilen Reagens abgespalten werden kann, wobei geeignete Beispiele ein Halogenatom, eine Sulfonyloxygruppe, eine 1-Pyridiniumylgruppe usw. umfassen. Y- bedeutet in der vorstehenden Formel V ein Anion, wobei geeignete Beispiele ein Halogenidion, ein Sulfonation, ein Schwefelsäureion, ClO4 -, BF4 -, PF6 - usw. umfassen. Wenn ein beliebiges von R1, R2, R3 und R4 eine Sulfogruppe aufweist, kann ein Vernetzungsmittel der Formel V ein intramolekulares Salz ohne unabhängiges Gegenion, das durch Y- dargestellt wird, bilden.
In den als Vernetzungsmittel geeigneten Carbodiimiden der Formel VI
R1-N=C=N-R2 (VI)
bedeutet R1 eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen (z. B. Methyl, Ethyl, 2-Ethylhexyl usw.), eine Cycloalkylgruppe mit 5 bis 8 Kohlenstoffatomen (z. B. Cyclohexyl usw.), eine Alkoxyalkylgruppe mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen (z. B. Methoxyethyl usw.), oder eine Aralkylgruppe mit 7 bis 15 Kohlenstoffatomen (z. B. Benzyl, Phenethyl usw.). In der vorstehenden Formel VI ist R2 günstigerweise eine Gruppe der folgenden Formel zusätzlich zu den als R1 definierten Gruppen:
worin R3 eine Alkylengruppe mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellt (z. B. Ethylen, Propylen, Trimethylen usw.): und R4 und R5 (die gleich oder verschieden sein können) bedeuten jeweils eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen (z. B. Methyl, Ethyl, usw.), oder ist es auch günstig, wenn sie miteinander kombiniert sind unter Bildung eines heterocyclischen Ringes zusammen mit einem Stickstoffatom (z. B. Pyrrolidin, Piperazin, Morpholin usw.). R6 bedeutet in der vorstehenden Formel eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen (z. B. Methyl, Ethyl, Butyl usw.), die vorzugsweise mit einem gewissen Substituenten substituiert ist. Geeignete Beispiele für einen derartigen Substituenten umfassen unsubstituierte und substituierte Carbamoylgruppen und die Sulfogruppe. X- bedeutet ein Anion, wobei geeignete Beispiele Halogenidionen, Sulfonationen, Schwefelsäureionen, ClO4 -, BF4 -, PF6 - usw. umfassen. Wenn der Härter der Formel V ein intramolekulares Salz bildet, ist das durch X- dargestelle Gegenanion nicht notwendig.
In den Halogenpyridinium-Verbindungen der Formel VII
bedeutet R1 eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen (z. B. Methyl, Ethyl, Butyl usw.), eine Arylgruppe mit 6 bis 15 Kohlenstoffatomen (z. B. Phenyl, Naphthyl usw.), oder eine Aralkylgruppe mit 7 bis 15 Kohlenstoffatomen (z. B. Benzyl, Phenethyl usw.). Diese Gruppen können jeweils mit einem beliebigen Substituenten substituiert sein. Geeignete Beispiele für derartige Substituenten umfassen eine Carbamoylgruppe, eine Sulfamoylgruppe, eine Sulfogruppe, usw. R2 und R3 in der Formel VII (die gleich oder verschieden sein können) stellen jeweils ein Wasserstoffatom ein Halogenatom, eine Acylamidogruppe, eine Nitrogruppe, eine Carbamoylgruppe, eine Ureidogruppe, eine Alkoxygruppe, eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe, eine Arylgruppe, eine Aralkylgruppe usw. dar. Darüberhinaus ist es auch günstig, wenn R2 und R3 miteinander kombiniert sind unter Bildung eines kondensierten Ringes zusammen mit dem Pyridiniumring-Gerüst.
X bedeutet in der Formel VII eine Gruppe, die von der durch die Formel VII dargestellten Verbindung durch Reaktion mit einem nukleophilen Reagens abgespalten wird, wobei bevorzugte Beispiele Halogenatome, die Sulfonyloxygruppe, oder Gruppen, dargestellt durch
sind, worin R4 eine Alkylgruppe
oder eine Arylgruppe darstellt. Wenn X eine Sulfonyloxygruppe ist, so ist es auch günstig, wenn X an R1 gebunden ist.
Y- in der Formel VII stellt ein Anion dar, wobei bevorzugte Beispiele Halogenidionen, Sulfonationen, Schwefelsäureionen, ClO4 -, BF4 -, PF6 - und dergleichen umfassen. Jedoch kann Y- abwesend sein, wenn R1 eine sulfo-substituierte Gruppe ist, wodurch die Verbindung ein intramolekulares Salz bildet.
In den Sulfonylaminopiperidiniumsalzen der Formel VIII
haben R1 und R2 die gleichen Bedeutungen wie für R1 und R2 in der Formel III definiert, und R3 bedeutet eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen (z. B. Methyl, Ethyl, Butyl, usw.), eine Arylgruppe mit 6 bis 15 Kohlenstoffatomen (z. B. Phenyl, Naphthyl, usw.), oder eine Aralkylgruppe mit 7 bis 15 Kohlenstoffatomen (z. B. Benzyl, Phenylethyl, usw.). X- bedeutet ein Anion, wobei bevorvorzugte Beispiele Halogenidionen; Sulfonationen, Schwefelsäureionen, ClO4 -, BF4 -, PF6 - und dergleichen umfassen.
Zusätzlich zu den durch die vorstehenden Formeln I bis VIII dargestellten Härtern werden auch Verbindungen, beschrieben in den JP-OS'en 38 540/75, 93 470/77, 43 353/81 und 1 13 929/83 und der US-PS 33 21 313, vorteilhaft als Härter vom Carboxylgruppen aktivierenden Typ verwendet.
Spezielle Beispiele für Härter des vorstehenden beschriebenen Typs, die besonders vorteilhaft verwendet werden können, werden nachstehend anhand von Beispielen veranschaulicht, ohne jedoch eine Einschränkung darzustellen.
  • a) Verbindungen der Formeln I-III Die Verbindungen sind in einfacher und aus der Literatur bekannter Weise darstellbar. Aus den sekundären Aminen stellt man z. B. mit Phosgen die Carbaminsäurechloride her, die dann unter Lichtabschluß mit aromatischen, heterocyclischen stickstoffhaltigen Verbindungen umgesetzt werden. Die Herstellung der Verbindung 3 wird in den Chemischen Berichten 40, (1907), Seite 1831, beschrieben.
    Weitere Angaben zur Synthese finden sich auch in der JP-OS 51 945/74 und der JP-OS 59 625/76.
  • b) Verbindungen der Formel IV
  • c) Verbindungen der Formel V
    Methoden zur Synthese dieser Verbindungen werden genauer beschrieben in Chemistry Letters (The Chemical Society of Japan), Seite 1891-1894 (1982).
  • d) Verbindungen der Formel VI
    Methoden zur Synthese dieser Verbindungen werden genauer beschrieben in den JP-OS'en 1 26 125/76 und 48 311/77.
  • e) Verbindungen der Formel VII
    Methoden zur Synthese dieser Verbindungen werden genauer beschrieben in den JP-OS'en 44 140/82 und 46 538/82 und der JP-PS 50 669/83.
  • f) Methoden der Formel VIII
    Methode zur Synthese dieser Verbindungen werden genauer beschrieben in der JP-OS 54 427/77.
  • g) Verbindungen, beschrieben in der JP-OS 38 540/75
  • h) Verbindungen, beschrieben in der JP-OS 93 470/77
  • i) Verbindungen, beschrieben in der JP-OS 43 353/81
  • j) Verbindungen, beschrieben in der JP-OS 1 13 929/83
  • k) Verbindungen, beschrieben in der US-PS 33 21 313
  • In den folgenden Beispielen wird die Synthese der Vernetzungsmittel am Beispiel einiger der genannten Verbindungen erläutert.
Beispiel 1 (Verbindung 6)
Phenyl-Methyl-Carbamoylchlorid
49,5 g Phosgen werden unter Kühlung (22-25°C) vorsichtig in 400 cm3 absolutes Toluol eingeleitet. Zu dieser Lösung tropft man unter gutem Rühren eine Lösung von 107 g destilliertem N-methylanilin in 450 cm3 absolutem Toluol. Anschließend wird die Mischung eine halbe Stunde auf 80-90°C erhitzt, abgekühlt und das ausgefällte Hydrochlorid abgesaugt. Schließlich wird die toluolische Lösung unter Feuchtigkeitsausschluß im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand kristallisiert beim Abkühlen.
Ausbeute: 81 g, Schmelzpunkt 85°C.
Morpholinocarbonylchlorid
Man leitet in
400 ml abs. Toluol langsam
49,5 g Phosgen ein und tropft dann in diese Mischung bei Raumtemperatur langsam eine Lösung von
87 g destilliertem Morpholin in
450 ml abs. Toluol unter gutem Rühren ein.
Anschließend wird die Mischung 1/2 Stunde auf 80-90°C erhitzt, abgekühlt und das ausgefallene Hydrochlorid abgesaugt.
Man wäscht mit abs. Toluol nach.
Das Filtrat wird im Vakuum unter Feuchtigkeitsausschluß abgedampft. Es bleibt ein Öl zurück, das man anschließend destilliert.
K p = 72°C
Ausbeute 50 g.
Verbindung 6:
33,9 g Phenyl-Methyl-Carbamoylchlorid werden im abgedunkeltem Raum unter Feuchtigkeitsausschluß in 400 cm3 absolutes Pyridin eingerührt. Das gebildete Carbamoylpyridiniumchlorid fällt nach 3 Stunden aus. Nach Zusatz der gleichen Menge Ether werden die Kristalle abgesaugt. In wenig absolutem Ethanol aufgenommen und wieder mit Ether ausgefällt. Man saugt ab, wäscht mit Ether gut aus und trocknet die Verbindung im Exsikkator.
Ausbeute: 41 g
Schmelzpunkt 108-110°C.
Beispiel 2 (Verbindung 15)
Das Verbindung 15 entsprechende Poly-4-vinyl-NN-Dimethylcarbamoylpyridiniumchlorid wird wie folgt hergestellt:
10,5 g Poly-4-vinyl-pyridin (Molgewicht 10 000) werden in
150 ml abs. Ethanol gelöst und unter gutem Rühren mit
10,8 g Diemthylcarbamidsäurechlorid versetzt.
Die Mischung wird bei Raumtemperatur 5 Stunden gerührt, und im Vakuum konzentriert. Man läßt die Mischung unter Rühren in Ether einlaufen und saugt das ausgefällte Produkt ab. Man wäscht es gut mit Ether.
Die Verbindung wird im Exsikkator getrocknet.
Ausbeute: 18 g.
Beispiel 3 (Verbindung 30)
1/20 Mol von Morpholinocarbonylchlorid werden unter Rühren in eine Lösung von 1/20 Mol 3-Acetaminopyridin in 60 ml Chloroform gegeben. Die Mischung wird 2 Stunden unter Feuchtigkeitsausschluß bei 50°C weiter gerührt. Das Chloroform wird dann im Vakuum entfernt und der hochviskose Rückstand mit wenig absoultem Aceton verrieben. Man saugt das kristalline Produkt ab und wäscht es mit wenig absolutem Ether nach. Dann trocknet man das Produkt im Exsikkator.
Ausbeute: 10 g
Schmelzpunkt 118-123°C.
Beispiel 4 (Verbindung 41)
15,9 g Pyridinsulfonsäure werden in 200 ml absolutem Dimethylformamid aufgeschlämmt. Dazu wird tropfenweise eine Lösung von 2,6 g Natrium in 150 ml Methanol gegeben (pH 7). Man filtriert die Lösung und setzt 13 g N,N- Dimethylcarbamidsäurechlorid zu. Die Mischung bleibt dann über Nacht bei Raumtemperatur stehen. nach Zufügen von 400 ml Ether fällt das Reaktionsprodukt aus. Es wird abgesaugt und gut mit Ether gewaschen.
Ausbeute: 19,5 g
Zersetzungspunkt: 250°C.
Beispiel 5 (Verbindung 44)
18 g Natriumsalz der Pyridin-3-sulfonsäure werden in einer Mischung von 1000 ml Dimethylformamid (trocken) und 100 ml Methanol gelöst und mit 15 g Piperdinocarbonylchlorid versetzt. Die Mischung bleibt über Nacht stehen und das Reaktionsprodukt wird mit 200 ml Ether ausgefällt. Man saugt es ab und wäscht mit Ether nach.
Ausbeute: 13 g
Zersetzungspunkt: über 250°C.
Beispiel 6 (Verbindung 45)
15,9 Pyridinsulfonsäure-(3) werden in 200 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und tropfenweise mit einer Lösung von 2,6 g Natrium in 150 ml abs. Methanol versetzt (bei pH 7).
Die erhaltene Lösung wurde von geringen unlöslichen Teilen abfiltriert und dann mit 18,9 g Morpholinylcarbonylchlorid umgesetzt. Die Mischung blieb 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Das Reaktionsprodukt war zum Teil ausgefallen. Die Ausbeute wurde durch Zugabe von abs. Ether verbessert.
Man saugt den Rückstand ab und wäscht ihn mit abs. Ether aus.
Ausbeute: 18 g
Schmelzpunkt: 236-237°C
Beispiel 7 (Verbindung 46)
Herstellung von Verbindung 46:
18,2 g des Natriumsalzes der Pyridin-3-sulfonsäure werden in einer Mischung von 100 ml Methanol und 100 ml Dimethylformamid gelöst. Zur Mischung fügt man 18,5 g N-Methyl-N-methylphenylcarbonylchlorid zu. Nach 3 tägigem Stehen fallen wenige Kristalle aus. Man saugt sie ab und wäscht sie mit Ether.
Ausbeute: 3 g
Schmelzpunkt: über 300°C.
Beispiel 8 (Verbindung 55)
18,9 g des Natriumsalzes der Pyridin-4-ethansulfonsäure werden in einer Lösung von 400 ml Dimethylformamid (trocken) und 400 ml Methanol (trocken) gelöst. Dazu fügt man 15 g Morpholinylcarbonylchlorid. Nach dem Stehen über Nacht wird das Reaktionsprodukt mit 1,3 l Ether ausgefällt. Man saugt die Kristalle ab und wäscht sie mit Ether nach.
Ausbeute: 22 g
Schmelzpunkt: 152-153°C.
Analyse:
Die Geruchsschwelle des Pyridins liegt bei 0,0004 mg/m3 Luft, die Wahrnehmbarkeit des Pyirins mit dem Geruchssinn beginnt also bereits bei sehr geringen Mengen. Im Vergleich dazu liegt die maximale Arbeitsplatzkonzentration für Pyridin, sein MAK-Wert, wesentlich höher, nämlich bei 15 mg/m3. Somit die Geruchsprobe ein durchaus geeignetes Mittel zur Feststellung sehr geringer Pyridinkonzentrationen am Arbeitsplatz. Den Grenzwert 15 mg/m3 Luft soll die Arbeitsplatzkonzentration von Pyridin nicht überschreiten (Reichhard, Lösungsmitteleffekte in der organischen Chemie, Verlag Chemie, Seite 172).
Die als Härtungsmittel gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen sind geruchslos, da sie in der Schicht fixiert werden. Dieses ist in einfacher Weise dadurch feststellbar, daß man etwa 1 ml einer 5%igen wäßrigen Lösung einer Verbindung zur Trockene eindampft und diesen Vorgang durch Geruchsproben auf einen pyridinähnlichen Geruch hin kontrolliert. Ähnlichen Bedingungen wird die Verbindung bei ihrer Anwendung zur Härtung von Reagenzschichten entsprechend den vorliegenden Verfahren unterworfen.
Daß sich die hier beschriebenen sulfonsäuregruppenhaltigen Carbamoyloniumverbindung unter den genannten Bedingungen als praktisch geruchslos erweisen, bedeutet auch, daß sie sich ohne die Gefahr einer Überschreitung der max. Arbeitsplatzkonzentration verarbeiten lassen.
Die in erfindungsgemäßer Weise angewandten Verbindungen werden den zu härtenden Reagenzschichten zweckmäßigerweise unmittelbar vor dem Vergießen, vorzugsweise in Form wäßriger oder alkoholischer Lösungen zugesetzt. Der Zusatz knapp vor dem Verguß ist deshalb erforderlich, weil die Verbindungen mit Gelatine oder den anderen in der diagnostischen Chemie üblicherweise verwendeten Proteinen sehr schnell reagieren. Nachdem man die Verbindungen zugesetzt hat, sollen die Gießlösungen innerhalb weniger Minuten vergossen werden. Die Geschwindigkeit, mit der die Härtungsreaktion abläuft, hängt in erster Linie von der Konzentration der Proteine in der Gießlösung ab.
Im Gegensatz zu den Derivaten des unsubstituierten oder mit niederen Alkylresten substituierten Pyridins, die beim Beguß und während der Trocknung eine erhebliche Geruchsbelästigung verursachen, vernetzen die erfindungsgemäßen Verbindungen die Gelatine ohne Abgabe gasförmiger Produkte.
Die MAK-Werte (in den USA auch threshold limit values genannt) geben die maximale Arbeitsplatzkonzentration eines gas-dampf- oder staubförmigen Arbeitsstoffes in der Luft eines Arbeitsraumes an, die bei täglich 8-stündiger Arbeit auch bei einer Einwirkung über Jahre hinweg die Gesundheit der im Arbeitsraum Beschäftigen nicht schädigt.
Eine weitere Möglichkeit die Verbindungen anzuwenden, besteht darin, zunächst die nicht gehärteten Gießlösungen zu vergießen und dann die so entstehenden Schichten mit einer Lösung der härtenden Verbindungen zu überschichten.
Die Schichten können außer Gelatine, Gelatinederivate, Proteine, Proteinderivate wasserlösliche hochpolymere Verbindungen enthalten, insbesondere Polyvinylalkohol, polyacrylsaures Natrium und andere carboxylgruppenhaltige Homo- oder Copolymerisate, ferner Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylamid oder hochmolekulare Naturstoffe, wie Dextrane, Dextrine, Stärkeether, Alginsäure bzw. Alginsäurederivate.
Die anzuwendenden Konzentrationen der Härtungsmittel gemäß der Erfindung können innerhalb weiter Grenzen schwanken und hängen im wesentlichen von der verwendeten härtenden Verbindung ab.
Gute Ergebnisse liefern Mengen von 0,1-10 Gew.-% und vorzugsweise 0,2-6 Gew.-% bezogen auf das Bindemitteltrockengewicht.
Wie bereits erwähnt, setzt die Härtungsreaktion zwischen den Verbindungen der Erfindung und der Gelatine bzw. den Proteinen sofort ein, so daß der optimale Härtungsgrad etwa gleichzeitig mit dem Trocknen der Schichten im Anschluß an den Beguß bzw. ihrer Verarbeitung erreicht wird.
Die Wirkung der härtenden Verbindungen wird bestimmt mit Hilfe des Schmelzpunktes der Schichten, der sich auf folgende Weise ermitteln läßt:
Die auf eine Unterlage vergossene Schicht wird zur Hälfte in Wasser getaucht, das kontinuierlich bis 100°C erwärmt wird. Die Temperatur, bei der die Schicht von der Unterlage abläuft (Schlierenbildung), wird als Schmelzpunkt bzw. Abschmelzpunkt bezeichnet. Nach diesem Meßverfahren zeigen reine Protein- bzw. Gelatineschichten ohne Härtungsmittel in keinem Falle eine Schmelzpunkterhöhung. Der Abschmelzpunkt liegt unter diesen Bedingungen bei 30-35°C.
Die Verbindungen gemäß der Erfindung reagieren in überraschender Weise schnell mit Proteinen und machen es dadurch möglich, proteinhaltige Materialien in kürzester Zeit bis zu einem optimalen Grad zu härten. Diese unerwartete Wirkung der Verbindung ist von besonderer Bedeutung für die Härtung diagnostischer Materialien, die Proteine oder Proteinderivate als Bindemittel enthalten. Der erwünschte Härtungsgrad kann in gut kontrollierbarer Weise praktisch bei der Herstellung der Materialien eingestellt werden, ohne daß längere Lagerzeiten und die damit verbundenen Unsicherheiten einer unkontrollierbaren Nachhärtung in Kauf genommen werden müßten.
Beispiel 9
Eine 10%ige Caseinlösung wird in Wasser durch Zusatz von Natronlauge hergestellt. Zu 100 ml Lösung setzt man als Filterfarbstoff 0,1 g Tartrazin zu. Vor dem Gießen werden bei einem pH-Wert von 7 verschiedenen Proben der Lösung je 3 Gew.-% der Verbindungen 22, 19, 20, 21, 24, 25, 30, 31, 37, 41, 44, 45, 50, 52, 53, 55, 56 gelöst in Wasser, zugesetzt. Man vergießt die Mischungen auf Glasplatten und erhält nach dem Trocknen gehärtete Filterfolien, die sich in alkalischem Wasser nicht mehr auflösen.

Claims (10)

1. Gehärtete Reagenzschichten mit einem Bindemittel auf Protein und/oder Polymerbasis dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix mit einem Carboxylgruppen- aktivierenden Vernetzungsmittel gehärtet ist.
2. Gehärtete Reagenzschichten nach Anspruch 1, gehärtet mit einem Carboxylgruppen-aktivierende Vernetzungsmittel aus der Gruppe
  • a) Carbamoylverbindungen der allgemeinen Formel I worin bedeuten:
    R1= eine Alkylgruppe vorzugsweise mit 1-3 C- Atomen, eine gegebenenfalls mit einem Niederalkylrest oder mit Halogen substituierte Arylgruppe, z. B. Phenyl, gegebenenfalls substituiert mit Methyl, Ethyl oder Propyl, Cl oder Br, eine Aralkylgruppe, z. B. Benzyl, die in gleicher Weise wie die Arylgruppe substituiert sein kann,
    R2 = hat die gleiche Bedeutung wie R1 oder stellt einen zweibindigen, gegebenenfalls substituierten Alkylen-, Arylen-, Aralkylen-oder Alkyl-Aryl-Alkyl-Rest dar, z. B. einen Ethylen-Propylen-, Phenylen-, oder Xylylen-Rest, der über seine zweite Bindung mit einer weiteren Carbamoylammoniumgruppierung obiger allgemeiner Formel verbunden ist, oder
    R1 und R2 bilden zusammen die zur Vervollständigung eines gegebenenfalls substituierten Piperidin-, Piperazin oder Morpholinringes erforderlichen Atomgruppe, wobei der Ring z. B. mit einer Alkylgruppe mit 1-3 C-Atome oder mit Halogen wie Cl oder Br substituiert sein kann,
    R3 = -NR4-CO-R5
    R4 = H, Alkyl (1-4 C)
    R5 = H, Alkyl (1-4 C)
       = NR6R7
    R6, R7 = H, Alkyl (C1- C4)
    R3= -(CH2) m -NR8R9
    R8 = -CO-R10
    R9 = H, Alkyl, (C1-C4)
    R10 = NR11R12
    R11 = Alkyl (C1-C4), Aryl
    R12 = H, Alkyl, Aryl
    m = 1-3
    R3=-(CH2) n -CONR13R14
    R13 = H, Alkyl (C1-C4), Aryl
    R14 = H, Alkyl (C1-C4) oder
    R13 und R14 bilden zusammen die zur Vervollständigung eines 5- oder 6-gliedrigen aliphatischen Ringes erforderliche Atomgruppe
    n = 0-3 R15 = H, Alkyl (C1-C4) gegebenenfalls substituiert durch Halogen
    Y = -O-, -NR17-,
    R16 = H, Alkyl, -CO-R18, -CO-NHR19
    R17, R18, R19 = H, Alkyl (C1-C4)
    p = 2-3
    Z = die zur Vervollständigung eines 5- oder 6- gliedrigen aromatischen heterocyclischen Ringes, gegebenenfalls mit anelliertem Benzolring, erforderlichen C-Atome und
    X⊖ ein Säureanion,
    oder
  • b) Carbamoylammoniumverbindung der allgemeinen Formel II worin R1 und R2 die bei den Carbamoylammoniumverbindungen der Formel I angegebene Bedeutung haben und
    R20 für Methylen, Ethylen, Propylen, oder eine einfache chemische Bindung,
    R21 für Wasserstoff, Methyl oder Ethyl,
    X⊖ für ein Säureanion wie Halogen⊖, BF4⊖, NO3⊖, SO4⊖, ClO4⊖, CH3OSO3⊖ und
    Me⊕ für ein Alkalimetallkation steht,
    oder
  • c) Carbamoylammoniumverbindung der allgemeinen Formel III worin bedeuten
    R1 und R2 (die gleich oder verschieden sein können) jeweils eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen eine Arylgruppe mit 6 bis 15 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkylgruppe mit 7 bis 15 Kohlenstoffatomen (z. B. Benzyl, Phenethyl usw.), oder sie können miteinander kombiniert sein unter Bildung eines heterocyclischen Rings zusammen mit dem Stickstoffatom;
    R3 ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine Carbamoylgruppe, eine Sufogruppe, ein Halogenatom, eine Carbamoylgruppe, eine Sulfogruppe, eine Ureidogruppe, eine Alkoxygruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder wenn R3 eine Alkyl- oder eine Alkoxygruppe, wie vorstehend beschrieben, darstellt, können diese Gruppen jeweils weiter substituiert sein mit einem Halogenatom, einer Carbamoylgruppe, einer Sulfogruppe, einer Ureidogruppe;
    X- stellt in der Formel III ein Anion dar und wirkt als ein Gegenion für das N-Carbamoylpyridiniumion unter Bildung eines Salzes, oder es kann darin abwesend sein, wenn
    R3 eine Sulfogruppe als Bestandteil enthält, und so ein intramolekulares Salz gebildet wird, oder
  • d) Carbamoyloxoammonium-Verbindungen der Formel IV in der
    R1, R2, R3 und X- die gleichen Bedeutungen haben wie in der Formel III angegeben,
    oder
  • e) Verbindungen der Formel V worin bedeuten,
    R1, R2, R3 und R4 (die gleich oder verschieden sein können) jeweils eine Alkylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, eine Aralkylgruppe mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, oder eine Arylgruppe mit 5 bis 20 Kohlenstoffatomen wobei diese Gruppen noch substituiert sein können oder, zwei Gruppen, ausgewählt aus R1, R2, R3 und R4, miteinander unter Bildung eines Ringes kombiniert sind,
    X eine Gruppe, die von der Verbindung der Formel V durch Reaktion mit einem nukleophilen Reagens abgespalten werden, kann, wobei geeignete Beispiele ein Halogenatom, eine Sulfonyloxygruppe, eine 1-Pyridiniumylgruppe umfassen,
    Y- bedeutet ein Anion, wobei geeignete Beispiele ein Halogenidion, ein Sulfonation, ein Schwefelsäureion, ClO4 -, BF4 -, PF6 - umfassen,
    oder
  • f) Verbindungen der Formel VI R1-N=C=N-R2 (VI)worin bedeutet
    R1 eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Cycloalkylgruppe mit 5 bis 8 Kohlenstoffatomen, eine Alkoxyalkylgruppe mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen, oder Aralkylgruppe mit 7 bis 15 Kohlenstoffatomen oder R2 für eine Gruppe der folgenden Formel steht zusätzlich zu den als R1 definierten Gruppen: worin
    R3 eine Alkylengruppe mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellt; und
    R4 und R5 (die gleich oder verschieden sein können) bedeuten jeweils eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, oder ist es auch günstig, wenn sie miteinander kombiniert sind unter Bildung eines heterocyclischen Ringes zusammen mit einem Stickstoffatom,
    R6 eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, die vorzugsweise mit einem Substituenten substituiert ist aus der Gruppe der unsubstituierten und substituierten Carbamoylgruppen oder die Sufogruppe,
    X- bedeutet ein Anion wie Halogenidionen, Sulfonationen, Schwefelsäureionen, ClO4 -, BF4 -, PF6 -,
    oder
  • g) Halogenpyridinium Verbindungen der Formel VII worin bedeutet
    R1 eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 6 bis 15 Kohlenstoffatomen, oder eine Aralkylgruppe mit 7 bis 15 Kohlenstoffatomen, die jeweils substituiert sein können,
    R2 und R3 (die gleich oder verschieden sein können) ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine Acylamidogruppe, eine Nitrogruppe, eine Carbamoylgruppe, eine Ureidogruppe, eine Alkoxygruppe, eine Alkylgruppe, eine Alkenylgruppe, eine Arylgruppe, eine Aralkylgruppe, eine Arylgruppe, dar, oder
    R2 und R3 miteinander kombiniert sind, unter Bildung eines kondensierten Ringes zusammen mit dem Pyridiniumring-Gerüst,
    X eine Gruppe, die von der durch die Formel VII dargestellten Verbindung durch Reaktion mit einem nukleophilen Reagens abgespalten wird, wie z. B. Halogenatome, die Sulfonyloxygruppe, oder Gruppen, dargestellt durch sind, worin
    R4 eine Alkylgruppe oder eine Arylgruppe darstellt,
    Y- stellt ein Anion dar, wie Halogenidionen, Sulfonationen, Schwefelsäureionen, ClO4 -, BF4 -, PF6 - und dergleichen,
    oder
  • h) Sulfonylaminopiperidinumsalze der Formel VIII in der
    R1 und R2 die gleichen Bedeutungen haben wie für R1 und R2 in der Formel I definiert, und
    R3 bedeutet eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 6 bis 15 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkylgruppe mit 7 bis 15 Kohlenstoffatomen,
    X- bedeutet ein Anion, wie Halogenidionen, Sulfonationen, Schwefelsäureionen, ClO4 -, BF4 -, PF6 - und dergleichen.
3. Gehärtete Reagenzschichten nach den Ansprüchen 1 und 2 enthaltend als Bindemittel Gelatine, Gelatinederivate, Casein und/oder Zein.
4. Gehärtete Reagenzschichten nach den Ansprüchen 1 bis 3 bei denen die Menge an Vernetzungsmittel 0,2 bis 40 Gew.-% bezogen auf das Gewicht des Bindemittels beträgt.
5. Gehärtete Reagenzschichten nach den Ansprüchen 1 bis 4 enthaltend Reagenzien aus der Gruppe Enzyme, Coenzyme, Effektoren, Indikatoren, Substrate, Antigene, Antikörper, Stabilisatoren, Netzmittel und Puffer.
6. Verwendung von gehärteten Reagenzschichten nach den Ansprüchen 1 bis 5 zur Herstellung von trockenchemischen Testmitteln.
7. Verfahren zur Herstellung von gehärteten Reagenzschichten gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß einer Gießlösung die ein Binde mittel enthält das Vernetzungsmittel zugesetzt wird und die resultierende Lösung zu einer Schicht vergossen und anschließend getrocknet wird.
8. Verfahren zur Herstellung von gehärteten Reagenzschichten gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet, daß man
  • a) eine Gießlösung die ein Bindemittel enthält zu einer Bindemittelschicht vergießt und
  • b) anschließend das Vernetzungsmittel in Form einer Lösung mit der Bindemittelschicht in Kontakt bringt um die Härtung durchzuführen.
9. Verfahren nach Anspruch 8 dadurch gekennzeichnet, daß die Bindemittelschicht mit einer 0,2 bis 5%igen Lösung des Vernetzungsmittels überschichtet wird.
10. Verfahren nach den Ansprüchen 7 bis 9 bei dem das Vernetzungsmittel als alkoholische, wäßrige oder wäßrig-alkoholishe Lösung angewendet wird.
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