FI71431B - Foerfarande foerbestaemning av malondialdehyd - Google Patents

Description

KUULUTUSJULKAISU r7 1 /1 7 1 «iSIHP B 11 UTLÄGGNINGSSKRIFT / ! 40 ! 0¾¾ C (45) Pitoni U i../3.u.v tty

Potent me’.'cl?.t 19 12 1'JcG

(51) Kv.lk.7int.CI.4 G 01 N 33/52, 33/48 SUOMI—FINLAND (21) Patenttihakemus — Patentansöknlng 793270 (22) Hakemispäivä — Ansökningsdag 22.10.79 (23) Alkupäivä — Giltlghetsdag 22.10.79 (41) Tullut julkiseksi — Blivlt offentlig 28 Qij 80

Patentti- ja rekisterihallitus Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. —

Patent- och registerstyrelsen ' ' Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad 09 . 09.86 (86) Kv. hakemus — Int. ansökan (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus — Begärd prioritet 27.10.78 Luxemburg(LU) 80437 (71) Continental Pharma Inc., Delaware, US; Avenue Louise, 135, Bruxelles, Belgia-Belgien(BE) (72) Rom6o Roncucci, Paris, Ranska-Frankrike(FR)

Jacqueline Lansen, Anderlecht, Belgia-Belgien(BE) (74) Leitzinger Oy (54) Menetelmä malonid ia 1dehydin määrittämiseksi -Förfarande för bestämning av malondialdehyd Tämän keksinnön kohteena on menetelmä malonidialdehydin kvantitatiiviseksi määrittämiseksi verihiutaleista, jossa tietystä veri-määrästä peräkkäisinä vaiheina valmistetaan runsaasti verihiutaleita sisältävä plasma, lasketaan verihiutaleet plasmassa, saatetaan verihiutaleet laskeutumaan ja suspendoidaan uudelleen laskeutuneet verihiutaleet lisäämällä fosfaattipuskuria pH-arvossa 7,4, lisätään suspensioon aines, joka edistää verihiutaleiden malonidialdehydin muodostusta, lisätään tämän jälkeen näin saatuun näytteeseen kolori-metrinen reagenssi, joka on 2-tiobarbituurihappo, lämmitetään näytettä ja määritetään tämän jälkeen kolorimetrisesti sen maloni-dialdehydipitoisuus. Keksinnön mukaisen menetelmän tuntomerkit on esitetty patenttivaatimuksessa.

Keksinnön mukaisesti valmistetaan sarja näytteitä, jotka sisältävät malonidialdehydiä ja jotka on segmentoitu kaasulla, nämä näytteet saatetaan dialyysiin proteiinin poistamiseksi ja malonidialdehydi-pitoisuus määritellään klorimetrialla.

Verihiutaleet kykenevät muodostamaan huomattavia määriä endoperoksi- 2 71 431 deja arakishaposta. Tämä muuntuminen tapahtuu johtuen syklo-oksygenaasin entsymaattisesta järjestelmästä.

Endoperoksidit muuttuvat puolestaan eri metaboliiteiksi, joihin kuuluu malonidialdehydi (MDA). Tiedetän, että yksi annos asetyylisalisyylihappoa (aspiriini) muuttaa palautumattomaksi hiutalesyklo-oksygenaasijärjestelmän ja estää siis endoperoksidien muodostumisen verihiutaleista. Samoin estyy palautumattomasti MDA:nf endoperoksidien metabolisen johdannaisen muodostus. MDA-hiutalepitoisuuden määritteleminen ennen ja jälkeen asetyylisalisyylihapon yhden suullisannoksen muodostaa siis mahdollisuuden arvioida hiutale-regeneraatio.

Itse asiassa ne hiutaleet, joita asetyylisalisyylihappo on "koskettanut" in vivo, menettävät peruuttamattomasti kykynsä muodostaa normaalisti MDArta; toisaalta tämä ehkäisyilmiö ei tapahdu niiden hiutaleiden kohdalla, jotka kiertävät aspiriinin poistumisen jälkeen, joka on muuten hyvin nopea. Tämän seurauksena, jos MDA-määriä verrataan ennen asetyylisalisyylihappoannosta läsnäolleisiin määriin sopivien käyrien avulla, voidaan saada hiutaleen regene-raatioaika.

Arvioimalla näitä perustietoja vaikuttaa siltä, että päinvastoin kuin 51cr-menetelmä, tämä tekniikka pikemminkin mittaa hiutale-muodostusmäärän luuytimestä kuin niiden poistumismäärän.

Jäljempänä selvitetään rajoittamattoman esimerkin muodossa erästä tiettyä keksinnön suoritusmuotoa malonidialdehydin määrittele-miseks i.

Tämä on malonidialdehydin puoliautomaattinen määritys verihiutaleista .

Siihen kuuluu käsin suoritettu vaihe malonidialdehydiä sisältävien näytteiden valmistamiseksi ja automaattinen vaihe näissä näytteissä olevan malonidialdehydin varsinaiseksi määrittelemiseksi. On ymmärrettävä, että myös tämä ensimmäinen vaihe voitaisiin automatisoida 3 71431 täysin automaattisen menetelmän aikaansaamiseksi.

Manuaalinen vaihe 9 ml ihmisverta kerätään ja estetään koaguloitumasta 1 ml :11a 0,129 M trinatriumsitraattiliuosta. Hiutalerikastettu plasma (PRP) saadaan linkoamalla kokonaisverta 200 xg:ssä 10 minuutin ajan (22°C). Hiutalelaskenta suoritetaan kunkin PRP-näytteen kohdalla trombolaskimella (Coulter Electronics). Hiutalenapit saadaan linkoamalla (2000 xg; 30 minuuttia, 21°C) 2 ml PRP.

Nämä napit suspendoidaan 2 ml:aan fosfaattipuskuria pH 7,4 (Na2HP04, 1,36 paino/tilavuusprosenttia; NaOH 0,33 % paino/tilavuus) ja inkuboidaan 15 minuutin ajan 37°C:ssa N-etyylimaleidin (1 mM, NEM) tai arakishapon (0,64 nM, AA) läsnäollessa. Nämä aineet stimuloivat hiutale-MDA:n muodostumista. Mainitun inkubointijakson jälkeen näytteisiin kohdistetaan ultraääniä 15 minuutin ajan. Hiutale-jätteet poistetaan suodattamalla.

Automaattinen vaihe

Oheisessa piirustuksessa on esitetty virtauskaavio malonidialdehydin automaattiseksi määrittelemiseksi verihiutaleista. Eri Technicon ^ modulit, joita käytetään tähän määrittelyyn, ovat seuraavat: Tyyppiä II oleva näytteenjakelija 40 näytteen ottamiseksi tunnissa (otto-sude: Näytteen huuhtelu : 2-1); peristalttinen annostelupumppu, jossa tyyppiä II olevat multiputket; kuprofaanikalvolla varustettu dialyysiyksikkö, joka pidetään 37°C:ssa; lämpövalvottava öljykylpy, jonka lämpötila on asetettu 82°C:een; kolorimetri, jossa on putki-säiliö, jossa 15 mm optinen rata ja 530 nm suodatin sekä kynäpiirturi, jossa nelinkertainen mittakaavan suurentaja; jännite-muuntaja ja vakaaja.

Kaksi liuosta perkloorihappoa (PCA) on valmistettu pitoisuuksien ollessa 2 ja 10 % (til./til.) vastaavassa järjestyksessä. 0,05 % Brij-35 (til./til) lisätään kumpaankin liuokseen juoksutteen kuplit-tamisen säätämiseksi.

4 71431

Valmistetaan 0,8 % (paino/til.) liuos 2-tiobarbituurihappoliuosta tekniikalla, jota on kuvattu julkaisussa "The new England Journal of Medecine", 19.6.1975, sivut 1310-1313, Marie J. Stuart, M.B., B.S. Scott Murphy, M.D. ja Frank A. Oski M.D.: "A simple non radioisotope technic for the determination of Platelet Life-Span".

10 %:n PCA-luos sekoitetaan näytevirtaukseen, joka on aikaisemmin segmentoitu ilmalla tai jollakin muulla kaasulla. Saostuneet proteiinit poistetaan dialyysillä 37°C lämpötilassa ja MDA otetaan talteen vastadialyysikuplavirtauksella, jossa on 2 % PCA. 2-tio-barbituurihappoliuos lisätään vastadialyysivirtaukseen. 10 minuutin inkubointi 82°C:ssa mahdollistaa väriltään vaaleanpunaisen kompleksin muodostumisen MDA:n ja 2-tiobarbituurihapon välille. Tämä värittyminen luetaan 530 nm sen jälkeen, kun seos on jäähdytetty huoneen lämpötilassa lämmönvaihtimellä (Sinned-coller).

10 nM liuos MDA:ta valmistetaan hydrolysoimalla malonidialde-hyditetraetyyliasetaalia 0,5 N suolahapolla. Kalibrointikäyrä tehdään MDA-liuoksille, joiden pitoisuus vaihtelee välillä 0,25 ja 3 nmoolia/ml. Nämä liuokset saadaan laimentamalla alkuliuos tislatulla vedellä.

MDAin automaattisen annostelun yhteensopivuusraja a) Näytejakelijän nopeus voi vaihdella alueella 20 - 70 näytettä per tunti. Näytteen huuhtelusuhde voi vaihdella 2-3 suhteesta 2-1 suhteeseen.

b) Pumpun moottorin käyttönopeutta voidaan tarvittaessa muuttaa.

c) Dialyysin aikajakso voi vaihdella esimerkiksi välillä 1-10 minuuttia ja on edullisesti noin 3 minuutin luokkaa, kun taas lämpötila on yleensä välillä 20 - 50°C ja edullisesti välillä 35 - 40°C. Yllä mainitussa esimerkissä annetut olosuhteet ovat kuitenkin optimaalisia. Vastadialyysivirtaus voi olla väkevyydeltään alhainen vesipitoinen happoliuos. Happotyypin merkitys on suhteellisen vähäinen, mutta sen väkevyys ei saa edullisesti ylittää 5 %. Perkloorihapon (PCA), lisäksi voidaan käyttää esimerkiksi seuraavia: H3PO4, CH3 COOH ja CCI3COOH.

5 71431 d) Proteiinien saostamiseen käytetty happoväkevyys ei ole kriittinen. PCAtn kohdalla voidaan käyttää esimerkiksi väkevyyksiä 5 - 12 %. Suurten PCA-väkevyyksien käyttö aiheuttaa kuitenkin korroosio-ongelmia erityisesti dialyysijärjestelmän suhteen. Prosessin tässä vaiheessa PCA voitaisiin myös substituoida jollakin yllä mainitulla hapolla. Mainittu happo voisi olla sama tai eri kuin vastadialyysiin käytetty happo.

e) 2-tiobarbituurihapon väkevyyden laskeminen johtaa värittymisen vähenemiseen. 2-tiobarbituurihapon väkevyyden lisäys ei lisää herkkyyttä.

f) Viipymisaika öljykylvyssä ja sen lämpötila ovat kriittisiä tekijöitä yllä kuvatussa järjestelmässä. Itse asiassa lämpötilan nousu estää virtauksen hyvän valvonnan ja lämpötilan lasku johtaa herkkyyden katoamiseen.

Kuvattu värittymisaika (10 minuuttia) riittää MDA:n ja 2-tiobarbituurihapon välisen reaktion loppuun suorittamiseen. Tätä aikaa voidaan pidentää, mutta ei lyhentää.

Johtopäätöksenä voidaan todeta, että yllä kuvatut olosuhteet hiutale MDA:n automaattiseksi määrittelemiseksi ovat parhaat mahdolliset. Oheisessa kuviossa esitetyn virtauskaavion muuttaminen saattaisi johtaa herkkyyden katoamiseen. Tämä häviö voitaisiin kuitekin välttää vahvistamalla elektronisesti kolorimetrin lähtösignaali.

Seuraavaksi selvitetään yksityiskohtaisesti laitetta automaatti-vaiheen suorittamiseksi, johon laitteeseen on jo viitattu ja joka on esitetty oheisessa piirustuksessa.

Laitteeseen kuuluu järjestyksessä seuraavat osat: Näytteenjakelija 1, dialysaattori 2, öljykylpy 3, kolorimetri 4 ja piirturi 5.

Näytteenjakelija on yhdistetty dialysaattoriin 2 putkella 6. Putkeen on yhdistetty peräkkäisesti ilmansyöttö 7 dialysaattorin läpi syötetyn näytteen segmentoimiseksi olennaisesti vakiomittaisiin ja yhtä kaukana toisistaan oleviin osiin, ja lisäksi putkeen liittyy 10 %:n perkloorihapon syöttö 8, joka happo sekoitetaan näytteeseen proteiinien saostamiseksi. Edelleen sen kohdan takapuolella, jossa per- 71 431 6 kloorihappo saatetaan kosketukseen näytteen kanssa, on putkeen 6 järjestetty sekoituskäämit 9, jotka muodostavat tässä kohdassa putkeen 6 olennaisesti turbulenssin virtauksen, joka varmistaa perkloorihapon ja näytteiden homogeenisen seoksen. Saostuneet proteiinit poistuvat viitenumeron 10 mukaisesti.

Kanavaan 11 on yhdistetty lisäilmansyöttö 12 ja sen avulla saadaan muodostetuksi yllä mainittu kupliva vastadialyysivirtaus 2-prosent-tista perkloorihappoa. 2-tiobarbituurihappoliuos lisätään tähän virtaan kanavan 13 kautta. Tämän jälkeen kokonaisuus sekoitetaan sekoituskäämeissä 14 ennen sen kuljettamista öljykylvyn 3 läpi, jossa pidetään 82°C luokkaa oleva lämpötila.

Kylvyn läpi siirtynyt virta syötetään tämän jälkeen putken 15 kautta kolorimetriin 4 sen jälkeen, kun se on jäähdytetty huoneen lämpötilaan "Sinned-cooler"-tyyppisessä jäähdyttäjässä 16.

Osa näytteestä kulkee kolorimetrin 4 läpi MDA-pitoisuuden mittaamiseksi, ja ylimäärä on aikaisemmin poistettu viitenumeron 18 mukaisesti kanavan 17 kautta. Kolorimetrin läpi kulkenut osa siirtyy tämän jälkeen kanavan 19 läpi ja samoin ulos viitenumeron 18 mukaisesti.

Pesuveden syöttö on lopuksi järjestetty kanavan 20 kautta näytteen-jakelijan ottoneulan huuhtelemiseksi, mainitun näytteen segmentoimiseksi ja sen sekoittamiseksi PCA:an. Vesi ja huuhtelutuotteet poistuvat kohdassa 21.

Virtauksen eri kanavissa, putkissa ja väliainesyötöissä saa aikaan pumppu 7.

Esimerkiksi yllä kuvatussa esimerkissä näytteitä syöttää putki 6, jonka sisähalkaisija on 1,3 mm, ilmaputki, jonka sisähalkaisija on 1 mm ja 10 % PCA putki, jonka sisähalkaisija on 0,9 mm. Vastadia-lyysiä varten tarkoitettua 2 % PCA:ta syöttää kanava 13, jonka sisähalkaisija on 1,4 mm, kun taas ilmaa lisätään tähän PCA-virtaan kanavan kautta, jonka sisähalkaisija on 1,1 mm.

7 71431

Tiobarbituurihappoa syöttää kanava 13, jonka sisähalkaisija on 1,27 mm.

Huuhteluvesikanavan sisähalkaisija on 1,8 mm.

Tässä yhteydessä havaitaan, että eri putkien sisähalkaisijät voivat vaihdella tietyissä rajoissa. Kuitenkin automaattisen määrittelyn mahdollistamiseksi parhaissa mahdollisissa MDA-olosuhteissa niiden eri putkien sisähalkaisijoiden suhteet, jotka keksinnön mukaisesti mahdollistavat pumpun 7 ohjaamat sopivat virtausnopeuden, vaikuttavat varsin suurilta.

Keksinnön mukaisen laitteen kaikki putket, johteet ja kanavat on yleensä valmistettu lasista.

Claims (1)

1. 8 71431 Patenttivaatimus Menetelmä malonidialdehydin kvantitatiiviseksi määrittämiseksi verihiutaleista, jossa tietystä verimäärästä peräkkäisinä vaiheina valmistetaan runsaasti verihiutaleita sisältävä plasma, lasketaan verihiutaleet plasmassa, saatetaan verihiutaleet laskeutumaan ja suspendoidaan uudelleen laskeutuneet verihiutaleet lisäämällä fosfaattipuskuria pH-arvossa 7,4, lisätään suspensioon aines, joka edistää verihiutaleiden malonidialdehydin muodostusta, lisätään tämän jälkeen näin saatuun näytteeseen kolorimetrinen reagenssi, joka on 2-tiobarbituurihappo, lämmitetään näytettä ja määritetään tämän jälkeen kolorimetrisesti sen malonidialdehydipitoisuus, tunnettu siitä, että malonidialdehydia sisältävän näytteen jatkuvaa käsittelyä varten näyte ennen 2-tiobarbituurihapon lisäystä jaetaan dialysaattorin näytteensyöttökoeputkissa yksittäisiin pieniin samantilavuuksisiin näyte-eriin, joita erottavat samantilavuuksiset kaasusulkeutumatj että proteiinit saostetaan näistä yksittäisistä näyte-eristä lisäämällä happoa ja erottamalla dialyysillä, jolloin malonidialdehydi siirtyy vastadialyysi-vir-taukseen, että kolorimetrinen reagenssi lisätään tähän virtaukseen, jonka jälkeen tämä virtaus saatetaan lämpötilaan noin 82°C, jossa virtausta kolorimetrisen reagenssin kanssa pidetään kunnes malonidialdehydi on täysin reagoinut ennen kuin malonidialdehydin pitoisuuden kolorimetrinen määritys suoritetaan.