DE2216496B2

DE2216496B2 - Reagenz und Verfahren zur Bestimmung des Thyroxingehaltes von Blutserum

Info

Publication number: DE2216496B2
Application number: DE2216496A
Authority: DE
Inventors: James L. House Springs Brown; Floyd P. Kirkwood Hallett
Original assignee: Byk Mallinckrodt Chemische Produkte GmbH
Current assignee: Byk Mallinckrodt Chemische Produkte GmbH
Priority date: 1971-04-08
Filing date: 1972-04-06
Publication date: 1975-04-17
Also published as: US3745211A; DE2216496C3; DE2216496A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Reagenz mit den Merkmalen nach dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1 sowie ein Verfahren zur Bestimmung des Thyroxingehaltes von Blutserum mit den Merkmalen nach dem Oberbegriff des Patentanspruchs 7.

Ein solches Reagenz und ein solches Verfahren sind aus der US-PS 34 14 383 bereits bekannt.

Das im Serum befindliche Protein thyroxinbindendes Globulin (TBG) hat eine vergleichsweise hohe und spezifische Affinität für das Schilddrüsenhormon Thyroxin (im folgenden T4 genannt). Weiterhin ist bekannt, daß, wenn man radioaktiv markiertes T 4 (das ist T 4, welches radioaktives Jod, wie J-125, enthält) zu einer Lösung hinzufügt, die mit einem Barbiturat gepuffertes TBG enthält, praktisch alles T 4 an das TBG gebunden wird. Fügt man dann zu dieser TBG-Lösune nicht radioaktives T 4 hinzu, wird das radioaktive T 4 vom TBG im Verhältnis zur zugefügten Menge

ίο nicht radioaktiv markierten T 4 in Freiheit gesetzt. Anschließend wird ein weiteres T4-bindendes Reagenz, z. B. ein Ionenaustauscher, zu diesem System hinzugefügt, der das radioaktive T 4 bindet, welches vom TBG in Freiheit gesetzt worden ist.

Es sind verschiedene Methoden beschrieben, die auf dem obengenannten Prinzip beruhen. So kann z. B. die Menge des freigesetzten radiaoktiv markierten T4 und damit auch die Menge des zugefügten nicht radioaktiven Thyroxins dadurch bestimmt werden, daß

man den Ionenaustauscher mit dem gebundenen radioaktiven T4 entfernt und die in der Lösung verbleibende Radioaktivität vergleicht. Gibt man steigende Mengen von stabilem T4 zu Lösungen, die gleiche Mengen von radioaktivem T4 und TBG enthalten, und verfährt wie oben angegeben, dann sinkt die verbleibende Radioaktivität in der TBG-Lösung. Trägt man in ein Koordinaten-System das Verhältnis Radioaktivität vor Versuchsbeginn zu Radioaktivität nach Versuchsende gegen die hinzugefügte Menge stabilen T4 ein, erhält

man eine Gerade. Wenn unbekannte Mengen stabiles T4 zu der TBG-Lösung hinzugefügt und identisch behandelt worden sind, dann kann man die Menge des T4 dem Diagramm entnehmen.

Für diese Bestimmung wird als TBG-Quelle normalerweise verdünntes Blutserum verwendet.

Zu." Bestimmung von T4 im Blutserum muß das Serum-T4 zuerst von den bindenden Proteinen befreit werden. Dies geschieht durch Denaturierung der Proteine mit Alkohol. Nach Zentrifugation findet man in dem alkoholischen überstehenden Produkt etwa 80% des vorhandenen T 4.

In der US-PS 34 14 383 wird eine sehr gut geeignete praktische Methode zur Bestimmung von Serum-T4 beschrieben.

Bei dieser Methode wird zu einer definierten Menge Reagenz, das eine Lösung von TBG und radioaktivem T4 enthält, eine definierte Menge des alkoholischen Extrakts der Serumprobe und ein Ionenaustauscher hinzugefügt. Nach einer bestimmten Zeit wird der Ionenaustauscher entfernt und die verbleibende Aktivität in der Lösung bestimmt. Das Ergebnis wird mit denen nach Zugabe definierter Mengen stabilen Thyroxins erhaltenen verglichen.
In den meisten Fällen liefert zwar diese Methode gute Ergebnisse, doch werden von Zeit zu Zeit auch ungenaue und zu hohe T4-Werte gefunden. Die Reproduzierbarkeit von Wiederholungsbestimmungen ist manchmal nicht annehmbar.

Bei der Methode gemäß der US-PS 34 14 383 ist die Menge des im Blut vorhandenen Thyroxins eine lineare Funktion des Verhältnisses Radioaktivität in der Reagenz-Lösung vor Entfernung einer Ionenaustausch-Membrane zur Radioaktivität nach Entfernung dieser Membrane, wie sie mit herkömmlichen Zählgeräten gemessen werden kann. Dieses Verhältnis, hier in der Folge precount-postcount-Verhältnis genannt, ist relativ hoch, wenn die Probe eine große Menge Thyroxin enthält, weil eine relativ große Menge

3 4

von radioaktivem Thyroxin am Globulin ersetzt und zung des T4 in der Standardlösung bewirkt, daß weni

aus der Lösung durch den Ionenaustauscher entfernt ger stabiles T4 zur Verfügung steht, um radioaktive:

wird. Wenn die zugefügte Menge des Thyroxins klein 1 4 aus dem TBG in Freiheit zu setzen. Dadurch wire

ist, dann ist das precount-postcount-Verhältnis eben- eine zu geringe Menge von radioaktivem T4 durch da:

falls niedrig. Bei dieser Methode tritt nun gelegentlich 5 Ionenaustauscherharz absorbiert, die postcount- Mes

eine solche Störung auf, daß bei der Untersuchung sung ist zu hoch und das Verhältnis precount zi

eines Standardserums mit einer bestimmten Menge postcount ist zu niedrig. Wenn erfindungsgemäß den

Thyroxin ein abnorm niedriges precount-postcount- Reagenz ein Chelatbildner hinzugefügt wird, dann wire

Verhältnis auftritt. Dieses Problem tritt auch mit dieses Problem eliminiert, und zwar wahrscheinlich da·

Standardlösungen auf, die zur Erstellung des Dia- io durch, daß die Kupfer- und Eisenionen komplex ge

gramms verwendet werden. Wertet man dann die Er- bunden werden und so eine katalytische Zersetzung de:

gebnisse von Untersuchungen unbekannter Proben Thyroxins verhindert wird.

aus, dann werden zu hohe Werte gefunden. Es ist des- Es wurde festgestellt, daß zuverlässige Ergebnissf

halb erforderlich, die Reproduzierbarkeit und Ge- nur dann erhalten werden, wenn der Chelatbildner derr

nauigkeit der Methode gemäß der US-PS 34 14 383 zu 15 TBG-Reagenz zugefügt wird. Das mag darin begrün

verbessern. det sein, daß im TBG-Reagenz bereits Ionen des Kup

Der vorliegenden Erfindung liegt nun die Aufgabe fers und des Eisens vorhanden sind. Diese Ionen gelan

zugrunde, die oben beschriebenen Nachteile des be- gen wahrscheinlich in die TBG-Lösung, wenn diese

kannten Verfahrens zu beseitigen und ein Reagenz zur durch einen Ionenaustauscher läuft, um das natürlich

Bestimmung des Thyroxingehaltes von Blutserum zur 20 vorhandene Thyroxin zu entfernen. Es wurde festge-

Verfügung zu stellen, das es gestattet, die bislang stellt, daß die Zufügung von Chelatbildnern zu der

aufgetretenen Meßfehler zu eliminieren und eine hohe Standardlösungen nicht im genügenden Maße die ober

Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des Bestim- beschriebenen Störfaktoren eliminiert. Nur das Hinzu-

mungsverfahrens zu gewährleisten. fügen des Chelatbildners zur Reagenzlösung erbringl

Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst. 25 zuverläßige Werte.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Reagenz Wie im Beispiel 3 unten aufgezeigt wird, stellen sich zur Bestimmung des Thyroxingehaltes von Blutserum die gelegentlichen Ungenauigkeiten bei der Methode aus einer gepufferten Lösung von radioaktiv markiertem gemäß der US-PS 34 14 383 mehr in abnorm niedriger Thyroxin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es precount-postcount-Verhältnissen bei den Standardweiterhin einen Chelatbildner enthält. 30 Lösungen als bei den bekannten Lösungen dar. Die

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren Gründe hierfür sind noch nicht völlig geklärt, aber es

zur Bestimmung des Thyroxingehaltes von Blutserum kann daran liegen, daß die Standardlösungen keine

unter Verwendung von radioaktivem Thyroxin als Serumextrakte sind, während dagegen die unbekannter

Tracer, bei welchem man zu einer bekannten Menge Proben Serumextrakte sind, die möglicherweise natür-

eines Reagenzes aus einer thyroxinbindendes Globulin 35 lieh vorkommende Substanzen enthalten, die eine

und radioaktives Thyroxin enthaltenden Lösung a) durch Metallionen initiierte Zersetzung des Thyroxins

einen alkoholischen Extrakt einer Blutserumprobe, verhindern. Somit kann die erfindungsgemäße Zugabe

deren Thyroxingehalt zu bestimmen ist, und b) ein eines Chelatbildners zu dem TBG-Reagenz die Mög-

Ionenaustauscherharz hinzufügt, die Lösung eine be- lichkeit einer Zersetzung von Thyroxin, hervorgerufen

stimmte Zeitspanne in Kontakt mit dem Ionenaus- 40 durch die Standardlösung oder durch die unbekannte

tauscherharz beläßt, dann das Ionenaustauschcrharz Serumprobe, verhindern.

von der Globulinlösung abtrennt und die Radioaktivi- Es liegt eine große Auswahl von chelatbildenden tat der Globulinlösung mit der von Globulinlösungen Reagenzien vor, die verwendet werden können; die ArI vergleicht, zu denen bekannte Mengen stabilen Thy- des zu verwendenden Chelatbildners ist nicht kritisch, roxins, gelöst im gleichen Volumen Alkohol gleicher 45 Besonders brauchbare Chelatbildner sind Aminopoly-Provenienz wie der im alkoholischen Extrakt der Blut- carbonsäuren, wie Äthylendiamintetraessigsäure serumprobe, hinzugefügt wurden, das dadurch gekenn- (EDTA) und deren Salze, wie Alkalisalze. Andere verzeichnet ist, daß man dem Reagenz einen Chelatbildner wendbare Aminopolycarbonsäurevcrbindungen sind zusetzt. Nitrilotriessigsäure, Diäthylentriaminpentaessigsäure,

Die Erfindung wird an Hand der Zeichnungen er- 50 N-Hydroxyäthylendiamintetraessigsäure, 1,2-Di-aminc

läutert. cyclohexantetraessigsäure und die entsprechender

F i g. 1 zeigt Serum-T4-Werte, die nach der Methode Salze dieser Säuren. Andere Chelatbildner, die erfin-

von Brown unter Anwendung einer normalen dungsgemäß verwendet werden können, sind z. B. De-

TBG-T4-Reagenzlösung erhalten worden sind; feroxamin, Natriumdiäthylthiocarbamat, Hydralazin

F i g. 2 zeigt falsche, zu hohe T4-Werte des gleichen 55 Methisazon, 8-Hydroxychinolin, /9-Mercaptovalin, N-

Serums, die durch ein abnormes TBG-radioaktives- Acetyl-ß-mercaptovalin, 5-Amino-l-phenyl-l H-tetra·

T4-Reagenz hervorgerufen wurden; zol, Isonicotinsäurehydrazid und 2,3-Dimercapto-l·

F i g. 3 zeigt normale Serum-T4-Werte des gleichen propanol.

Serums nach Verwendung einer TBG-T4-Reagenzlö- Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung sung wie in F i g. 2, zu der 0,1 mg des Dinatriumsalzes 60 noch weiter,
der Äthylendiamintetraessigsäure pro ml Reagenz hinzugefügt worden sind. Beispiel 1

Es kann angenommen werden, daß die gelegentlich

auftretenden Ungenauigkeiten bei Verwendung der Zu 78 ml Serum werden 1850 ml einer Barbital-

Methode gemäß der US-PS 34 14 383 auf eine kataly- 65 pufferlösung von pH 8,6 hinzugefügt, die 2,39% Na-

tische Zersetzung des T4 in der Standardlösung zu- triumbarbital und 0,7% Natriumazid als Bakterio-

rückzuführen ist, wenn das Reagenz Spuren von Metall- statikum enthält. Der pH-Wert wird mit Salzsäure ein-

ionen, wie Cu⁺⁺, Fe⁺++ u. dgl., enthält. Eine Zerset- gestellt. Hierzu wird eine kleine Menge von radioakti-

vem Τ4, ungefähr 0,13 mCi, hinzugefügt, das als Tracer zur Bestimmung der Extraktionsrate benötigt wird.

Die Extraktionskolonne wird wie folgt hergestellt:

Eine genügende Menge von Ionenaustauscher wird in eine passende Glassäule eingefüllt; das Volumen sollte etwa 1000 ml betragen, die Durchflußmenge etwa 10 ml/Minute. Am geeignetsten ist ein stark basischer Anionenaustauscher mit quarternären Ammoniumbasen. Es können aber auch andere Anionen- oder Kationenaustauscher verwendet werden.

Der Ionenaustauscher wird in Wasser aufgeschlämmt und auf die Säule gegeben. Über der Säule sollte stets eine Wasserschicht stehen. Die Säule wird dann mit einem Behälter verbunden, der die zu extrahierende Serumlösung enthält. Die Durchflußgeschwindigkeit beträgt 10 ml Minute. In bestimmten Zeitabständen wird 1 ml des Eluats entnommen und dessen Radioaktivität bestimmt. Auf diese Weise kann der Extraktionsgrad bestimmt werden. Die Radioaktivität des Eluats sollte kleiner als 10% der ursprünglichen Aktivität pro Volumeneinheit sein.

Zu etwa 8 ml des obenerwähnten Barbitalpuffers werden genügend (0,125 g EDTA-Na₂) Di-Natriumsalz der Äthylendiamintetraessigsäure hinzugegeben, daß eine Konzentration von 0,1 mg Di-Natrium-EDTA/ml des Eluates (extrahierte Serumlösung) erhalten wird. Das Auflösen von EDTA kann durch leichtes Erwärmen beschleunigt werden. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wird diese Lösung zu dem Säuleneluat (extrahierte Serumlösung) hinzugegeben. Zu dem Eluat wird radiaoktives Thyroxin (ungefähr 0,27 mCi) hinzugefügt. Es empfiehlt sich, die extrahierte Serumlösung durch einen O,22^-Filter zu filtrieren. Anschließend werden 11 580 ml (= 6 · das Volumen des Eluats) Barbitalpuffer, der 0,1 mg Natrium-EDTA/ml enthält, zu dem Eluat hinzugefügt. Das so gewonnene Reagenz hat einen pH-Wert von ungefähr 8,6 und eine Di-Natrium-EDTA-Konzentration von 0,1 mg/ml.

Beispiel 2

Man entnimmt etwa 10 ml Blut, dessen Thyroxingehalt zu bestimmen ist, und läßt es koagulieren. Das Serum wird dann abgetrennt, 1 ml des Serums werden tropfenweise zu 2 ml von 95 %igem Äthanol in ein Zentrifugengläschen hinzugefügt. Die Bestandteile werden gut gemischt, um die Serumproteine zu denaturien. Diese Alkoholmischung wird dann bei 2500 Umdrehungen pro Minute etwa 4 bis 5 Minuten zentrifugiert. 0,3 ml des überstehenden Produkts werden in ein geeignetes Testgläschen überführt, welches 4 ml der TBG/radioaktive-T4-Reagenzlösung enthält, wie sie im Beispiel 1 beschrieben wird. Auf die gleiche Art und Weise werden 2 Standardproben hergestellt; an Stelle des äthanolischen Serumextraktes werden je 0,3 ml einer äthanolischen Lösung hinzugefügt, die eine bestimmte Menge (z. B. 0 oder 12 ng) stabiles Thyroxin enthalten.

Zu jedem Testgläschen wird dann ein Ionenaustauschermembranstreifen gegeben. Da Thyroxin amphoter ist, kann dieser lonenaustauscherstreifen sowohl anionenselektiv als auch kationenselektiv sein. Viele dieser Ionenaustauscherstreifen sind als Membranen erhältlich.

Nach Zugabe des Ionenaustauscherstreifens werden die Fläschchen verschlossen und genau 1 Stunde bei Raumtemperatur rotiert. Es empfiehlt sich, einen Rotator zu verwenden, der speziell für diese Zwecke konstruiert worden ist. Da die Aufnahme von radioaktivem Thyroxin durch den Streifen eine Funktion der Rotationszeit ist, ist es wesentlich, daß sowohl für die bekannten als auch unbekannten Proben die Rotationszeit identisch ist. Nach einer Stunde Rotationszeit wirJ der lonenaustauscherstreifen mit Hilfe einer Pinzette entfernt und verworfen. Die Radioaktivität jedes Gläschens wird dann bestimmt und als postcount registriert. Es sollten mindestens 10 000 counts per Minute (cpm) registriert werden, um einen statistisehen Fehler von weniger als 2% zu haben. Der sogenannte precount wird bestimmt durch Messen eines Gläschens, das nur 4 ml der TBG/radioaktiven-T4-Lösung enthält. Anschließend berechnet man das precount-postcount-Verhältnis für jede Probe. Die für die Standardproben erhaltenen Werte werden gegen die Menge hinzugefügten T4 in ein Diagramm eingetragen. Die so erhaltenen Punkte werden durch eine Gerade verbunden. Der Thyroxingehalt unbekannter Proben kann aus dem Diagramm ermittelt werden.

Da die Alkoholextrakte nur etwa 80% des im Serum vorhandenen T4 enthalten, muß der erhaltene Wert durch 0,8 — den sogenannten Extraktionsfaktor — dividiert werden, um den tatsächlichen Gehalt an Thyroxin im Serum zu erhalten. Dieser so korrigierte Wert stellt den Gehalt an T 4 in ng in je 0,1 ml Serum dar, welcher numerisch äquivalent zu dem T4 μg% des Patientenserums ist. 1 μg% = 1 μg%/100 mi Serum. Da die Serumprobe vorher mit 2 Volumina Äthanol pro Volumen Serum verdünnt wurde und 0,3 ml des

Äthanolserumüberstandes entnommen wurden, ist tatsächlich nur 0,1 ml des Serums untersucht worden. So enthält 0,1 ml von einem 12,0 μg% Thyroxinserum:

100 ml

0,1ml	B	e	12,0 · 10-³ μg	12,0 ng
Probe		Probe	Probe
	i s ρ i e 1 3

Die Zeichnungen verdeutlichen die Störung, die gelegentlich bei Verwendung des in der US-PS 3414383 beschriebenen Reagenzes auftritt, und wie diese Störung durch das Reagenz gemäß dieser Erfindung eliminiert werden konnte.

Die Diagramme von F i g. 1, 2 und 3 stellen die Ergebnisse von Untersuchungen zweier Standardlösungen nach Beispiel 2 dar. Der erste Standard war eine äthanolische Lösung, die kein Thyroxin enthielt, und der zweite eine gleiche Lösung, die genau 12 ng T 4

enthielt. Bei jeder Untersuchung wurde das precountpostcount-Verhältnis bestimmt, und die 3 Punktpaare wurden eingetragen. So wurden die drei Standardkurven erhalten. Jedesmal wurde der 12-ng-Wert weger des Extraktionsgrades von 80% korrigiert. Dei

12-ng-Wert wurde deshalb bei 15 ng eingetragen. Dieser ermöglicht eine direkte Ablesung der korrigierter T 4-Werte von der Standardkurve.

Parallel mit den 0- und 12-ng-Standards wurde eir standardisiertes Normalserum (in diesem Fall da:

»Unbekannte«) untersucht. Der T4-Gehalt dieses standardisierten Normalserums wurde unabhängif voneinander nach der Murphy-Patty-Methode unc der PBJ-(Protein-Bound-Iodine-)Methode bestimmt. Ei betrug 9,3 _με% T4. Die Murphy-Patty-Methode ist ir

der Veröffentlichung von B. E. P. Murphy unc C. J. P a 11 y »Determination of Thyroxine Utilisini the Property of Protein Binding«, Journal of Clin Endocrinology, Bd. 24, S. 187 (1964), beschrieben. Ir

der Literatur sind verschiedene Methoden zur Bestimmung des PBJ bekannt; vgl. auch J. R ο b i η s und J. E. R a 11 »The Iodine Containing Hormones«, »Hormones in Blood«, C. H. Grey und A. L. B ach ar ach, Bd. 1, 2. Auflage, Academic Press New York, S. 405 bis 413.

Bei den durchgeführten Untersuchungen waren die 0- und 12-ng-T4-Standards und das Normalserum konstant, variable war das Reagenz, das TBG und

radioaktives T4 enthielt. Die Ergebnisse der Radioaktivitätsmessung sind in der Tabelle angegeben. In den Zeichnungen stellen die Punkte 10, 20 und 30 die precount-postcount-Verhältnisse für die 0-ng-Standards, die Punkte 11, 21 und 31 die entsprechenden Ablesungen für die 12-ng-Standards (korrigiert auf 15 ng) dar. Die Punkte 12, 20 und 32 stellen die Ergebnisse der Intersuchungen des standardisierten Normalserums dar.

Probe	cpm	cpm	Verhält
	precount	postcount	nis
F i g. 1 O-ng-Std	44 060	23 849	1,84
12-ng-Std	43 884	14 400	3,04
Std. Normal
serum	43 449	16 596	2,61
F i g. 2 O-ng-Std	30 910	18 668	1,65
12-ng-Std	30 859	13 537	2,28
Std. Normal
serum	30 979	12 368	2,50
F i g. 3 O-ng-Std	30 677	17,386	1,76
12-ng-Std	30 865	10,475	2,95
Std. Normal
serum	31221	12 399	2,52

Bei den Untersuchungen, die in F i g. 1 dargestellt sind, war ein normales TBG/radioaktives-T4-Reagenz verwendet worden, wie es in der US-PS 34 14 383 beschrieben ist. Die Ergebnisse sind wie erwartet. Bei den Ergebnissen in F i g. 2 war eine andere Charge von TBG/radioaktivem -T4-Reagenz nach Brown verwendet worden. Diese Untersuchung ergab ein abnorm niedriges precount-postcount-Verhällnis für den 12-ng-Standard (Punkt 21). Dies resultierte in einem falsch hohen Serum-T4-Wert (Punkt 22) für das standardisierte Normalserum.

Bei den Bestimmungen in F i g. 3 war das gleiche Reagenz wie bei F i g. 2 genommen worden, nur war in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung 0,1 mg_ Di-Natrium-EDTA/ml hinzugefügt worden. Diese Änderung ergab normale "Werte für den 12-ng-Standard (Punkt 31) und dementsprechend ein exakter T4-Wert für das standardisierteNormakerum(Punkt32)·

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Reagenz zur Bestimmung des Thyroxingehaltes von Blutserum, bestehend aus einer gepufferten Lösung von radioaktiv markiertem Thyroxin, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin einen Chelatbildner enthält.

2. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Thyroxin radioaktives Jod enthält.

3. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich Blutserum enthält, aus dem das meiste natürlich vorkommende Thyroxin extrahiert worden ist.

4. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es als Chelatbildner eine Aminopolycarbonsäure oder eines ihrer Saize enthält.

5. Reagenz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es als Chelatbildner Äthylendiamintetraessigsäure oder eines ihrer Salze enthält.

6. Reagenz nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es als Chelatbildner das Di-Natriumsalz der Äthylendiamintetraessigsäure enthält.

7. Verfahren zur Bestimmung des Thyroxingchaltes von Blutserum unter Verwendung von radioaktivem Thyroxin als Tracer, bei welchem man zu einer bekannten Menge eines Reagenzes aus einer thyroxinbildendes Globulin und radioaktives Thyroxin enthaltenden Lösung, a) einen alkoholischen Extrakt einer Blutserumprobe, deren Thyroxingehalt zu bestimmen ist, und b) ein lonenaustauscherharz hinzufügt, die Lösung eine bestimmte Zeitspanne in Kontakt mit dem Ionenaustauscherharz beläßt, dann das Ionenaustauscherharz von der Globulinlösung abtrennt und die Radioaktivität der Globulinlösung mit der von Globulinlösungen vergleicht, zu denen bekannte Mengen stabilen Thyroxins, gelöst im gleichen Volumen Alkohol gleicher Provenienz wie der im alkoholischen Extrakt der Blutserumprobe, hinzugefügt wurden, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Reagenz einen Chelatbildner zusetzt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Chelatbildner eine Aminopolycarbonsäure oder eines ihrer Salze verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Chelatbildner Äthylendiamintetraessigsäure oder eines ihrer Salze verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als Chelatbildner das Di-Natriumsalz der Äthylendiamintetraessigsäure verwendet.