DE3040748A1

DE3040748A1 - Verfahren zur herstellung von keratinhydrolysayten und daraus erhaltene oligopeptidhaltige mittel

Info

Publication number: DE3040748A1
Application number: DE19803040748
Authority: DE
Inventors: Jean-Clude Paris Arnaud; Pierre Montfermeil Bore
Original assignee: LOreal SA
Current assignee: LOreal SA
Priority date: 1979-10-29
Filing date: 1980-10-29
Publication date: 1981-05-07
Also published as: LU81836A1; GB2061956A; GB2061956B; JPS5673095A; AU6380780A; AU543085B2

Description

J. REITSTÖTTER

PROF. DR. DR. DIPL. ING. W. BUNTE (1958-1Θ7Θ)

PATENTANWÄLTE

-H-

DR. ING.

W. KINZBBACH

DR. PHIL. DIPL. CHEM.

K. P. HÖLLER

DR. RER. NAT. DIPL. CHEM.

TELEFON: (0B9) 37 ΘΒ TELEX: E2162O8 IBAR D

BAUERSTRASSE 22, 8000 MÜNCHEN

München, den 23. 10. 1980 M/21 244

L¹OREAL 14, rue Royale

75008 Paris (Frankreich)

Verfahren zur Herstellung von Keratinhydrolysaten und daraus erhaltene oligopeptidhaltige Mittel

13C019/08 9

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
Oligopeptide enthaltenden Mitteln. Dabei geht man von
keratinhaltigein Material aus, das man einem enzymatischen
Abbau unterwirft.

Bekanntlich sind die Keratinhydrolysate und insbesondere die
Hydrolysate, die einen größeren Anteil an Oligopeptiden
besitzen, für die kosmetische Industrie von großem Interesse, ^] da sie den Zustand der Haaroberfläche oder der Haut beein- ^! flüssen, sie sind außerdem für die Nahrungsmittelindustrie ', von großem Interesse. '

Dennoch ist das·Interesse an diesen Verbindungen um so stärker, je größer der Oligopeptidgehalt ist. Das bedeutet, daß das
in dem als Grundstoff dienenden Keratin enthaltene Protein- ! material in Oligopeptidketten aufgespalten werden muß, die j mehrere Aminosäuren enthalten, wobei deren Molekulargewicht i

j jedoch so niedrig sein muß, daß sie hydrolysierbar sind. j

Das Interesse an Keratinhydrolysaten ist daher um |

so größer, je weniger freie Aminosäuren diese Hydro- ί

lysate enthalten. Außerdem hat man festgestellt, daß es ■

von besonderem Interesse ist, die in dem Keratin bestehenden ί

Cystinbindungen in den oligopeptidhaltigen Mitteln zu !

erhalten, wobei das Cystin, wenn es in Form von Oligopeptiden '

vorliegt, wirksamer ist, als wenn es in Form einer Amino- j

säure vorliegt.

130019/0831
ORIGINAL INSPECTED

ES ist vorgeschlagen worden, Keratinhydrolysate entweder
ausgehend von nicht bearbeiteten keratinhaltigen Rohstoffen,
wie z.B. Schweineborsten, Geflügelfedern oder Hufen, oder
ausgehend von fasrigen Rückständen und keratinhaltigen
Abfällen, wie z.B. Nebenprodukten von Schlächtereien und
Gerbereien, zu gewinnen. Man unterwirft diese Keratine
oder diese Keratinderivate entweder alkalischen oder sauren
chemischen Hydrolysen, die nur teilweise durchgeführt werden,
damit die Herstellung von freien Aminosäuren begrenzt wird,
oder enzymatischen Hydrolysen.

Bekanntlich üben die gewöhnlich groteolytischen Enzyme " '
(Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin, Papain) keine merkbare Wirkung ; auf nicht abgebaute, natürliche Keratine aus. Unter nicht ^; abgebauten Keratinen verstehet man Keratine, die keiner | chemischen, industriellen oder kosmetischen Behandlung unter- i worfen worden sind. Selbst die als potentiell keratinolytischen ; beschriebenen Enzyme, wie z.B. die Enzymextrakte von verschiedenen Stämmen von Keratomyceen (Pronase, Keratinase, j

M'zyme, PSF 2019) besitzen tatsächlich nur eine sehr geringe ! oder gar keine Aktivität für die prinzipiellen, natürlichen . j Keratinmaterialien. So betragen z. B. die Ausbeuten des
Abbaus von Humanhaaren, die mit solchen Enzymen behandelt
wurden, weniger als 10 %. Sicherlich können die Abfälle und ! industriellen Keratxnnebenprodukte durch proteolytische oder
keratolytische Enzyme abgebaut werden. In diesem Fall wird ; das ursprüngliche Keratinmaterial zwar abgebaut, jedoch sind
auch die meisten der Cystinbindungen des Keratins gespalten. _; Folglich enthalten die erhaltenen Hydrolysate praktisch _; kein Cystin mehr. Tatsächlich stellen alle enzymatischen ' Hydrolysen, die eine nicht zu vernachlässigende Wirksamkeit ^: besitzen, Hydrolysen dar, die entweder für Rohstoffe ver- ; wendet werden, in denen die Cystinbindungen bereits zu einem ! großen Teil gespalten worden sind, oder die für Materialien
verwendet werden, die bereits einer Vorbehandlung unter- : worfen wurden, um den Hauptteil der Cystinbindungen zu zer-

130019/0891

ORIGINAL [NSPECTED

stören. In allen anderen Fällen führt die enzymatische
Behandlung von Keratin zu einer Ausbeute, die praktisch Null
ist.

Um Keratinhydrolysate zu erhalten ist ist es auch vorgeschlagen worden, saure oder alkalische chemische Hydrolysen
durchzuführen. Die sauren Hydrolysen sind schwer zu kontrollieren und die erhaltenen Hydrolysate sind reich an freien Aminosäuren, selbst wenn die Säurelösungen nur wenig konzentriert
sind. Die Ausbeute an Oligopeptiden ist jedoch gering. Die
alkalischen Hydrolysen werden in Gegenwart von Alkalihydroxyden oder quaternären Ammoniumhydroxyden durchgeführt und bewirken die Zerstörung von gewissen Aminosäuren und insbesondere von Cystin. Es bildet sich H^S, Lanthionin, Lysinoalanin und Cystein. Die so erhaltenen Hydrolysate weisen
daher nur sehr wenig Cystin auf.

Es ist im Stand der Technik noch kein Verfahren zur Herstellung von Keratinhydrolysaten beschrieben worden, das es ermöglicht, _j Oligopeptide zu erhalten, die eine beträchtliche Konzentration; an Cystin enthalten. Entweder wiesen die Hydrolysate nur ! geringe Mengen an Oligopeptiden und eine große Anzahl von j freien Aminosäuren auf, oder die Hydrolysate enthalten '·

praktisch kein Cystin mehr. |

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren ! zur Herstellung von Oligopeptide enthaltenden Mitteln, ; die eine hohe Konzentration an Cystin aufweisen, bereit- ! zustellen. Dieses Verfahren bedient sich einer enzymatischen
Keratinhydrolyse, nachdem das Keratin einer Vorbehandlung
unterzogen wurde, die das Cystin nicht zerstört. Sämtliche ! im Stand der Technik beschriebene Vorbehandlungen, die für
Keratine enthaltende Materialien verwendet wurden, so daß
diese Materialien enzymatisch behandelt werden konnten, ;

zerstörten das Cystin. Diesbezüglich kann man folgende Ver- ^! fahren nennen:

13001970801

Die Oxydationsverfahren, die Cystin reversibel in Cysteinsäure anwandeln, die Verfahren zur Behandlung mit Sulfiten, die Cystin teilweise unter Bildung einer äquivalenten Menge S-Sulfocystein zu Cystein reduzieren und die Verfahren zur Reduktion mit Thiolen, die Cystin in Cystein und gleichermaßen in Lanthionin (unter Verlust von Schwefel) und in gemischte Dischwefelverbindungen umwandeln. In all diesen Fällen besitzen die erhaltenen enzymatisehen Hydrolysate nur einen geringenCystingehalt. Es wurde daher im Stande der Technik die mit einer guten Ausbeute verlaufende Behandlung mit Enzymen als inkompatibel mit der Gegenwart von Cystinbindungen in dem zu hydrolysierenden Material angesehen.

Erfindungsgemäß wurde nun überraschend gefunden, daß man eine enzymatische Hydrolyse mit einer guten Ausbeute durchführen kann, ohne dabei die ursprünglich in dem der Hydrolyse unterworfenen Keratinmaterial enthaltenen Cystinbindungen im größeren Ausmaß zu zerstören. Dazu sensibilisiert man zuvor das zu hydrolysierende Material. Dies geschieht entweder durch konzentrierte Elektrolytlösungen, die den Wasserstoff der Wasserstoffbindungen abfangen, oder durch polare Lösungsmittel, die die zwischen den Fibrillen-Bündeln bestehenden interfibrillären Bindemittel auflösen, wobei die Fibrillen aus Mikrofibrillen bestehen, die wiederum aus Proteinketten vom Keratin gebildet werden, oder durch ein hautzerstörendes Mittel, falls das Keratinmaterial eine das Keratinprodukt umschließende Oberhaut besitzt.

In allen diesen Fällen beeinflußt die erfindungsgemäße vorgeschlagene Sensibilisierungsbehandlung die Cystinbindungen des Keratins nicht wesentlich. Die erhaltenen Hydrolysate weisen immer noch mehr als 30 % der Cystinbindungen auf, die in dem ursprünglichen Keratinmaterial vorhanden waren, dagegen findet man in den analogen Mitteln des Standes der Technik, die reich an Oligopeptiden sind, niemals mehr als 10 % der Cystinbindungen des ursprünglichen Keratinmaterials wieder.

"13 0 0 19/0891

Die vorliegende Erfindung stellt somit ein neues "^T~:fahren zur Herstellung von oligopeptidhaltigen Mitteln durch Hydrolyse eines Keratinmaterials und Behandlung mit proteoiytischen und/oder keratolytischen Enzymen bereit, das dadurch gekennzeichnet ist,- daß man das Keratinmaterial vor der enzymatischen Behandlung einer Vorbehandlung mit mindestens einem Sensibilisierungsmittel, ausgewählt unter Elektrolyten, die in wäßrigem Milieu in einer Konzentration größer oder gleich 8 Mol pro Liter vorliegen, und polaren Lösungsmitteln unterwirft, oder, falls das Keratininateriai Eautkeratin ist, Ultraschall und/ oder Ameisensäure in einer Konzentration im Behandlungsmilieu von mehr als 90 Gew.-% als hautablösendes Mittel für die Vorbehandlung einsetzt.

Ais erfindungsgemäß besonders verwendbaren Elektrolyt kann man Lithiumbromid nennen.

Wenn das Sensibilisierungsmittel aus einem oder mehreren polaren Lösungsmitteln besteht, machen diese polaren Lösungsmittel vorzugsweise wenigstens 75 Gew.-% des Milieus aus, in dem die Sensibilisierungsbehandlung vorgenommen wird. Als besonders verwendbare Lösungsmittel kann man Dimethylformamid und Methanol nennen.

Wenn die Sensibilisierungsbehandlung mit wenigstens einem Elektrolyt und/oder wenigstens einem polaren Lösungsmittel durchgeführt wird, dauert diese Behandlung vorzugsweise länger als 30 Minuten und wird bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und der Siedetemperatur des Milieus bei Atmosphärendruck vollzogen.

130019/0891

Wenn man zur Behandlung von Haut-

Keratin . Ameisensäure als hautablösendes Mittel verwendet, wird die Sensibilisierung vorzugsweise langer als 30 Minuten und bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und der Siedetemperatur des Milieus bei Atmosphärendruck durchgeführt.

Es wurde bei Verwendung von Ultraschallemissionen als hautablösendes Mittel festgestellt, daß man befriedigende Resultate erzielt, wenn der Ultraschall eine Frequenz zwischen 20 KHz und 70 KHz besitzt und langer als 30 Minuten einwirkt und wobei die abgestrahlte Leistung zwischen 50 und 150 Watt pro behandelter dm³ beträgt.

Wenn das als Rohstoff dienende Keratinmaterial der oben erwähnten Sensibilisierungsreaktion unterworfen worden ist, kann man eine enzymatische Hydrolyse durchführen, wobei man sich proteolytischer und/oder keratolytischer Enzyme bedient, und erhält sehr befriedigende Hydrolyseausbeuten. Die enzymatische Behandlung wird vorteilhafterweise bei einem pH kleiner oder- gleich 9 und einer Temperatur kleiner 50 ° durchgeführt, um eine störende alkalische Hydrolyse zu vermeiden. Dabei werden die Enzyme bei einem pH eingesetzt, der nicht ihrer optimalen Kinetik entspricht. Die verwendete Enzymkonzentration hängt von den Betriebsbedingungen ab und reicht aus, um in dem Milieu eine enzymatische Wirkung zu erzielen. Die Enzymbehandlung dauert im allgemeinen zwischen 20 Stunden und 90 Stunden.

Das erhaltene Hydrolysat kann entweder als Lösung verwendet werden, nachdem der pH eingestellt worden ist, oder lyophilisiert, dialysiert, ohne Temperaturerhöhung zerstäubt, aus dem Lösungsmittel ausgefällt oder in Form eines festen Rückstandes aus einem Rotationsverdampfer bei ungefähr 40 ° ' gewonnen werden, wenn das Milieu neutralisiert worden ist.

13001.9/0891 ·

In allen Fällen stellt man fest, daß die erhaltenen oligopeptidhaltigen Mittel wenig freie Aminosäure aufweisen, reich an Oligopeptiden mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 5000 sind und mehr als 30 % der in dem ursprünglichen Keratinmaterial enthaltenen Cystinbindungen aufweisen.

Die vorliegende Erfindung stellt auch oligopeptidhaltige Mittel bereit, die durch das oben beschriebene Verfahren gewonnen werden und dadurch gekennzeichnet sind, daß 75 Gew.-% der in den Mitteln enthaltenen Oligopeptide ein Molekulargewicht zwischen 1000 und 5000 besitzen, wobei die Mittel außerdem mehr als 30 Gew.-% der Cystingruppen enthalten, die in dem als Rohstoff dienenden Keratinmaterial vorhanden waren.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung des oben beschriebenen oligopeptidhaltigen Mittels zi ■: Behandlung der Haare oder der Haut oder in der Nahrungsmittelindustrie.

Die folgenden Beispiele di- nen -ram besseren Verständnis der Erfindung. In diesen Beisp^„. . st die Ausbeute des ensymatischen Abbaus durch Analyse (Chromatographie auf Ionenaustauscherharzen) nach Hydrolyse eine aliquoten Teils des oben schwimmenden Filtrats und Zentrifugats berechnet. In jedem Beispiel wird die Ausbeute des ursprünglich eingesetzten behandelten (sensibilisierten) Keratinmaterials mit der Ausbeute des enzymatischen Abbaus des nicht behandelten (nicht sensibilisierten) Keratinmaterials verglichen. Zusätzlich wird der anfänglich in dem natürlichen, behandelten Keratin vorhandene Cystingehalt mit dem Cystingehalt in dem ' erhaltenen Hydrolysat (Proteinanalyse) verglichen. ;

Unter "Gesamtprotein" wird das gesamte proteinhaltige Material verstanden.

130019/0891 fMSPECTED~

Beispiel 1

a} Erste Stufe: Sensibilisierung

1GO g geschnittene (Abschnitte mit einer Länge von 2 cm)Haare werden in 2 Liter auf 120 C vorgeheiztes Dimethylformamid getaucht.

Die Lösung wird 2 Stunden bei 120 ⁰C stehen gelassen.

Die Haare werden dann abfiltriert, mehrere Male mit demineralisiertem Wasser, dann mit Alkohol und Äther gespült und bei Raumtemperatur getrocknet.

b) Zweite Stufe: Enzymatischer Abbau

Eine Enzymlösung, die Proteinase "PSF 2019" (Firma ORIL-Paris) enthält, wird kurz vor Verwendung hergestellt. Sie besitzt die folgende Zusammensetzung:

Proteinase "PSF 2019" gereinigt
(11 000 Anson Einheiten /mg) 3,2 g

Borsäure 22,5 g

1 η Natriumhydroxidlösung 130 ml

MgCl₂, 6 H₂O 0,03 g

demineralisiertes Wasser soviel wie nötig für 2000,00 ml

Die in Dimethyl-Formamid vorsensibilisierten Haare werden in eine auf 40 ⁰C geheizte Lösung getaucht.

Ein Blattrührer stellt ein dauerhaftes Rühren sicher.

Der Abbau dauert 4 Tage. Nach Abfiltration des unlöslichen Rückstandes wird die Lösung neutralisiert.

130019/0891

Es werden folgende Ergebnisse erhalten: 1) Ausbeute des enzymatischen Abbaus:

nicht sensibilisierte Kontrollhaare 5 %

sensibilisierte Haare 38 %

2) Charakterisierung des Keratinhydrolysats:

Cystin- Gehalt im Hydrolysat:

56 χ 10 Mol für 100 g Gesamtprotein

Cystin -Gehalt im ursprünglichen Keratin: 62 χ 10 Mol für 100 g Gesamtprotein.

Beispiel 2

a) Erste Stufe: Sensibilisierung

Man geht gemäß Beispiel 1 vor, jedoch wird 4 Stunden lang sensibilisiert.

b) Zweite Stufe: Enzymatischer Abbau Man geht gemäß Beispiel 1 vor.

Man erhält folgende Ergebnisse:

1) Ausbeute des enzymatischen Abbaus:

nicht sensibilisierte Kontroll-Haare 5 %

sensibilisierte Haare 95 %

2) Charakterisierung des Keratinhydrolysats:

Cystin- Gehalt im Hydrolysat:

50 χ 10 Mol für 100 g Gesamtprotein

130 019/0891

M/21 244 - 14 -

Cystin-Gehalt im ursprünglichen Keratin :

_3
62 χ 10 Mol pro 100 g Gesamtprotein.

Beispiel

a) Erste Stufe: Sensibilisierung

Man arbeitet gemäß Beispiel 1, sensibilisiert jedoch 6 Stunden lang.

b) Zweite Stufe: Enzymatischer Abbau

Man geht gemäß Beispiel 1 vor und erhält folgende Ergebnisse:

1) Ausbeute des enzymatischen Abbaus:

nicht sensibilisierte Kontrollhaare 5 %

sensibilisierte Haare 98 %

2) Charakterisierung des Keratinhydrolysats: Cystin-Gehalt im Hydrolysat:

35 χ 10~³ Mol pro 100 g Gesamtprotein

Cystingehalt im ursprünglichen Keratin: 62 χ 10 Mol pro 100 g Gesamtprotein. .

Beispiel

a) Erste Stufe: Sensibilisierung

100 g geschnittene Haare ( Abschnitte mit einer Länge von 2 cm) werden in zwei Liter auf 140 C vorgeheiztes Dimethylformamid getaucht.Die Lösung wird zum Sieden gebracht und 1 Stunde am Rückfluß gekocht.

Die Haare werden abfiltriert, mehrere Male mit demineralisiertem Wasser, dann mit Alkohol und mit Äther gespült und bei Raumtemperatur getrocknet.

130013/0891

b) Zweite Stufe: Enzymatischer Abbau

Man arbeitet gemäß Beispiel 1 und erhält folgende Ergebnisse:

1) Ausbeute des enzymatischen Abbaus:

nicht sensibilisierte Kontrollhaare 5 %

sensibilisierte Haare 81 %

2) Charakterisierung des Keratinhydrolysats:

Cystingehalt im Hydrolysat

25 χ 10 Mol pro 100 g Gesamtprotein

Cystingehalt im ursprünglichen Keratin 62 χ 10~ Mol pro 100 g Gesamtprotein.

Beispiel

a) Erste Stufe: Sensibilisierung

100g geschnitten v.i , s'sbsch- itte mit einer Lrnge \v-2 cm) werden in 2 Liter "isung aus 1 500 ml LfiL.e Formamid und 500 ml demineralisiertem Wasser getaucht.

Diese Lösung wird zum Sieden gebracht und am Rückfluß Stunden lang gekocht. Die Haare werden abfiltriert; mehrere Male mit demineralisiertem Wasser, dann mit Alkohol und mit Äther gespült und bei Raumtemperatur getrocknet.

b) Zweite Stufe: Enzymatischer Abbau

Man geht gemäß Beii_"^l 1 vor und erhalt folgende Ergebnisse:
1) Ausbeute des enzymatischen Abbaus:

nicht sensibilisierte Kontrollhaare 5 %

sensibilisierte Haare 59 %

130019/0891 ORIGINAL INSPECTED

2) Charakterisierung des Keratinhydrolysats:

Cystingehalt im Hydrolysat: 42 χ 10 Mol pro 100 g Gesamtprotein

Cystingehalt im ursprünglichen Keratin

_3
62 χ 10 Mol pro 100 g Gesamtprotein.

Beispiel 6

a) Erste Stufe Sensibilisierung

g geschnittene Haare (Abschnitte mit einer Länge von cm) werden in zwei Liter Methanol getaucht. Die Lösung wird zum Sieden gebracht und 12 Stunden am Rückfluß gekocht. Die Haare werden abfiltriert und bei Raumtemperatur getrocknet.

b) Zweite Stufe: Enzymatischer Abbau

Man geht gemäß Beispiel 1 vor und erhält folgende Ergebnisse:

1) Ausbeute des enzymatischen Abbaus:

nicht sensibilisierte Kontrollharre 5 %

sensibilisierte Haare 16 %

2) Charakterisierung des Keratinhydrolysats:

Cystingehalt im Hydrolysat: 60 χ 10~ Mol pro 100 g Gesamtprotein

Cystingehalt im ursprünglichen Keratin : 62 χ 10~ Mol pro TOO g Gesamtprotein.

130019/089 1

Beispiel 7

a) Erste Stufe: Sensibilisierung

Man geht gemäß Beispiel 6 vor, jedoch sensibilisiert man 24 Stunden.

b) Zweite Stufe: Enzymatischer Abbau

Man geht gemäß Beispiel 1 vor und erhält folgende Ergebnisse:

1) Ausbeute des enzymatischen Abbaus:

nicht sensibilisierte Kontrollhaare 5 %

sensibilisierte Haare 19 %

2) Charakterisierung des Keratinhydrolysats:

Cystingehalt im Hydrolysat:

•—3 ι

58 χ 10 Mol pro 100 g Gesamtprotein

Cystingehalt im ursprünglichen Keratin:. 62 χ 10 Mol pro 100 g Gesamtprotein.

Beispiel

a) Erste Stufe: Sensibilisierung

100 g geschnittene Haare (Abschnitte mit einer Länge von 2 cm) werden in 2 Liter auf 90 C vorgeheizte Ameisensäure getaucht. Die Lösung wird zum Sieden gebracht und 30 Minuten am Rückfluß gekocht.

Die Haare werden abfiltriert, mit reichlich demineralisi:ertem Wassser, dann mit Alkohol und Äther gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet. ;

130019/0 8 91

b) Zweite Stufe: Enzymatischer Abbau

Man geht gemäß Beispiel 1 vor und erhält folgende Ergebnisse;

1) Ausbeute des enzymatischen Abbaus:

nicht sensibilisierte Kontrollhaare 5 %

sensibilisierte Haare 14 %

2) Charakterisierung des Keratinhydrolysats:

Cystingehalt im Hydrolysat: - .

59 χ 10~³ "Mol pro 100 g Gesamtprotein

Cystingehalt im ursprünglichen Keratin: 62 χ 10 Mol pro 100 g Gesamtprotein.

Beispiel

a) Erste Stufe: Sensibilisierung:

100 g geschnittene Haare (Abschnitte mit einer Länge von 2 cm) werden in zwei Liter auf 90 C vorgeheizte Ameisensäure getaucht. Die Lösung wird zum Sieden gebracht und 30 Minuten am Rückfluß gekocht. Die Haare werden abfiltriert, erneut in 2 Liter Ameisensäure getaucht und 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Haare werden abfiltriert, mit reichlich demineralisiertem Wasser, dann mit Alkohol und Äther gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet. '

b) Zweite Stufe: Enzymatischer Abbau:

Man geht gemäß Beispiel 1 vor und erhält folgende Ergebnisse";

1) Ausbeute des enzymatischen Abbaus:

nicht sensibilisierte Kontrollhaare 5 %

sensibilisierte Haare 23 %

COPY

(30019/089 1

2) Charakterisierung des Keratinhydrolysats;

Cystingehalt im Hydrolysat ■. ~^#

_3
57 χ 10 Mol pro 100 g Gesamtproteine

Cystingehalt im ursprünglichen Keratin: 62 χ 10 - pro 100 g Gesamtprotein.

Beispiel 10

a) Erste Stufe: Sensibilisierung

Man stellt eine Lösung von Lithiumbromid her, indem man

1 737 g Lithiumbromid in demineralisiertem Wasser solubilisiert und auf 2 Liter auffüllt.

100 g geschnittene Haare (Abschnitte mit einer Länge von

2 cm) werden in 2 Liter der auf 90 ⁰C vorgeheizten Sensibilisierungslösung getaucht. Die Lösung wird zum

. Sieden gebracht und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Die Haare were on ■· bf iltriert, mit reichlich demineralisiertem, heißem Wasser, dann m:^J- Alkohol und Äther gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet.

b) Zweite Stufe: Enzymatischer Abbau

Man geht gemäß Beispiel 1 vor und erhält folgende Ergebnisse:

1.) Ausbeute des enzymatischen Abbaus:

nicht sensibilisierte Kontrollhaare 5 %

sensibiliiserte Haare 75 %

2) Charakterisierung des Keratinhydrolysats: Cystingehalt im Hydrolysat: 53 χ 10 Mol pro 100 g Gesamtprotein

Cystingehalt im ursprünglichen Keratin: 62 χ 10~ Mol für 100 g Gesamtprotein

COPY

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Beispiel 11

a) Erste Stufe: Sensibilisierung

Man stellt eine Lösung von Lithiumbromid her, indem man 1390 g LiBr in demineralisiertem Wasser solubilisiert und auf 2 Liter auffüllt. 100 g geschnittene Haare (Abschnitte mit einer Länge von 2 cm) werden in 2 Litern der auf 90 ⁰C vorgeheizten Sensibilisierungslösung getaucht. Die Lösung wird zum Sieden gebracht und 4 Stunden am Rückfluß gekocht. Die Haare werden abfiltriert, mit reichlich demineralisiertem, heißem Wasser, dann mit Alkohol und Äther gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet.

b) Zweite Stufe: Enzymatischer Abbau

Man geht gemäß Beispiel 1 vor und erhält folgende Ergebnisse:

1) Ausbeute des enzymatischen Abbaus:

nicht sensibilisierte Kontrollhaare 5 %

sensibilisierte Haare 15 %

2) Charakterisierung des Keratinhydrolysats:

Cystingehalt im Hydrolysat:
54 χ 10 Mol pro 100 g Gesamtprotein Cystingehalt im ursprünglichen Keratin: 62 χ 10 Mol pro 100 g Gesamtprotein

Beispiel 12

a) Erste Stufe: Sansibilisierung

Man stellt eine Lösung von Lithiumbromid her, indem man

Wasser

1 737 g LiBr in demineralisiertem/solubilisiert und auf

2 Liter auffüllt. 100 g geschnittene Haare (Abschnitte mit einer Länge von 2 cm) werden in 2 Liter der Sensibilisierungslösung getaucht. Die Lösung wird auf 100 ⁰C erhitzt und dann 16 Stunden bei dieser Temperatur gehalten.

30019/0891

M/21 244 - 21 -

Die Haare werden abfiltriert, mit reichlich demineraiisiertem, heißem Wasser, dann mit Alkohol und Äther gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet.

b) Zweite Stufe: Enzymatischer Abbau

Man geht gemäß Beispiel 1 vor wobei man folgende Ergebnisse

erhält:

1) Ausbeute des enzymatischem Abbaus

i.icht sensibilisierts Kontrollhaare 5 % sensibilisierte Haare 13 %

2) Charakterisierung des Keratinhydrolysats;

Cystingehalt im Hydrolysat:

60 χ 10 ~ Mol pro 100 g Gesamtprotein.

Cystingehalt im ursprünglichen Keratin: 62 χ 10~° Mol pro 100 g Gesamtprotein

Beispiel 13

a) Erste Stufe: Sensibilisierung

Man geht gemäß Beispiel 10 vor. Nachdem die Haare eine Stunde in der Lithiumbromidlösung am Rückfluß gekocht worden sind, werden sie filtriert, dann mit reichlich demxneralxsxertem, heißem Wasser und Alkohol gewaschen. Sie werden dann in zwei Liter auf 140 ⁰C vorgeheiztes Dimethylformamid getaucht. Die Lösung wird zum Sieden gebracht und 30 Minuten am Rückfluß gekocht. Die Haare werden abfiltriert, mehrere Male mit demineraiisiertem Wasser, dann mit Alkohol und Äther gespült und bei Raumtemperatur getrocknet.

130019/0891

b) Zweite Stufe: Enzymatischer Abbau

Man geht gemäß Beispiel 1 vor und erhält folgende Ergebnisse:

1) Ausbeute des enzymatischen Abbaus:

nicht sensibilisierte Kontrollhaare 5 %

sensibilisierte Haare 91 %

2) Charakterisierung des Keratinhydrolysats:

Cystingehalt im Hydrolysat:

50 χ 10~ Mol pro 100 g Gesamtprotein

Cystingehalt im ursprünglichen Keratin: 62 χ 10 Mol pro 100 g Gesamtprotein

Beispiel 14

a) Erste Stufe: Sensibilisierung

Man stellt eine Lithiumbromid-Lösung her, indem man 1 737 g LiBr in demineralisiertem Wasser solubilisiert und auf

2 Liter auffüllt. ■

100 g Hornpulver werden in 2 Liter einer auf 90 °C vorgeheizten Sensxbilisierungslösung getaucht. Die Lösung wird zum Sieden erhitzt und 1 Stunde am Rückfluß gekocht. Das Hornpulver wird abfiltriert, mit reichlich demineralisiertem, heißem Wasser, dann mit Alkohol und Ä'ther gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet.

b) Zweite Stufe: Enzymatischer Abbau

Eine Enzymlösung, die Proteinase "PSF 2019" (Societe Oril, Paris) enthält, wird kurz vor der Verwendung hergestellt. Sie besitzt folgende Zusammensetzung':

13 0019/0891

Proteinase "PSF 2019", gereinigt,
(11 000 Anson-Einheiten/mg) 2, 5 g

Tris(hydroxymethyl)-aminomethan 24,2 g

HCl (1 normale Lösung) 55 ml

MgCl₂, 6 H₂O 0,03 g

demineralisiertes Wasser soviel wie nötig auf 2000 ml

Das mit Lithiumbromid vorsensibilisierte Hornpulver wird in die auf 4 0 ⁰C geheizte Enzymlösung eingetaucht und

gerührt.

Der Abbau dauert 4 Tage. Der unlösliche Rückstand wird

filtriert und die Lösung neutralisiert.

Es werden die folgenden Ergebnisse erhalten:

1) Ausbeute des enzymatischen Abbaus

nicht sensibilisiertes Hornpulver

als Kontrolle 46 %

sensibilisiertes Hornpulver 62 %

2) Charakter is it,., .j - is Keratinhydrolysats:

Cystingehalt im Hydroxysau:

25 χ 10 Mol pro 100 g Gesamtprotein

Cystingehalt im ursprünglichen Keratin:
31 χ 10 Mol pro 100 g Gesamtprotein.

Beispiel 15

a) Erste Stufe: Sensibilisierung

100 g Hornpulver v/erden in 2 Liter auf 120 °C vorgeheiztes Dimethylformamid getaucht. Die Lösung wird 4 'stunden bei 120 °C gehalten.

130019/0891

Das Hornpulver wird abfiltriert, mehrere Male mit demineralisiertem Wasser, dann mit Alkohol und Äther gespült und bei Raumtemperatur getrocknet.

b) Zweite Stufe Enzymatischer Abbau

Eine Enzymlösung, die Chymotrypsin enthält, wird kurz vor der Verwendung hergestellt.

Sie hat folgende Zusammensetzung:

Alpha-Chymotrypsin (47 E/mg) 1,5 g

Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan 24,2 g

HCl (1 normale Lösung) 100 ml

demineralisiertes Wasser soviel wie nötig auf 2000 ml

Das mit Dimethylformamid vorsensibilisierte Hornpulver wird in die auf 4 0 C geheifete Enzymlösung eingebracht und gerührt. Der Abbau dauert 4 Tage.

Der unlösliche Rückstand wird abfiltriert und die Lösung neutralisiert.

Man erhält folgende Ergebnisse:

1) Ausbeute des enzymatisehen Abbaus:

nicht sensibilisiertes Hornpulver als 18 % Kontrolle,

sensibilisiertes Hornpulver 35 %.

2) Charakterisierung des Keratinhydrolysats:

Cystingehalt im Hydrolysat:

24 χ 10 Mol pro 100 g Gesamtprotein

Cystingehalt im ursprünglichen Keratin: 31 χ 10 Mol pro 100 g Gesamtprotein.

130019/0891

Beispiel 16 a} Erste Stufe: Sensibilisierung

10Og saubere Kaninchenhaare werden in 2 Liter auf 120 ⁰C vorgeheiztes Dimethylformamid getaucht. Die Lösung wird 3 Stunden bei 120 °C gehalten, Die Kaninchenhaare v/erden abfiltriert, mehrere Male mit demineralisiertem Wasser, dann mit Alkohol und Äther gespült und bei Raumtemperatur getrocknet.

b) Z^T.;sJ-te Stufe: Enzymatischer Abbau

Eine Enzymlösung, die Pronase enthält (KOCH-LIGHT), wird kurz vor der Verwendung hergestellt. Sie besitzt folgende Zusammensetzung:

Pronase (aus streptomycins griseus) 2,4 g

Borsäure (H₃BO₃) 22,5 g

1 normale Natriumhydroxidlösung 130 ml

MgCl₂, 6H₂O 0,03 g

demineralisiertes Wasser soviel wie nötig auf 2000 ml

Die mit Dimethylformamid vörsensibilisierten Kaninchenhaare werden in eine auf 40 C gebrachte Enzymlösung getaucht und gerührt. Der Abbau dauert 4 Tage. Der unlösliche Rückstand wird abfiltriert und die Lösung wird neutralisiert. Man erhält folgende Ergebnisse:

1) Ausbeute des enzymatischen Abbaus:

nicht sensibilisierte Kaninchenhaare

als Kontrolle 4 %

sensibilisierte Kaninchenhaare 78 %

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2) Charakterisierung des Keratinhydrolysats:

Cystingehalt im Hydrolysat:

23,5 χ 10~ Mol pro 100 g Gesamtprotein

Cystingehalt im ursprünglichen Keratin:

_3
31 χ 10 Mol pro 100 g Gesamtprotein.

Beispiel 17

a) _rste Stufe: Sensibilisierung

Man stellt eine Lithiumbromid-Lösung her, indem man 1737 g LiBr in demineralisiertem Wasser solubilisiert und auf 2 Liter auffüllt. 100 g saubere Kaninchenhaare werden in 2 Liter einer auf 90 °C vorgeheizten Sensibilisierungslösung getaucht. Die Lösung wird zum Sieden gebracht und 1 Stunde am Rückfluß gekocht.

Die Kaninchenhaare werden abfiltriert, mit reichlich demineralisiertem, heißem Wasser, dann mit Alkohol und Äther gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet.

b) Enzymatischer Abbau (Zweite Stufe) i

Eine Enzymlösung, die Trypsin enthält, wird kurz vor der ' Verwendung hergestellt. Sie besitzt folgende Zusammensetzung: '

Trypsin pur (317 E/mg) 15 g

Borsäure (H₃BO₃) 50 g

1 normale Natriumhydroxidlösung 290 ml

demineralisiertes Wasser soviel wie notig auf 5000 ml.

Die mit Lithiumbromid vorsensibilisierten Kaninchenhaare werden in eine auf 40 C gebrachte Enzymlösung getaucht und gerührt. Der Abbau dauert 4 Tage. Der unlösliche Rückstand wird abfiltrier und die Lösung

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neutralisiert. Man erhält die folgenden Ergebnisse:

1) Ausbeute des enzymatischen Abbaus

nicht sensibilisierfce Kaninchenhaare 3 sensibilisierte Kaninchenhaare 33

2) Charakterisierung des Keratinhydrolysats

Cystingehalt im Hydrolysat

25 χ 10~ Mol pro 100 g Gesamtprotein

Cystingehalt im ursprünglichen Keratin: 31 χ 10 Mol pro 100 g Gesamtprotein

Beispiel

a) Erste Stufe: Sensibilisierung

100 g Geflügelfedern (Daunen) werden in 2 Liter auf 120 °C vorgeheiztes Dimethylformamid getaucht. Die Lösvng wird 4 Stunden ... 120 C gehalten. Die Federn werden abfiltriert, mehrere Mal, ;v demineralisiertem Wasser, dann mit Alkohol und Äther gespült und bei Raumtemperatur getrocknet.

b) Zweite Stufe: Enzymatischer Abbau

Eine Enzymlösung, die Pronase (KOCH-LIGHT) enthält, wird kurz vor der Verwendung hergestellt. Sie hat folgende Zusammensetzung:

Pronase (ex streptomyces griseus) 2,4 g

Tris(hydroxymethy1}ar ^A omethan 24,2 g

HCl (1 normale Lösung) 55 ml

MgCl₂, 6H₂O 0,03 g

eiitmineralisiertes Wasser soviel wie nötig auf 2000 ml.

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M/21 244 - 28 - 3040

Die mit Dimethylformamid vorsensibilisierten Federn werden in eine auf 40 ⁰C gebrachte Enzymlösung getaucht und gerührt. Der Abbau dauert 4 Tage. Der unlösliche Rückstand wird abfiltriert und die Lösung neutralisiert. Man erhält folgende Ergebnisse:

1) Ausbeute des enzymatischen Abbaus

nicht sensibilisierte Federn als Kontrolle 10 % sensibilisierte Federn 27 %

2) Charakterisierung des Keratinhydrolysats:

Cystingehalt im Hydrolysat

_3
31,5 χ 10 Mol pro 100 g Gesamtprotein

Cystingehalt im ursprünglichen Keratin 34 χ 10 Mol pro 100 g Gesamtprotein

Die Proteinhydrolysate beinflussen, wenn sie in Pflegeoder Behandlungsmitteln vorhanden sind, das Haar vorteilhaft. Die positiven physiologischen und kosmetischen Wirkungen erklären sich dadurch, daß sich mehr oder weniger in der Epidermis der Haare ein Proteindepot bildet, das die Haare gegen chemische oder physikochemische Belastungen schützt und sie leicht frisierbar macht. Die Keratinhydrolysate sind reich an Schwefel und ähneln den Haaren in ihrer chemischen Zusammensetzung stark und stellen somit ideale Proteine für die Haarpflege dar.

Es folgen zwei Beispiele für die Verwendung der erfindungsgemäßen Keratinhydrolysate.

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Beispiel 19 Vitalisierende Lotion
Die Lotion hat die folgende Zusammensetzung:

Keratinhydrolysat 1 g

mit 20 Mol Ethylenoxid polyoxyäthylenierter Oleinäther (verkauft unter der Handelsbezeichnung "BRIJ 98" durch die Fa. ATLAS;

Essigsäure , so viel wie nötig für Farbstoff

Parfura

Alkohol

demineralisiertes Wasser soviel wie nötig auf

Alkohol ( 96°)

0,1	g
pH 7
0,1	g
0,1	g
10	ml
100	ml

Die Lotion wird auf die Haare aufgebracht und durch eine leichte Massage gut verteilt, Anschließend wird bei Raumtemperatur oder unter einer Haube getrocknet.

Beispiel 20

Spüllotion

Die Lotion besitzt folgende Zusammensetzung:

Keratinhydrolysat 1 g

mit 20 Mol Äthylenoxyd polyoxyäthylenierter Oleinäther (verkauftunter der Handelsbezeichnung "BRIJ 98" von Fa. ATLAS) 6,1 g

Essigsäure soviel wie nötig für pH 7

Farbstoff 0,1 g

Parfüm 0,1 g

demineralisiertes Wasser soviel wie nötig auf 100 ml

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M/21 244

Diese Lotion wird homogen auf saubere Haare aufgebracht. Nach einer Einwirkungszeit von ungefähr 5 Minuten werden die Haare mit Wasser gespült und unter einer Haube getrocknet.

Die Wirkungen der erfindungsgemäßen Keratinhydrolysate wurden mit den Wirkungen der Keratinhydrolysate des Standes der Technik verglichen. Dazu wurden die auf der Oberfläche abgelagerten Mikrostrukturen bewertet. Man hat in den Lotionen der Beispiele 19 und 20 drei Arten von KeratinhydroIysäten verglichen:

Das gemäß Beispiel 2 der vorliegenden Anmeldung hergestellte Hydrolysat, ein Chlorwasserstoffsäurekeratinhydrolysat und ein enzymatisches Hydrolysat, hergestellt aus einem abgebauten Keratin, das wenig Cystin enthält.

Auf der willkürlich verwendeten Skala sind die Produkte, die zwischen Null und 50 bewertet werden, für die Kosmetik geeignet. Je kleiner die Zahl ist, desto besser ist die Qualität des Depots.

verwendetes Hydrolysat

vitalisierende Spülloticn, aufLotion, aufgetragen getragen auf auf entfärbte Haare entfärbte Haare (Beisp. 19) (Beisp. 20)

gemäß Beispiel 2 hergestelltes Keratinhydrolysat - reich an

Cystin (1000 <Molekulargewicht< 5000)

Chlorwasserstoffsäure-Hydrolysat (Molekulargewicht Ci 130)

enzymatisches Hydrolysat von abgebautem Keratin - arm an Cystin

(1000 < Molekulargewicht <5000)

19

48

65

11

31

49

130 019/0891

Das gemäß Beispiel 2 der vorliegenden Erfindung hergestellte Keratinhydrolysat führt zu einer Ablagerung oder einem Depot, das am besten für die Kosmetik geeignet ist. Die so behandelten Haare werden durch das Depot nicht beschwert und werden deutlich in ihren Eigenschaften verbessert.

111/Hch

130019/0891

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von oligopeptidhaltigen Mitteln durch Hydrolyse eines Keratinmaterials und Behandlung mit proteolytischen und/oder keratolytischen Enzymen, dadurch gekennzeichnet,

daß man das Keratinmaterial vor der enzymatischen Behandlung einer Vorbehandlung mit mindestens einem Sensibilisierungsmittel, ausgewählt unter Elektrolyten, die in wäßrigem Milieu in einer Konzentration größer oder gleich 8 Mol pro Liter vorliegen, und polaren Lösungsmitteln unterwirft, oder, falls das Keratinmaterial Hautkeratin ist, Ultraschall und/oder Ameisensäure in einer Konzentration im Behandlungsmilieu von mehr als 90 Gew.-% als hautablösendes Mittel für die Vorbehandlung einsetzt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Elektrolyt Lithiumbromid ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

daß das Milieu, in dem die Behandlung durchgeführt wird, mindestens 75 Gew.-% polare Lösungsmittel enthält.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das polare Lösungsmittel Dimethylformamid und/oder Methanol ist.

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5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Sensxbxlisierungsbehandlung mittels mindestens eines Elektrolyten und/oder mindestens eines polaren Lösungsmittels langer als 30 Minuten zwischen Raumtemperatur und der Siedetemperatur des Milieus bei Atmosphärendruck durchgeführt wird.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei als hautablösendes Mittel Ameisensäure verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Sensxbxlisierungsbehandlung länger als 30 Minuten zwischen Raumtemperatur und der Siedetemperatur bei Atmosphärendruck durchgeführt wird.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei für die Hautablösung Ultraschall verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, daß man Ultraschall mit einer Frequenz zwischen 20 KHz und 70 KHz verwendet und langer als 30 Minuten einwirken läßt, wobei die abgestrahlte Energie 50 bis 150 Watt pro behandelter dm beträgt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die an die Sensxbxlisierungsbehandlung j anschließende enzymatische Behandlung bei einem pH kleiner '_ oder gleich 9, einer Temperatur unter 50 ⁰C und mit einer , wirksamen Konzentration an Enzymen durchgeführt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatische Behandlung 20 bis 90 Stunden dauert.

10. Oligopeptidhaltige, durch das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 erhaltene Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens 75 Gew.-% der in den Mitteln enthaltenen Oligopeptide ein Molekulargewicht zwischen 1000 und 5000

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besitzen, wobei die Mittel außerdem mindestens 30 Gew.-% der in dem als Rohstoff dienenden Keratonmaterial vorhandenen Cystingruppen enthalten.

11. Verwendung der Mittel gemäß Anspruch 10 zur Behandlung der Haare oder der Haut oder in der Nahrungsmittelindustrie.

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