DE2942617A1

DE2942617A1 - Verfahren und vorrichtung zur quantitativen bestimmung von malondialdehyd

Info

Publication number: DE2942617A1
Application number: DE19792942617
Authority: DE
Inventors: Jacqueline Lansen; Romeo Roncucci
Original assignee: Continental Pharma Inc
Current assignee: Continental Pharma Inc
Priority date: 1978-10-27
Filing date: 1979-10-22
Publication date: 1980-05-08
Also published as: IT1125601B; IT7926792A0; GB2036310A; LU80437A1; US4318706A; NO154287C; AR225295A1; FI71431B; NO793463L; DE2942617C2; IN151553B; SE7908794L; FR2439996A1; CA1121702A; JPS5589751A; FI71431C; BE879668A; NL7907787A; FI793270A; NO154287B

Description

29Α7Π17

Anmelderin: Stuttgart, den 18. Okt. 1979

Continental Pharma P 3781 S/Bn

135» avenue Louise

Bruxelles, Belgien

societ^e anonyme beige

Vertreter:

Kohler-Schwindling-Späth

Patentanwälte

Hohentwielstr . /+1

7000 Stuttgart - 1

Verfahren und Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung von Malondialdehyd

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Malondialdehyd, insbesondere des Malondialdehyds von Blutplättchen.

Nach der Erfindung stellt man eine Folge von durch Gasmengen getrennte, Malondialdehyd enthaltende Proben her, unterwirft die Proben einer Dialyse zur Entfernung der Proteine und bestimmt dann den Gehalt an Malondialdehyd durch Kolorimetrie.

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Obwohl die Erfindung nicht auf die quantitative Bestimmung des Malondialdehyds der Blutplättchen beschränkt ist, liegt hierin doch eine bevorzugte Anwendung.

Die Blutplättchen sind in der Lage, ausgehend von Arachidonsäure bedeutende Mengen an Endoperoxiden zu erzeugen. Diese Umwandlung wird durch das Enzymsystem der Cyclooxygenasen bewirkt.

Die Endoperoxide wandeln sich ihrerseits in verschiedene Metaboliten um, zu denen das Melondialdehyd (MDA) gehört. E^ ist bekannt, daß die Einnahme von Acetylsalicylsäure (Aspirin) in irreversibler Weise das System der Cyclooxygenasen der Blutplättchen verändert und auf diese Weise die Produktion der Endoperoxide der Blutplättchen verhindert. Die Produktion von MDA, des metabolischen Derivats der Endoperoxidc ist gleichfalls in irreversibler Weise inhibiert. Aus diesem Grunde bildet die quantitative Bestimmung des Gehaltes der Blutplättchen an MDA vor und nach einer oralen Dosis von Acetylsalicylsäure eine Möglichkeit, die Regeneration der Blutplättchen zu bestimmen.

Tatsächlich verlieren die Blutplättchen, die in vivo mit der Acetylsalicylsäure in Berührung kommen, ihre Fähigkeit, in normaler Weise MDA zu erzeugen. Dagegen tritt diese Inhibition nicht für diejenigen Blutplättchen ein, die nach der Ausscheidung des Aspirin, die übrigens sehr schnell erfolgt, in den Kreislauf eintreten. Wenn man also den Gehalt an MDA mit demjenigen vergleicht, der vor der Einnahme von Acetylsalicylsäure bestand, kann man durch Anlegen einer geeigneten Graphik die Regenerationszeit der Blutplättchen ermitteln.

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Es ist ersichtlich, daß auf dieser Basis, im Gegensatz

zur Cr-Methode, bei dieser Technik eher die Geschwindigkeit der Erzeugung von Blutplättchen durch das Knochenmark anstatt der Geschwindigkeit ihrer Zerstörung gemessen wird.

Nachstehend wird als nicht einschränkendes Beispiel eine spezielle Art der quantitativen Bestimmung von Malondialdehyd nach der Erfindung beschrieben. Es handelt sich dabei um eine halbautomatische Bestimmung des Malondialdehyds der Blutplättchen. Sie umfaßt einen manuellen Abschnitt zur Vorbereitung von Proben, welche das Malondialdehyd enthalten, und einen automatischen Abschnitt zur eigentlichen quantitativen Bestimmung des Malondialdehyds, das in den Proben enthalten ist. Es versteht sich, daß auch der erste Abschnitt automatisiert werden kann, um ein vollständig automatisiertes Verfahren zu erhalten.

Manueller Abschnitt

Es werden 9 ml menschliches Venenblut entnommen und durch Zugabe von 1 ml einer 0,129 M-Lösung Trinatriuracitrat am Gerinnen gehindert. Das an Blutplättchen reiche Plasma (PRP) wird durch Zentrifugieren der Gesamtmenge des Blutes bei 200 g während 10 Minuten bei ZZ C erhalten. Die Auszählung der Blutplättchen erfolgt für jede PRP-Probe mit Hilfe eines Thrombocounter (Coulter Electronics). Dann werden Plättchenrückstände durch Zentrifugieren von 2 ml des PRP erhalten (2000 g,30 Min«, 22⁰C). Diese Rückstände werden in 2 ml eines Phosphatpuffers mit einem pH von 7,k (1,36 Vol.% Na₂HPO,, 0,33 Vol.% NaOH) suspendiert und 15 Min. lang bei 37°C in Gegenwart von N-Äthylmaleinimid (1 mM, NEM) oder Arachidonsäure (0,6^ mM, AA) ruhen gelassen. Diese Agentien stimulieren die Produktion des

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MDA der Blutplät tchen. Nach dieser Incubationszeit v/erden die Proben 15 Min. lang einer Ultraschallbehandlung ausgesetzt. Die Blutplättchen-Rückstände werden durch Abfiltrieren mittels eines Seraclear-Filters eliminiert.

Automatischer Abschnitt

Das FluiSdiagramm für die automatische quantitative Bestimmung des Malondialdehyds der Blutplättchen ist in der beigefügten Zeichnung wiedergegeben. Die für diese Bestimmung verwendeten Technicon -Module sind die folgenden: Ein Probenverteiler vom Typ II, der die Entnahme von ^O Probon pro Stunde ermöglicht (Verhältnis der Probenentnahme zur Probenreinigung =2 : I)₁ eine mehrkanalige Schlauch-Dosierpumpe vom Typ II, eine Dialyseeinrichtung, die mit einer auf 37 C gehaltenen Cuprophan-Membran versehen ist, ein thermostatisch geregeltes ölbad, dessen Temperatur auf 82°C eingestellt ist, ein Kolorimeter mit einer rohrförmigen Küvette mit einem optischen Weg von 15 mm Länge und einem 530 nm-Filter, ein Tintenschreiber mit vierfacher Maßstabsdehnung, ein Transformator und ein Spannungsstabilisator.

Es wurden zwei Lösungen von Perchlorsäure (PCA) hergestellt, die eine Konzentration von 2 bzw. 10 Vol.% aufwiesen. Zu jeder Lösung wurden 0,05 Vol.% Brij-35 hinzugefügt, um die Blasenbildung im Strom zu regulieren.

Nach der Technik, die in dem Aufsatz "A Simple non radioisotope technic for the determination of Platelet Life-Span¹¹ von Marie J. Stuart, Scott Murphy und Frank A. Oski in "The new England Journal of Medecine", 19. Juni 1975, Seiten 1310 - 1313, beschrieben ist, wurde eine

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0,8 Gew.% enthaltende Losung von 2-Thiobarbitursäure hergestellt.

Die 10 /oige PCA-Lösung wird dem Strom der zuvor durch Luft oder ein anderes Gas in Abschnitte unterteilten Probe beigemischt. Die ausgefällten Proteine werden durch eine Dialyse bei 37⁰C entfernt, und es wird das MDA in einem Gegendialyse-Blasenstrom der 2 %igen PCA aufgenommen. Zu dem Strom der Gegendialyse wird die Lösung der 2-Thiobarbitursäure hinzugefügt. Eine Incubation von 10 Min. bei 82 C ermöglicht die Bildung eines rosa gefärbten Komplexes zwischen dem MDA und der 2-Thiobarbitursäure. Diese Färbung wird nach dem Abkühlen der Mischung auf Umgebungstemperatur mittels eines Wärmetauschers (Sinned-cooler) bei 530 nM abgelesen.

Es wird eine Losung von 10 mM der MDA durch Hydrolyse von Malondialdehyd-Tetraäthylacetal mit 0,5 N Salzsäure hergestellt. Es werden anhand von MDA-Lösungen,deren Konzentrationen zwischen 0,25 und 3 nMol/ml variieren, Weichkurven erstellt. Diese Lösungen werden erhalten, indem die Ausgangslösung mit destilliertem Wasser verdünnt wird.

Grenzen der Leistungsfähigkeit der automatischen Bestimmung von MDA

a) Die Leistung der Ausgabeeinrichtung für die Proben kann in den Grenzen von 20 bis 70 pro Stunde variieren. Das Verhältnis Probe zu Reinigung kann im Bereich von 2 : 3 bis 2 : 1 variieren.

b) Die Antriebsgeschwindigkeit des Pumpenmotors kann nach Belieben geändert werden·

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c) Die Dauer der Dialyse kann beispielsweise zwischen und 1ü Min· variieren. Bevorzugt wird eine Dauer im Bereich von 3 Min. wahrend die Temperatur im allgemeinen zwischen 20 und 50⁰C und vorzugsweise zwischen 35 und L\ö° C liegt. Jedenfalls sind die in dem vorstehenden Beispiel angegebenen Bedingungen die optimalen. Der Strom der Gegendialyse kann von einer wässrigen Säurelösung mit schwacher Konzentration gebildet werden. Die Art der Säure ist von relativ geringer Bedeutung, Jedoch sollte ihre Konzentration vorzugsweise 5 % nicht überschreiten. Außer Perchlorsäure (PCA) kann beispielsweise H-,PO^ , CH,.COOH oder CCl-XOOH verwendet werden·

d) Die Konzentration der Säure, die zum Ausfällen der Proteine benutzt wird, ist nicht kritisch. PCA kann beispielsweise in Konzentrationen zwischen 5 und 12 % verwendet werden. Die Vorwendung hoher Konzentrationen an PCA führt jedoch zu Korrosions-Problemen, insbesondere im Bereich des Dialyse-Systems. In dieser Phase des Verfahrens könnte die PCA auch durch eine andere der oben angegebenen Säuren ersetzt werden. Ks kann sich dabei um die gleiche oder um eine andere Säure handeln, als in der Gegen-Dialyse verwendet wird«

e) Eine Verminderung der Konzentration der 2-Thiobarbiturs^:iui\: hat eine Verminderung der Färbung zur Folge. i'Jino Erhöhung der Konzentration an 2-Thiobarbitursäure trägt nicht zur Erhöhung der Empfindlichkeit bei.

f) Diu Zuii, des Durchlaufes durch das Ölbad und dessen Temperatur sind in dem vorstehend behandelten System gewürdigt. Eine Erhöhung der Temperatur verhindert eine

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gute Regelung des Durchflusses, wogegen eine Verminderung der Temperatur einen Empfindlichkeitsverlust nach sich zieht. Die beschriebene Incubationsdauer (10 Min.) ist ausreichend, um eine vollständige Reaktion zwischen dem MDA und der 2-Thiobarbitursäure zu gewährleisten. Diese Zeit kann erhöht, jedoch nicht vermindert werden.

Zusammenfassend ist festzustellen, daß die vorstehend beschriebenen Bedingungen für die automatische Bestimmung des MDA der Blutplättchen optimalisiert worden sind. Jede Veränderung des in der Zeichnung angegebenen Schemas konnte einen Verlust an Empfindlichkeit zur Folge haben.

Die Vorrichtung zur Durchführung des automatischen Abschnittes des Verfahrens, auf welche vorstehend Bezug genommen worden ist und die in der beigefügten Zeichnung dargestellt ist, wird nachstehend mehr im einzelnen beschrieben.

Die Vorrichtung umfaßt eine hintereinander angeordnete Folge von Einrichtungen oder Geräten, nämlich eine Ausgabeeinrichtung 1 für Proben, eine Dialyseeinrichtung 2, ein Ölbad 3| ein Kolorimeter l\. und einen Schreiber 5·

Die Ausgabeeinrichtung 1 ist mit der Dialyseeinrichtung 2 durch ein Rohr 6 oder einen Schlauch verbunden. An dieses Rohr 6 sind nacheinander eine Luftzuführung 7 zur Unterteilung der der Dialyseeinrichtung zugeführten Probe in Abschnitte, die im wesentlichen gleiche Längen und gleiche Abstände voneinander haben, und eine Zufuhr 8 für 10 %ige Perchlorsäure angeschlossen, die dazu bestimmt ist, mit den Proben vermischt zu werden, um daraus die Proteine auszufällen. Weiterhin ist in Flußrichtung hinter der Stelle, wo die

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Perchlorsäure zugeführt wird, im Rohr 6 eine Mischschlange 9 angeordnet, die es erlaubt, an dieser Stelle im Rohr 6 eine im wesentlichen turbulente Strömung zu erzeugen, welche eine homogene Vermischung der Perchlorsäure mit den Proben gewährleistet.

Die genannten ausgefällten Proteine werden bei 10 eliminiert.

Eine Leitung 11, an die eine weitere Luftzuführung 12 angeschlossen ist, erlaubt es, den genannten Blasenstrom zur Gegen-Dialyse mit 2 %iger Perchlorsäure zu bilden. Die 2-Thiobarbituräsure-Lösung wird dem Blasenstrom mittels einer Leitung 13 zugeführt. Das Ganze wird dann in einer Mischschlange 1/f gemischt, bevor es zum ölbad gelangt, wo eine Temperatur im Bereich von 82⁰C eingehalten wird.

Der Strom, der dieses Ölbad passiert hat, wird dann mittels eines Rohres 15 dem Kolorimeter /+ zugeführt, nachdem er mittels eines Kühlers 16 vom Typ "Sinned-cooler" auf Umgebungstemperatur gebracht worden ist.

Ein Teil der Probe durchläuft das Kolorimeter ^, um den Gehalt an MDA bestimmen zu können, während ein Überschuß zuvor über eine Leitung 17 nach 18 abgeführt wird. Der Anteil, der das Kolorimeter passiert hat, wird anschließend über eine Leitung 19 ebenfalls nach 18 abgeführt.

Endlich ist die Zuführung von Waschwasser über eine Leitung 20 vorgesehen, die zum Reinigen der Entnahmenadel der Einrichtung zur Probenverteilung sowie zur Unterteilung der Probe in Abschnitte und zu deren Mischung

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mit der PCA dient. Das Wasser und die Reinigungs-Rückstände werden bei 21 entfernt. Der Fluß durch die verschiedenen Leitungen, Rohre und Zuflüsse wird durch eine Pumpe 22 bewirkt.

Bei dem vorstehend beschriebenen, konkreten Beispiel werden die Proben durch ein Rohr 6 mit einem Innendurchmesser von 1 ,295*+ mm, die Luft durch ein Rohr mit einem Innendurchmesser von 1,0160 mm und die 10 %ige PCA durch ein Rohr mit einem Innendurchmesser von 0,8890 mm zugeführt.

Die 2 %ige PCA für die Gegen-Dialyse wird durch eine Leitung 11 mit einem Innendurchmesser von 1,422/f nun zugeführt, während diesem PCA-Strom die Luft durch eine Leiting 12 mit einem Innendurchmesser von 1, Hf30 mm zugeführt wird.

Die Thiobarbitursaure wird durch eine Leitung 13 mit einem Innendurchmesser von 1,270 mm zugeführt. Der Innendurchmesser der das Waschwasser führenden Leitung beträgt 1,85^2 mm.

Es sei angemerkt, daß die Innendurchmesser der verschiedenen Rohre in gewissen Grenzen verändert werden können. Um eine automatische Bestimmung des MDA unter optimalen Bedingungen zu gewährleisten, erweist sich jedoch ein ziemlich genaues Einhalten der Verhältnisse zwischen den Innendurchmessern der verschiedenen Rohre, die erfindungsgemäß die geregelte Zufuhr der richtigen Mengen mittels der Pumpe 22 zulassen, als notwendig.

Allgemein bestehen alle Rohre und Leitungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung aus Glas.

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Claims

Patentansprüche

1·)Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Malondialdehyd, insbesondere des Malondialdehyds der Blutplättchen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Folge von durch Gasmengen getrennte, Malondialdehyd enthaltende Proben herstellt, die Proben einer Dialyse zur Entfernung der Proteine unterwirft und dann ihren Gehalt an Malondialdehyd durch Kolorimetrie bestimmt,
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Bestimmung des Malondialdehyds von Blutplättchen aus einer bestimmten Blutmenge nacheinander ein an Blutplättchen reiches Plasma herstellt, die im Plasma enthaltenen Blutplättchen zählt, die Blutplättchen zum Absetzen bringt und die abgesetzten Blutplättchen durch Zugabe eines Phosphatpuffers bei einem pH-Wert von 7>k wieder suspendiert, zu der Suspension ein Aggregationsmittel hinzufügt, das die Produktion von Malondialdehyd der Blutplättchen fördert, wie z.B. Arachidonsäure oder N-Äthylmaleinimid, dann die genannten getrennten Proben herstellt und der genannten Dialyse unterwirft und endlich ein kolorimetrisches Reagenz hinzufügt, welches die Bestimmung des Gehaltes an Malondialdehyd durch Kolorimetrie gestattet.

3· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben nach der Zugabe von 2-Thiobarbitursäure als kolorimetrische Reaganz etwa 10 Min. lang auf einer Temperatur von etwa 82⁰C gehalten werden, bevor die Bestimmung des Gehaltes an Malondialdehyd durch Kolorimetrie erfolgt.

i+» Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung von Malondialdehyd, insbesondere des Halondialdehyds der Blutplättchen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Ausgabeeinrichtung (1) für Malondialdehyd enthaltende Proben,

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eine rnehrkanalige Schlauch-Dosierpumpe (2.2.), eine
Dialyseeinrichtung (2), ein auf einer Temperatur von etwa 82⁰C gehaltenes Flüssigkeitsbad (3) und ein
Kolorimeter (Zf) hintereinander geschaltet sind und ein Kanal (7) der Dosierpumpe (22) an eine Gasquelle zum Abteilen der Proben angeschlossen ist, die von einem anderen Kanal (6) der Pumpe der Dialyseeinrichtung
(2) zugeführt werden.

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