LU80437A1 - Procede et dispositif pour le dosage de la malondialdehyde - Google Patents

Procede et dispositif pour le dosage de la malondialdehyde Download PDF

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R Roncucci
J Lansen
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Continental Pharma
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Description

V.345.520 DB.32.469 2.4111 ow ΖΓ~ΐ- GRAND-DUCHÉ DE LUXEMBOURG Brevet N«.....Û Q...........3 / _ <> du ...27.....octobre.....,1.9.7..8 , ßl||® Monsieur le Ministre , 0¾¾¾ de l’Économie Nationale et des Classes Moyennes
Titre délivré : ........................................
Service de la Propriété Industrielle LUXEMBOURG
Demande de Brevet d’invention I. Requête la société.....anonyme.....belge.....dite:"Continental......Phariaa",.....135»......avenu^, lnuise r.....Bruxelles.......Belgique,......représentée.....par.....Monsieur..............................................
...Charles .München T consei 1 en brevets â Luxembourg, agissant.................(2) ...an.....qualiti.....d.e.....man.data.ire...............................................................................................................................................................................
dépose ce vingt-sept octobre 1.900 soixante-dix-huit.................(3) à.......1.5..· OU... heures, au Ministère de l’Économie Nationale et des Classes Moyennes, à Luxembourg : 1. la présente requête pour l’obtention d’un brevet d’invention concernant,: |( . .. ."..Er.o.c.é.d.ë e..t. ,d.!Î...s..p..o..S..t.t..i.f. po..ur le dosage de la (4) p ...........................................................................................................................................................................................................................................................................................
déclare, en assumant la responsabilité de cette déclaration, que l’(es) inventeur(s) est (sont) :
Monsieur Loraëo.....KONCUCCI,rus.....d.G......la.....HulPS,......31/B,......Rosiêrss.....St......(5j ...An.dr.é..».....Rivensartt......Belgique st »iadame.....Jacqueline LÄUSEN,.....26,...................
...pua.....Ih.é.o.da.i?.a.....£.ë.k.a.er.t..,.....£n.dsxl.s.c.!it..,......E.&l.o.iq.ua..,.........................................................................................
........................................................................................................................................-...........-.........................................................................................................—--------------- 2. la délégation de pouvoir, datée de.......—................. le .........J.H.....................
3. la description en langue ÎX.L'l.Ç..LX.&.q..... ....................... de l’invention en deux exemplaires ; 4............1.................. planches de dessin, en deux exemplaires ; 5. la quittance des taxes versées au Bureau de l’Enregistrement à Luxembourg, 1e .....2.7....QC.lc.:.'t.rq......12.7.3.........................................................................................................................................................................................................
revendique pour la susdite demande de brevet la priorité d’une (des) demande(s) de (6) .........U.................................................... ..........................déposée(s) en (7)..... ...........11....................................................................................................
le ...........................././..........................................................................................................................................................................................................................................(8) ................................................../-/..................................................................................................................................................................................................................
au nom de ........ ............................U......................................................................................................................... ..................................................................................(9) élit domicile pour lui (elle) et, si désigné, pour son mandataire, à Luxembourg ........................................
...J.Is........ui^ ...................................................................................................................................................... (10) sollicite la délivrance d’un brevet d’invention pour l’objet décrit et représenté dans les annexes susmentionnées, — avec/niournement de cette délivrance à —.d.i..X.".r<.U.J..t mois.
’ Le ....^ψ.ΰ.^ΪχΙψ ....................y * ^ .
II. Procès-verbal de Dépôt
La susdite demande de brevet d’invëntion a été déposée au Ministère de l’Économie Nationale et des Classes Moyennes, Service de la Propriété Industrielle à Luxembourg, en date du : 27 octetrs 1?7 8
Pr. le Ministre à 1e !“,ri heures ' /%\J* ' v' c#4\ <3e l'Économie Nationale^ des "Classes Moyennes, , // r- ' '"-λ >>c a <mi__/_J » p______ éi___________l___/_____ MEMOIRE DESCRIPTIF déposé à l’appui d'une demande de BREVET D'INVENTION au nom de "Continental Pharma" pour : «
"Procédé et dispositif pour le dosage de la malondialdéhyde". Inventeurs : Romeo RONCUCCI
Jacqueline IANSEN
La présente invention est relative à un procédé de j dosage de la malondialdehyde, notamment la malondialdehyde de plaquettes sanguines.
Suivant l'invention, on prépare une série d'échantil-! - Ions contenant de la malondialdehyde et segmentés par du gaz, ; on soumet ces échantillons à une dialyse de manière à éliminer f ~ i les protéines et on détermine la teneur en malondialdehyde^ | / | par colorimétrie. f\f/ ’ » - 2 -
Quoique l'invention ne soit pas limitée au dosage de la malondiâldéhyde de plaquettes sanguines, ceei constitue une application préférée.
Les plaquettes sanguines sont capables de produire des quantités importantes d'endoperoxydes à partir de l'acide arachidonique. Cette transformation s'opère grâce au système enzymatique_ dé cyclooxygénases.' * · Les endoperoxydes se transforment à leur toux en divers métabolites dont la malondialdéhyde (MDA). Il est connu qu'une prise orale unique d'acide acétylsalicylique (aspirine) altère de manière irréversible le système de cyclooxygénases plaquettaire et inhibe ainsi la production d'endoperoxydes des plaquettes sanguines. La production de MDA, dérivé métabolique des endoperoxydes, est également inhibée de manière irréversible. Dès lors, le dosage du contenu plaquettaire en MDA, avant et après une prise orale unique d'acide acétylsalicylique constitue une possibilité d'évaluer la régénération plaquettaire.
En effet, les plaquettes ayant été"touchées“ in vivo par » l'acide acétylsalicylique perdent irréversiblement leur capa cité de produire normalement de la MDA; par contre ce phénomène d'inhibition n'intervient pas pour les plaquettes gui entrent en circulation après l'élimination de l'aspirine qui est par ailleurs très rapide. De ce fait, si l'on compare les taux de MDA à ceux qui existaient avant la prise d'acide acé- / tylsalicylique,en traçant des graphiques appropriés,on'peut / - 3 - obtenir le temps de régénaration plaquettaire.
Sur ces bases, il apparaît que;contrairement à la 51 méthode au Cr, cette technique mesure davantage la vitesse de production des plaquettes à partir de la moelle osseuse que leur vitesse de destruction.
Ci-après est décrit, à titre d'exemple non limitatif, une forme de réalisation particulière de dosage de malondial-déhyde suivant l'invention.
Il s'agit d'un dosage semi-automatique de la malondialdé- hyde des plaquettes sanguines.
Elle comporte une partie manuelle pour la préparation d'échantillons contenant de la malondialdéhyde et une partie automatique pour le dosage proprement dit de la malondialdé- hyde contenue dans ces échantillons. Il va bien entendu de « soi que cette première partie pourrait également être automatisée en vue d'obtenir un procédé complètement automatique. Partie manuelle.
9 ml de sang veineux humain sont récoltés et anticoagulés par un ml d'une solution de citrate trisodique 0,129 M. Le plas- * ma riche eh plaquettes (PRP) est obtenu par centrifugation du sang total à 200 x g pendant 10 min. (22°C). La numération plaquettaire s'effectue sur chaque échantillon de PRP à l'aide d'un Thrombocounter (Coulter Electronics). Les culots plaquettaires sont ohtenus par centrifugation (2000 x g; 30 min; 22°C) de 2 ml de PRP. Ces culots sont suspendus dans 2 ml de tampon phosphate pH 7,4 (Na„HP0., 1,36% p/v; RaOH 0,33% p/v) » 1 - 4 - et incubés pendant 15 min à 37°C en présence de N-éthylmalei-mide (1 mM; NEM) ou d'acide arachidonique (0,64 mM; AA).
Ces agents stimulent la production de MDA plaquettaire. Après cette période d'incubationtles échantillons sont passés aux ultra-sons pendant 15 min. Les débris plaquettaires sont éliminés par filtration à travers des filtres Seraclear.
* Partie automatique.
Le diagramme des flux pour le dosage automatique de la malondialdehyde des plaquettes sanguines est montré dans la figure annexée. Les divers modules TechnicoiW utilisés pour ce dosage sont les îsuivants : un distributeur d'échantillons du type II permettant le prélèvement de 40 échantillons par heure (rapport de prélèvement : échantillon - rinçage : 2 - 1); une pompe péristaltique proportionnante à multicanaux de ty- r pe II; un dialÿseur équipé d'une membrane en cuprophane main-tenueà 37°C; un bain d'huile thermoréglable dont la température est ajustée à 82°C; un colorimètre équipé d'une cuve tubulaire de 15 mm de trajet optique et d'un filtre de 530 nra; un enregisteur à une plume muni d'une expansion d'échelle v % 4 X; un transformateur et stabilisateur de voltage.
Deux solutions d'acide perchlorique (PCA) ont été préparées à la concentration de 2 et 10 % (v/v) respectivement. 0,05 % de Brij - 35 (v/v) est additionné à chaque solution pour régulariser le bullage du flux.
Une solution d'acide 2—thiobarbiturique à 0,8% (p/v) est préparée selon la technique décrite dans “The new England,/ / - 5 -
1 J
Journal of Medecine", June 19f 1975, p. 1310-13133 Marie J. Stuart, M.B., B.S., Scott Murphy, M.D. and Frank A. Oski M.D. :?'a simple non radioisotope technic for the determina-. tion of Platelet Life-Spanl
La solution de PCA 10% est mélangée au flux d’échantillon préalablement segmenté par de l'air ou un autre gaz. Les protéines précipitées sont éliminées par une dialyse à 37°C j et la MDA est reprise par un flux bulle de contre-dialyse de PCA 2%. La solution d'acide 2-thiobarbiturique est additionnée au flux de contre-dialyse. Une incubation de 10 min à 82°C permet la formation du complexe coloré rose entre la MDA et l'acide 2-thiobarbiturique. Cette coloration est lue à 530 nm après refroidissement du mélange à température ambiante par un échangeur de chaleur (Sinned-cooler).
Une solution 10 mM de MDA est préparée par hydrolyse de la malondialdéhyde têtraéthylacétal avec de l*acide chlorhydrique 0,5 N. Des courbes de calibration sont réalisées à partir de solutions de MDA dont les concentrations varient de 0.25 à 3 nmoles/ml. Ces solutions sont obtenues en diluant * la solution mère avec de l'eau distillée.
Limite de compatibilité du dosage automatique de la MDA.
= a) La cadence du distributeur d'échantillons peut varier dans les limites de 20 à 70 à l'heure. La proportion échantillon rinçage peut varier d'un rapport 2-3 à 2-1.
\ / ; b) La vitesse d’entraînement du moteur de la pompe peut être/ ! " / ; modifiée à loisir. ./ j ί - 6 - c) La durée de la dialyse peut par exemple varier entre 1 et 10 min. et est de préférence de l'ordre de 3 min. tandis que la température est généralement comprise entre 20 et 50°C et est de préférence comprise entre 35 et 40°C. Toutefois les conditions données dans l'exemple décrit ci-dessus sont celles optimalisées. Le flux de contre-dialyse peut être une solution aqueuse acide de concentration faible. La nature de l'acide est relativement peu importante mais sa concentration ne peut de préférence pas dépasser 5%. Outre l'acide perchlo-rique (PCA), on peut utiliser le H^PO^, CH^COOH ou le CCl^COOH par exemple.
d) La concentration en acide utilisée pour précipiter les protéines n'est pas critique.
Pour le PCA par exemple on peut envisager d'utiliser des concentrations de 5 à 12%*. Toutefois l'utilisation de fortes concentrations en PCA entraîne des problèmes de corrosion, surtout au niveau du système de dialyse. Dans cette phase du procédé le PCA pourrait également être substitué par un des autres acides énumérés ci-dessus. Cet acide pourrait être le meme ou dif-* férent de celui utilisé pour la contre-dialyse.
e) Une diminution de la concentration en acide 2~thiobarbitu- . rique entraîne une diminution de la coloration. Une augmenta- ! tion de la concentration en acide 2-thiobarbiturique n'apporte j aucun gain de sensibilité.
f) Le temps de passage au bain d'huile et sa température soniy critiques dans le système envisagé ci-dessus. En effet, un//' / / - 7 - augmentation de la température empêche une bonne régulation du flux et une diminution de la température entraîne une perte de sensibilité.
Le temps de coloration décrit (10 min.) est suffisant pour que la réaction entre la MDA et l'acide 2-thiobarbiturique soit complète. Ce temps peut être augmenté mais non diminué.
En conclusion, les conditions décrites précédemment pour * le dosage automatique de la MDA plaquettaire sont optimalisées.
» , Toute modification du schéma montré dans, la figure annexée pourrait entraîner une perte de sensibilité. On pourrait toutefois remédier à cette perte par une amplification électronique du signal de sortie du colorimètre.
Le dispositif pour la mise en oeuvre de la partie automatique auquel on s*est déjà référé ci-dessus et qui a été représenté dans la figure annexée sera décrit plus en détail * ci-après.
j Ce dispositif comprend en série successivement les ap- j pareils suivants : un distributeur d'échantillon 1, un ! dialyseur 2, un bain d'huile 3, un colorimètre 4 et un en- ! registeur 5.
Le distributeur d'échantillon est raccordé au dialyseur • 2 par l'intermédiaire d'un tuyau 6. Sur ce tuyau sont bran chés successivement une arrivée d'air 7 pour segmenter l'échan-! . t'illon véhiculé vers le dialyseur en des portions de longueur f . * ' sensiblement constante et équidistantes et une arrivée 8, d'aci- I; j, de perchlorique à 10% destiné à être mélangé à l'échan tillon pour y £>récipiter les protérines. De .plus, fj - 8 - en aval de l'endroit où l'acide perchloriqùe est mis en· contact avec l'échantillon,sont prévues, sur le tuyau 6, des spires mélangeuses 9 (mixing coil) permettant de créer, à cet endroit, dans le tuyau 6, un écoulement sensiblement turbulent assurant le mélange homogène de l'acide perchlori-que et des échantillons.
Les protéines précipitées susdites sont éliminées en 10.
Une conduite 11 sur laquelle est branchée une nouvelle arrivée d'air 12/permet de former le flux bulié susdit de contre-dialyse d'acide perchloriqùe' à 2%. La solution d'acide 2-thiobarbiturique est additionnée à ce flux par une conduite 13. Le tout est alors mélangé dans une nouvelle série de spires mélangeuses 14 avant de passer au bain d'huile 3 où une température de l'ordre de 82°C est maintenue.
Le flux ayant traversé ce bain est alors acheminé par « un tuyau 15 vers le colorimètre 4,après avoir été ramené à la température ambiante dans un refroidisseur 16 du type "Sinned-cooler".
Une partie de l'échantillon passe à traws le colorimètre '4 pour permettre la mesuré de la teneur en MD A, l'excès est évacué en 18, préalablement ;par une conduite 17. La partie ayant traversé le colorimètre passe alors dans la. conduite 19 pour être évacuée également en 18.
| „ Enfin, une alimentation d'eau de lavage est prévue ' par la conduite 20 pour rincer l'aiguille de prélèvement du ! distributeur de l'échantillon, de le segmenter' et de le me-langer au PCA. L'eau et les produits du rinçage sont éliminés r .
* - 9 -
Le débit dans les divers conduits, tuyaux et arrivées de fluides est assuré par la pompe 7.
Ainsi, dans l'exemple concret décrit ci-dessus, les échantillons sont amenés par le tuyau 6 de diamètre intérieur de 0,051 inch, l'air avec un tuyau de diamètre intérieur de 0,040 inch et le PCA 10 % avec un tuyau de diamètre intérieur de 0,035 inch.
Le PCA ä 2 % pour la contre-dialyse est amené par la conduite 13 de diamètre intérieur de 0.056 inch tandis que l'air·
Iest ajouté à ce courant de PCA par une conduite de diamètre intérieur de 0,045 inch.
L'acide thiobarbiturique est amené par la conduite 13 de diamètre intérieur de 0,05 inch.
! Le diamètre interne de la conduite d'eau de rinçage est de 0,073 inch.
i1 II y a lieu de not,er que les diamètres intérieurs i ' des divers tuyaux peuvent varier entre certaines limites.
I Toutefois, pour permettre un dosage automatique dans des | conditions optimales de la MDA, les rapports des diamètres ’ intérieurs de ces différents tuyaux qui, suivant !l l'invention, permettent des débits appropriés réglés par la pompe 7, s'avèrent devoir être assez rigoureux, i' En général, tous les tubes, tuyaux et conduites du' il I] disuositif suivant l'invention sont réalisés en verre. / | ' /7/ ij ' w i

Claims (5)

  1. 2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé ! en ce que, pour le dosage de la malondialdéhyde de plaquettes I sanguines, on prépare, à partir d'une quantité déterminée de sang, un plasma riche en plaquettes, on effectue le comptage des plaquettes contenues dans le plasma, on sédimente les plaquettes, on les resuspend à pH 7,4 par l'addition d'un tampon phosphate, on ajoute un agent d'agrégation des plaquettes stimulant la production de la malondialdéhyde plaquet-j taire, tel que de l'acide arachidonique ou de la N-éthyl- ] maléimide, on prépare les échantillons segmentés susdits, on j soumet ces échantillons à la dialyse susdite et on ajoute un \ réactif colorimétrique permettant 3.a détermination de la te- | . ! neur en malondialdéhyde par colorimétrie. Itt
  2. 3.- Procédé suivant l'une ou l'autre des revendications 1! jj 1 et 2, caractérisé en ce qu'on maintient les échantillons, j après l'addition d'acide 2-thiobarbiturique comme reactxf • -colorimétrique pendant environ 10 minutes à une température ' d© l'ordre de 82CC avant la détermination de la teneur en • I * - il -
  3. 4. Procédé de dosage de la malondialdéhyde^tel que décrit ci-dessus ou résultant du dessin annexé.
  4. 5,- Dispositif pour le dosage de la malondia ldéhyde, notamment de la malondialdéhyde de plaqu-ettes sanguines, | caractérisé en ce qu'il comprend, montés en série successi- ! vement un distributeur d'échantillons contenant de la malon- * dialdéhyde, une pompe péristaltique proportionnante à multi- » canaux, un dialyseur, un bain d'un fluide maintenu à une température de l'ordre de 82°C et un colorimètre, un canal de la pompe étant raccordé à une source de gaz pour segmenter les échantillons dirigés par un autre canal de la pompe vers i | le dialyseur. i
  5. 6. Dispositif pour le dosage de la malondialdehyde, ί tel que décrit ci-dessus et montré au dessin annexé. i i i * /i____ Γ ΐΙιΐιι -a ! I J / t fr.ô Cc..u3 i λ A -Ci11 - ( ! · -“ ' - . . | ------ * ^ .... c _ description I ' ^ /----.:. ce revendications ; ...X....... descriptif j Luxembourg, !e^ Vio ; Charles ^vj-nocen j i ! i
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