CH632845A5 - Procede et dispositif pour le dosage du dialdehyde malonique de plaquettes sanguines. - Google Patents

Description

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REVENDICATIONS

1. Procédé de dosage du dialdéhyde malonique de plaquettes sanguines, caractérisé en ce qu'on prépare une série d'échantillons de sang contenant du dialdéhyde malonique et segmentés par du gaz, et on soumet ces échantillons à une dialyse de manière à éliminer les protéines et à déterminer la teneur en dialdéhyde malonique par colorimétrie.

2. Dispositif pour la mise en œuvre du procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend, montés en série successivement, un distributeur d'échantillons (1) contenant du dialdéhyde malonique, une pompe péristaltique (22) proportionnante à multi-canaux, un dialyseur (2), un bain (3) d'un fluide maintenu à une température de l'ordre de 82°C et un colorimètre (4), un canal (7) de la pompe (22) étant raccordé à une source de gaz pour segmenter les échantillons dirigés par un autre canal (6) de la pompe vers le dialyseur.

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'on prépare, à partir d'une quantité déterminée de sang, un plasma riche en plaquettes, on effectue le comptage des plaquettes contenues dans le plasma, on sédimente les plaquettes, on les resuspend à pH 7,4 par l'addition d'un tampon phosphate, on ajoute un agent d'agrégation des plaquettes stimulant la production du dialdéhyde malonique plaquet-taire, on prépare les échantillons segmentés, on soumet ces échantillons à la dialyse et on ajoute un réactif colorimé-trique permettant la détermination de la teneur en dialdéhyde malonique par colorimétrie.

4. Procédé selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'on ajoute comme agent d'agrégation des plaquettes de l'acide arachidonique ou du N-éthylmaléimide.

5. Procédé selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce qu'on maintient les échantillons, après l'addition d'acide 2-thiobarbiturique comme réactif colorimétrique, pendant au moins 10 minutes à une température de l'ordre de 82°C avant la détermination de la teneur en dialdéhyde malonique par colorimétrie.

Un objet de la présente invention est le procédé de dosage du dialdéhyde malonique de plaquettes sanguines défini dans la revendication 1.

Les plaquettes sanguines sont capables de produire des quantités importantes d'endoperoxydes à partir de l'acide arachidonique. Cette transformation s'opère grâce au système enzymatique de cyclooxygénases.

Les endoperoxydes se transforment à leur tour en divers métabolites dont le dialdéhyde malonique (MDA). Il est connu qu'une prise orale unique d'acide acétylsalicylique (aspirine) altère de manière irréversible le système de cyclooxygénases plaquettaires et inhibe ainsi la production d'endoperoxydes des plaquettes sanguines. La production de MDA, dérivé métabolique des endoperoxydes, est également inhibée de manière irréversible. Dès lors, le dosage du contenu plaquettaire en MDA, avant et après une prise orale unique d'acide acétylsalicylique constitue une possibilité d'évaluer la régénération plaquettaire.

En effet, les plaquettes ayant été «touchées» in vivo par l'acide acétylsalicylique perdent irréversiblement leur capacité de produire normalement du MDA; par contre ce phénomène d'inhibition n'intervient pas pour les plaquettes qui entrent en circulation après l'élimination de l'aspirine qui est par ailleurs très rapide. De ce fait, si l'on compare les taux de MDA à ceux qui existaient avant la prise d'acide acétylsalicylique, en traçant des graphiques appropriés, on peut obtenir le temps de régénération plaquettaire.

Sur ces bases, il apparaît que, contrairement à la méthode au 51Cr, cette technique mesure davantage la vitesse de production des plaquettes à partir de la moelle osseuse que leur vitesse de destruction.

Ci-après est décrit, à titre d'exemple une forme de réalisation particulière du procédé selon l'invention.

Il s'agit d'un dosage semi-autömatique du dialdéhyde malonique des plaquettes sanguines.

Elle comporte une partie manuelle pour la préparation d'échantillons contenant du dialdéhyde malonique et une partie automatique pour le dosage proprement dit du dialdéhyde malonique contenu dans ces échantillons. Il va bien entendu de soi que cette première partie pourrait également être automatisée en vue d'obtenir un procédé complètement automatique.

Partie manuelle.

9 ml de sang veineux humain sont récoltés et anticoagulés par un ml d'une solution de citrate trisodique 0,129 M. Le plasma riche en plaquettes (PRP) est obtenu par centrifuga-tion du sang total à 200x g pendant 10 min (22°C). La numération plaquettaire s'effectue sur chaque échantillon de PRP à l'aide d'un «Thrombocounter» (Coulter Electronics). Les culots plaquettaires sont obtenus par centrifugation (2000x g; 30 min; 22°C) de 2 ml de PRP. Ces culots sont suspendus dans 2 ml de tampon phosphate pH 7,4 (NaîHPOt, 1,36% p/v; NaOH 0,33% p/v) et incubés pendant 15 min à 37°C en présence de N-éthylmaléimide (1 mM; NEM) ou d'acide arachidonique (0,64 mM; AA). Ces agents stimulent la production de MDA plaquettaire. Après cette période d'incubation, les échantillons sont passés aux ultra-sons pendant 15 min. Les débris plaquettaires sont éliminés par fïltration à travers des filtres «Seraclear».

Partie automatique.

Le diagramme des flux pour le dosage automatique du dialdéhyde malonique des plaquettes sanguines est montré dans la figure annexée. Les divers modules «Technicon» utilisés pour ce dosage sont les suivants: un distributeur d'échantillons du type II permettant le prélèvement de 40 d'échantillons par heure (rapport de prélèvement: échantillon-rinçage: 2-1); une pompe péristaltique proportionnante à multica-naux de type II; un dialyseur équipé d'une membrane en «Cuprophane» maintenue à 37°C; un bain d'huile thermoréglable dont la température est ajustée à 82°C; un colorimètre équipé d'une cuve tubulaire de 15 mm de trajet optique et d'un filtre de 530 nm; un enregistreur à une plume muni d'une expansion d'échelle 4 X; un transformateur et stabilisateur de voltage.

Deux solutions d'acide perchlorique (PCA) ont été préparées à la concentration de 2 et 10% (v/v) respectivement. 0,05% de «Brij»-35 (v/v) est additionné à chaque solution pour régulariser le bullage du flux.

Une solution d'acide 2-thiobarbiturique à 0,8% (p/v) est préparée selon la technique décrite dans «The new England Journal of Medecine», June 19,1975, p. 1310-1313, Marie J. Stuart, M.B., B.S., Scott Murphy, M.D. and Frank A. Oski M.D.: «A Simple non radioisotope technic for the détermination of Platelet Life-Span».

La solution de PCA 10% est mélangée au flux d'échantillon préalablement segmenté par de l'air ou un autre gaz. Les protéines précipitées sont éliminées par une dialyse à 37°C et la MDA est reprise par un flux bullé de contre-dialyse de PCA 2%. La solution d'acide 2-thiobarbiturique est additionnée au flux de contre-dialyse. Une incubation de 10 min à 82°C permet la formation du complexe coloré rose entre la MDA et l'acide 2-thiobarbiturique. Cette coloration est lue à 530 nm après refroidissement du mélange à température ambiante par un échangeur de chaleur du type «Sinnedcooler».

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Une solution 10 mM de MDA est préparée par hydrolyse de tétraéthylacétal de dialdéhyde malonique tétraéthylacétal avec de l'acide chlorhydrique 0,5 N. Des courbes de calibra-tion sont réalisées à partir de solutions de MDA dont les concentrations varient de 0,25 à 3 nmoles/ml. Ces solutions sont obtenues en diluant la solution mère avec de l'eau distillée.

Limite de compatibilité du dosage automatique de la MDA.

a) La cadence du distributeur d'échantillons peut varier dans les limites de 20 à 70 à l'heure. La proportion échantillon rinçage peut varier d'un rapport 2-3 à 2-1.

b) La vitesse d'entraînement du moteur de la pompe peut être modifiée à loisir.

c) La durée de la dialyse peut par exemple varier entre 1 et 10 min et est de préférence de l'ordre de 3 min tandis que la température est généralement comprise entre 20 et 50°C et est de préférence comprise entre 35 et 40°C. Toutefois les conditions données dans l'exemple décrit ci-dessus sont celles optimalisées. Le flux de contredialyse peut être une solution aqueuse acide de concentration faible. La nature de l'acide est relativement peu importante mais sa concentration ne peut de préférence pas dépasser 5%. Outre l'acide perchlorique (PCA), on peut utiliser le H2PO4, CH3COOH ou le

CC13COOH par exemple.

d) La concentration en acide utilisée pour précipiter les protéines n'est pas critique.

Pour le PCA par exemple on peut envisager d'utiliser des concentrations de 5 à 12%. Toutefois l'utilisation de fortes concentrations en PCA entraîne des problèmes de corrosion, surtout au niveau du système de dialyse. Dans cette phase du procédé le PCA pourrait également être substitué par un des autres acides énumérés ci-dessus. Cet acide pourrait être le même ou différent de celui utilisé pour la contre-dialyse.

e) Une diminution de la concentration en acide 2-thiobarbiturique entraîne une diminution de la coloration. Une augmentation de la concentration en acide 2-thiobarbiturique n'apporte aucun gain de sensibilité.

f) Le temps de passage au bain d'huile et sa température sont critiques dans le système envisagé ci-dessus. En effet, une augmentation de la température empêche une bonne régulation du flux et une diminution de la température entraîne une perte de sensibilité.

Le temps de coloration décrit (10 min) est suffisant pour que la réaction entre le MDA et l'acide 2-thiobarbiturique soit complète. Ce temps peut être augmenté mais non diminué.

En conclusion, les conditions décrites précédemment pour le dosage automatique du MDA plaquettaire sont optimalisées. Toute modification du schéma montré dans la figure annexée pourrait entraîner une perte de sensibilité. On pourrait toutefois remédier à cette perte par une amplification électronique du signal de sortie du colorimètre.

Un autre objectif de l'invention est le dispositif pour la mise en œuvre du procédé décrit, défini dans la revendication 2 et auquel on s'est déjà référé ci-dessus et qui a été représenté dans la figure annexée et dont un mode d'exécution sera décrit plus en détail ci-après.

Ce dispositif comprend en série successivement les appareils suivants: un distributeur d'échantillon 1, un dialyseur 2, un bain d'huile 3, un colorimètre 4 et un enregistreur 5.

Le distributeur d'échantillon est raccordé au dialyseur 2 par l'intermédiaire d'un tuyau 6. Sur ce tuyau sont branchées successivement une arivée d'air 7 pour segmenter l'échantillon véhiculé vers le dialyseur en des portions de longueur sensiblement constante et équidistantes et une arrivée 8 d'acide perchlorique à 10% destiné à être mélangé à l'échantillon pour y précipiter les protéines. De plus, en aval de l'endroit où l'acide perchlorique est mis en contact avec l'échantillon, sont prévues, sur le tuyau 6, des spires mélangeuses 9 permettant de créer, à cet endroit, dans le tuyau 6, un écoulement sensiblement turbulent assurant le mélange homogène de l'acide perchlorique et des échantillons.

Les protéines précipitées susdites sont éliminées en 10.

Une conduite 11, sur laquelle est branchée une nouvelle arrivée d'air 12, permet de former le flux bullé susdit de contre-dialyse d'acide perchlorique à 2%. La solution d'acide 2-thiobarbiturique est additionnée à ce flux par une conduite 13. Le tout est alors mélangé dans une nouvelle série de spires mélangeuses 14 avant de passer au bain d'huile 3 où une température de l'ordre de 82°C est maintenue.

Le flux ayant traversé ce bain est alors acheminé par un tuyau 15 vers le colorimètre 4, après avoir été ramené à la température ambiante dans un refroidisseur 16 du type «Sinned-cooler».

Une partie de l'échantillon passe à travers le colorimètre 4 pour permettre la mesure de la teneur en MDA, l'excès est évacué en 18, préalablement, par une conduite 17. La partie ayant traversé le colorimètre passe alors dans la conduite 19 pour être évacué également en 18.

Enfin, une alimentation d'eau de lavage est prévue par la conduite 20 pour rincer l'aiguille de prélèvement du distributeur de l'échantillon, de segmenter et de mélanger ce dernier au PCA. L'eau et les produits du rinçage sont éliminés en 21.

Le débit dans les divers conduits, tuyaux et arrivées de fluides est assuré par la pompe 22.

Ainsi, dans l'exemple concret décrit ci-dessus, les échantillons sont amenés par le tuyau 6 de diamètre intérieur de 1,2954 mm, l'air avec un tuyau de diamètre intérieur de 1,0160 mm et le PCA 10% avec un tuyau de diamètre intérieur de 0,8890 mm.

Le PCA à 2% pour la contre-dialyse est amené par la conduite 11 de diamètre intérieur de 1,4224 mm tandis que l'air est ajouté à ce courant de PCA par une conduite 12 de diamètre intérieur de 1,1430 mm.

L'acide thiobarbiturique est amené par la conduite 13 de diamètre intérieur de 1,270 mm.

Le diamètre interne de la conduite d'eau de rinçage est de 1,8542 mm.

Il y a lieu de noter que les diamètres intérieurs des divers tuyaux peuvent varier entre certaines limites. Toutefois, pour permettre un dosage automatique dans des conditions optimales de MDA, les rapports des diamètres intérieurs de ces différents tuyaux qui, suivant l'invention, permettent des débits appropriés réglés par la pompe 22, s'avèrent devoir être assez rigoureux.

En général, tous les tubes, tuyaux et conduites du dispositif suivant l'invention sont réalisés en verre.

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