NL7907787A - Werkwijze en inrichting voor de bepaling van malondialdehyde. - Google Patents

Description

N.0.28.380

Werkwijze en inrichting voor de bepaling van malondialdehyde.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de bepaling van malondialdehyde, in het bijzonder malondialdehyde van bloedplaatjes.

Yolgens de uitvinding bereidt men een reeks monsters, die ma-5 londialdehyde bevatten en door gas in segmenten zijn verdeeld, onderwerpt men deze monsters aan eEn dialyse om de proteïnen te verwijderen en bepaalt men het gehalte malondialdehyde door colori-metrie.

Hoewel de uitvinding niet beperkt is tot de bepaling van 10 malondialdehyde van bloedplaatjes vormt dit een voorkeurstoepassing.

De bloedplaatjes zijn in staat aanzienlijke hoeveelheden endoperoxiden voort te brengen uit arachidonzuur. Deze omzetting heeft plaats dankzij het enzymatische systeem van cycloöxygenasen.

De endoperoxiden worden op hun beurt omgezet tot verschillende 15 metabolieten, waaronder het malondialdehyde (MDA). Het is bekend, dat een eenmalige orale opname van acetylsalioylzuur (aspirine) op irreversibele wijze het systeem van plaatjes cycloöxygenasen verandert en aldus de produktie remt van endoperoxiden van bloedplaa-tjes. "De produktie van MDA, een metabolisme-derivaat van endoper-20 oxiden, wordt eveneens op irreversibele wijze geremd. Yan dat ogenblik af vormt de bepaling van de plaatjesinhoud aan MDA, voor en na een eenmalige orale opname van acetylsalioylzuur, een mogelijkheid de plaatjesregeneratie te evalueren.

Inderdaad verliezen de plaatjes, die in vivo met acetylsalicyl-25 zuur in "aanraking" zijn geweest, op irreversibele wijze hun vermogen op normale wijze MDA voort te brengen; daarentegen doet zich dit remmingsverschijnsel niet voor voor de plaatjes, die in circulatie treden na de eliminatie van de aspirine, die overigens zeer snel is. Daardoor kan men, wanneer men de gehalten van MDA verge-30 lijkt met de gehalten, die bestaan na de opname van acetylsalicyl-zuur, wanneer men de geschikte grafieken tekent, de plaatjes-regeneratietijd verkrijgen.

Op deze grondslagen blijkt het dat, in tegenstelling tot de 51 methode met Cr, deze techniek meer de produktiesnelheid van de 35 plaatjes meet uitgaande van het beenmerg dan de destructiesnelheid.

Hierna wordt bij wijze van voorbeeld, evenwel niet beperkend een bijzondere uitvoeringsvorm beschreven van de bepaling van malon- 7907787 2 dialdehyde volgens de uitvinding.

Het betreft een semi-automatische bepaling van malondialde-hyde van bloedplaatjes.

De bepaling brengt een handgedeelte met zich mee voor de be-5 reiding van de monsters, die malondialdehyde bevatten en een automatisch gedeelte voor de eigenlijke bepaling van het malondialdehyde, dat in deze monsters aanwezig is. Het spreekt vanzelf, dat het eerste gedeelte eveneens geautomatiseerd zal kunnen worden met het oog op het verkrijgen van een volledig automatische werkwijze.

10 Handgedeelte 9 ml aderlijk bloed van de mens worden verzameld en aan een anticoagulatiebehandeling onderworpen met 1 ml van een 0,129 molaire trinatriumcitraatoplossing. Het aan plaatjes rijke plasma (PRP) wordt verkregen door centrifugering van het totale bloed bij 15 200 x g gedurende 10 minuten bij 22°G. De plaatjestelling wordt uitgevoerd bij elk monster van PRP met behulp van een Thrombo-counter (Coulter Electronics). De plaatjes bezinksels worden verkregen door centrifugeren (2000 x g; 30 min; 22°C) van 2 ml PRP.

De bezinksels worden gesuspendeerd in 2 ml van een fosfaatbuffer 20 pH 7,4 (Ha2HP04, 1,36% g/v; HaOH 0,33% S^) en gedurende 15 minuten bij 37°0 geïncubeerd bij aanwezigheid van H-ethylmalelmide (1 mM; HEM) of arachidonzuur (0,é4 mM; AA). Deze middelen stimuleren de produktie van plaatjesachtig MDA. Ha deze incubatieperiode worden de monsters aan ultrageluid onderworpen gedurende 15 minuten.

25 De plaatjesachtige resten worden verwijderd door filtratie door Seraclear filters.

Automatisch gedeelte

Het diagram van de stromen voor de automatische bepaling van malondialdehyde van bloedplaatjes is aangegeven in de bijgevoegde lR) 30 figuur. De verschillende Technicon ^ modules gebruikt voor deze bepaling zijn de volgende ; een distributie-inrichting van monsters van het .type II, die de afname mogelijk maakt van 40 monsters per uur (verhouding afname s monster - spoelbehandeling : 2 - 1); een peristaltische verdeelpomp met‘meer kanalen van het 35 type II; een dialyse-inrichting voorzien van een cuprofaanmembraan, dat op 37°C wordt gehouden; een thermisch regelbaar oliebad, waarvan de temperatuur op 82°C is ingesteld; een colorimeter voorzien van een buisvormig vat met een optisch traject van 15 mm en een filter van 530 nm; een schrijvende registratie-inrichting voorzien 40 van een schaaluitzetting van 4 X; een transformator en een spanning- 7907787 ·» 3 stabilisator.

!Fwee oplossingen ran perchloprzuur (PCA) zijn bereid met een . concentratie van 2 en 10 vol.%. 0,05 % Brij - 35 (v/v) wordt aan elke oplossing toegevoegd voor het regelen van de bel-nrorming van 5 de stroom.

Een oplossing van 2-thiobarbituurzuur van 0,8 gew/vol.% wordt bereid volgens de techniek beschreven in "The new England Journal of Medicine", Juni 19» 1975» blz. 1310-1315» Marie j. Stuart, M.B., B.S., Scott Murphy, M.D. en Frank A. Oski M.D. : "A Simple non 10 radioisotope technic for the determination of Platelet Life-Span”.

De 10-procents oplossing van PGA wordt gemengd met de monster-3troom, die vooraf in segmenten is verdeeld met lucht of een ander gas, De neergeslagen proteïnen worden door een dialyse bij 57°C verwijderd en het MDA wordt weer opgenomen door een bellen bevatten-15 de stroom van contra-dialyse van 2 % PCA. De oplossing van 2-thio-barbituurzuur wordt aan de contra-dialysestroom toegevoegd. Een incubatie van 10 minuten bij 82°C maakt de vorming mogelijk van het roze gekleurde complex tussen het MDA en het 2-thiobarbituurzuur. Deze kleuring wordt lichtend bij 530 nm na afkoeling van het meng-20 sel bij omgevingstemperatuur door een warmte-uitwisselaar (koeler volgens Sinned).

Een 10 mM oplossing van MDA wordt bereid door hydrolyse van het tetraethylacetaal van malondialdehydetetraethylacetaal met 0,5 N zoutzuur. IJk-kurven worden tot stand gebracht met oplossingen van 25 MDA, waarvan de concentraties variëren van 0,25 tot 5 nmol/ml. Deze oplossingen worden verkregen door de moederoplossing met gedestilleerd water te verdunnen.

Overeenstemmingsgrens van de automatische bepaling van het MDA.

a) De regelmaat van de monsterverdelingsinrichting kan variëren 50 binnen grenzen van 20 tot 70 per uur. De verhouding monster " spoelbehandeling kan variëren van een verhouding van 2 - 5 tot 2 - 1 .

b) Le aandrijfsnelheid van de motor van de pomp kan gemakkelijk gemodificeerd worden.

55 c) De duur van de dialyse kan bijvoorbeeld variëren van 1 tot 10 minuten en ligt bij voorkeur in de ordegrootte van 5 minuten, terwijl de temperatuur in het algemeen tuseen 20 en 50°C en bij voorkeur tussen 55 en 40°C ligt. Evenwel zijn de in het hierna beschreven voorbeeld gegeven omstandigheden de geoptimaliseerde 40 omstandigheden. De contra-dialysestroom kan een zure water bevat- 7907787 4 tende oplossing zijn met een geringe concentratie. De aard van het zuur is relatief weinig van belang, maar de concentratie er-van dient bij voorkeur niet groter te zijn dan 5 %· Behalve het perchloorzuur (PCA)kan men H^PO^, CH^COOE of CCl^COOH bijvoor-5 beeld gebruiken.

d) De concentratie aan zuur toegepast voor het neerslaan van de proteïnen is niet kritisch.

Bijvoorbeeld voor het PCA kan men overwegen concentraties van 5 tot 12 % te gebruiken. Evenwel brengt het gebruik van grote 10 concentraties aan PCA corrosieproblemen met zich mee, vooral op het vlak van het dialysesysteem. In deze fase van de werkwijze zal het PCA eveneens vervangen kunnen worden door een van de hiervoor vermelde zuren. Dit zuur zal hetzelfde zuur kunnen zyn of verschillen van het zuur, dat voor de contra-dialyse gebruikt 1 5 wordt.

e) Een vermindering van de concentratie aan 2-thiobarbituurzuur brengt een vermindering van de kleuring mee. Een verhoging van de concentratie aan 2-thiobarbituurzuur brengt geen enkel ge-voeligheidsvoordeel mee.

20 f) De passagetijd in het oliebad en de temperatuur ervan zijn kritisch in het hiervoor beschouwde systeem. In feite verhindert een verhoging van de temperatuur een goede regeling van de stroom en een vermindering van de temperatuur brengt een gevoeligheids-verlies mee.

25 De beschreven kleurtijd (10 minuten) is voldoende opdat de reactie tussen het MDA en het 2-thiobarbituurzuur volledig is. Deze tijd kan verhoogd maar niet verminderd worden.

Concluderend zijn de hiervoor beschreven omstandigheden voor de automatische bepaling van plaatjesachtig MDA geoptimaliseerd.

30 Elke modificatie van het in de bijgevoegde figuur aangegeven schema zal een gevoeligheidsverlies met zich mee kunnen brengen. Men zal evenwel dit verlies kunnen verhelpen door een elektronische vergroting van het uitgangssignaal van de colorimeter.

De inrichting voor de uitvoering van het automatische gedeelte, 35 waarnaar hiervoor reeds is verwezen en dat is voorgesteld in de bijgevoegde figuur zal hierna gedetailleerd worden beschreven.

Deze inrichting omvat in serie achtereenvolgens de volgende apparatuur : een monsterverdeelinrichting 1, een dialysatie-inrichting 2, een oliebad 3> een colorimeter 4 en een registratie-40 inrichting 5· 7907787 5

De monsterverdeelinrichting is aan de dialyse-inrichting 2 verbonden door middel van een buis 6. Aan deze buis zijn achtereenvolgens als aftakkingen aangebracht een luchttoevoer 7 voor het in segmenten verdelen van het monster overgebracht in de richting van 5 de dialyse-inrichting in lengte-gedeelten die nagenoeg constant en op gelijke afstand zijn en een toevoer 8 van 10 % perchlocrzuur bestemd om gemengd te worden met het monster om de proteïnen erin neer te slaan. Bovendien zijn, stroomafwaarts van de plaats, waar het perchloorzuur inaanraking wordt gebracht met het monster, op de buis q 6 mengspiralen 9 aanwezig, die het mogelijk maken op deze plaats in de buis 6 een nagenoeg turbulente doorstroming tot stand te brengen, die het homogene mengsel van het perchloorzuur en de monsters waarborgt.

De betreffende neergeslagen proteïnen worden bij 10 verwijderd. 15 Een leiding 11, waarop als vertakking een nieuwe luchttoevoer is aangebracht, maakt het mogelijk de bellen bevattende stroom van contra-dialyse van 2 % perchloorzuur te vormen. De oplossing van 2-thiobarbituurzuur wordt aan deze stroom toegevoegd door een leiding 15. Het geheel wordt vervolgens in een nieuwe reeks mengspira-20 len 14 gemengd vóór de toevoer aan het oliebad 3» waar een temperatuur in de ordegrootte van 82°C wordt gehandhaafd.

De stroom, die door"dit bad is gegaan, wordt vervolgens voortbewogen door een buis 15 naar de colorimeter 4> nadat is teruggebracht op omgevingstemperatuur in een koeler 16 van het type 25 "Sinned-koeler".

Een deel van het monster gaat door de colorimeter 4 om de meting van het gehalte aan MDA mogelijk te maken, de overmaat wordt van tevoren door een leiding 17 bij 18 afgevoerd. Het gedeelte, dat door de colorimeter is gegaan, gaat vervolgens in een leiding 30 19 om eveneens bij 1.8 te worden afgevoerd.

Tenslotte wordt gezorgd voor een toevoer van waswater door de leiding 20 om de monstertreknaald van de distributie-inrichting van het monster te spoelen, in seg^menten te verdelen en deze laatste te mengen met PCA. Het water en de spoelprodukten worden bij 21 ver-35 wijderd.

Het debiet in de verschillende leidingen, buizen en toevoeren van vloeistoffen wordt gewaarborgd door de pomp 7.

Aldus worden in het hiervoor concreet beschreven voorbeeld de monsters toegevoerd door de leiding 6 met een inwendige diameter van 40 1,2954 mm, de lucht met een buis met een inwendige diameter van 7907787 ' ' 6 1,0160 mm en het 10-procents PCA met een huis met een inwendige diameter van 0,8890 mm.

Het 2-procents PCA voor de contra-dialyse wordt toegevoerd door de leiding 11 met een inwendige diameter van 1,4224 mm, ter-5 wijl de^ucht aan deze stroom van PCA wordt toegevoegd door een leiding 12 met een inwendige diameter van 1,1430 mm.

Het thiobarbituurzuur wordt toegevoerd door de leiding 13 met een inwendige diameter van 1,270 mm.

De inwendige diameter van de spoelwaterleiding bedraagt 10 1,8542 mm.

Br dient te worden opgemerkt dat de inwendige diameters van de verschillende buizen kunnen variëren tussen bepaalde grenzen.

Om een automatische bepaling mogelijk te maken onder optimale MDA-omstandigheden, blijken de verhoudingen van de inwendige diameters ^ van deze verschillende buizen, die volgens de uitvinding geschikte debieten mogelijk maken geregeld door de pomp 7, evenwel voldoende stipt te moeten zijn. In het algemeen worden alle buizen, leidingen en vaten van de inrichting volgens de uitvinding uit glas vervaardigd .

7907787

Claims (2)

1. Werkwijze voor de bepaling van malondialdehyde, in het bijzonder van malondialdehyde van bloedplaatjes, met het kenmerk, dat men een reeks monsters bereidt, die het malon- 5 dialdehyde bevatten en door gas in segmenten zijn verdeeld, de monsters aan een dialyse onderwerpt om de proteïnen te verwijderen en het gehalte aan malondialdehyde door colorimetrie bepaalt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1,met het kenmerk, dat men voor de bepaling van malondialdehyde van bloed- 10 plaatjes uit een bepaalde hoeveelheid bloed een plaatjesrijk plasma bereidt, de telling van de plaatjes in het plasma uitvoert, de plaatjes sedimenteert, de plaatjes opnieuw suspendeert bij een pH van 7»4 door toevoeging van een fosfaatbuffer, een plaatjes-aggre-gatiemiddel toevoegt dat de produktie van het plaatjesachtige ma- 15 londialdehyde stimuleert, zoals arachidonzuur of N-ethylmaleïmide, de gesegmenteerde monsters bereidt, deze monsters onderwerpt aan de dialyse en een colorimetrisch reagens toevoegt, dat de bepaling van het gehalte aan malondialdehyde door colorimetrie mogelijk maakt. 20 5« Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het ken merk, dat men de monsters, na de toevoeging van 2-thiobarbituur-zuur als colorimetrisch reagens gedurende 10 minuten handhaaft op een temperatuur in de ordegrootte van 82°C vóór de bepaling van het gehalte malondialdehyde door colorimetrie. 25 4· Inrichting voor de bepaling van malondialdehyde, in het bijzonder malondialdehyde van bloedplaatjes, met het kenmerk, dat de inrichting in serie opgesteld een monsterdistri-butie-inrichting, die malondialdehyde bevat, een peristaltische verdeelpomp met meer kanalen, een dialyse-inrichting, een bad van 30 een fluïdum, dat op een temperatuur in de ordegrootte van 82°C wordt gehouden en een colorimeter bevat, waarbij een kanaal van de pomp verbonden is met een gasbron om de monsters in segmenten te verdelen, gestuurd door een ander kanaal van de pomp in de richting van de dialyse-inrichting. 7907787