DE3514659A1

DE3514659A1 - Antioxidans

Info

Publication number: DE3514659A1
Application number: DE19853514659
Authority: DE
Inventors: Norihiro Machida Tokio/Tokyo Kakimoto; Kohei Tokio/Tokyo Miyao; Mitsuo Namiki; Toshihiko Nagoya Aichi Osawa
Original assignee: Asai Germanium Research Institute Co Ltd
Current assignee: Asai Germanium Research Institute Co Ltd
Priority date: 1984-04-25
Filing date: 1985-04-23
Publication date: 1985-10-31
Also published as: GB2158070A; DE3514659C2; GB8509822D0; CH663030A5; JPS60226592A; FR2563528B1; US4720564A; GB2158070B; JPS6218590B2; US5071873A; FR2563528A1

Description

ASAl GERMANIUM RESEARCH INSTITUTE Tokio (Japan)

Antioxidans

Die Erfindung betrifft ein neuartiges Antioxidans, das als Wirkstoff eine 0rgan6gerraaniumverbindung enthält.

Der Sauerstoff ist zwar für den Menschen und allgemein für alle aeroben Lebewesen lebenswichtig, kann aber bekanntlich auch verschiedene unerwünschten Wirkungen haben. Beispielsweise erfährt in Nahrungsmitteln enthaltenes Fett oder öl durch den Luftsauerstoff eine Autooxidation, durch die der Geschmack und der Nährwert des Nahrungsmittels herabgesetzt wird und infolge der Bildung von Peroxiden toxische Substanzen erzeugt werden. Ferner ist seit einiger Zeit erkannt worden, daß die Bildung von Peroxiden in Lebewesen zu deren Alterung beiträgt und kanzerogene und andere unerwünschte Wirkungen hat.

Beispielsweise wird angenommen, daß die ungesättigten Fettsäuren, beispielsweise die mehrfach ungesättigten Fettsäuren, die wegen der Bildung von Phospholipiden

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oder dergleichen von großer Bedeutung sind und als essentielle Fettsäuren einen unentbehrlichen Nahrungsbestandteil bilden, der Autooxidation durch ein freies Radikal des Sauerstoffes oder eines Oxidationsmittels unterliegen, wobei in einer Radikalkettenreaktion die als "Hydroperoxide" bezeichneten Peroxylipide gebildet werden, und daß diese Hydroperoxide und Produkte, die durch die oxidative Zerstörung von während der Autooxidation erzeugten Endoperoxiden gebildet werden, beispielsweise das Malonaldehyd, auf die DNS, die RNS, Eiweißstoffe oder Zellwandgewebe einwirken und dadurch zu den vorgenannten Krankheiten beitragen.

Das Antineoplastikum Anthracyclin ist eines der zur Behandlung von Karzinomen verwendeten Chemotherapeutika und enthält das Adriamycin, das bekanntlich ein besonders breites antineoplastisches Wirkungsspektrum besitzt, von dem jedoch einige Nebenwirkungen berichtet worden sind. Es ist ferner berichtet worden, daß die Kardiotoxizität, die eine der Nebenwirkungen darstellt, durch die Peroxidation von Lipiden mit freien Radikalen in Form des Superoxidanions 0 *") , des Hydroxyls (ÖH) , des im Singulettzustand befindlichen Sauerstoffs (¹O₂) oder dergl. verursacht wird, die von der Chinonstruktur abgeleitet sind, die in der chemischen Struktur des Adriamycins enthalten ist (Edward G. Mimnaugh et al, The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Band 226, Nr. 3, 806, 1983).

Es sind schon zahlreiche Anstrengungen unternommen worden, die vorstehend erläuterte Autooxidation zu verhindern. Derzeit sind synthetische Antioxidantien auf Phenolbasis bekannt, beispielsweise das Butylhydroxyanisol (BHA) und das Butylhydroxytoluol (BHT), sowie natürliche

Antioxidantien, wie das Tocopherol. Das erstgenannte dieser Antioxidantien wird sehr viel angewendet.

Die genannten synthetischen Antioxidantien haben den Nachteil, daß sie nicht ungefährlich sind. Beispielsweise führt das BHA häufig zu Leberstörungen. Andererseits haben die natürlichen Antioxidantien Nachteile hinsichtlich der Verfügbarkeit der Ausgangsstoffe, der Wirksamkeit und der Kosten. Einige der Erfinder der vorliegenden Erfindung haben sich daher bemüht, andere wirksame Antioxidantien als das Tocopherol zu entdecken. Dabei ist es ihnen gelungen, ein wirksames und ungefährliches natürliches Antioxidans zu entwickeln, das als Wirkstoff das in dem Blattwachs des Eukalyptus enthaltene n-Tritriacontan-16,18-dion enthält (JP-AS 57-26744). Es besteht ferner ein Bedürfnis nach wirksamen, aber ungefährlichen synthetischen Antioxidantien.

Das unter diesen Gesichtspunkten entwickelte Antioxidans gemäß der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß es eine Organogermaniumverbindung der allgemeinen Formel

Ge - C - CH - COY (I)

enthält, in der R-, R2 und R₃ jeweils ein Wasserstoffatom, eine substituierte oder nxchtsubstituxerte Phenylgruppe oder eine Alkylgruppe bedeuten, Y eine Hydroxyl- oder eine Aminogruppe und Z ein Sauerstoff- oder Schwefelatom bedeutet.

35H659

Aus den beigefügten Zeichnungen geht die Antioxidationswirkung der Antioxidantien gemäß der Erfindung hervor. Dabei zeigt

Figur 1 die Ergebnisse von Versuchen mit Zellwandstücken von Erythrozyten und

Figur 2 das Ergebnis von Versuchen mit Rattenlebermikrοsomen, und zwar in Figur 2(a) bei Verwendung von ADP-Fe und in Figur 2(b) bei Verwendung von Adriamycin.

Das Antioxidans gemäß der vorliegenden Erfindung enthält eine Organogerraaniumverbindung der allgemeinen Formel (1). In dieser sind die Substituenten R-, R₂ und R₃ jeweils ein Wasserstoffatom, eine substituierte oder nichtsubstituierte Phenylgruppe oder eine Alkyl-, beispielsweise Methyl- oder Ethylgruppe, und ist der Substituent Y eine Hydroxyl- oder eine Aminogruppe.

Der Substituent Z ist ein Sauerstoff- oder Schwefelatom, Wenn daher Z=O ist, ist die Organogermaniumverbindung der allgemeinen Formel (I) ein Sesquioxid, in dem die Hauptstrukturen und die Sauerstoffatome miteinander im Verhältnis 2:3 verbunden sind. Wenn dagegen Z=S ist, stellt die Formel ein Sesquisulfid dar, in dem die Hauptstrukturen und die Schwefelatome miteinander im Verhältnis von 2:3 verbunden sind.

Die gemäß der Erfindung verwendeten Organogermaniumverbindungen werden zweckmäßig in der üblichen Weise durch die allgemeine Formel (I) dargestellt. Dabei ist die Organogermaniumverbindung ein großes Molekül, in dem die Grundstrukturen und die Sauerstoff- oder Schwefelatome miteinander im Verhältnis von 2:3 miteinander ver-

-0 "

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bunden sind. Daher wird die Struktur dieser Organogermaniumverbindung durch die allgemeine Formel (I) nicht genau dargestellt. Man kann die genannte Organogermaniumverbindung auch durch die allgemeine Formel

ζ	R	1	CH	2
Ti	13		1
Ge	— C		R
I	I
Z	R
i

- COY

(Γ)

oder durch die allgemeine Formel

R 13 C I «1

CH

- COY

2n^Z3n

darstellen.

Man kann die vorgenannten Organogermaniumverbindungen nach verschiedenen Verfahren erzeugen.

Beispielsweise kann man das Sesguioxid der allgemeinen Formel (I)/ in der Z ein Sauerstoffatom und Y eine Hydroxylgruppe ist, in einem Verfahren erzeugen, in dem Trichlorgerman

Cl₃GeH

(ID

mit einem Acrylsäurederivat

■?■■ ;.::.·,.= w--T^v- ■

C=C- COOH

I 1

R₁ R₂

zu einem Derivat der Trichlorgeriaylpropionsäure

Ϊ3

CIqGe - C- CH - COOH (IV)

\ ^R2

umgesetzt und dieses hydrolysiert wird, oder in einem Verfahren, in dem das vorgenannte Trichlorgerman (II) mit einem Acrylnitrilderivat

«3

C = C -CN (_In.)

^R2

zu einem Trichlorgermylpropionitrilderivat

13

Cl3Ge - C-CH-CN (IV)

I I
Rl R₂

umgesetzt und dieses hydrolysiert wird.

Das Sesquisulfid der allgemeinen Formel (I), in der Z ein Schwefelatom und Y eine Hydroxylgruppe ist, kann in einem Verfahren erzeugt werden, in dem das vorgenannte Trichlorgermylpropionsäurederivat (IV) in einem wasserfreien Lösungsmittel aufgelöst und durch die Lösung in Gegenwart von wasserfreiem Pyridin trockener Schwefelwasserstoff geführt wird.

Die Verbindung der allgemeinen Formel (I), in der Y NH~ ist, kann beispielsweise in einem Verfahren erzeugt werden, in dem das Trichlorgermylpropionsaurederivat (IV) mit einem Halogeniermittel zu dem entsprechenden Acylhalogenid umgesetzt und dieses mit Ammoniak behandelt wird, worauf das Produkt hydrolysiert oder trockener Schwefelwasserstoff hindurchgeführt wird.

Es wird angenommen, daß bei der Erzeugung des Sesquioxids oder Sesquisulfids von einem zunächst gebildeten Zwischenprodukt (V)

ZH Ι*., I I³

HZ - Ge - C - CH - COOH (V)

I t i

ZH R₁ R₂

ZH₂ intermolekular abgespaltet und dadurch die Organogermaniumverbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten wird.

Die in der vorstehend angegebenen Weise synthetisch erzeugte Organogermaniumverbindung wurde in lebenden Organismen auf ihre Antioxidationswirkung geprüft. Dabei wurde ein System angewendet, das dem in vitro angewendeten ähnelte.

35H6

Die durch das t.Butylhydroperoxid verursachte Peroxidation wurde in einem System quantitativ bestimmt, das Zellwandstücke von Erythrozyten enthielt. Die von NAD(P) abhängige Peroxidation durch ADP-Fe³⁺, freie Sauerstoffradikale, Wasserstoffperoxid und freie Hydroxylradikale wurde in einem System P-450 mit Rattenlebermikrosomen quantitativ bestimmt. Ferner wurde die durch das vorgenannte Adriamycin verursachte Peroxidation quantitativ bestimmt. Aus den Ergebnissen dieser Versuche geht hervor, daß das Antioxidans gemäß der Erfindung eine ausgezeichnete Antioxidationswirkung hat, die der des vorgenannten Tocopherols ähnelt.

Nachstehend werden Ausführungsbeispiele der Erfindung beschrieben.

Beispiel 1 - Synthese der Organogermaniumverbindung der allgemeinen Formel (I)

Versuch 1: Sesquioxid der 2-Methyl-3-Germy!propionsäure (Verbindung 1)

84,7 ml (0,1 Mol) Methacrylsäure wurden 5 Minuten lang zu 18 g (0,1 Mol) rohem Trichlorgerman zugetropft, das in einem Eisbad auf 5° C gekühlt worden war. Das Gemisch wurde bei derselben Temperatur eine Stunde lang und dann bei Zimmertemperatur 1,5 Stunden lang gerührt. Die ausgefällten Kristalle wurden abgenutscht, mit jeweils 10 ml über Kaliumchlorid getrocknetem η-Hexan viermal gewaschen, im Vakuum getrocknet und dann eine Stunde lang in einem Phosphorpentoxid enthaltenden Exsikkator auf 65° C gehalten, wobei der Druck mittels einer Vakuumpumpe herabgesetzt wurde, die eine Kaliumhydroxid enthaltende Kühlfalle besaß. Es wurden 17,03 g kristalline 2-Methyl-3-(trichlorgermyl)propionsäure erhalten.

- 35Η659

IR-Spektrum (KBr, cm"¹): 2950-3600, 1690, 1265, 580, 550,

Schmelzpunkt 54-55° C
IR-Spektrum (KBr, cm~

NMR-Spektrum (CDCl₃,cT): 1,46 (3H, d), 2,33 (2H, dd), 3,03

(1H,£), 10,13 (1,H, s)

Elementaranlyse

Berechnet: C18,O5, H 2,63, Cl 40,00 Gefunden: C18,12, H 2,70, Cl 39,97

Zu 2 g (0,0075 Mol) wie vorstehend angegeben erzeugter 2-Methyl-3-(trichlorgermyl)propionsäure wurden 10 ml reines Wasser zugesetzt. Dabei wurde die Verbindung vollständig aufgelöst und erwärmte sich die Lösung auf 25° C. Nach 2 Minuten wurde die Lösung trübe und setzte ein Ausfällen von Kristallen ein. Zum vollständigen Ausfällen der Kristalle wurde die Lösung auf 85° C erwärmt und eine Stunde lang auf dieser Temperatur gehalten. Die Kristalle wurden abfiltriert und mit 10 ml reinem Wasser, dann mit 10 ml 99,5%igem Ethanol und dann mit 10 ml Ether gewaschen und danach im Vakuum getrocknet. Es wurde 0,638 g kristallines Sesguioxids der 2-Methyl-3-Germy!propionsäure erhalten (Ausbeute 86,3 %) .

^rGe - CH₂ - CH - COOH
CH₃

Sesquioxid der 2-Methyl-3-Germylpropionsäure (Verbindung 1)

IR-Spektrum (KBr, cm~¹): 3420, 1705, 1245, 900, 802 NMR-Spektrura (D₃O,ti) : 1,30 (3H, d) , 168 (2H, dd), 2,93 (1H, m)

35U659

Elementaranalyse

Berechnet: C 26,16, H 3,84
Gefunden: C 25,52, H 4,08

Versuch 2: Sesquioxid des 2-Methy1-3-germylpropionamids (Verbindung 7)

Zu 26,6 g (0,1 Mol) der im Versuch (1) erzeugten 2-Methyl-3-(trichlorgermyl)propionsäure wurden 100 ml Thinylchlorid zugesetzt. Das Gemisch wurde 10 Stunden lang unter Rückfluß gekocht und zum Entfernen von überschüssigem Thionylchlorid vakuumdestilliert. 25,1 g des entsprechenden Säurechlorids wurden als eine farblose durchsichtige Substanz mit einem Siedepunkt von 101 bis 101,5° C bei 800 Pa erhalten (Ausbeute 88 %).

5.69 g (0,02 Mol) dieses Chlorids wurden in 150 ml wasserfreiem Benzol aufgelöst. In diese mit einem Eisbad gekühlte Lösung wurde eine Stunde lang trockenes Ammoniak eingeleitet und danach eine Stunde lang gasförmiger Chlorwasserstoff. Nach dem Zusatz von 100 ml Methylacetat zu der Lösung wurde das Gemisch gerührt und filtriert. Das Filtrat wurde destilliert und durch Umkristallisieren des erhaltenen Rückstandes aus einem Gemisch von Aceton und Benzol (1:2) wurden 5 g des entsprechenden Amids erhalten (Ausbeute 79,8 %).

5.70 g (0,02 Mol)dieses Amids wurden nach einem üblichen Verfahren zur Hydrolyse nur der Germanium-Chlor-Bindungen behandelt. Dabei wurden 3,01 g der gewünschten Verbindung (Ausbeute 79,8 %) mit den nachstehenden Kennwerten erhalten.

/Ge - CH₂ - CH - CON CH₃

Sesguioxid des 2 -Methy 1-3 -Germylpropionamids (Verbindung 7) IR-Spektrum (KBr, cm"¹): 1660, 900, 800

Elementaranalyse

Berechnet: Ge 39,73, C 26,30, H 4,41, N 7,67 Gefunden: Ge 39,52, C 26,37, H 4,39, N 7,61

Differentialthermoanalyse

Maximum der endothermen Abkühlung bei 246° C Maximum der exothermen Erwärmung bei 315° C.

Zu den Verbindungen der allgemeinen Formel (I), in denen Z = 0 ist, gehören die vorstehend angegebenen Verbindungen 1 und 7 und die nachstehend angegebenen Verbindungen 2 bis 6 und 8 bis 12, die ähnlich wie vorstehend angegeben erzeugt werden können und die in der Tabelle angegebenen Kennwerte besitzen.

35ΊΑ659

_fGe - CH - CH- - COOH \

CH.

2°3

Ge - CH - CH - COOH

I I
CH, CH,

(3)

CH,

'Ge-C- CH₂ - COOH
CH,

2°3

(4)

.Ge - CH - CH₂ - COOH'

2°3

(5)

,Ge - CH - CH - COOH

2°3

(6)

- CH - CH₂ - CONH₂
CH₃

Ge - CH - CH - C0NH₂>

2°3

(9)

35Η659

«3

Ge-C- CH-, - CONH.

CH,

(10)

Ge-CH- CH₂ - CONH₂,

2°3 (11)

Ge - CH - CH - CONH. I CH,

'2°3 (12)

» f* I* ■

-K-

35U659.

Elementaranalyse

Berechnet Gefunden

Tabelle (1)

Verbindung

Ge

Schmelzpunkt, C

IR (KBr, cm"¹)

39,52	36,72	36,72	29,54	27,94
39,45	36,60	36,66	29,55	27,99
26,16	30,37	30,37	43,99	46,23
25,73	30,39	30,37	44,01	46,21
1,84	4,59	4,59	3^69	4,27
4,02	4,58	4,55	3,61	4,27
184	228	230	200	200
(Zs.)	(Zs.)	(Zs.)	(Zs.)	(Zs.)
1700	1715	1690	1710	1710
900	880	895	880	880
800	880	795	700	700

NMR ((T)

(Lösungsmittel)

Ausbeute, %

D₂O	D₂O	D₂O	D₂O	D₂O
1,23 (3H,d)	1 ,20 (3H,d)	1,30 (6H,s)	3,00 (2H,d) H, S)	1,15 (5H,m) (3H,m)
2,05	1,30 (3H,d)	2,55 (2H,s)	3,35 /1 TT J. \ V ' '**/ ^^- /	3,20 (2H,d)
2,67 (2H,dd)	2,10		7,35 (5H,m)	7,30 (5H,m)

98,0

2,90

84,7

65,8

84,5

86,6

-*«- 35Η659

Versuch 3: Sesquisulfid der 2-Methyl-3-germylpropionsäure (Verbindung 15)

5,3 g (0,02 Mol) 2-Methyl-3-(trichlorgermyl) propionsäure wurden in 100 ml wasserfreiem Benzol aufgelöst. Zu der mit einem Eisbad gekühlten Lösung wurden 5,2 g (0,066 Mol) wasserfreies Pyridin zugesetzt. Danach wurde das Gemisch gerührt. Eine Stunde lang wurde trockener Schwefelwasserstoff in das Gemisch eingeleitet. Das Benzol wurde entfernt und der Rückstand in 30 ml Methanol aufgelöst. Die Lösung wurde zu 100 ml abgekühltem Wasser zugesetzt und das Gemisch zum Ausfällen von Kristallen 2 Stunden lang gerührt. Durch Umkristallisieren der Kristalle aus einem Gemisch von Methanol und Wasser (1:1) wurden 3,9 g kristallines Sesquisulfid der 2-säure erhalten (Ausbeute 93 %).

[Ge - CH₂ - CH - COOH¹
CH₃

Sesquisulfid der 2-Methyl-3-Germylpropionsäure (Verbindung 15)

IR-Spektrum (KBr, cm"¹): 3450, 1705, 1245, 425

NMR-Spektrum (CD₃OD, £ ): 1,38 (3H,d) , 2,03 (2H, m) , 2,94 (1H,m)

ElementaranaIyse

Berechnet: Ge 34,94, C 23,13, H 3,40, S 23,15 Gefunden: Ge 35,79, C 23,39, H 3,45, S 22,96

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Versuch 4: Sesquisulfid der 3-Pheny1-3-Germy!propionsäure (Verbindung 18)

16,4 g (0,05 Mol) 3-Phenyl-3-(trichlorgermyl)-propionsäure wurden in 200 ml wasserfreiem Aceton aufgelöst. Zu der mit einem Eisbad gekühlten Lösung wurden 12,6 g (0,16 Mol) wasserfreies Pyridin zugesetzt. Danach wurde das Gemisch gerührt. Eine Stunde lang wurde trockener Schwefelwasserstoff in das Gemisch eingeleitet. Das Aceton wurde entfernt und der Rückstand in 50 ml Ethanol aufgelöst. Zum Ausfällen von Kristallen wurde die Lösung zu 400 ml Wasser zugesetzt. Durch Umkristallisieren der Kristalle aus einem Gemisch von Methylacetat und Benzol (1:3) wurden 12,7 g kristallines Sesquisulfid der 3-Phenyl-3-Germylpropionsäure erhalten.

Ge — CH - CH₂ - COOH

Sesquisulfid der 3-Pheny1-3-Germy!propionsäure (Verbindung 18) IR-Spektrum (KBr, cm"¹): 3450, 1710, 1600, 1410, 1230, 700, NMR-Spektrum (Aceton -d_g, c^): 3,05 (2H,d), 3,62 (1H,t) ,

7,23 (5H, m)

Elementaranalyse

Berechnet: Ge 26,90, C 40,06, H 3,36, S 17,82 Gefunden: Ge 26,92, C 39,83, H 3,41, S 17,64

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Versuch 5: Sesquisulfid des 2-Methyl-3-Germyl-3-methylpropionamids (Verbindung 23)

28,0 g (0,1 Mol) 2-Methyl-3-(trichlormethyl)buttersäure wurden mit 100 ml Thionylchlorid behandelt. Durch Vakuumdestillation des Reaktionsgemisches wurden 27,0 g 2-Methyl-3-(trichlorgermyl)butanoylchlorid in Form einer blaßgelben Substanz mit einer Siedetemperatur von 99 bis 100° C bei 800 Pa erhalten (Ausbeute 90,4 %).

5,8 g (0,02 Mol) dieses Chlorids wurden in 50 ml wasserfreiem Benzol aufgelöst. In die mit einem Eisbad gekühlte Lösung wurde eine Stunde lang trockenes Ammoniak und dann eine Stunde lang gasförmiger Chlorwasserstoff eingeleitet. Dann wurden 100 ml Methylacetat zugesetzt und wurde das Gemisch gerührt und filtriert. Der beim Destillieren des Filtrates erhaltene Rückstand wurde aus einem Gemisch aus Aceton und Benzol (1:2) umkristallisiert. Es wurden 4,1 g 2-Methyl-3-(trichlorgermyl)butanamid erhalten (Ausbeute 76,0 %)

10,8 g (0,04 Mol) dieses 2-Methyl-3-(trichlorgermyl)-butanamids wurden in 200 ml wasserfreiem Benzol aufgelöst. Der Lösung wurden 9,5 g (0,12 Mol) wasserfreies Pyridin zugesetzt. Das Gemisch wurde gerührt. Eine Stunde lang wurde trockener gasförmiger Schwefelwasserstoff durch die Lösung geblasen. Die ausgefällte Verbindung wurde abgetrennt und gereinigt, entweder durch Umkristallisieren aus wässrigem Aceton oder durch Abtrennen mit Hilfe von Molekularsieben wie Sephadex LH-20 (Handelsname) unter Verwendung von Methanol als Entwickler. Es wurden 7,8 g der gewünschten Verbindung erhalten (Ausbeute 88,3 %).

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Sesquisulfid des 2-Methyl-3-Germyl-3-methylpropionamids (Verbindung 23)

- CH - CH - CONH
CH₃ M

Schmelzpunkt: 205° C (Zs.)

IR (KBr, cm""¹); 3400, 3200, 2960, 1660, 1460, 1400, 780, 570,

NMR (CD₃OD, ζ ): 1,30 (3H, d, CO-CH-CH)

1 ,38 (3H, d, Ge-CH-CH)

2,14 (1H, m, Ge-CH)

2,27 (1H, ra, CO-CH)

2,70 (2H, d, NH₂)

Elementaranalyse

	Ge	87	C	,20	H	56	N	34	S	/87
Berechnet:	32,	59	27	/37	4,	43	6,	25	21	,56
Gefunden:	32,	27	4/	6,	21

Zu den Verbindungen der allgemeinen Formel (I), in der Z= S ist, gehören außer den vorgenannten Verbindungen 15, 18 und 23 auch die nachstehend angegebenen Verbindungen 13, 14, 16, 17, 19, 20 bis 22 und 24 bis 26. Diese wurden ähnlich wie vorstehend angegeben erzeugt und haben die in den Tabellen 2-1 und 2-2 und 2-3 angegebenen Kennwerte.

35H659

(13) (GeCH₂CH₂CONH₂J₂S_{3 (2Q)}

CH.

(Ge /^s/ COOH) CH

CH-

^C00H)

2"

CH.

CHI

CH.

COOH) S₃

(Ge/ ^f^ —~~' 2" CH. CH.

CH

(Ge

₂S₃

Elementaranalyse

Tabelle 2-1

Verbindung

35U659

14

16

17

Berechnet
Gefunden

Ge

Schmelzpunkt, C

IR (KBr, cm ¹)

34,92	32,73	32,73	25,57
35,21	3~2,53	32,64	25,49
23,13	27,07	27,07	42,31
23,17	27,26	27,17	42,33
3,40 J739"	4,09 4,10	4,09 4,14	3,91 3,90
23,15	21,68	21,68	16,94
23,34	21,57	21,54	16,99
185 (Zs.)	200 (Zs.)	190 (Zs.)	190 (Zs.)
1705 425	1700 400	1700 425	1705 700 425

(Lö sung smittel)

CD₃OD

1,36 (3H,d)

2,08-2,95 (3H,m)

CD₃OD

1,33
(3H,d)

1,40
(3H,d)

2,18

CD₃OD

1,46
(6H,s)

2,6O
(2H,s)

Aceton-d₍

1,43 (3H,m)

3,27 (2H,m)

7,17 (5H,s)

Ausbeute, (%)

57,7

92,4

80,3

86,0

35 U659

Elementaranalyse

Berechnet
Gefunden

Ge C

Schmelzpunkt, C

NMR ( )
(Lösungsmittel)

Tabelle 2-2

Verbindung

20 21

22

Die Elementaranalyse der Verbindungen stimmte mit den berechneten Werten gut überein, Ge +0,3, C +0,3, H +0,3

203
(Zs.)

DMSO-d,

206
(Zs.)

DMSO-d,

248 (Zs.)

DMSO-d,

1,88 (2H,t)	2,1-2,4 (3H,m)_	1,17 (d)
2,40 (2H,t)	1,1-1,2 (3H,m)	1,70 (dd)
		2,04 (dd)
		2,72 (br)

Ausbeute, % 60,2

84,1

88,0

35U659

Tabelle 2-3

Verbindung

Elementaranalyse

Berechnet
Gefunden

Ge

Schmelzpunkt, C IR (KBr, cm" )

32,87

32,	96	tl± ,11
27,	20	,78
27,	14
4,56 4,68
vo\|vo
21

21,53

230 (Zs.)

3400, 3200 2960, 1660 1460, 1120 420

27,00 27,26

40,20 40,34

3,75 3793"

5,21 5,18

17,89 17,66

210 (Zs.)

3450, 3350 3200, 1660 1600, 1400 765, 420

25	,66
25	,87
42	,46

42,49

4,27 4,33

4,95 4,70

17,00 16,86

215 (Zs.)

3450, 3350 3200, 1660 1455, 1400 700,

NMR

(Lösungsmittel)

Ausbeute, %

CD₃OD	2,43
1,26	(1H,t)
(6H,s)	3,05
2,86	(2H,d)
(2H,s)	7,23
	(5H,m)

76,5 81,8

82,3

-**- *^ψ 35U659

Beispiel 2 - Prüfung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) auf Antioxidationswirkung

Mit Zellwandstücken von Kaninchenerythrozyten in vitro durchgeführte Antioxidationsprüfung

Zu 50 bis 200 ml einer im Handel erhältlichen Kaninchenblutkonserve wurde ungefähr das dreifache Volumen einer isotonischen Flüssigkeit zugesetzt. Das Gemisch wurde dreimal jeweils 20 Minuten lang bei 3500 U/min zentrifugiert. Zu dem Ausfällprodukt wurde ungefähr das dreifache Volumen einer 10 mM-Phosphat-Pufferlösung zugesetzt. Das Gemisch wurde viermal jeweils 40 Minuten lang bei 13 000 U/min zentrifugiert. Der so erhaltene Niederschlag bestand aus Zellwandstücken von Erythrocyten. Durch Verdünnen des Niederschlages wurde eine Suspension erhalten, die bei Bestimmung nach dem Lowry-Verfahren ungefähr 10 mg Eiweiß pro 4 ml Pufferlösung enthielt. Eine geeignete Menge der Zellwandstücksuspension wurde in ein Reagensglas gegeben. In dieses wurden ferner 5 til t,Butylhydroperoxid als Oxidationsbeschleuniger und ein mit Dimethylsulfoxid (MDSO) oder destilliertem Wasser verdünntes Antioxidans gemäß der Erfindung gegeben. (Wenn das Antioxidans in DMSO aufgelöst wird, verwendet man die Lösung vorzugsweise in einer Menge von nicht mehr als 50 jil.) Dann wurde mit der obengenannten 10 mM-Phosphat-Pufferlösung auf insgesamt 1 ml aufgefüllt. In einer thermostatgesteuerten Kammer wurde die Suspension 20 Minuten lang bei 37° C geschüttelt. Dann wurden der Suspension 1 ml einer 20%igen wässrigen Lösung von TCA und 2 ml einer 0,67%igen wässrigen Lösung von TBA zugesetzt. Das Gemisch wurde in einem siedenden Wasserbad 15 Minuten lang erhitzt, danach mit Wasser abgekühlt und 15 Minuten lang bei 3500 U/min zentrifugiert. Durch Messung des Absorptionsvermögens der überstehenden Flüssigkeit wurde die Antioxidationswirkung bestimmt.

35H659

Dabei wurde die Antioxidationswirkung durch das in Prozent ausgedrückte Verhältnis des durch Subtraktion des Absorptionsvermögens der kein t.Butylhydroperoxid enthaltenden Blindprobensubstanz von dem Absorptionsvermögen der t.Buty!hydroperoxid enthaltenden Probensubstanz erhaltenen Wertes zu dem Absorptionsvermögen der Probensubstanz angegeben.

Die Ergebnisse sind in der Figur 1 angegeben.

Mit Rattenlebermikrοsomen in vitro durchgeführte Antioxidationsprüfung

Versuch 1:

Männliche Wistarratten (8 Wochen, 180 bis 200 g), die einen Tag lang keine Nahrung erhalten hatten» wurden enthauptet, und ihre Bäuche wurden zur Entnahme der Leber aufgeschnitten. Die Lebern wurden mit etwa 40 ml einer gekühlten 0,95%igen Natriumchloridlösung durchtränkt, um das Blut aus den Lebern zu entfernen. Pro Rattenleber wurden den Lebern 80 ml einer gekühlten Lösung von 0,25 M Saccharose zugesetzt. Das mit einem Eisbad gekühlte Gemisch wurde homogenisiert und danach 10 Minuten lang bei 13000 U/min zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde eine Stunde lang bei 37 500 U/min erneut zentrifugiert. Zu dem Niederschlag wurden etwa 20 ml einer Lösung von 125 mM Kaliumchlorid zugesetzt. Durch Homogenisieren dieses Gemisches wurde eine Mikrosomensuspension erhalten.

Diese wurde zu einer Suspension verdünnt, die bei Bestimmung nach dem Lowry-Verfahren 1,5 mg Eiweiß pro 6,5 ml der Pufferlösung enthielt.

35H659

Die Mikrosomensuspension in einer Menge, die einer Eiweißmenge von 1,5 mg entsprach, wurde in ein Reagensglas gegeben. In dieses wurden ferner eine geeignete Menge eines Antioxidans gemäß der Erfindung, ADP (400 u) NADPH (120 uM) und FeSO₄.7H₂ (500 uM) gegeben (die angegebenen Konzentrationen sind die Endkonzentrationen) und danach ein Gemisch von 0,1 M Tris-Pufferlösung (pH-Wert 7,4) und 0,15 M KCl (1:2), so daß eine Gesamtmenge von 1,5 ml erhalten wurde. Das Gemisch wurde in einer thermostatgesteuerten Kammer 30 Minuten lang bei 37° C geschüttelt. Dann wurden 3 ml einer 10%igen Lösung von TCA und 2 ml einer 0,67%igen Lösung von TBA in das Reagensglas gegeben und wurde das Gemisch 15 Minuten lang in einem siedenden Wasserbad erhitzt, dann mit Wasser abgekühlt und 10 Minuten lang bei 3500 U/min zentrifugiert. Zur Bestimmung der Antioxidationswirkung wurde das Absorptionsvermögen der überstehenden Flüssigkeit bei 532 nm gemessen.

Dabei wurde die Antioxidationswirkung durch das in Prozent ausgedrückte Verhältnis des durch Subtraktion des Absorptionsvermögens der kein ADP, kein NADPH und kein FeSO₄.7H₂O enthaltenden Blindprobensubstanz von dem Absorptionsvermögen der ADP, NADPH und FeSO₄.7H₂O enthaltenen Probensubstanz erhaltenen Wertes zu dem Absorptionsvermögen der Probensubstanz angegeben.

Die Ergebnisse sind in der Figur 2(a) dargestellt.

Versuch 2:

Aus einer enthaupteten Ratte wurde die Leber herausgenommen und in einer Pufferlösung von 150 mM KCl und 50 mM Tris-HCl homogenisiert und dann 3 Minuten bei 9000 g und danach eine Stunde bei 105 000 g zentrifugiert. Die dadurch erhaltene Mikrosomensuspension wurde wie im Versuch (1)

zu einer Suspension verdünnt, die bei Bestimmung nach
dem Lowry-Verfahren 1 mg Eiweiß pro 1 ml Pufferlösung enthielt.

In ein Reagensglas wurden die Suspension und danach eine geeignete Menge eines Antioxidans gemäß der Erfindung und Adriamycin in einer Menge gegeben, die einer Endkonzentration von 100 pM entsprach. Dann wurden in das Reagensglas 1,9 mM NADP, 20 mM Glucose-6-phosphorsäure, 1,1 I.E./ml Glucose-6-phoyphorsäuredehydrogenase und 8,6 mM Magensiumchlorid jeweils in Form einer wässrigen Lösung gegeben, so daß die Gesamtmenge 1,75 ml betrug. Wie im
Versuch (1) wurde die Lösung in einer thermostatgesteuerten Kammer behandelt und zur Bestimmung der Antioxidationswirkung das Absorptionsvermögen der überstehenden
Flüssigkeit bei 532 nm gemessen.

Die Blindprobensubstanz und die Proben substanz wurden wie im Versuch (1) hergestellt.

Die Ergebnisse sind in der Figur 2(b) dargestellt.

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Claims

PATENTANSPRUCH

Antioxidans, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Organogermaniumverbindung der allgemeinen Formel

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C - CH

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enthält, in der R_-., R₂ und R₃ jeweils ein Wasser stoff atom, pi «ι« substituierte oder nichtsubstituierte Phenylgruppe ovler eine Alkylgruppe bedeuten, Y eine Hydroxyl- oder eine Aminogruppe und Z ein Sauerstoff- oder Schwefelatom bedeutet.