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Stoffe der empirischen Summenformel
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C25H33N3O3S2 Die Erfindung betrifft einen wirkstoffhaltigen Extrakt,
ein Verfahren zur Weiterverarbeitung dieses Extrakts zu neuen Stoffen der empirischen
Summenformel C25E33N30382, diese Stoffe und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
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Die erfindungsgemäßen neuen Stoffe werden durch einen Stamm des Bacteriums
Myxococcus fulvus der Klasse Flexibacteriae, der Ordnung Myxobacterales und der
Familie Myxococcaceae produziert. Der Stamm wurde 1971 aus einer Bodenprobe von
Borobudur/Java isoliert. Er wurde als NCIB 12062 hinterlegt.
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Die vegetativen Zellen des Stamms sind schlanke Stäbchen (3,5 bis
6/um lang und 0,8 µm dick) mit leicht verjüngten Enden. Auf geeigneten Nährböden,
z.B. Wasseragar-Ausstrichen von Escherichia coli, bildet der Organismus rotbraune,
tropfenförmige, weichschleimige Fruchtkörper von etwa 200 nm Durchmesser. In diesen
Fruchtkörpern befinden sich kugelige, unter dem Phasenkontrastmikroskop stark lichtbrechende
Myxosporen mit einem Durchmesser von 1,2 bis 1,5/im. Das Bacterium bewegt sich gleitend
fort. Die Kolonien oder Schwärme breiten sich deshalb allmählich über die Kulturplatten
aus.
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Gehalt an Guanin + Cytosin der DNS: 70,4 Mol% Guanin + Cytosin (Tm
2 Schmelztemperatur) 69,5 Mol% Guanin + Cytosin CUZ = Ultrazentrifuge; vgl. Behrens,
Flossdorf & Reichenbach, Int. J. Syst. Bacteriol., 26 (1976) 561-562. Der Organismus
läßt sich unter submersen aeroben Bedingungen in einem C, N und S sowie Mineralsalze
enthaltenden wäßrigen Nährmedium bei 15 bis 40, vorzugsweise 25 bis 35, insbesondere
ca. 30 °C kultivieren. Der Organismus wächst gut auf Peptonagar, z.B.
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- cy-Agar: 0,3 S6 eines pankreatisch verdauten Kaseins (Pepton) (Difco/Detroit);
0,1 % Bäckerhefeextrakt (Difco); 0,1 % CaCl2.2H2O; 1,5 % Agar; oder - vy/2-Agar:
0,5 % bezogen auf Frischgewicht) Bäckerhefe; 0,1 % CaC12-2 H20; 1,5 9' Agar; pH
7,2.
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In Flüssigmedien wächst der Stamm in homogener Suspension sowohl in
Schüttelkolben (etwa 150 Umdrehungen/min) als auch in Fermentern (bis zu 200 1 getestet).
Als Medium eignet sich - eine Peptonlösung: 1 % trypisches Pepton aus Kasein (Merck);
0,3 % MgSO4.7 H2O; pH 7,2.
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Der Stamm ist streng aerob, hat aber keine hohe O2-Zehrung. Die Generationszeit
liegt bei etwa 7 h . Aus 10 1 Kultur kann man etwa 100 g Zellmasse erhalten (Beuchtgewicht
= etwa 25 g Trockengewicht). Der Stamm ist auf die Verwertung von Proteinen und
Peptonen eingestellt und besitzt eine Reihe von noch nicht charakterisierten Enzymen
zum Abbau anderer Mikroorganismen (Bakterien und Hefen).
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Der Stamm produsiert mindestens drei verschiedene Bacteriocine, Fulvocine
genannt. Diese werden ins Mediun abgegeben und wirken nur gegen nahe verwandte Bakterien;
vgl. Hirsch, durch, Microbiol. 115 (1977) 45 - 49. Zellfreie Kulturlösung
des
Stamms zeigt antibiotische Aktivität gegen grampositive Bakterien (z.B. Bacillus
subtilis und Staphylococcus aureus) sowie manche Pilze (z.B. Botrytis cinerea).
Der Stamm produziert mehrere chemisch verschiedenartige Antibiotika, wie verzweigte
Fettsäuren, Indolderivate, wie z.B. 3-Formylindol und die erfindungsgemäßen Stoffe.
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Der Stamm kann folgendermaßen konserviert werden: - Einfrieren vegetativer
Zellen von Platten- oder Blüssigkulturen in Peptonlösung bei - 80 - Trocknen von
Fruchtkörpern auf Filterpapier und Lagern bei Raumtemperatur; - Trocknen von Myxosporen
in Milch und Lagerung unter Stickstoff bei Raumtemperatur.
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In Kulturen, die sich in schlechtem Zustand befinden, werden die erfindungsgemäßen
Stoffe ins Medium ausgeschieden. Kennzeichen eines schlechten Zustands sind: Die
Bakterien befinden sich in der stationären Phase; alkalischer pil-Wert von etwa
8 bis 8,5; die Zellen sind mehr oder weniger undicht, so daß sie normalerweise intrazelluläre
Substanen verlieren; allmählicher Übergang zu Zell-Lyse.
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Wenn die kulturen in gutem Zustand sind, befinden sich die erfindungsgemäßen
Stoffe in den Zellen. Kennzeichen eines guten Zustands sind: Die Bakterien befinden
sich in der logarithmischen Wachstumsphase; die Zellen sind bei balanciertem StofitWechsel
völlig intakt und auf Wachstum programmiert.
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Die Ausbeuten aus Zellen sind höher als aus überstand, d.h.
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zellfreiem Medium; außerdem sind die effindungsgemaßen Stoffe leichter
bei der Gewinnung aus Zellen zu reinigen, als wenn man von zellfreiem Medium ausgeht.
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Die Produktion der erfindungsgemäßen Stoffe hängt mit dem Wachstum
zusammen, wobei sich keine spezifische Produktionsphase erkennen läßt. Jedoch kann
die Produktion der erfindungsgemäßen Stoffe trotz guten Wachstums abgeschwächt oder
unterdrückt sein, z.B. in Gegenwart von Hefeextrakt.
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Man kann einen wirkstoffhaltigen Extrakt mit u.a. einem Gehalt an
den erfindungsgemäßen Stoffen dadurch gewinnen, daß man a) Zellen von Myxococcus
fulvus NCIB 12062 oder b) Kulturflüssigkeit nach Abtrenung der Bakterienzellen mit
einem polaren organischen Lösungsmittel extrahiert und den Extrakt gewinnt.
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Als polare organische Lösungsmittel eignen sich bei der Arbeitsweise
a) Alkohole, wie Methanol, oder Ketone, wie Aceton, oder Xitrile, wie Acetonitril
oder. Propionitril, und bei der Arbeitsweise gemäß a) und. b) Ester, wie Methyl-
oder Äthylester von Essigsäure oder Propionsäure, oder CHC13 oder CH2C12.
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Die erfindungsgemäßen Stoffe besitzen die empirische Summenformel
C25H33N3O3S2, sind in Aceton, Methanol, Essigsäureäthylester und Acetonitril löslich
und besitzen Spektren mit folgenden Peaks: a) W in Isopropanol (lambda max. (log
epsilon)).: 227 (4,58), 307 (3,84); b) IR in Chloroform Cny (cm-1)): 3540, 3490,
3415 (stark), 3340 (breit), 2980, 2950 (Schulter), 2900 (Schulter), 2850 (Schulter),
1680 (stark), 1655 (Schulter), 1625 (stark), 1590 (stark); c) Massenspektrum (be.
22!) ° und 12 bzw. 70 eV): h+ = m/e 437; d) ¹H-NMr (3 mg/0,4 ml CDCl3 mit TMS),
# (ppm) (Multiplizität, Integral): 7,89 (s, 1), 7,14 (s, 1), 6,63 Cd, 1, A-Teil
eines ABX-Systems), 6,41 (dd, 1, B-Teil des ABX-Systems mit JB - 15
Hz
und JBX = 7 Hz, 6,26 bis 5,60 (m, 6, davon 2 H austauschbar), 4,97 (s, 1), 4,16
(Quintett,1), 3,96 (Quintett, 1), 3,82 (t, 1), 3,58 (s, 3), 3,35 (s, 3), 2,33 (m,
1), 1,54 Cd, 3), 1,17 (d, 3), 1,01 (d, 6); e ¹³C-NMR (15 mg/0,4 ml CDCl3 mit 0,3
ffi TMS), delta (ppm) (Multiplizität des Off-Resonanzspektrums): 176,3 (s), 171,9
(s), 169,4 (s), 162,6 (s), 154,5 (s), 149,0 (s), 142,4 (d), 132,6 (d), 131,9 (d),
131,4 (d), 126,6 (d), 126,0 (d), 115,6 (d), 115,3 (d), 94,3 (d), 85,2 (d), 56,8
(q), 55,1 (q), 41,3 (d), 39,7 (d), 31,1 (d), 22,3 (q), 20,9 (q), 14,4 (q).
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Das UV-Spektrum wird durch Zusatz von 2 n Natronlauge sowie 2 n Salzsäure
nicht verändert.
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Elementaranalyse gefunden berechnet C (%) 61,53 61,58 H (%) 7,09
6,82 N (%) 7,63 8,62 S (9') 10,84 13,12 Die empirische Summenformel folgt aus dem
Massenspektrogramm und der Elementaranalyse.
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Das ¹H-NMR-Spektrum wurde mit 3 mg Substanz und 0,4 ml Deuterochloroform
und 0,3 9' Tetramethylsilan als interner Standard durchgeführt. Das ¹³H-NMR-Spektrum
wurde mit 15 mg Substanz und 0,4 ml Deuterochloroform und 0,3 % Tetramethylsilan
als interner Standard in einem 5 ml-Rohr durchgeführt.
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Auf Grund von Doppelstrahl-Kernresonanz-Untersuchungen werden folgende
Teilstrukturen postuliert: Eine C9-trans-trans-Dien-Kette und eine weitere C5-Einheit:
Die erfindungsgemäßen Stoffe werden als Ol gewonnen und verhalten sich wie neutrale
Verbindungen.
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Die erfindungsgemäßen Stoffe lassen sich nach dem Chromatographieren
unter den folgenden Bedingungen durch zwei Fraktionen noch näher kennzeichnen: Säule
mit 800 g Kieselgel (32 bis 64,um), Länge 320 mm, Durchmesser 65 mm; 3 bar; 1 g
Extrakt von yxococcus fulvus-Zellen NCIB 12062 in Methylenchlorid/Isopropanol (90
: 10), 5 ml/min.
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Dabei weist die schneller eluierbare Fraktion folgendes CD-Spektrum
auf (Zirkulardichroismus; nm): 300 positive Elliptizität, 255 positives Maximum,
230 teta n 0, 220 positives Maximum; die langsamer eluierbare Fraktion weist folgendes
CD-Spektrum (nm) auf: 300 positive Elliptizität, 255 positives Maximum, 230 teta
n 0, 220 negatives Maximum.
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Beide Fraktionen unterscheiden sich nicht hinsichtlich der empirischen
Summenformel, der Löslichkeit in den angegebenen
Lösungsmitteln
und der Peaks der W-, IR-, Massenspektren-, und und 13C-NMR-Spektren.
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Wenn man jede der beiden angegebenen Fraktionen für sich unter den
angegebenen Bedingungen chromatographiert, erhält man jeweils wiederum zwel Fraktionen,
und zwar die schneller und die langsamer eluierbare Fraktion.
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Die erfindungsgemäßen Stoffe zeigen beim Plättchen-Test folgendes
Wirkungsspektrum (zum Plättchen-Test vgl. z.B.
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Drews, Mikrobiologisches Praktikum, 2. Aufl., Springer-Verlag 1974):
Testorganismus Hemmung a) Pilze Botrytis cinerea Tü 157 + Microsporum gypseum CBS
424.66 + Penicillium digitatum CBS 319.48 + Mucor hiemalis Tü + Geotrichula candidum
CBS 187.38 + Polyporus spec. + Phycomyces blakesleeanus + Rhizoctonia solani CBS
177.44 Alternaria brassicola CBS 106.41 Glicladium roseum b) Hefen Candida albicans
C3S 187.38 Schizosaccharomyces pombe Tü 501 c) Bakterien Bacillus subtilis ATCC
6051 + Staphylococcus aureus + Escherichia coli E 12 Pseudomonas sp.
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Minimale Hemmkonzentration (getestet in Flüssigkulturen mit weitgehend
gereinigtem Stamm): Mucor hiemalis 1,5 pg/ml
Staphylococcus aureus
50 Fg/ml und nur bis maximal 35 56 gehemmt Wirkungsmechanismus (untersucht an Sporen
von Mucor hiemalis): Die erfindungsgemäßen Stoffe wirken fungistatisch. Sie hemmen
sofort nach Zugabe (2 µg/ml) die Protein-, RNS- und Chitinsynthese, wie an dem abbrechenden
Einbau spezifischer Prekursoren in die Makromoleküle abgelesen werden kann. Auch
der Einbau von 14C aus Glucose bricht sofort ab. Der genaue Wirkungsort ist noch
nicht bekannt.
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Biosynthese: Wenn man Kulturen des Stammes NCIB 12062 mit radioaktiven
Substanzen füttert, so findet man in den gereinigten erfindungsgemäßen Stoffen Radioaktivität
aus 35S-Cystein, 14C-Isoleucin, 14C-Leucin eingebaut. Bei Fütterung mit 14c-Phenylalanin,
14C-Tyrosin, 14C-Mevalonat und 14C-Valin erfolgt kein Einbau.
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Nach einer ersten Verfahrensvariante lassen sich die erfindungsgemäßen
Stoffe dadurch gewinnen, daß man a) aus einem Kulturmedium von Myxococcus fulvus
NCIB 12062 die Zellmasse abtrennt, b) die abgetrennte Zellmasse mit einem polaren
organischen Lösungsmittel extrahiert, c) ein unpolares organisches Lösungsmittel
zugibt und ein Zweiphasen-Sgstem bildet und d) die Phase des polaren organischen
Lösungsmittels chromatographiert und das Laufmittel von den erfindungsgemäßen Stoffen
abtrennt.
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Als polares organisches Lösungsmittel kann man einen 1i1-kohol, z.B.
Methanol, ein Keton, z.B. Aceton, einen Ester z.B. Methyl- oder Äthylester von Essigsäure
oder Propionsäure, oder ein Nitril, z.B. Acetonitril oder Propionitril, und als
unpolares organisches Lösungsmittel einen bei Raumtemperatur flussigen aliphatischen
oder aromatischen Kohlenwasserstoff,
z.B. einen C520-Kohlenwasserstoff,
verwenden.
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k kann dabei so vorgehen, daß man a) aus dem Kulturmedium die Zellmasse
abtrennt, b) die abgetrennte Zellmasse mit Aceton oder Methanol extrahiert, c) den
erhaltenen Extrakt einengt, d) den eingeengten Extrakt mit Essigsäureäthylester
aufnimmt und mit Methanol versetzt, e) den Niederschlag abtrennt und gegebenenfalls
mehrmals mit Methanol wäscht, f) die methanolische Fraktion bzw. Fraktionen zwischen
Acetonitril und einem Alkan verteilt, g) die Acetonitrilphase abtrennt, einengt
und chromatographiert und h) eine Fraktion mit einem Gehalt an erfindungsgemäßen
Stoffen gewinnt, von der man das Laufmittel abtrennt.
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3ei einer zweiten Verfahrensvariante kann man die erfindungsgemäßen
Stoffe dadurch gewinnen, daß man a) aus dem Kulturmedium von mrxococcus fulvus NCIB
12062 die Zellmasse abtrennt, b) die abgetrennte Zellmasse mit einem polaren organischen
Lösungsmittel extrahiert, c) den erhaltenen Extrakt einengt und mit einem unpolaren
organischen Lösungsmittel aufnimmt, d) die erhaltenc Lösung mit Aktivkohle versetzt
und die Aktivkohle von dem unpolaren organischen Lösungsmittel abtrennt, e) die
Aktivkohle mit einem polaren organischen Lösungsmittel auswäscht und f) die erhaltene
Lösung chromatographiert und das Laufmittel von den erfindungsgemäßen Stoffen abtrennt.
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Als polares organischen Lösungsmittel kann man dabei ein Keton, z.B.
Aceton, und als unpolares organisches Lösung mittel einen bei Raumtemperatur flüssigen
aliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoff, z.B. einen C5 20-lÇohlenwasserstoff,
verwenden.
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Man kann dabei so vorgehen, daß man a) aus dem Kulturmedium die Zellmasse
abtrennt, b) die abgetrennte Zellmasse mit Aceton extrahiert, c) den erhaltenen
Extrakt einengt, d) den eingeengten Extrakt in Chloroform aufnimmt, die gebildete
wäßrige Phase verwirft und die Chloroformphase trocknet, e) die getrocknete Chloroformphase
einengt, f) den Rückstand in einem Alkan aufnimmt, g) die Alkanlösung mit Aktivkohle
versetzt, h) die Aktivkohle über Kieselgel von dem Alkan abfiltriert und gegebenenfalls
mehrmals mit dem Alkan wäscht, i) die Aktivkohle auf dem Kieselgel mit Dichlormethan
auswäscht, j) an dem Kieselgel gegebenenfalls mehrmals chromatographiert und k)
eine Fraktion mit einem Gehalt an erfindungsgemäßen Stoffen gewinnt, von der man
das Laufmittel abtrennt.
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Bei beiden Verfahrensvarianten kann man das Einengen bei einer Temperatur
von bis zu 60 °C, vorzugsweise bis zu 40 0C und vorzugsweise unter reduziertem Druck
vornehmen und/oder pentan, n-Hexan oder n-Heptan als Alkan verwenden und/oder an
Kieselgel chromatographieren.
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Sofern man bei den Verfahren zur Gewinming der erfindungsgemäßen Stoffe
nicht von Zellen, sondern von zellfreiem Medium ausgeht, kann man das zellfreie
Medium mit einem mit Wasser nicht mischbaren polaren organischen Lösung mittel extrahieren,
z.B. mit einem Carbonsäureester, wie Essigsäureäthylester, und den Extrakt danach
in die Stufe c) einsetzen.
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Nachstehend wird die Erfindung durch Beispiele näher erläutert.
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Beispiel 1. Vermehrung Es wurde ein 50 l-Fermenter (Giovanola, Manthey/Schweiz)
mit einem Arbeitsvolumen von 70 1: verwendet. Das eingesetzte Medium enthielt 1
9/o tryptisches Pepton aus Kasein (Merck), 0,3 % MgS04-7 H20 und 0,03 % eines oberflächenaktiven
Mittels (Antischaum Umlub Lb 625 von Brenntag, Mülheim/Ruhr) bei einem pH von 7,2
und Autoklavierung.
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Das eingesetzte Animpfvolumen betrug 7 1 von Schüttelkulturen (entsprechend
3 x 108 Zellen/ml). Die Temperatur betrug 30 °C. Die Flüssigkeit wurde mit 500 Umdrehungen/min
in einem Ki:)nwexionsstrom bewegt (Umwurf). Man belüftete bis zur 13. h mit 1 Nl/min
1 Kulturvolumen und danach mit 1,7 Nl/min 1 Kulturvolumen. Der P02 fiel innerhalb
von 10 h gegen G ab und wurde danach niedrig gehalten. Der Ausgangs-pH-Wert von
7,2 stieg während des Wachstums auf 7,5 an und wurde durch Gegentitrieren mit Essigsäure
bei diesem Wert gehalten. Die Gesamtfermentationsdauer betrug 30 h. Aus den abzentrifugierten
Zellen wurden 2 bis 3 mg erfindungsgemäße Stoffe pro 1 1 Kultur gewonnen. Der Überstand
war unter diesen Bedingungen praktisch frei von erfindungsgemäßen Stoffen.
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Beispiel 2 Die mit einer Durchlaufzentrifuge vom Nährmedium des Beispiels
1 getrennte rote Zellmasse wurde mit Aceton (oder Methanol in einem Parallelversuch)bis
zur Entfärbung exextrahiert. Der eingeengte Extrakt wurde in wenig Essigsäureäthylester
gelöst und mit Methanol versetzt. Die daraufhin ausfallenden unpolaren Substanzen
wurden abgenutscht und mehrmals mit Methanol gewaschen. Die eingeengte methanolische
Lösung wurde nun zwischen Acetonitril und n-Heptan verteilt, wobei die restlichen
unpolaren Substanzen in die Alkanphase übergingen. Danach wurde die Acetonitrilphase
eingeengt. Sie enthielt die erfindungsgemäßen Stoffe.
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Zur Reindarstellung wurde 1:iber eine Kieselgelsäule mit einer Länge
von 320 mm und einem Durchmesser von 65 mm mit einer Dosierpumpe bei 3 bar chromatographiert,
wobei die Kieselgelsäule 800 g Kieselgel einer Teilchengröße von 32.bis 64 enthielt
(Riedel de Haen). Dazu wurde 1 g eingeengter Zellextrakt im Laufmittel Methylenchlorid/Isopropanol
(10 : 1; nachdestillierte pa Lösungsmittel von Merck/Darmstad;t) mit einer Durchflußrate
von 5 ml/min chromatographiert. Mit einem selbstregistrierenden Durchfluß-UV-Spektrographen
(bei 254 nm) wurden die erfindungsgemäßen Stoffe nach 2,5 h im Auslauf ermittelt.
Es erschienen zwei Fraktionen, die mit einer Retentionszeitdifferenz von 20 min
eluiert wurden.
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Die eingeengten Fraktionen erhielten zusammen 15 mg Substanz.
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In der folgenden Zusammenstellung sind die RF-Werte der erfindungsgemäßen
Stoffe in verschiedenen Laufmittelsgstemen angegeben. Die Werte gelten für Dünnschichtchromatographie-Alufolien
mit Kieselgel einer Schichtdicke von 0,2 mm (60 F254 Merck/Darmstadt).
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RF-Werte der erfindungsgemäßen Stoffe in verschiedenen Laufmitteln
(Kammern mit Laufmittel gesättigt, Laufhöhe 10 cm) RF-Werte Laufmittelsystem 0,26
Dichlormethan/Isopropanol (95 : 5) 0,29 Essigsäureäthylester 0,32 Toluol/Dioxan/Eisessig
(30 : 10 : 1) Die sehr stark Fluoreszenz löschenden Flecke der erfindungsgemäßen
Stoffe lassen sich durch Ansprühen mit Molybdatophosphorsäure und anschließendes
Erhitzen auf 150 0C schwach sichtbar machen. Ebenfalls schwach reagieren die erfindungsgemäßen
Stoffe mit Benzidin nach vorgehender Behandlung mit Chlor. Die Jodazid-Stärke-Reaktion
ist positiv.
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Beispiel 3 Der Inhalt eines 8 l-Fermenters wurde folgendermaßen aufgearbeitet.
Die vom Nährmedium abzentrifugierten Zellen wurden bis zur Entfärbung mit etwa 2
1 Aceton extrahiert.
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Der Acetonextrakt wurde im Wasserstrahlvakuum bei etwa 40°C so weit
eingeengt, bis sich Carotinoide und andere Substanzen am Kolbenrand abzusetzen begangen.
Zur Abtrennung von Wasser wurde nunmehr in etwa 500 ml Chloroform aufgenommen, die
Wasserphase im Scheidetrichter abgetrennt und die Chloroformphase über Natriumsulfat
getrocknet. Das Lösungsmittel wurde erneut im Rotationsverdampfer bei etwa 40°C
abdestilliert; der Rückstand wurde in etwa 200 ml n-Heptan aufgenommen; in Parallelversuchen
wurd n-Pentan und n-Hexan verwendet. Die n-Alkanphase wurde nun mit so viel Aktivkohle
(2186 zur Analyse, Merck) versetzt, daß die vorher rötlich gefärbte Lösung farblos
bis blaß gelbgrünlich aussah. Danach wurde die Aktivkohle über einer Kieselgelsäule
CHöhe 50 mm, Durchmesser 15 mm) von der überstehenden Lösung abfiltriert. Man wusch
noch dreimal mit 50 ml-Portionen des verwendeten n-Alkans. Die Filtration ließ sich
beschleunigen, wenr man einen Überdruck auf die Säule anlegte.
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Danach wurden die erfindungsgemäßen Stoffe mit etwa 50 ml Dichlormethan
aus der Aktivkohle auf das Kieselgel gewaschen.
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Anschließend wurde nochmals Dichlormethan verwendet, bis das Kieselgel
von shratlichen gelben Zonen entfärbt war (Chromatographie). Auf diese Weise wurden
alle unpolareren Stoffe als die erfindungsgemäßen Stoffe herausgewaschen, da die
Stoffe gemaß der Erfindung bei dieser Polarität auf Kieselgel festgehalten werden
und nicht wandern. Anschließend wurde Dichlormethan/i-Propanol C95 : 5) auf die
Säule aufgegeben, so daß eine gelbbräunliche Zone mit einem Gehalt an den erfindungsgemäßen
Stoffe wanderte. (Wenn zuvor zuwenig Aktivkohle verwendet wurde, war diese Zone
infolge eines Gehalts an Carotinoiden rotbräunlich gefärbt.) Nach Einengen der gefärbten
Zone erhielt man 400 mg Rohprodukt, das etwa 25 mg der erfindungsgemäßen Stoffe
enthielt.
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Das Rohprodukt ließ sich gemäß Beispiel 2 feinreinigen.
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Allgemein läßt sich sagen, daß sich die erfindungsgemäßen Stoffe mit
der Fluoreszenz löschenden Bande bei 254 nm identifizieren lassen. Damit läßt sich
die Wirksamkeit von Maßnahmen zur Gewinnung dieser Stoffe ohne weiteres beurteilen.