DE3504940A1

DE3504940A1 - Multipotente paramunitaetsmediatoren, verfahren zu ihrer herstellung und diese mediatoren enthaltende arzneimittel

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Publication number: DE3504940A1
Application number: DE19853504940
Authority: DE
Inventors: Mathias Dr.med.vet. 8000 München Büttner; Anton Prof.Dr.med.vet.Dr.h.c.mult. Mayr
Original assignee: Individual
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1984-02-17
Filing date: 1985-02-13
Publication date: 1985-10-31
Anticipated expiration: 2005-02-14
Also published as: DE3504940C2

Description

Die Erfindung betrifft Paramunitätsmediatoren, insbesondere
multipotente Paramunitätsmediatoren (PM-Cocktails), Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Mediatoren enthaltende Arzneimittel.
Hintergrund der Erfindung Als "Paramunität" wird der Zustand eines schnell entstandenen, unterschiedlich lange anhaltenden, Nichterreger- und Nichtantigen-spezifischen Schutzes eines Individuums gegenüber einer Mehrzahl verschiedenartiger Infekt ionen bezeichnet; vgl. A. Mayr et al., Fortschritte der Medizin, Bd. 97 (197), 1159-1165 und 1205-1210, und A. Mayr et al., Handbuch der Schutzimpfung in der Tiermedizin (1984), Verlag Paul Parey, Berlin und Hamburg, S. 82-101.
Die funktionellen Grundlagen einer Paramunität sind komplex und beruhen hauptsächlich auf einer Steigerung der Phagozytose-Leistung, der Stimulierung humoraler Abwehrfaktcren, insbesondere des Opsonin-Properdin-Komplement-Systems, auf einer Aktivierung des lymphopoetischen Zellsystems und auf einer Interferonisierung. Die für eine Paramunität verantwortlichen Aktivitäten können dabei je nach Art ihrer Stimulierung unterschiedlich vorherrschen.
Paramunität wird auf natürliche Weise im Verlaufe eines Infektionsgeschehens oder auch künstlich, d.h. medikamentös, erworben, und zwar sowohl systemisch als auch lokal über die Schleimhäute des Respirations-, Digestions- und Urogenitaltraktes. Für diesen Vorgang wird der Begriff "Paramunisierung" in Anlehnung an die paraspezifische Wirkung ganz unterschiedlicher Infektionen und Schutzimpfungen vorgeschlagen.
Paramunitätsinducer sind Arzneistoffe, die dazu bestimmt sind, bei Mensch und Tier zur Erzeugung von Abwehr- und Schutzstoffen im Sinne einer Paramunisierung angewendet zu werden; vgl. A. Mayr, a.a.O., 1984, S. 97-99. Man unterscheidet zwischen biologischen und chemischen Inducern.
Die medikamentöse Paramunisierung ist die Methode der Wahl bei all den.Fällen, in denen die klassischen Methoden der Prophylaxe und der Therapie von Infektionskrankheiten durch den Panoramawechsel in der Infektiologie nicht mehr ausreichen. Im wesentlichen handelt es sich dabei um die Bekämpfung von infektiösen Faktorenkrankheiten, Mischinfektionen, infektiösem Hospitalismus, chronischen Verlaufsformen von Infektionskrankheiten, persistierenden Infektionen und ihren immunpathogenen Folgen, Chemotherapie-resistenten Bakterien-und Virusinfektionen, Therapieversagen bei immunsupprimierten oder sonst in ihrer Abwehr geschädigten Patienten und schließlich um eine zusätzliche Hilfe bei der Bekämpfung von Tumoren, speziell Virus-bedingten Tumorkrankheiten.
Die Induktion einer breit ausgelegten Paramunität kann Neuinfektionen der vorstehend erwähnten Art in ihrer Entstehung und Ausbreitung verhindern und bestehende Infektionen heilen oder günstig beeinflussen.
Paramunität ist ein sehr variabler Schutzzustand, bei dem je nach Ärt der Stimulierung verschiedene Systeme, z.B. die Phagozytose, die Natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) und die Makrophagenaktivität, humorale Mechanismen, die T- und B-Zellstimulierung oder andere Zellaktivitäten dominieren.
Dementsprechend ist die Schutzwirkung einer Paramunität gegenüber verschiedenen Infekt ionen abhängig von der Art der induzierten Aktivitäten. Die Induktion einer breit ausgelegten Paramunität kann somit kurzfristig Infektionen unterschiedlichster Art günstig für den Patienten beeinflussen.
Auf natürliche Weise ist Paramunität zu Beginn einer Infektion, noch vor Ausbildung einer spezifischen Immunität, die sich entwickelnde rlSofort"-Abwehr eines Organismus. Qualität und Quantität der paramunisierenden Wirkung einer Infektion oder einer Schutzimpfung werden von der Art des beteiligten Infektionserregers bestimmt. Sie kann sehr stark sein, aber auch so gering, daß sie nicht nachweisbar bzw.
durch andere Vorgänge neutralisierbar ist (z.B. bei Tumoren, BVD/MD-Infektionen).
Paramunität entwickelt sich innerhalb weniger Stunden und hält unterschiedlich lange an - je nachdem, welche Abwehrmechanismen bevorzugt stimuliert wurden. Paramunität kann innerhalb weniger Tage verschwinden, aber auch über mehrere Wochen anhalten, wie Tierversuche beweisen. Von der spezifischen Immunität unterscheidet sie sich aber dadurch, daß außer einem Trainingseffekt des Abwehrapparates nach Absinken der erhöhten Körperfunktion keine spezifische Gedächtnisreaktion zurückbleibt.
Als Paramunitätsinducer eignen sich die unterschiedlichsten Präparate. Nach bisherigen Erfahrungen lassen sie sich in folgende Gruppen einteilen: 1. Impfstoffe mit paraspezifischer Wirkung z.B. gegen Pocken, Influenza, Parainfluenza-3, Newcastle, Polio, IBR/IPV.
2. Präparate, die zur erregerunspezifischen Steigerung der Infektabwehr führen: Organ- und Blutextrakte (z.B. von Thymus und Milz; Embryonalextrakte), Viruspräparationen (z.B. aus Pocken-, Paramyxo-, Herpesviren), pyrogenfreie Bakterien- und Pilzextrakte (z.B. aus BCG, Brucellen, Diphtherie-Tetanus, Salmonellen, E.coli, Mycobacterium bovis, Corynebacterium parvum, Toxoplasma gondii), Endotoxine, bakterielle Ribosomen, Pflanzenextrakte, Dextrane, Hormone und hormonähnliche Substanzen, Lipide, Proteine und Protein-Spaltprodukte, anorganische Substanzen, tierische Gift- und Kampfstoffe.
3. Interferon-Inducer: Bestimmte Viren und Polyribonukleotide, synthetische Polyanionen, Lymphozyten-stimulierende Agentien u.a.m.
4. Lymphozytenstimulantien: Nicht-spezifische Mitogene (Phythämagglutinin, Concanavalin A, usw.), biologische und chemische Antigene, Thymosin, Lymphokine.
5. Sonstige Substanzen: z.B. Kombinationspräparate aus den vorstehenden Gruppen.
6. Synthetische Substanzen: 2-Cyan-aziridine, isotaktische Polyacrylsäuren, Levamisol, Tiloron u.a.m.
In der Tabelle I sind als Beispiel Präparate zusammengestellt, die derzeit unter verschiedenen Bezeichnungen im Handel sind, im Prinzip aber als Paramunitätsinducer wirken.
Tabelle I Beispiele für im Handel befindliche Präparate mit paramunisierender Wirksamkeit Humanmedizin: Pflanzenextrakte: Echinacin-Präparate Esberitox Aristolochiasäure-Präparate (in der BRD nicht mehr im Handel) Iscador R Organextrakte: Resistocell R Thymusextrakte bakterielle Präparate: I.R.S. 19 R Symbioflor R Broncho-Vaxom R Diribiotin R R Viruspräparate: Carts (Bakteriophagen) chemische Präparate: Tiloron Delimmun 1-(Dimethylamino)-2-propanol-(4-acetaminobenzoat) (Isoprinosine Levamisol Veterinärmedizin (zusätzlich zu den oben genannten Präparaten, die auch ad us.vet. erhältlich sind) bakterielle Präparate: BSK-Kolb R Farmetan R (zusätzlich pflanzl.
Extrakte enthaltend) Viruspräparate: Bayferon R (IBR-Virus, Herpesvirus) Parainfluenza 3-Präparate (Paramyxovirus) Duphapina , Duphamun , R Domavac-Inducer (Avipoxvirus) Wie dieser kurze überblick zeigt, sind es überwiegend biologische Präparate, denen eine paramunisierende Wirksamkeit zugesprochen werden kann. Viele biologische Paramunitätsinducer haben den großen Nachteil, daß sie schwer standardisierbar sind und ihre Verabreichung häufig mit unangenehmen Nebenerscheinungen, wie Toxizität oder mit einer "negativen Initialphase", verbunden ist.
Nach ihrer Wirkung unterscheidet man multipotente und unipotente Paramunitätsinducer.
Unipotente Paramunitätsinducer stimulieren nur einzelne, für die nichterregerspezifische Abwehr notwendige Faktoren, z.B. die Interferonbildung oder die Phagozytose.
Durch multipotente Paramunitätsinducer werden dagegen gleichzeitig stets mehrere Faktoren oder Re akt ionsketten stimuliert. Man kann deshalb davon ausgehen, daß die Wirksamkeit eines multipotenten Inducers davon abhängt, wie breit das Spektrum der durch ihn stimulierten Abwehrvorgänge ist.
Da das Abwehrsystem auch an der Verarbeitung und Beseitigung von anderweitig geschädigten, körpereigenen oder körperfremden Materialien beteiligt ist (z.B. durch Phagozytose oder enzymatische Aktivitäten) kann die Paramunisierung mit einem hochwirksamen, multipotenten Paramunitätsinducer auch bei anderen Lebensvorgängen positive Auswirkungen haben. Paramunisierungen können z.B. im Rahmen der Leberschutztherapie, zur Steigerung des Leistungsvermögens, zur Verbesserung der Gewichtszunahmen in der Mast u.a. eingesetzt werden.
Voraussetzung für die bisher übliche Paramunisierung ist neben der Verfügbarkeit geeigneter multipotenter Paramunitätsinducer das Vorhandensein von funktionstüchtigen Zellen im Empfänger, die für unspezifische Abwehrreaktionen verantwortlich sind. Eine Paramunisierung läuft in einer'Mehrstufenreaktion ab. In der Anfangsphase stimuliert ein Inducer diese Zellen zur Bildung und Freisetzung von Mediatoren.
Je nach Art des Inducers können Makrophagen, NK-Zellen oder Lymphozyten zur Mediatorproduktion angeregt werden; sie fungieren in diesem Stadium als Induktorzellen. Die freigesetzten Mediatoren veranlassen nun in einer weiteren Reaktionsstufe noch nicht stimulierte Zellen des Abwehrsystems zu Aktivitäten, die zur Vernichtung oder Beseitigung vorhandener Erreger körperfremder bzw. transformierter Zellen u.ä.
Noxen führen (Lysis, Phagozytose etc.). Auch hierbei handelt es sich wieder um die obengenannten Zelltypen, die aber auf Grund ihrer Funktion in diesem Stadium als Effektorzellen bezeichnet werden. Alle diese Vorgänge sind unspezifisch und richten sich deshalb, wenn sie einmal in Gang gesetzt wurden, ganz allgemein gegen körperfremde Elemente.
Es sind bereits unspezifisch wirksame Mediatoren nachgewiesen worden. Inwieweit diese Mediatoren, die anhand ihrer biologischen Eigenschaften charakterisiert wurden, sich chemisch untereinander ähneln bzw. vielleicht sogar identisch sind, ist nicht bekannt. Bekannt ist lediglich, daß diese Mediatoren in der Regel lösliche Glykoproteine mit Molekulargewichten nicht höher als 100 000 Dalton sind, die für relativ kurze Zeitintervalle von unterschiedlichen Zellarten verschiedenster Spezies in vitro und in vivo gebildet werden, wobei die Sekretion spontan ablaufen oder durch Reize (Antigene, Mitogene, Toxine u.a.m.) ausgelöst oder verstärkt werden kann. Diese bekannten Mediatoren werden mit dem Oberbegriff "Cytokine" bezeichnet und je nach synthetisierender Zellart z.B. Monokine, Lymphokine" u.ä. genannt, Sie sind befähigt, Zielzellen bzw. -mechanismen des Abwehrsystems sowie andere eng damit verbundene funktionelle Systeme zu bestimmten Reaktionen, Interaktionen oder zur Synthese von reaktiven Verbindungen anzuregen. Gleichzeitig sind sie auch für die Kooperation und Regulation dieser Vorgänge verantwortlich. In der sehr umfangreichen Literatur werden generell antigenspezifische und antigenunspezifische Mediatoren unterschieden. Antigenunspezifische Mediatoren steuern im synergistischen Zusammenwirken Paramunitätsvorgänge.
Die bekannten Mediatoren sind keine Immunglobuline und zeigen auch keine strukturellen Ähnlichkeiten mit ihnen. Daß sie keine präformierten Bestandteile von Zellen sind, sondern erst nach Reiz synthetisiert und abgegeben werden, unterscheidet sie auch grundsätzlich von den Mediatoren der Anaphylaxie und von Enzymen phagozytierender Zellen, die in Form von Granula in der Zelle schon gestapelt vorliegen und lediglich als Folge eines Reiz zustandes abgegeben werden; vgl. E. Pick et al., Biology of the Lymphokines, Academic Press, N.Y. 1979, Bd. 1, S. 1-12. In genannter Arbeit wird zusammenfassend über Mediatoren berichtet.
Im klinischen Bereich sind bisher vereinzelt Versuche mit in vitro-hergestellten Mediatoren durchgeführt worden. Sie enthielten stets nur bestimmte Mediatoren (z.B. Lymphokine, Interferon, Leukin), welche durch die Stimulierung mit einem unipotenten Paramunitätsinducer gewonnen wurden.
Aufgabenstellunq Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, multipotente Paramunitätsmediatoren zu entwickeln, d.h. Präparate, die möglichst viele unterschiedliche Mediatorsubstanzen enthalten, die durch ihre synergistischen und antagonistischen Interaktionen nicht nur optimale Reaktionen der Effektorzellen, sondern auch die Kontrolle dieses Geschehens garantieren.
Der Vorteil gegenüber einer direkten Paramunisierung eines Patienten mittels Paramunitätsinducer liegt darin, daß unabhängig davon, ob geeignete Induktorzellen vorhanden sind, durch die Verabreichung derartiger multipotenter Paramunitätsmediatoren (PM-Cocktail) die verschiedensten verfügbaren Effektorzellen bzw. -mechanismen direkt zu Abwehrreaktionen stimuliert werden können. Ein derartiger PM-Cocktail ist um so wirksamer, je mehr synergistisch wirksame Paramunitätsmediatoren er enthält.
Die direkte Stimulierung entsprechender Abwehrmechanismen bei Mensch und Tier über multipotente Paramunitätsmediato- toren aus Zellen des Abwehrsystems hat entscheidende Vorteile. Die wesentlichen sind: 1. Schnelle und gezielte, direkte Stimulierung der Effektorzellen, z.B. endogene Interferon-Synthese, Erhöhung der NK-Aktivität, Verstärkung der Phagozytose. Hierdurch kann zusätzlich ein Zeitgewinn gegenüber der Verabreichung von Paramunitätsinducern entstehen, da die Stimulierung der Induktorzellen und die Bildung der Paramunitätsmediatoren entfällt. Dadurch können inaktive oder geschädigte Induktorzellen umgangen und Mediatorendefizite ausgeglichen werden.
2. Die Paramunitätsmediatoren lassen sich leicht reinigen und anreichern (Entfernung von unnötigen Ballaststoffen,wie Proteine, Kohlenhydrate, Lipide und sonstige Substanzen).
Im Gegensatz dazu bestehen die bisher gebräuchlichen Paramunitätsinducer aus komplexem biologischen Material (z.B.
Vollbakterien bzw. deren Spaltprodukte, Bakterienextrakte, inaktivierte Viren usw.). Bei ihrer Verwendung werden dem Patienten neben den für die Stimulierung der Induktorzellen notwendigen Bestandteilen eine Vielzahl anderer biologisch aktiver Stoffe einverleibt, bei Viren z.B. Nukleinsäuren, über deren genetische Interaktionen im Organismus noch nichts Genaues bekannt ist.
3. Die Verabreichung gereinigter und konzentrierter multipotenter Paramunitätsmediatoren erhöht die Sicherheit einer Prophylaxe oder Therapie (keine Teratogenität, keine akute Toxizität in der Babymaus bzw. der trächtigen Maus nachoewiesen).
4. Eine Immunisierung, wie sie bei Verwendung von Paramunitätsinducern aus Viren oder Bakterien bei mehrmaliger Anwendung möglich sein kann, ist bei der Anwendung von multipotenten Paramunitätsmediatoren nicht zu erwarten.
5. Die Stimulierung von Induktorzellen in einem Makroorganismus durch die Verabreichung von Paramunitätsinducern ist ein sehr variables Geschehen und immer abhängig vom Aktivitätszustand bzw. der Stimulierbarkeit der entsprechenden Effektorzellen. Nach dem Prinzip "ein Organ kann nur soviel leisten, wie seine Induktorzellen" wirkt sich die Paramunisierung mit Paramunitätsinducern deshalb von Individuum zu Individuum ganz unterschiedlich aus. Die Verabreichung von standardisierten multipotenten Paramunitätsmediatorpräparaten kann diesen Unsicherheitsfaktor zumindest teilweise ausschalten.
6. Mit der Herstellung von multipotenten Paramunitätsmediatoren unter einheitlichen Laborbedingungen lassen sich Schwankungen im biologischen Material, wie sie bei der Herstellung, z.B. von Paramunitätsinducern bakterieller oder viraler Herkunft, manchmal auftreten können (Probleme bei der Virusvermehrung, Gefahr einer Viruskontamination durch die verwendeten Organzellkulturen u.a.m.) praktisch ausschließen. Unter anderem kann die Verwendung permanenter Induktor-Zell-Linien eine Standardisierung der Paramunitätsmediatorproduktion ermöglichen, die in einem geschlossenen System ( Großfermenter zur Zellproduktion, Gradienten-Ultrazentrifuge zur Auftrennung und Reinigung etc.) weitgehend von mikrobiellen Kontaminationen unbeeinflußt bleibt.
Gegenstand der Erfindung sind somit multipotente Paramunitätsmediatoren, die aus einem Gemisch verschieden wirksamer Paramunitätsmediatoren mit einer breiten Molekulargewichtsverteilung von 10 000 bis 100 000 Dalton bestehen und deshalb als Paramunitätsmediator-Cocktail (PM-Cocktail) bezeichnet werden. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung dieser multipotenten PM-Cocktails in Zellen des Abwehrsystems, beispielsweise Lymphozyten, Hybridomazellen oder anderen zur Bildung von Paramunitätsmediatoren geeigneten Zellen bzw. Zellkulturen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Arzneimittel, die eine wirksame Menge eines multipotenten PM-Cocktails der Erfindung enthalten und zur Erhöhung der unspezifischen Abwehr bei Vertebraten geeiynet sind. Diese Arzneimittel dienen somit zur Prophylaxe und Therapie von Infektionen verschiedenster Art, speziell von Virusinfektionen, Chemotherapieresistenten bakteriellen Infektionen, von infektiösen Komplexkrankheiten, Mischinfektionen, infektiösen Faktorenkrankheiten, infektiösem Hospitalismus, von hartnäckig rezidivierenden sowie chronischen Infektionen, von stressbedingten Abwehrschwächen und ihren Folgen, von erworbenen (z.B.
durch energiereiche Strahlen, Chemotherapeutika, AIDS-Syndrom u.a.) Immunsuppressionen und deren Folgen, von altersbedingten Ausfallserscheinungen (z.B. verminderte T-Lymphozytenaktivität), zur Entgiftung (z.B. Leberschutztherapie), zur Substitutionstherapie bei Tumoren und zur Unterstützung der Wirksamkeit und Unschädlichkeit einer Chemotherapie bzw Immunprophylaxe sowie zur Bekämpfung neonataler Krankheiten, die durch einen ungenügenden maternalen Schutz gegenüber der keimhaltigen Umwelt bedingt sind.
Die Lösung dieser Aufgaben ergibt sich aus den Patentansprüchen und der nachfolgenden Beschreibung.
Beschreibung der Erfindung Die Herstellung der multipotenten Paramunitätsmediatoren (PM-Cocktail) wird durch folgendes Fließschema erläutert: 1. Kultivierung von Induktorzellen, z.B. in Monolayer-oder Suspensionskultur; 2. Stimulierung dieser Induktorzellen durch multipotente Paramunitätsinducer; 3. Gewinnung des "rohen" PM-Cocktail-haltigen Kulturmediums; 4. Gewinnung des reinen PM-Cocktails durch Ultrafiltration des Kulturmediums; 5. Lagerung des PM-Cocktails bei + 40C bis -200C oder Lyophilisation; 6. Nachweis der Reinheit, Unschädlichkeit und Wirksamkeit.
Stufe 1: Für die Herstellung der Induktor-Zellkulturen werden Zellen des Abwehrsystems, vorzugsweise Lymphozyten, Monozyten und/oder Makrophagen "ex vivo" oder "post mortem" gewonnen und zur Stimulation "in vitro" kultiviert.
Transformierte Abwehrzellen, wie z.B. Burkitt-Lymphomzellen "Raji" des Menschen, die permanent in vitro kultivierbar sind, können ebenfalls zur Stimulation verwendet werden.
Vorzugsweise werden funktionelle Intra- oder Interspezies-Hybridomazellen, z.B. gewonnen durch Fusion von Milzzellen und Myelomzellen (P3-X63-Ag8) nach der Methode von Köhler und Milstein, als Induktorzellen benutzt (vgl. G. Köhler und C. Milstein, Nature Bd. 256 (1975), S. 495-497)-.
Diese Hybridomazellen können nach gezielter Fusion spontan oder nach Stimulation mit multipotenten Paramunitätsinducern Paramunitätsmediatoren produzieren. Die Induktorzellen werden in an sich bekannter Weise in Monolayer- oder Suspensionskulturen gezüchtet, vorzugsweise als Suspensionskulturen in Spinnergefäßen oder im Fermenter, unter Verwendung üblicher Zellkulturmedien, beispielsweise MEM (minimal essential medium) +58 fetales Kälberserum + 1,5% NaHCO3. Bevorzugt werden aber serumfreie Medien. Alle verwendeten Zellkulturmedien enthalten die üblichen Antibiotikazusätze. Die Teilungsrate der Induktor-Zellkulturen wird ihrer Vermehrungsgeschwindigkeit angepaßt, z.B.
2-3mal pro Woche eine 1:3 Teilung.
Stufe 2: Zur Stimulierung der PM-Cocktail-Produktion wird den ausgewachsenen Induktor-Zellkulturen (z.B. Monolayer 100% dichter Zellrasen, Suspensionskulturen 1 x 106 Zellen/ml evtl. Einstellung der Zelldichte) ein multipotenter Paramunitätsinducer zugesetzt. Als Paramunitätsinducer eignen sich grundsätzlich alle in Tabelle I genannten Präparate, besonders aber Präparate aus inaktivierten Viren (Pocken-, Parapocken-, Paramyxoviren), Bakterien (Corynebakterien, Mycobakterien, Pasteurellen, Clostridien, Brucellen) und Pilzen (Hefen, Sproßpilze), sowie chemische Verbindungen.
Besonders bevorzugt sind Präparate aus inaktiviertem Orfvirus (Parapoxvirus) und aus inaktiviertem Hühnerpockenvirus (Avipoxvirus). Beide Präparate sind in der DE-OS 27 14 665 beschrieben. Es können auch Gemische dieser Präparate verwendet werden. Für die Wahl und Menge geeigneter multipotenter Paramunitätsinducer ist maßgebend, daß der entstandene PM-Cocktail eine multipotente Wirksamkeit besitzt. Die Wirksamkeit eines PM-Cocktails kann durch die folgenden in vivo- und in vitro-Tests nachgewiesen werden.
a) In vivo-Verfahren: Nachweis der antiinfektiösen Wirksamkeit in Virus-Belastungsmodellen (VSV-Test mit Babymäusen, Aujeszky-Test mit adulten Mäusen) und bakteriellen Belastungsmodellen (Pseudomonas, E. coli u.a., vgl. H.H. Sedlacek, Behring Inst. Mitt., No. 74 (1984), S. 122-131); b) in vitro-Verfahren: Lymphozytenstimulationstest, Latex-Inkorporationstest (Phagozytose), 51Cr-Freisetzungstest (natürliche (spontane) zellvermittelte Zytotoxizität), Interferonnachweis im Plaquereduktionstest. Diese Teste dienen dem Nachweis, daß die wichtigsten Reaktionssysteme der unspezifischen Abwehr durch den PM-Cocktail stimuliert werden. Der Nachweis der Wirksamkeit eines PM-Cocktails kann auch mit anderen geeigneten in vitro-Testmethoden durchgeführt werden.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten multipotenten Paramunitätsinducer können als Flüssigkeit oder als Lyophilisat vorliegen. In letzterem Falle werden sie vor ihrer Verwendung in einer entsprechenden Flüssigkeitsmenge aufgelöst, z.B. in Tris-Puffer pH 10, MEM pH 7,4 oder Aqua dest. Die Stimulationsdosis beträgt 0,5 - 10 ml pro 100 ml Kulturmedium, vorzugsweise 1 ml/100 ml. Die Inkubationsdauer beträgt etwa 18 bis 96 Stunden, vorzugsweise etwa 36 Stunden, bei etwa 330 bis 390 C, vorzugsweise bei etwa 370 C, Sofern die Inkubation in einem offenen Kultur-System durchgeführt wird, muß zusätzlich CO2 bis zu einer Konzentration von etwa 5% zugesetzt werden (CO2-Brutschrank). Während der Inkubation werden die Induktorzellen lichtmikroskopisch auf cytopathische oder cytotoxische Veränderungen regelmäßig kontrolliert.
Beim Auftreten von derartigen Veränderungen werden die Zellkultur-Uberstände sofort gewonnen, filtriert, konzentriert und auf eventuellen Mediatorengehalt geprüft. Fällt diese Wirksamkeitsprüfung negativ aus, werden sie verworfen.
Stufe 3: Die Induktorzellen werden vom Kulturmedium abgetrennt, z.B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren. Alle folgenden Arbeitsgänge werden vorzugsweise bei Raumtemperatur und unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Das den PM-Cocktail enthaltende Zellkulturmedium kann bei +40 C bis -200 C oder darunter aufbewahrt werden.
Stufe 4: Aus dem von den Zellen befreiten Kulturmedium wird der PM-Cocktail isoliert, der nur Bestandteile enthalten soll, deren Molekulargewicht zwischen 10 000 und 100 000 Dalton liegt. Wichtig ist dabei, daß die hierfür nötige Ultrafiltration schonend (Vermeidung von Scherkräften) durchgeführt wird, um die Paramunitätsmediatoren in nativem Zustand zu halten. Hierfür eignen sich z.B. Geräte der Fa.
Amicon, Witten, BRD (Stirred Ultrafiltration Cell, Modell 402 für Mengen bis 2000 ml) oder für größere Mengen das Pellicon-Kassetten-System der Fa. Millipore, Neu-Isenburg, BRD. Bei diesen Geräten wird der Flüssigkeitsstrom tangential über das Membran- bzw. Kassettensystem geführt, so daß die bekannten Nachteile konventioneller Filtration entfallen.
Durch die Verwendung von Membranen bzw. Kassetten mit einer nominalen Molekulargewichtstrenngrenze (NMGG) von 100 000 Dalton werden zunächst alle höhermolekularen Bestandteile des Rohpräparates abgetrennt. Das gewonnene Filtrat wird dann durch Membranen bzw. Membrankassetten mit einer NMGG von 10 000 geleitet. Das Filtrat wird verworfen.
Das Retentat enthält den PM-Cocktail der Erfindung in konzentrierter Form, da gleichzeitig eine Einengung auf das 10- bis 20fache des Ausgangsvolumens erfolgt ist. Die Abtrennung des PM-Cocktails kann selbstverständlich auch nach anderen Verfahren erfolgen, sofern sie eine schonende Behandlung garantieren, so z.B. durch Gelchromatographie oder Dichtegradienten-Zentrifugation.
Stufe 5: Der gewonnene PM-Cocktail kann bis zur Verwendung bei +40 C bis -200 C oder bei tieferen Temperaturen gelagert werden. Er kann auch in bekannter Weise gefriergetrocknet werden.
Stufe 6: A) Nachweis der Reinheit Es werden folgende Kontrolluntersuchungen durchgeführt: 1. elektronenmikroskopische Untersuchung auf das Fehlen von größeren Partikeln, zur Überprüfung der Filtrationssysteme; 2. mikrobiologische Untersuchung auf das Fehlen von Kontaminationen durch Bakterien, Viren oder Pilze nach den Vorschriften des Europ. Arzneibuches; 3. serologische Untersuchung auf das Fehlen von Antikörpern (sofern zur Antikörper-Bildung befähigte Zellen durch virale oder mikrobielle Paramunitätsinducer in Stufe 2 zur Stimulierung verwendet worden sind) mittels Neutralisations- oder ELISA-Test oder anderen bekannten serologischen Verfahren.
B) Nachweis der Unschädlichkeit (Pyrogenität, Toxizität, Teratogenität) nach den Vorschriften des DAB 6 bzw. des Europ.
Arzneibuches.
C) Nachweis der Wirksamkeit Es werden folgende Untersuchungen durchgeführt: 1. Der Infektionsbelastungsversuch mit dem Stomatitis vesicularis-Virus in der Babymaus (VSV-Modell), 2. der Infektionsbelastungsversuch mit dem Aujeszky-Virus in der adulten Maus (AV-Modell).
Im VSV-Modell werden 30 NMRI-Babymäuse (gleichmäßige Mischung aus verschiedenen Würfen) mit 0,1 ml des PM-Cocktails subcutan vorbehandelt und 16-24 Stunden später mit 20-50 LD50 des hochvirulenten Stomatitis vesicularis-Virus (VSV) intraperitoneal infiziert. Die Infektion führt ab dem 4. Tag p. inf. zum Tod. Die Infektionsdodis ist so eingestellt, daß ca. 80-100% der Tiere sterben.
Das zweite Modell beinhaltet die Vorbehandlung von je 20 adulten NMRI-Mäusen (weibl., 20 g schwer) mit 0,2 ml des PM-Cocktails intraperitoneal (oder 0,5 ml subcutan) und 16-24 Stunden später die Infektion dieser Mäuse mit 20-50 LD 0 des Aujeszky-Virus ebenfalls intraperitoneal. Die In-50 fektionsdosis wird so eingestellt, daß ab dem 3. Tag p.inf.
80-100% der Mäuse sterben.
Als Kontrollen werden bei beiden Modellen entsprechende Tierzahlen mit einem Placebopräparat vorbehandelt. Das Placebopräparat wird gemäß den Stufen 1, 3-5, d.h. ohne Stimulierung der Induktorzellen, hergestellt. Die Morbidität und Mortalität wird über einen Zeitraum von 14 Tagen ausgewertet. Es wird der Wirkungsindex (WI) nach der folgenden Formel errechnet: WI = b b a b x 100 b = % Mortalität der Kontrollgruppe a = % Mortalität der Versuchsgruppe Beispiel: Mortalität bei der Kontrolle 88,8% Mortalität bei der zu testenden Substanz 7,1% 88,8 - 7,1 x 100 = 92 88,8 Diese beiden Infektionsmodelle wurden ausgewählt, weil sie mit zwei völlig unterschiedlichen Virus arten mit unterschiedlichen pathogenetischen Verlaufs formen und einmal im neugeborenen Tier mit unreifem Abwehrsystem (VSV-Modell) und im anderen Fall im adulten Tier (AV-Modell) durchgeführt werden. Beide Infektionsmodelle stellen höchste Ansprüche an die Infektabwehr, da die Infektionsdosis so hoch eingestellt wird, daß die Gesamtmortalität von Placebo-behandelten Kontrolltieren innerhalb der Beobachtungszeit zwischen 80% und 100% liegt, wobei die Mehrzahl der Todesfälle bereits in der 1. Woche auftritt. Zur Bewertung der Wirksamkeit wird der Wirkungsindex berechnet. Ein Wirkungsindex von größer 20 ist signifikant.
Die in vitro-Tests sind so ausgewählt, daß ein möglichst breites Spektrum der körpereigenen Abwehrreaktionen erfaßt werden kann. Hierzu gehören 1. der Lymphozytenstimulationstest zum Nachweis der Stimulierbarkeit von vorbehandelten Lymphozyten über die Messung des Einbaus von 14C oder ³H-Thymidin in die DNA; vgl. H.-P. Lohrmann et al., J. exp. Med., Bd. 139 (1974), 1037-1048; 2. der Latex-Inkorporationstest, die erhöhte Phagozytose von Mikroorganismen, die erhöhte Chemoluminiszenz zum Nachweis der Mikro- bzw. Makrophagenaktivität; vgl. R.D. Nelson et al., Infection and Immunity, Bd. 17 (1977), S. 513-520; J.R. David u. H.G. Remold, in: Biology of the Lymphokines, by SCohen et al., 1979, Academin PTess,-New York.
3. der 51Chrom-Freisetzungstest zum Nachweis der Erhöhung der natürlichen (spontanen) zellvermittelten Zytotoxizität; vgl. R.B. Herberman, NK cells and other Natural Effector Cells, 1982, -eademic Press, New York.
4. der direkte'und indirekte Interferonnachweis im VSV-Plaquereduktionstest zum Nachweis der Interferonproduktion; vgl. J. Vilcek, Virology Monographs, Springer Verlag, Wien-New York, Band 6 (1969), S. 13-15.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 Hybridomazellen (permanenter Zellstamm, gewonnen durch Fusion von Mäusemyelomzellen (P3-X63-Ag8) und Mäusemilzzellen BALB/c Mäuse) werden entsprechend ihrer Vermehrungsrate 1:3 geteilt und als Suspensionskulturen in ein Nährmedium (MEM (minimal essential medium) + 5% fetales Kälberserum + 1,5% NaHCO3 sowie 100 I.E. Penicillin, 100 ßg Streptomycin und 2 ßg Amphotericin B) verbracht. Bei Verwendung von halboffenen Kulturgefäßen wird die atmosphärische Luft durch 5% CO2 angereichert. Größere Mengen werden günstiger in Spinnerkulturgefäßen bzw. im Laborfermenter angezüchtet.
Die Bebrütungstemperatur beträgt stets 370 C. Nach 2-3 Tagen ist die Kultur optimal ausgewachsen. Das Nährmedium wird entfernt und durch Erhaltungsmedium ersetzt. Als Erhaltungsmedium dient das gleiche Medium ohne Serumzusatz. Der pH-Wert des Mediums wird mit Hilfe von HCl/NaHCO3 oder HEPES-Puffer auf 7,2 bis 7,4 eingestellt. Die Zelldichte wird gleichzeitig auf 1 x 106 Zellen/ml eingestellt. Der Zellkultur wird nun zur Stimulierung der Paramunitätsmediatoren-Produ; .r,n als Paramunitätsinducer inaktiviertes Orfvirus in ein r Dosis on 1 ml pro 100 ml (0,01 ml/ml) Zellkulturmedium zugesetzt und die Kultur anschließend 24 bis 96 Stunden bei 370 C bebrütet. Der Paramunitätsinducer liegt als gefriergetrocknetes Präparat vor und wird kurz vor der Verwendung in Tris-Puffer (pH 10,0) entsprechend dem Ausgangsvolumen aufgelöst.
Die Hybridomazellen werden während der Inkubierung regelmäßig lichtmikroskopisch auf cytopathische und cytotoxische Veränderungen kontrolliert. In diesem Sinne veränderte Zellkulturen werden sofort in der Inkubation gestoppt, ihre Überstände gewonnen, filtriert und konzentriert und auf eventuellen Mediatorgehalt überprüft. Fällt dieser Wirksamkeitstest negativ aus, werden sie verworfen. Die Inkubations- bzw. Stimulationszeit wird durch die Trennung.der Zellen vom Kulturmedium beendet. Dies geschieht z.B. durch Zentrifugieren (ca. 2000 g) während 20-30 Minuten oder durch Filtrieren durch Membranen mit einer Porengröße von 0,22 ßm - 0,45 Am. Der gewonnene Überstand bzw. das Filtrat enthält den ungereinigten PM-Cocktail. Dieser kann bis zur Weiterverarbeitung bei +4° C bis -200 C oder tieferen Temperaturen aufbewahrt werden.
Zur Gewinnung des reinen PM-Cocktails wird eine zweistufige schonende Ultrafiltration durchgeführt. Hierfür eignen sich z.B. Geräte der Fa. Amicon, Witten bzw. für größere Mengen das Pellicon-Kassetten-System der Fa. Millipore, Neu-Isenburg. In der 1. Ultrafiltrationsstufe werden Membranen bzw.
Membran-Kassetten mit einer NMGG von 100 000 Dalton verwendet. Das Filtrat, das nunmehr von allen höhermolekularen Verbindungen befreit ist, wird in der zweiten Stufe durch Membranen bzw. Membran-Kassetten mit einer NMGG von 10 000 Dalton geleitet. Das Filtrat dieser 2. Stufe wird verworfen, es enthält alle niedermolekularen Verbindungen. Das Reten- tat, das gleichzeitig eine Einengung auf das 10-15fache des Ausgangsvolumens erfahren hat, wird gewonnen. Es enthält nur noch Verbindungen, deren Molekulargewicht zwischen 10 000 und 100 000 Dalton liegt und stellt somit ein Konzentrat aller gebildeten Paramunitätsmediatoren dar. Es wird deshalb als Paramunitätsmediator-Cocktail (PM-Cocktail) bezeichnet. Der gewonnene PM-Cocktail wird bei Temperaturen von +40 C bis -200 C oder tieferen Temperaturen aufbewahrt.
Er kann auch in gefriergetrockneter Form aufbewahrt werden.
Die Reinheit, Spezifität und Wirksamkeit des erfindungsgemäßen PM-Cocktails wird durch entsprechende Kontrolluntersuchungen überprüft.
Die Prüfungen auf Reinheit, Unschädlichkeit und Spezifität umfassen folgende Untersuchungen, die nach den bekannten Verfahren durchgeführt werden: 1. Elektronenmikroskopische Kontrolle mit den üblichen Methoden auf das Fehlen des PM-Cocktails von größeren Partikeln; 2. übliche Kontrollen auf mikrobielle Kontaminationen nach den Richtlinien des Europ. Arzneibuches; 3. die Unschädlichkeit wird nach den Richtlinien des Europ. Arzneibuches vorgenommen (Toxizität, Teratogenität, Pyrogenität); 4. eine Überprüfung des PM-Cocktails auf vorhandene Antikörper gegen das Inducer-Virus wird nur vorgenommen, wenn zur Antikörperbildung befähigte Zellen (B-Lymphozyten, Plasmazellen) stimuliert wurden. Sie wird allerdings durch eine ausreichende Filtration überflüssig.
Zum Nachweis der Wirksamkeit wird der PM-Cocktail nach den vorstehend beschriebenen Methoden untersucht.
Als in vivo-Nachweis werden immer die beiden Infektionsmodelle in der Maus (NMRI-Stamm) verwendet, nämlich 1. die VSV-Infektion der Babymaus und 2. die Aujeszky-Infektion der adulten Maus. In den Tabellen II und III sind typische Ergebnisse aus diesen Tests zusammengestellt.
Tabelle II VSV-Infektionsmodell Mortalität Testpräparat in % Wirkungsindex PM-Cocktail unverdünnt 6 94 1:4 10 90 1:8 26 74 1:16 62 38 1:32 86 14 1:64 100 0 Kontrollen fetales Kälberserum 97 Extrakt nicht stimulierter Zellkulturen 98 Medium nicht stimulierter Kulturen 100 Zellkulturmedium (Viruskontrolle) 96 Tabelle III Aujeszky-Infektionsmodell Testpräparat Mortalität Wirkungsindex in in % PM-Cocktail unverdünnt 0 100 1:4 5 94 1:8 10 89 1:16 50 38 1:32 50 38 1:64 48 49 1:128 85 11 Kontrollen fetales Kälberserum 100 Extrakt nicht stimulierter Zellkulturen 90 Medium nicht stimulierter Kulturen (Placebo) 97 Zellkulturmedium (Viruskontrolle) 100 Die Signifikanz liegt bei diesen beiden Testmodellen bei einem Wirkungsindex von größer 20. Als brauchbar werden nur solche Chargen bewertet, deren Wirkungsindex mindestens 50 beträgt. Zur Standardisierung gewonnener PM-Cocktails werden die Wirkungseinheiten, bezogen auf das VSV-Modell, berechnet. Hierzu wird der PM-Cocktail in log 2 Verdünnungen im VSV-Modell getestet. 1 Wirkungseinheit (WE) pro applizierte Dosismenge (= 0,1 ml) ist bei der Verdünnungsstufe erreicht, bei der noch ein Wirkungsindex von 20 erzielt wird. In der unverdünnten Ausgangssubstanz ist dementsprechend die Anzahl der WE um das Vielfache der Endverdünnung höher. Im vorliegenden Beispiel enthält die Verdünnung 1:16 1 WE; der PM-Cocktail enthält demnach 160 WE pro ml (16 WE/0,1 ml).
Nur PM-Cocktails, die sich in den in vivo Tests als ausreichend wirksam erweisen, werden den vorstehend beschriebenen in vitro-Tests unterzogen. Mit Hilfe des Lymphozytenstimulationstestes wird überprüft, ob ein in vivo applizierter PM-Cocktail die Lymphozytenaktivität zu stimulieren vermag.
Dabei werden die homologe und heterologe Wirksamkeit getestet. In der Tabelle IV sind typische Ergebnisse des Lymphozytenstimulationstests mit Lymphozyten von drei verschiedenen Species zusammengestellt.
Tabelle IV Lymphozytenstimulationstest Art der Testpräparat cpm # se¹) Stimulationsindex Lymphozyten Schweinelympho- PM-Cocktail uv ²) 1830 # 41 10,6 zyten 1:2 630 # 20 3,6 1:4 179 # 3 1,0 (heterolog) 1:8 134 + 14 0 pos.Kontrolle PHA3) ßg/ml 13 595+ 78,1 neg.Zellkon- 174 + 5 0 trolle Mäuselympho- PM-Cocktail uv 2352 + 23 13,0 zyten 1:4 1977 + 67 11,0 1:8 1645 + 49 9,1 (homolog) 1:16. 1519 + 60 8,4 pos.Kontrolle: 3292 + 60 18,3 PHA 2µg/ml neg.Zellkontrolle 180 + 10 0 humane Lympho- PM-Cocktail uv 457 + 15 5,2 zyten 1:4 319 + 19 3,6 (heterolog) pos.Kontrolle 3588 + 19 40,8 PHA 2µg/ml neg.Zellkontrolle 88 + 1 0 1) Counts pro Minute + Standardfehler 2) unverdünnt 3) Phythämagglutinin Signifikant positiv sind nach dem t-Test Präparate, deren Stimulationsindex mindestens 3fach höher als der der entsprechenden Zellkontrolle ist (Irrtumswahrscheinlichkeit X = 4,015 bei einer Vertrauensgrenze von 0,001). Die getestete Charge war demnach mit allen 3 Lymphozytenarten positiv.
Im Latex-Inkorporationstest wird überprüft, inwieweit ein PM-Cocktail den zur Phagozytose befähigten Zellanteil des peripheren Blutes verschiedener Species in vitro zu erhöhen vermag. In der Tabelle V sind typische Ergebnisse eines Tests zusammengestellt.
Tabelle V Latex-Inkorporationstest Phagozytose-Prozentsatz Testpräparat Schwein Rind Maus PM-Cocktail 76 75 68 Kontrollen: fetales Kälberserum 38 57 35 Medium nicht stimulierter Kulturen 37 50 34 Zellkulturmedium 34 52 37 PHA 2ßg/ml n.u. n.u. 44 Der Phagozytose-Prozentsatz, der den Anteil der zur Phagozytose befähigten Zellen widergibt, ist bei allen 3 getesteten Tierarten deutlich höher als der der Kontrollen. Gleichzeitig wird deutlich, daß das Phythämagglutinin (PHA) zwar die Lymphozyten-, nicht aber die Makrophagentätigkeit zu stimulieren vermag.
Bei der Bewertung der natürlichen (spontanen) zellvermittelten Zytotoxizität wird die Erhöhung der spezifischen Lysis von Zielzellen durch zuvor in vivo oder in vitro mit PM-Cocktail stimulierte homologe oder heterologe NK-Zellen registriert. In der Tabelle VI sind typische Ergebnisse eines 51Cr-Freisetzungstestes nach in vivo-Stimulierung von Mäusen zusammengestellt. Den Mäusen wurde hierfür 24 Stunden vor der NK-Zellgewinnung aus der Milz 0,2 ml PM-Cocktail intraperitoneal verabreicht.
Tabelle VI 51cr-Freisetzungstest Spezifische Lysis bei einem Testpräparat Effektor-Zielzellen-Verhältnis von 100 : 1 50 : 1 (Zielzelle: VERO) PM-Cocktail 36,3 2,0 positive Kontrolle: inakt. Orfvirus 22,8 14,7 negative Kontrolle: Milzzellen unbehan- 1,5 delter Mäuse Die spezifische Lysis der Zielzellen ist bei den mit PM-Cocktail vorbehandelten Mäusen signifikant höher als bei unbehandelten Kontrollmäusen.
Für den Nachweis, daß durch die Applikation des PM-Cocktails die Interferonproduktion stimuliert wird, werden Seren von vorbehandelten Mäusen im indirekten VSV-Plaquereduktionstest untersucht. Die Seren werden hierfür 8 Stunden nach der Applikation des PM-Cocktails gewonnen. In der Tabelle VII sind typische Ergebnisse eines indirekten VSV-Plaquereduktionstestes zusammengestellt.
Mit dem direkten Plaquereduktionstest kann daneben auch der Interferongehalt eines PM-Cocktails geprüft werden.
Tabelle VII VSV-Plaquereduktionstest Testpräparat Hemmung in % durch Serumzugabe PM-Cocktail 1:2 87 1:4 81 1:8 71 1:16 74 1:32 69 1:64 51 1:128 27 positive Kontrolle Poly I:C 1:2 94 negative Kontrolle Placebo (Medium nicht 0 stimulierter Kulturen) Der Interferontiter des untersuchten Mäuseserums beträgt 1: 64.
Als konstante Bezugsgröße für die Bewertung und Einstellung standardisierter PM-Cocktails dient der Gehalt an Wirkungseinheiten im VSV-Infektionsmodell in der. Babymaus. Der Mindestgehalt des PM-Cocktails sollte -100 WE/ml betragen.
Bei spiel 2 "Ex vivo" oder post mortem" gewonnene Abwehrzellen aus dem Blut (z.B. Blutlymphozyten, Monozyten) oder aus zur Abwehr befähigten Organen (z.B. Milz, Thymus) werden gemäß Beispiel 1 kultiviert. Die Stimulierung der Zellkulturen (Induktorzellen) erfolgt mit einem der in Beispiel 3 - 5 genannten multipotenten Paramunitätsinducer. Die weitere Aufarbeitung sowie die Prüfung auf Reinheit und Wirksamkeit erfolgt gemäß Beispiel 1.
Es werden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse wie in Beispiel 1 erhalten.
Beispiel 3 Die Herstellung des PM-Cocktails erfolgt gemäß Beispiel 1 oder 2, anstelle des inaktivierten Orfvirus wird jedoch inaktiviertes Hühnerpockenvirus als Paramunitätsinducer verwendet. Man erhält einen multipotenten PM-Cocktail, dessen Reinheit und Wirksamkeit gemäß den im Beispiel 1 genannten Verfahren nachgewiesen werden. Es werden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse wie in Beispiel 1 erhalten.
Beispiel 4 Die Herstellung des PM-Cocktails sowie dessen Prüfung auf Reinheit und Wirksamkeit erfolgt gemäß Beispiel 1, jedoch mit einem inaktivierten Mykobakterium bovis als bakteriellem Paramunitätsinducer. Es werden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse wie in Beispiel 1 erhalten.
Anstelle der Mykobakterien können beispielsweise auch Brucellen, Salmonellen, Corynebakterien, Clostridien und andere Bakterienspezies verwendet werden.
Beispiel 5 Die Herstellung des PM-Cocktails sowie dessen Prüfung auf Reinheit und Wirksamkeit erfolgt gemäß Beispiel 1, jedoch mit Levamisol als chemischem Paramunitätsinducer. Es werden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse wie in Beispiel 1 erhalten.
Anstelle von Levamisol können auch Tiloron, Delimmun oder Isoprinosine verwendet werden.
Beispiel 6 Die gemäß Beispiel 1 bis 5 hergestellten PM-Cocktails werden lyophilisiert und dienen in dieser Form als Ausgangsprodukt zur Herstellung entsprechender Arzneimittel. Vor der Verwendung wird das Lyophilisat entsprechend dem Ausgangsvolumen mit üblichen pharmazeutischen Trägern versetzt, beispielsweise sterilem, pyrogenfreien Aqua dest. In dieser Zubereitungsform eignet es sich sowohl für die parenterale (z.B. intramuskuläre) als auch für die lokale (beispielsweise Gurgeln, Aufschnupfen, Nasenspray) Verabreichung.
Der erfindungsgemäße PM-Cocktail kann auch in andere pharmazeutische Träger eingearbeitet werden. Hierbei muß berücksichtigt werden, daß die Sterilität und Haltbarkeit, z.B.
durch proteolytische Bestandteile des Trägers, nicht beeinträchtigt werden.
In der Humanmedizin empfiehlt sich bei der parenteralen Applikation eine Dosis von 1-2 ml pro Injektion. Bei akuten Infektionen wird beispielsweise 1-3 mal täglich je 1-2 ml intramuskulär verabreicht. Je nach Schwere der Erkrankung werden die Injektionen 3 bis 5 Tage gegeben. Diese Behandlung kann nach 2-4 Wochen, bzw. bei erneutem Auftreten von klinischen Symptomen auch früher, wiederholt werden. Für die Prophylaxe genügt in der Regel 1 Injektion pro Tag über 3 Tage. Zur Behandlung von chronischen Infektionen oder anderen, länger bestehenden Beschwerden (z.B. in der Geriatrie), wird der Behandlungsrhythmus den individuellen Bedürfnissen angepaßt.
Für den Einsatz in der Tiermedizin gelten grundsätzlich die gleichen Regeln. Die Dosierung wird hier lediglich der Größe der betreffenden Tierart und der Schwere der Erkrankung angepaßt (z.B. Rind: 4 ml; neugeborene Welpen: 0,5 ml).
Beispiel 7 Um die Verwendungsmöglichkeiten und die Wirksamkeit des PM-Cocktails der Erfindung zu zeigen, sind einige Beispiele von prophylaktischen und therapeutischen Anwendungen bei Mensch und Tier in den Tabellen VIII bis X zusammengestellt. Wie aus den Daten hervorgeht, können durch den Einsatz des PM-Cocktails Infektionskrankheiten unterschiedlicher Genese in ihrem Verlauf gestoppt, gemildert oder überhaupt am Ausbruch gehindert werden.
Tabelle VIII Einsatz von PM-Cocktail in der Humanmedizizn (männliche und weibliche Freiwillige, Behandlungsmodus gemäß Beispiel 6, bei den Versuchen handelt es sich aus nahaliegenden Gründen nicht um Doppelblindversuche) Zahl der Krankheitsbild Ergebnis Bemerkungen Fälle 3 Virushepatitis A bereits 48 Std. nach Behandlungs Krankheitsdauer konventionell beginn Absinken der Leberwerte, Nor- behandelter, unkomplizierter Fälle malisierung der Leberwerte innerhalb mindestens 2-6 Wochen von 1-2 Wochen 4 infektiöse Monlo- nach der 1.Injoktion: durchschnittliche Krankheitsdauer: (Erwachsene nukleose Besserung des Allgemeinbefindens, 6-8 Wochen, bei Erwachsenen häufig Sistieren der Fieberanfälle; Komplikationen Normalisierung der Leberwerte inneehalb von 3 bis Tagen 6 Herpes zoster Rückgang der Beschwerden bereits durchschnittliche Krankheitsdauer 4 beginnende Erkran wenige Stunden nach der ersten 31 Tage; vgl. Söltz-Szöts, J., (oralen!) Behandlung,völlige Hei- Zschr. Haut-Geschl.Krh.,Bd. 46 lung innerhalb von 1-2 Tage, (1974), 46-49 und A. Mayr et al., keine post-Zosterneuritis Fortschr. Med. Bd. 95 (1977), 87-93, 119-122, 152-158.
2 länger bestehende Nachlassen der Schmerzen innerhalb Erkrarkungen (mehr als von 48 Stunden nach Behandlungs-8 Tage) geginn, Abfallen der Krusten nach 5-9 Tagen, keine post-Zosterneuritis 7 Herpes simplex, innerhalb von wenigen Stunden Rück- mit den bisherigen Behandlungsmethoden Anfnagsstadium gang der Beschwerden, schnelle Ein- normale Krankheitsdauer 2 bis 4 Wotrocknung der Herpesblasen in weni- chen, teilweise post-infektiöse Komgen Tagen, keine eritere Ausbreitung, plikationen; vgl. G.Schwarz und keine neuralen Komplikationen H.Stickl, Fortschr. Med. Bd. 99 (1981) 722-727 Tabelle IX Einsatz von PM-Cocktail zur Prophylaxe des infektiösen eXPensterbens Krankheitsbild und Zahl der behandel- Behandlungsmodus Ergebnisse ten Fälle Mutterhundin in d.
letzten Woche der 24 neugeborene Welpen Trächtigkeit: 1 ml alle 24 Welpen aus 8 Würfen, i.m. gesund aufgezo@ behandelt neugeborene Welpen: gesund aufgezogen je 0,5ml i.m. sofort nach der Geburt + 12- 24 Std. post partum 17 unbehandelte Wurf- 5 aufgezogen, geschwister als 12 innerhalb der Kontrollen ersten 7 Lebenstage gestorben Die Verwendung des PM-Cocktails in einem Doppelblindversuch bei neugeborenen Welpen verdeutlicht, daß durch die prophylaktische Anwendung dieses Präparates eine infektiöse Welpenerkrankung mit einer hohen Mortalitätsrate wirksam unter Kontrolle gebracht werden kann.
Tabelle X Einsatz von PM-Cocktail zur Prophylaxe der Crowding Disease in der Kälbermast Tiergruppen erkrankte Tiere gestorbene Tiere 24 Kälber, behandelt 2 0 24 Kälber, unbehandelt 13 3 Auch dieser Doppelblindversuch in einem Kälbermastbetrieb, in dem die Behandlung mit PM-Cocktail sofort nach dem Eintreffen der Kälber in den Bestand durchgeführt worden ist, verdeutlicht, daß das Präparat eine ausgezeichnete prophylaktische Wirksamkeit gegen Infektionen unterschiedlicher Genese besitzt.
Die aufgeführten Beispiele beweisen die Wirksamkeit des PM-Cocktails der Erfindung bei Mensch und Tier. Sie beweisen ferner ihre Unschädlichkeit. Es wurden keine Nebenreaktionen beobachtet.

Claims

Multipotente Paramunitätsmediatoren, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Mediatoren enthaltende Arzneimittel" Patentansprüche 1. Multipotente Paramunitätsmediatoren mit einem Molekulargewicht von etwa 10 000 bis 100 000 Dalton, erhältlich durch Stimulieren von Zellen des Abwehrsystems mit einem multipotenten Paramunitätsinducer in einem Zellkulturmedium, Inkubieren während etwa 18 bis 96 Stunden bei etwa 33 bis 390 C, anschließendes Abtrennen der Zellen aus dem Zellkulturmedium und Gewinnung der Fraktion mit einem Molekulargewicht von etwa 10 000 bis 100 000 Dalton durch Ultrafiltration des Zellkulturmediums, und mit folgenden Eigenschaften: a) antiinfektiöse Wirksamkeit in vivo gegen die Stomatitis vesicularis der Babymaus und gegen die Aujeszky-Infektion der adulten Maus sowie die eJndogene Interferonproduktion; b) erhöhte Stimulierbarkeit der Lymphozyten, erhöhte Makrophagentätigkeit- und erhöhte natürliche (spontane) zellvermittelte Zytotoxizität.
2. Multipotente Paramunitätsmediatoren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Stimulierung mit einem viralen multipotenten Paramunitätsinducer durchgeführt worden ist.
3. Multipotente Paramunitätsmediatoren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Stimulierung mit einem inaktivierten Virus der Familie Poxviridae durchgeführt worden ist.
4. Multipotente Paramunitätsmediatoren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Stimulierung mit einem bakteriellen multipotenten Paramunitätsinducer durchgeführt worden ist.
5. Multipotente Paramunitätsmediatoren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Stimulierung mit inaktivierten Bakterien der Gattung Mykobakterium durchgeführt worden ist.
6. Multipotente Paramunitätsmediatoren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Stimulierung mit einem multipotenten chemischen Paramunitätsinducer durchgeführt worden ist.
7. Multipotente Paramunitätsmediatoren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Stimulierung mit Levamisol durchgeführt worden ist.
8. Multipotente Paramunitätsmediatoren nach einem der Ansprüche 1-7 dadurch gekennzeichnet, daß die Stimulierung mit einem Gemisch von multipotenten Paramunitätsinducern durchgeführt worden ist.
9. Multipotente Paramunitätsmediatoren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß als Zellkulturen Hybridoma-Zellklone verwendet worden sind.
10. Verfahren zur Herstellung von multipotenten Paramunitätsmediatoren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen des Abwehrsystems mit einem multipotenten Paramunitätsinducer in einer zur Stimulierung der Paramunitätsmediatoren-Produktion ausreichenden Menge versetzt und etwa 18 bis 96 Stunden bei etwa 33 bis 390 C inkubiert, anschlie-Bend die Zellen aus dem Zellkulturmedium abtrennt und durch Ultrafiltration des Zellkulturmediums die Fraktion mit einem Molekulargewicht von etwa 10 000 bis 100 000 Dalton gewinnt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stimulierung mit einem viralen multipotenten Paramunitätsinducer durchführt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stimulierung mit einem inaktivierten Virus der Familie Poxviridae durchführt.
13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stimulierung mit einem bakteriellen multipotenten Paramunitätsinducer durchführt.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stimulierung mit inaktivierten Bakterien der Gattung Myokobakterium durchführt.
15. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stimulierung mit einem multipotenten chemischen Paramunitätsinducer durchführt.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stimulierung mit Levamisol durchführt.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stimulierung mit einem Gemisch von multipotenten Paramunitätsinducern durchführt.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Ultrafiltration die erhaltene Fraktion gefriertrocknet.
19. Arzneimittel zur Erhöhung der nicht-erregerspezifischen Abwehr von Vertebraten, gekennzeichnet durch einen wirksamen Gehalt an multipotenten Paramunitätsmediatoren gemäß den Ansprüchen 1 bis 9.