DE2942617C2

DE2942617C2 - Verfahren und Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung des Malondialdehyds von Blutplättchen

Info

Publication number: DE2942617C2
Application number: DE2942617A
Authority: DE
Inventors: Jacqueline Anderlecht Lansen; Romeo Paris Roncucci
Original assignee: Continental Pharma SA Bruxelles; Continental Pharma Inc
Current assignee: Continental Pharma Inc
Priority date: 1978-10-27
Filing date: 1979-10-22
Publication date: 1983-12-29
Also published as: DK452879A; GB2036310A; AR225295A1; SE7908794L; FR2439996B1; US4318706A; CH632845A5; SE441548B; NO154287B; LU80437A1; FR2439996A1; GB2036310B; NO793463L; JPS5589751A; NO154287C; FI793270A; CA1121702A; BE879668A; FI71431B; NL7907787A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung des Malondialdehyds von Blutplättchen, bei dem man aus einer bestimmten Blutmenge nacheinander ein an Blutplättchen reiches Plasma herstellt, die im Plasma enthaltenen Blutplättchen zählt, die Blutplättchen zum Absetzen bringt und die abgesetzten Blutplättchen durch Zugabe eines Phosphatpuffers bei pH 7,4 wieder suspendiert, zu der Suspension ein die Produktion von Malondialdehyd der Blutplättchen förderndes Mittel hinzufügt danach zu der so erhaltenen Probe ein kolorimetrisches Reagenz hinzufügt die Probe erhitzt und endlich ihren Gehalt an Malondialdehyd durch Kolorimetrie bestimmt

Blutplättchen sind in der Lage, ausgehend von Arachidonsäure bedeutende Mengen an Endoperoxiden

•ο zu erzeugen. Diese Umwandlung wird durch das Enzymsystem der Cyclooxygenasen bewirkt

Die Endoperoxide wandeln sich ihrerseits in verschiedene Metaboliten um, zu denen das Melondialdehyd (MDA) gehört Es ist bekannt daß die Einnahme von Acetylsalicylsäure (Aspirin) in irreversibler Weise das System der Cyclooxygenasen der Blutplättchen verändert und auf diese Weise die Produktion der Endoperoxide der Blutplättchen verhindert. Die Produktion von MDA, des metabolischen Derivats der Endoperoxide ist gleichfalls in irreversibler Weise inhibiert Aus diesem Grunde bildet die quantitative Bestimmung des Gehaltes der Blutplättchen an MDA vor und nach einer oralen Dosis von Acetylsalicylsäure eine Möglichkeit die Regeneration der Blutplättchen zu bestimmen.

Tatsächlich verlieren die Blutplättchen, die in vivo mit der Acetylsalicylsäure in Berührung kommen, ihre Fähigkeit, in normaler Weise MDA zu erzeugen. Dagegen tritt diese Inhibition nicht für diejenigen Blutplättchen ein, die nach der Ausscheidung des Aspirin, die übrigens sehr schnell erfolgt in den Kreislauf eintreten. Wenn man also den Gehalt an MDA mit demjenigen vergleicht der vor der Einnahme von Acetylsalicylsäure bestand, kann man durch Anlegen einer geeigneten Graphik die Regenerationszeit der Blutplättchen ermitteln.

Ein Verfahren der eingangs genannten Art ist aus der Zeitschrift »The new England Journal of Medicine«, 19. Juni 1975, Seiten 1310 bis (313, bekannt Das bekannte Verfahren wird bis zur kolorimetrischen Bestimmung des Malondialdehyd-Gehaltes an Einzelproben von Hand durchgeführt. Die Auftrennung der zur Untersuchung benötigten Blutmenge in mehrere, zur Untersuchung benötigte Anteile erfolgt schon nach der Herstellung des Plasma. Die dann aus den vom Plasma getrennten Blutplättchen hergestellte Suspension wird nach Zusätzen des kolorimetrischen Reagenz 15 Minuten in iinem kochenden Wasserbad erhitzt Danach wird die Suspension zentrifugiert, um die suspendierten Blutplättchen wieder zum Absetzen zu bringen, so daß dann die optische Dichte der überstehenden Lösung bestimmt werden kann.

In dieser Form ist das bekannte Verfahren nicht zur automatischen Durchführung geeignet, da weder die Erhitzung der Suspension in einem kochenden Wasserbad noch das Zentrifugieren, mit dem das Absetzen der Blutplättchen aus der Suspension erzwungen wird, Verfahrensschritte sind, die einen automatischen Verfahrensablauf gestatten.

Demgegenüber liegt deF Erfindung die Aufgabe zugrunde, das bekannte Verfahren so weiterzubilden, daß es unter Verwendung geeigneter Geräte automatisiert werden kann.

Diese Aufgabe wird nach der Erfindung dadurch gelöst, daß zur kontinuierlichen Behandlung der das Malondialdehyd enthaltenden Probe diese vor Zugabe des kolorimetrischen Reagenz durch Gasmengen in einzelne Abschnitte unterteilt wird, daß aus diesen

einzelnen Abschnitten der Probe die Proteine durch Säurezusatz ausgefällt und durch Dialyse abgetrennt werden und das Malondialdehyd in einem Gegendialyse-BIasenstrom aufgenommen wird, daß das kolorimetrische Reagenz zu diesem Gegendialyse-Blasenstrom hinzugefügt und danach dieser Blasenstrom auf eine Temperatur von etwa 82° C gebracht und bis zur vollständigen Umsetzung des Malondialdehyds mit dem kolorimetrischen Reagenz gehalten wird, bevor die kolorimetrische Bestimmung des Gehaltes an Malondialdehyd erfolgt

Gegenstand der Erfindung ist auch eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei der eine Ausgabeeinrichtung für die durch Behandeln von Blut gewonnenen, Malondialdehyd enthaltenden Proben, eine mehrkaiialige Schlauchdosierpumpe, eine Dialyseeinrichtung, ein auf einer Temperatur von etwa 82° C gehaltenes Flüssigkeitsbad und ein Kolorimeter hintereinandergeschaltet sind und ein Kanal der Dosierpumpe an eine Gasquelle zum Abteilen der Proben angeschlossen ist sowie ein weiterer Kanal der Dosierpumpe zum Zuführe/, einer Säure zu dem unterteilten Probenstrom und ein dritter Kanal der Dosierpumpe zum Zuführen eines kolorimetrischen Reagenz zu der dialysierten Probe vorgesehen sind.

Nachstehend wird als Beispiel eine spezielle Art der quantitativen Bestimmung von Malondialdehyd nach der Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnung beschrieben. Es handelt sich dabei um eine halbautoma- -·^ο tische Bestimmung des Malondialdehyds der Blutplättchen. Sie umfaßt einen manuellen Abschnitt zur Vorbereitung von Proben, welche das Malondialdehyd enthalten, und einen automatischen Abschnitt zur eigentlichen quantitativen Bestimmung des Malondialdehyds, das in den Proben enthalten ist. Es versteht sich, daß auch der erste Abschnitt automatisiert werden kann, um ein vollständig automatisiertes Verfahren zu erhalten.

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Manueller Abschnitt

Es werden 9 ml menschliches Venenblut entnommen und durch Zugabe von 1 ml einer 0,129 M-Lösung Trinatriumcitrat am Gerinnen gehindert Das an Blutplättchen reiche Plasma (PRP) wird durch Zentrifugieren der Gesamtmenge des Blutes bei 200 g während 1Ö Minuten bei 22° C erhalten. Die Auszählung der Blutplättchen erfolgt für jede PRP-Probe mit Hilfe eines Thrombocounter (Coulter Electronics). Dann werden Plättchenrückstände durch Zentrifugieren von 2 ml des ⁵ⁿ PRP erhalten (2000 g, 30 Min, 22° C). Diese Rückstände werden in 2 mr eines Phosphatpuffers mit einem pH von 7,4 (136 Vol.-% Na₂HPO₄, 033 Vol.-o/o NaOH) suspendiert und 15 Min. lang bei 37°C in Gegenwart von N-Äthylmaleinimid (1 mM, NEM) oder Arachidonsäure (0,64 mM, AA) ruhen gelassen. Diese Agentien stimulieren die Produktion des MDA der Blutplättchen. Nach dieser Inkubationszeit werden die Proben 15 Min. lang einer Ultraschallbehandlung ausgesetzt. Die Blutplättchen-Rückstände werden durch Abfiltrieren mittels eines Seraclear-Filters eliminiert.

Automatischer Abschnitt

Das Flußdiagramm für die automatische quantitative Bestimmung des Malcndialdehyds der Blutplättchen ist in der Zeichnung wiedergegeben. Die für diese Bestimmung verwendeten t. Module der Firma Technicon sind die folgenden: Ein Probenverteiler vom Typ II, der die Entnahme von 40 Proben pro Stunde ermöglicht (Verhältnis der Probenentnahme zur Probenreinigung = 2 :1), eine mehrkanalige Schlauch-Dosierpumpe vom Typ II, eine Dialyseeinrichtung, die mit einer auf 37° C gehaltenen Cuprophan-Membran versehen ist ein thermostatisch geregeltes Ölbad, dessen Temperatur auf 82° C eingestellt ist, ein Kolorimeter mit einer rohrförmigen Küvette mit einem optischen Weg von 15 mm Länge und einem 530 nm-Filter, ein Tintenschreiber mit vierfacher Maßstabsdehnung, ein Transformator und ein Spannungsstabilisator.

Es wurden zwei Lösungen von Perchlorsäure (PCA) hergestellt, die eine Konzentration von 2 bzw. 10 VoL-% aufwiesen. Zu jeder Lösung wurden 0,05 VoI.-% Brij-35 hinzugefügt um die Blasenbildung im Strom zu regulieren.

Nach der bekannten Technik, die in der eingangs zitierten Literaturstelle »The new England Journal of Medicine«, 19. Juni 1975, Seiten 1310—1313, beschrieben ist wurde eine 0,8 Gew.-% enthalten''·; Lösung von 2-Thiobarbitursäure hergestellt.

Die 10%ige PCA-Lösung wird dem Strom der zuvor durch Luft oder ein anderes Gas in Abschnitte unterteilten Probe beigemischt Die ausgefällten Proteine werden durch eine Dialyse bei 37° C entfernt, und es wird das MDA in einem Gegendialyse-Blasenstrom der 2°/oigen PCA aufgenommen. Zu dem Strom der Gegendialyse wird die Lösung der 2-Thiobarbitursäure hinzugefügt Eine Inkubation von 10 Min. bei 82°C ermöglicht die Bildung eines rosa gefärbten Komplexes zwischen dem MDA und der 2-Thiobarbitursäure. Diese Färbung wird nach dem Abkühlen der Mischung auf Umgebungstemperatur mittels eines Wärmetauschers bei 530 nm abgelesen.

Es wird eine Lösung von lOmMol dei MDA durch Hydrolyse von Malondialdehyd-Tetraäthylacetal mit 0,5 N Salzsäure hergestellt Es werden anhand von MDA-Lösungen, deren Konzentrationen zwischen 0.25 und 3 nMol/ml variieren, Eichkurven erstellt. Diese Lösungen werden erhalten, indem die Ausgangslösung mit destilliertem Wasser verdünnt wird.

Grenzen der Leistungsfähigkeit
der automatischen Bestimmung von MDA

a) Die Leistung der Ausgabeeinrichtung für die Proben kann in den Grenzen von 20 bis 70 pro Stunde variieren. Das Verhältnis Probe zu Reinigung kann im Bereich von 2 :3 bis 2 :1 variieren.

b) Die Antriebsgeschwindigkeit des Pumpenmotors kann nach Belieben geändert werden.

c) Die Dauer der Dialyse kann beispielsweise zwischen 1 und 10 Min. variieren. Bevorz'igt wird eine Dauer im Bereich von 3 Min., während die Temperatur im allgemeinen zwischen 20 und 5O⁰C und vorzugsweise zwischen 35 und 40° C liegi. Jedenfalls sind die in dem vorstehenden "Beispiel angegebenen Bedingungen die optimalen. Der Strom der Gegendialyse kann von einer wäßrigen Säurelösung mit rchwacher Konzentration gebildet werden. Die Art der Säure ist von relativ geringer Bedeutung, jedoch sollte ihre Konzentration vorzugsweise 5% nicht überschreiten. Außer Perchlorsäure (PCA) kann beispielsweise H₃PO₄, CH₃COOH oder CCl₃COOH verwendet werden.

d) Die Konzentrator der Säure, die zum Ausfällen der Proteine benutzt wird, ist nicht kritisch. PCA kann beispielsweise in Konzentrationen zwischen 5 und 12% verwendet werden. Die Verwendung

hoher Konzentrationen an PCA führt jedoch zu Korrosions-Problemen, insbesondere im Bereich des Dialyse-Systems. In dieser Phase des Verfahrens könnte die PCA auch durch eine andere der oben angegebenen Säuren ersetzt werden. Es kann sich dabei um die gleiche oder um eine andere Säure handeln, als in der Gegen-Dialyse verwendet wird.

e) Eine Verminderung der Konzentration der 2-Thiobarbitursäure hat eine Verminderung der Färbung '° zur Folge. Eine Erhöhung der Konzentration an 2-Thiobarbitursäure trägt nicht zur Erhöhung der Empfindlichkeit bei.

Q Die Zeit des Durchlaufes durch das ölbad und dessen Temperatur sind in dem vorstehend behandelten System gewürdigt. Eine Erhöhung der Temperatur verhindert eine gute Regelung des Durchflusses, wogegen eine Verminderung der Temperatur einen Empfindlichkeitsverlust nach sich zieht. Die beschriebene Inkubationsdauer (tO Min.) ist ausreichend, um eine vollständige Reaktion zwischen dem MDA und der 2-Thiobarbitursäure zu gewährleisten. Diese Zeit kann erhöht, jedoch nicht vermindert werden.

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Zusammenfassend ist festzustellen, daß die vorstehend beschriebenen Bedingungen für die automatische Bestimmung des MDA der Blutplättchen optimalisiert worden sind. Jede Veränderung des in der Zeichnung angegebenen Schemas könnte einen Verlust an Empfindlichkeit zur Folge haben.

Die Vorrichtung zur Durchführung des automatischen Abschnittes des Verfahrens, auf welche vorstehend Bezug genommen worden ist und die in der Zeichnung dargestellt ist, wird nachstehend mehr im einzelnen beschrieben.

Die Vorrichtung umfaßt eine hintereinander angeordnete Folge von Einrichtungen oder Geräten, nämlich eine Ausgabeeinrichtung 1 für Proben, eine Dialyseeinrichtung 2, ein ölbad 3, ein Kolorimeter 4 und einen Schreiber 5.

Die Ausgabeeinrichtung 1 ist mit der Dialyseeinrichtung 2 durch ein Rohr 6 oder einen Schlauch verbunden. An dieses Rohr 6 sind nacheinander eine Luftzuführung 7 zur Unterteilung der der Dialyseeinrichtung zugeführten Probe in Abschnitte, die im wesentlichen gleiche Längen und gleiche Abstände voneinander haben, und eine Zufuhr 8 für 10%ige Perchlorsäure angeschlossen, die dazu bestimmt ist, mit den Proben vermischt zu werden, um daraus die Proteine auszufällen. Weiterhin ^x ist in Fhißrichtung hinter der Stelle, wo die Perchlorsäure zugeführt wird, im Rohr 6 eine Mischschlange 9 angeordnet, die es erlaubt, an dieser Stelle im Rohr 6 eine im wesentlichen turbulente Strömung zu erzeugen, welche eine homogene Vermischung der Perchlorsäure milden Proben gewährleistet.

Die genannten ausgefällten Proteins werden bei K eliminiert

Eine Leitung 11, an die eine weitere Luftzuführung V. angeschlossen ist, erlaubt es, den genannten Blasen strom zur Gegen-Dialyse mit 2%iger Perchlorsäure zi bilden. Die 2-Thiobarbitursäure-Lösung wird den; Blasenstrom mittels einer Leitung 13 zugeführt. Da Ganze wird dann in einer Mischschlange 14 gemischt bevor es zum ölbad 3 gelangt, wo eine Temperatur in Bereich von 82° C eingehalten wird.

Der Strom, der dieses ölbad passiert hat, wird danr mittels eines Rohres 15 dem Kolorimeter 4 zugeführt nachdem er mittels eines Kühlers 16 auf Umgebungs temperatur gebracht worden ist.

Ein Teil der Probe durchläuft das Kolorimeter 4, un den Gehalt an MDA bestimmen zu können, während ei! Überschuß zuvor über eine Leitung !7 nsch ! abgeführt wird. Der Anteil, der das Kolorimeter passier hat, wird anschließend über eine Leitung 19 ebenfall nach 18 abgeführt.

Endlich ist die Zuführung von Waschwasser über eini Leitung 20 vorgesehen, die zum Reinigen der Entnah menadel der Einrichtung zur Probenverteilung sowi zur Unterteilung der Probe in Abschnitte und zu derer Mischung mit der PCA dient Das Wasser und dii ReirJgungs-Rückstände werden bei 21 entfernt De Fluß durch die verschiedenen Leitungen, Rohre um Zuflüsse wird durch eine Pumpe 22 bewirkt.

Bei dem vorstehend beschriebenen, konkreten Bei spiel werden die Proben durch ein Rohr 6 mit einen Innendurchmesser von 1,2954 mm, die Luft durch eii Rohr mit einem Innendurchmesser von 1,0160 mm um die 10%ige PCA durch ein Rohr mit einem Innendurch messer von 0,8890 mm zugeführt

Die 2%ige PCA für die Gegen-Dialyse wird durch eine Leitung 11 mit einem Innendurchmesser von 1,4224 mm zugeführt, während diesem PCA-Strom die Luft durch eine Leitung 12 mit einem Innendurchmessei von 1,1430 mm zugeführt wird.

Die Thiobarbitursäure wird durch «ine Leitung 13 mi einem Innendurchmesser von 1,270 mm zugeführt Dei Innendurchmesser der das Waschwasser führenden Leitung beträgt 13542 mm.

Es sei angemerkt, daß die Innendurchmesser der verschiedenen Rohre in gewissen Grenzen verändert werden können. Um eine automatische Bestimmung des MDA unter optimalen Bedingungen zu gewährleisten erweist sich jedoch ein ziemlich genaues Einhalten dei Verhältnisse zwischen den Innendurchmes-isrn der verschiedenen Rohre, die erfindungsgemäß die geregel te Zufuhr der richtigen Mengen mittels der Pumpe 22 zulassen, als nötwendig:

Allgemein bestehen alte Rohre und Leitungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung aus Glas.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung des Malondialdehyds von Blutplätfchen, bei dem man aus einer bestimmten Blutmenge nacheinander ein an Blutplättchen reiches Plasma herstellt, die im Plasma enthaltenen Blutplättchen zählt, die Blutplättchen zum Absetzen bringt und die abgesetzten Blutplättchen durch Zugabe eines Phosphatpuffers bei pH 7,4 wieder suspendiert, zu der Suspension ein die Produktion von Malondialdehyd der Blutplättchen förderndes Mittel hinzufügt danach zu der so erhaltenen Probe ein kolorimetrisches Reagenz hinzufügt, die Probe erhitzt und endlich ihren Gehalt an Malondialdehyd durch Kolorimetrie bestimmt, dadurch gekennzeichnet, daß zur kontinuierlichen Behandlung der das Malondialdehyd enthaltenden Probe, diese vor Zugabe des kolorimetrischen Reagenz durch Gasmengen in einzelne Abscheide unterteilt wird, daß aus diesen einzelnen Abschnitten der Probe die Proteine durch Säurezusatz ausgefällt und durch Dialyse abgetrennt werden und das Malondialdehyd in einem Gegendialyse-Blasenstrom aufgenommen wird, daß das kolorimetrische Reagenz zu diesem Gegendialyse-Blasenstrom hinzugefügt und danach dieser Blasenstrom auf eine Temperatur von etwa 82° C gebracht und bis zur vollständigen Umsetzung des Malondialdehyds mit dem kolorimetrischen Reagenz gehalten wird, bevor die kolorimetrische Bestimmung des Gehaltes an Malondiaiuehyd erfolgt.

2. Verfahren nach Ansf ,uch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß a5s kobrimetrisches Reagenz 2-Thiobarbitursäure verwendet wiiv

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Blasenstrom etwa 10 Minuten lang auf der erhöhten Temperatur von 82° C gehalten wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Ausfällen der Proteine durch Zugabe von etwa 10%iger Perchlorsäure erfolgt

5. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Ausgabeeinrichtung (1) für die durch Behandeln von Blut gewonnenen, Malondialdehyd enthaltenden Proben, eine mehrkanalige Schlauch-Dosierpumpe (22), eine Dialyseeinrichtung (2), ein auf einer Temperatur von etwa 82°C gehaltene?. Flüssigkeitsbad (3) und ein Kolorimeter (4) hintereinandergeschaltet sind und daß ein Kanal (7) der Dosierpumpe (22) an eine Gasquelle zum Abteilen der Proben angeschlossen ist, ein weiterer Kanal (8) der Dosierpumpe (22) zum Zuführen einer Säure zu dem unterteilten Probenstrom und ein dritter Kanal (13) der Dosierpumpe zum Zuführen eines kolorimetrischen Reagenz zu der dialysierten Probe vorgesehen sind.