DE60005359T2

DE60005359T2 - Verfahren zur quantitativen feststellung von alkaloiden wie kokain in einer festen probe und reagenz zur benutzung in diesem verfahren

Info

Publication number: DE60005359T2
Application number: DE60005359T
Authority: DE
Inventors: Vincenzo Vitalone; Andrea Lotti; Massimo Gottardi
Original assignee: AZIENDA PROVINCIALE PER I SERV; AZIENDA PROVINCIALE PER I SERVIZI SANITARI
Current assignee: AZIENDA PROVINCIALE PER I SERV; AZIENDA PROVINCIALE PER I SERVIZI SANITARI
Priority date: 1999-07-20
Filing date: 2000-07-14
Publication date: 2004-07-22
Anticipated expiration: 2020-07-15
Also published as: IT1309450B1; AU5701000A; DE60005359D1; ES2206262T3; WO2001006251A3; WO2001006251A2; ATE250230T1; EP1196784A2; EP1196784B1; ITVR990059A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mengenmäßigen Bestimmung von Kokain und anderen Alkaloiden, wie zum Beispiel Morphine und Methadon in einer festen Probe, das heißt einer Haarprobe, indem ein screeningartiger Ansatz verwendet wird.
Die Erfindung betrifft auch ein Reagens zur Verwendung in einem solchen Verfahren und neue Diagnosegeräte zum Ausführen des Verfahrens mit einem solchen Reagens unter ihren Komponenten.
Mit „screeningartiger Ansatz" ist eine Art von Analyse gemeint, die es erlaubt in einer relativ kurzen Zeitspanne eine relativ große Anzahl von Proben auf billige, effiziente und standardisierte Weise zu analysieren. Diese Art der Analyse erlaubt es, die negativen Proben aus zu schließen durch unmittelbares Identifizieren der Proben, die nicht die Substanz oder die gesamte Substanzklasse enthalten oder jene, in denen diese Substanzen vorhanden sind mit einem Niveau, das unterhalb der Schwelle oder des Ausschlusswerts ist.
Die Schwelle oder der Ausschlusswert ist eine praktische Grenze, die ausgewählt ist, um fest zu legen, ob die Probe positiv oder negativ ist. Der Schwellenwert unterscheidet sich von der Grenze der Erfassung des Verfahrens, das heißt der niedrigsten Konzentration einer zu analysierenden Substanz, die feststellbar ist. Tatsächlich ist der Ausschlusswert normalerweise auf eine Konzentration eingestellt, die höher ist als die Grenze der Erfassung, um die Ungenauigkeit zu vermeiden der Analyse bei Werten, die nahe der Grenze der Erfassung liegen.
Ausschlusswerte sind üblicherweise festgelegt und berücksichtigen eine Vielzahl von Faktoren, wie zum Beispiel die Fähigkeit der Verwendung handelsüblich verfügbarer Reagenzien, die pharmakinetischen Eigenschaften der Substanzen und die Notwendigkeit falsche Negative zu vermeiden (siehe: P. Zuccaro, S. Pichini, I. Altieri und R. Pacifici: Proposta die linee guida per l'analisi delle sostanze d'abuso nei liquidi biologici in RAPPORTI ISTISAN 96/29 herausgegeben vom ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA').
Die Substanzen, die der Metabolismus des menschlichen Körpers aufnimmt in den Haaren, sind zahlreich. Normalerweise ist es erforderlich, das Vorhandensein von Alkaloiden und anderen missbräuchlichen Substanzen, wie zum Beispiel Morphine, Methadon und/oder Kokain, festzustellen. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können auch weitere Substanzen erfasst werden, wie zum Beispiel die aus der folgenden nicht beschränkenden Liste: 6-O-Mono-Acetyl-Morphine, Bi-Acetyl-Morphine, Kodeine, Papaverine, Nalorphine, Nikotine, Kotinine, Kaffeine, Noscarpine, Mepivacaine, Trimetropin, Buprenorphine, Pentazocyne, Methadon, Metabolyte, Benzoylecgonine, Amphetamine, Metamphetamine, Methylenedioxyamphetamine, Methylenedioxymetamphetamine, Methylenedioxyethylamphetamine, Benzodiazepine, Barbiturate.
Beschreibung des Standes der Technik
Es sind verschiedene Techniken bekannt für die Erfassung interessanter, zu analysierender Substanzen, wie die oben genannten. Insbesondere für die Analyse von Kokain, das im Haar vorliegt, sind Gaschromatographie (GC) kombiniert mit Massenspektrometrie (MS), im folgenden bezeichnet als GC/MS und die Radio Immun Prüfungstechnik, bekannt.
GC oder flüssige Chromatographie (LC) kombiniert mit MS sind Verfahren zur Auflösung, Reinigung oder Trennung und Identifikation von Komponenten komplexer Mischungen organischer oder anorganischer Substanze, die sogar streng ähnliche chemische Eigenschaften aufweisen. Die Trennung von Substanzen, die gelöst in einer Flüssigkeit oder fest auf einer fein unterteilten oder porös festen Substanz vorliegen, beruht auf Perkolation, beziehungsweise Elution durch diese eines eluenten Gases oder Flüssigkeit.
Wenn die zu separierenden/zu erfassenden Substanzen gasförmig gemacht werden können und ein Gas als Eluent genutzt wird, ist GC einschlägig. Das Letztere ist ein Trennverfahren, das auf der Verteilung zwischen einer festen oder flüssigen stationären Phase und einer mobilen Phase beruht, die aus den zu separierenden Gasen oder Dämpfen hergeleitet sind, die von einem Strom eines inerten Gases getragen werden.
Die analytischen Ergebnisse werden in einen Graphen, der als Chromatogramm bezeichnet ist, aufgetragen, in dem die Mengen der einzelnen in der Mischung vorhandenen und an das Gas/Flüssigkeit Eluent übertragenen Komponenten aufgetragen werden über der Zeit. Der Graph weist Spitzen auf, deren Höhe eine direkte Funktion der Menge der spezifischen Substanzen ist.
Chromatographische Verfahren, die verwendet werden können für bestätigende Analyse sind GC und LC, wobei die Letztere oft bezeichnet wird als „High Performance Liquid Chromatography" (HPLC). Die am häufigsten verwendeten Detektoren für GC sind Elektronen-Streu Detektoren und Phosphor Nitrogen Detektoren.
Wie oben ausgeführt verwendet GC/MS einen Gaschromatographen kombiniert mit einem Massenspektrometer. Hierdurch wirkt die Fähigkeit zur Trennung des GC zusammen mit der Spezifizierung, die dem MS zu eigen ist. Deshalb stellt GC/MS das Verfahren der Wahl für bestätigende Analyse der oben genannten Substanzen, wie auch von deren Metaboliten dar (siehe wiederum: Proposta die linee guida per l'analisi delle sostanze d'abuso nei liquidi biologici in RAPPORTI ISTISAN 96/29 herausgegeben vom ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA').
Bei der herkömmlichen Hydrolyse von Säuren wird Kokain jedoch extrahiert von hydrochlorischer Säure an sich, das heißt ohne Durchlaufen einer Transformation zu ihrem Metabolit Benzoylecgonin. Da die Mengen an Kokain, die auf diese Weise extrahiert werden, sehr gering sind, ist es nicht möglich Kokain zu bestimmen mittels der herkömmlichen Screening Verfahren.
Radio Immun Prüfung (RIA) beruht auf Radio-immunologischen Prüfungen, die bekannte Mengen an Antikörpern und von zu analysierenden Substanzen verwenden, die mit einem Radioisotop gekennzeichnet sind (im allgemeinen I125). Während der Inkubation wetteifern die gekennzeichneten, zu analysierenden Substanzen und das möglicherweise in der Probe vorhandene um die Antikörper Plätze. Nach Fällung der Antigen-Antikörper Komplexe und Zentrifugieren werden der Überschuss oder die Fällung übertragen auf einen Gamma Geiger Zähler, der das Radioaktivitäts-Niveau misst. RIA-Geräte sind äußerst empfindlich und ermöglichen die Identifikation von 1–5 ng an Substanz pro ml. Aufnahme von automatischen Instrumenten zum Pipettieren und Zählen ermöglicht die gleichzeitige Analyse von zahlreichen Proben mit Antwortzeiten von 1 bis 5 Stunden. Andererseits erfordert die Verwendung von radioaktiven Isotopen angemessene Sicherheitsmaßnahmen. Überdies erzwingt die relativ kurze Halbwertszeit der radioaktiven Isotopen sorgfältige Handhabung der Reagenzien.
RIA bietet sich nicht an für eine weit verbreitete Verwendung zur schnellen Bestimmung von den vorliegend in Frage kommenden Substanzen, zu aller erst wegen der hohen Kosten der Reagenzien, die weiter verschärft wird durch die Verlässlichkeit der Antisera. Zweitens, hinsichtlich der Gefahr der Analyse auf Grund der Notwendigkeit mit radioaktiven Materialien zu operieren, die gefährlich sind für den Analysten und auch hinsichtlich der erforderlichen Zeiten, die relativ lang sind. RIA erfordert auch die Verfügbarkeit von geeignet ausgestatteten und abgeschirmten Räumen so wie auch besondere Sorgfalt beim Umgang mit Abfallmaterialien und bei deren Beseitigung.
Deshalb wird RIA kaum verwendet bei dieser Art von Analyse. Der Stand der Technik zeigt daher, dass die Bestimmung von Kokain im Haar nicht praktikabel ist mit dem so genannten screeningartigen Ansatz, wie oben beschrieben, das heißt mit sehr schnellen und billigen Techniken wie verwendet für die Bestimmung der selben Substanzen im Urin.
Dies ist hauptsächlich bedingt durch die Tatsache, dass bei dem herkömmlichen screeningartigen Ansatz, das was analysiert wird, nicht Kokain ist, sondern sein Metabolit Benzoylecgonin. Die Tatsache, dass diese Substanz nicht an sich natürlich existiert, sondern nur als der Metabolit von Kokain und die Tatsache, dass die Reaktion der Transformation von Kokain in Benzoylecgonin, das heißt die Transformation der Ester-Gruppe in eine Hydroxyl-Gruppe, irreversibel ist in einer alkalinen Umgebung, macht die Bestimmung der Benzoylecgonin eine notwendige und hinreichende Bedingung für die Erfassung von Kokain.
Benzoylecgonin befindet sich im Haar in einem Verhältnis von 1 zu 4 oder sogar 1 zu 10 und mehr mit Bezug auf Kokain. Wenn die Menge an Kokain sehr niedrig oder nahe dem Ausschlusswert (0,2–0,1 ng Kokain pro mg Haar) ist, kann deshalb screening nicht durch geführt werden, wegen der geringen Menge dieses Metabolits (0,05–0,025 ng Benzoylecgonin pro mg Haar), wobei eine solche Menge nicht erfassbar mit den screening Vorrichtungen, die in den Laboren verfügbar sind.
US-A 910 419, welche der nächste Stand der Technik ist zu der Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum screenen von Haarproben, die wohl die bekannte ELISA Technik verwendet für das Vorhandensein von Kannabinoiden und weitere RIA für das Vorhandensein von Kokain. Wie bereits ausgeführt, bietet sich RIA nicht an für eine schnelle und billige Bestimmung von missbräuchlichen Medikamenten und bringt zudem Sicherheits- und Handhabungsprobleme mit sich.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Hauptaufgabe dieser Erfindung ist es, die oben genannten Nachteile zu überwinden, das heißt die Unmöglichkeit die Menge des Kokains, das in einer festen Probe enthalten ist, mit dem herkömmlichen screeningartigen Ansatz zu erfassen.
Gemäß der Erfindung wird diese Aufgabe gelöst mit einem screeningartigen Verfahren zur mengenmäßigen Bestimmung von Kokain und anderen Alkaloiden, die in einer festen Probe vorliegen, mit den folgenden Schritten gemäß Anspruch 1:

a) Vorbereiten einer festen Probe in fein unterteilter oder pulvriger Form,
b) Auswählen eines flüssigen Reagens, das konstante Konzentration von Hydroxyl-Gruppen bereitstellt, die geeignet sind, Kokain zu extrahieren und in Benzoylecgonin um zu wandeln und zum extrahieren anderer ähnlicher Substanzen,
c) Extrahieren von Kokain und anderer ähnlicher Substanzen, die in der Probe enthalten sind und Umwandeln des extrahierten Kokains in Benzoylecgonin, wobei die Probe vollständig untergetaucht in dem flüssigen Reagens gehalten wird bei einer Temperatur zwischen 10°C bis 250°C für eine Zeitdauer zwischen wenigen Sekunden bis 48 Stunden, und
d) Analysieren der Flüssigkeit, die aus der festen Probe separiert wurde, um die Konzentration des in der Flüssigkeit enthaltenen Benzoylecgonins zu bestimmen relativ zu der Abscheidungs-Grenze, wobei ein herkömmliches Analysegerät verwendet wird für die Bestimmung von Benzoylecgonin im Urin.

Bevorzugte Aspekte der Erfindung umfassen die Verwendung von Haar als das feste Material, das die feste Probe bildet, wobei ein Puffer verwendet wird als Reagens, die Hydroxyl-Gruppen bereit stellt, noch vorzugsweise einen Ammonium Puffer, am bevorzugtesten einen Puffer, der im folgenden als VMA bezeichnet wird und Aufheizen der in der Flüssigkeit unter getauchten Probe auf eine Temperatur zwischen 100°C bis 150°C für ungefähr eine Stunde.
Gemäß einem weiteren Aspekte der Erfindung ist ein Verfahren vorgesehen, dass die zusätzlichen Schritte umfasst: Anordnen der Proben in ansteigenden Konzentrationen der interessierenden Substanzen, und Durchführen von Bestätigungsanalysen mit Standardtechniken, wie zum Beispiel GC oder GC/MS.
Gemäß einer Ausgestaltung der Erfindung kann das Verfahren die folgenden Schritte vorsehen:

– Bereitstellen einer Probe aus ungefähr 50 mg bis 300 mg fein geteiltem und/oder pulverisiertem Material,
– Hinzufügen eines geeigneten flüssigen Reagens in das die Probe enthaltende Prüfrohr, bis die Probe vollständig untergetaucht ist, wobei das Reagens in der Lage ist Extrahieren und Umformen von Kokain in Benzoylecgonin zu leisten und gleichzeitig andere ähnliche Substanzen zu extrahieren, die in der Probe vorhanden sind,
– falls erforderlich Schütteln des Prüfrohrs, um das Untertauchen der Probe zu erleichtern,
– Erhitzen der Inhalte des Prüfrohrs auf eine Temperatur T1 in einem Zeitintervall t1, wobei das Prüfrohr unter getaucht in einem temperierten Bad gehalten wird oder in dem es in einen Ofen gesetzt wird,
– Kühlen des Prüfrohrs auf Zimmertemperatur,
– Entnehmen der Flüssigkeit und Übertragen in ein Prüfrohr, das geeignet ist für ein Instrument zum Screenen,
– Durchführen des Screenens, indem ein Reagenzgerät für die Bestimmung der Substanzen in Urin verwendet wird,
– Auslesen der Daten, die sich ergeben aus der Instrumentierung der ersten Ebene, um die Konzentrationswerte zu ermitteln mit Bezug auf die Abscheidungs-Grenze, und
– gleichzeitiges Bestimmen der Menge(n) an vorhandenen Substanz(en).

Gemäß einem weiteren Aspekte der Erfindung ist ein Reagens vorgesehen zur Verwendung in dem oben genannten Verfahren, das in der bevorzugtesten Ausgestaltung die folgende Formel aufweist: VMA = 0,2 M (NH4)2HPO4 + 5 ml/L 25% NH4OH
In der obigen Formel ist (NH₄)2HPO₄ dibasisches Ammoniumphosphat und NH₄OH ist Ammoniumhydrat. Tatsächlich ergeben 5 ml/L NH₄OH eine 0,07 M Konzentration von Hydroxyl-Gruppen, was enthalten ist in dem Bereich, der 100% Umwandlung ergibt.
Zusätzlich zu dem Hauptvorteil der Erfindung, wie oben ausgeführt, ist ein weiterer Vorteil, dass die Bestätigungsanalyse (zum Beispiel GC/MS) nur an den Proben durchgeführt werden muss, die beim ersten Screenen als positiv bestimmt wurden, wohingegen bei der Verwendung herkömmlicher Techniken alle Proben analysiert werden müssen, da kein Gerät verfügbar ist zur Bestimmung von Kokain sondern nur zur Bestimmung von Benzoylecgonin. Durchschnittlich erfordert die Analyse von 25 Proben zwei Stunden für das Herrichten der Proben plus eine Woche für die Bestätigungsanalyse aller (beider, positiver und negativer) Proben.
Andererseits wird ein Analyst beim Anwenden der vorliegenden Erfindung für die selben 25 Proben zwei Stunden brauchen für das Herrichten der Proben plus 30 Minuten für die screeningartige Analyse plus der erforderlichen Zeit zum Durchführen der Bestätigungsanalyse. Das Letztere muss aber nur an den Proben durchgeführt werden, die als positiv bestimmt wurden.
Da durchschnittlich die positiven Proben zwischen 0 und 20% liegen und da die meiste erforderliche Zeit verbracht wird bei der Bestätigungsanalyse, ermöglicht das Verfahren gemäß der Erfindung das Einsparen von wesentlicher Zeit, die geschätzt werden kann auf ungefähr 70 bis 90% der erforderlichen Zeit für die Analyse der in Betracht genommenen Proben.
Ein weiterer Vorteil gemäß dieser Erfindung ist es, dass das mögliche Ziehen der aktiven Substanzen von einer Probe zu einer anderen bei der Bestätigungsanalyse vermieden oder minimiert wird, weil es möglich ist, Proben anzuordnen in der Reihenfolge zunehmender Konzentration der interessierenden Substanzen, so dass die Bestätigungsanalyse vorgenommen wird, indem von den Proben mit der niedrigsten Konzentration ausgegangen wird und dann mit denen mit höheren und Höheren Konzentrationen.
Auf diese Weise ist die Möglichkeit vollkommen ausgeschlossen, dass eine Probe mit hoher Konzentration von, zum Beispiel Kokain, davon eine Spur in dem Instrument lässt, das verwendet wird für die Analyse und einen Einfluss hat auf die Bestimmung der selben Substanzen in der folgenden Probe, die vielleicht eine Konzentration hat, die gerade unter der Ausscheidungs-Grenze ist.
Noch ein weiterer Vorteil der Erfindung ist, dass sie ermöglicht zur selben Zeit und in der selben Probe nicht nur Kokain sondern auch andere Substanzen zu suchen und zu bestimmen, wie zum Beispiel Morphine, indem die selbe Ausscheidungs-Grenze verwendet wird oder ansonsten Methadon, indem die Ausscheidungs-Grenze modifiziert wird.
Ein weiterer Vorteil ist es, dass das Verfahren gemäß der Erfindung dem Analysten eine höhere Sicherheit bietet, weil ein positives Ergebnis mit zwei verschiedenen analytischen Verfahren bestätigt wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ist ein Diagnosegerät vorgesehen, das das oben genannte Reagens als eine seiner Komponenten enthält.
Noch weitere zusätzliche Vorteile der Erfindung werden offenbar beim Lesen der folgenden, genauen Beschreibung und der folgenden, nicht beschränkenden Beispiele.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist ein Chromatogramm, das ausgegeben wird von einer Vorrichtung, die Gaschromatographie an der Probe von Tabelle 2 durchführt;
2 ist der Graph, der ausgegeben wird von Massenspektrometrie an der ersten Probe nach Säurehydrolyse und das Vorhandensein von Kokain zeigt;
3 ist das Massenspektrum der selben ersten Probe nach Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung und zeigt das Vorhandensein von Benzoylecgonin;
4 ist das Massenspektrum der selben ersten Probe nach Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung und zeigt das Vorhandensein von Morphin;
5 ist ein Chromatogramm, das ähnlich ist zu dem von 1 und betrifft die erste Probe gemäß dieser Erfindung wie gezeigt in Tabelle 3;
6 ist ähnlich zu der MS von 3 und zeigt das Vorhandensein von Benzoylecgonin;
7 ist ähnlich zu der MS von 3 und zeigt das Vorhandensein von Morphin;
8 ist ähnlich zu 1, betrifft aber eine zweite Probe;
9 ist ähnlich zu 5, betrifft aber eine zweite Probe;
10 und 11 sind entsprechend ähnlich zu 8 und 9, betreffen aber eine dritte Probe;
12 und 13 sind entsprechend ähnlich zu 8 und 9, betreffen aber eine vierte Probe;
14 ist ein Diagramm, das die Umwandlung von Kokain zu seinem Metabolit Benzoylecgonin zeigt;
15 ist ein Graph, der die Konzentration von Kokain zur Konzentration von OH zeigt, wenn die Reaktion von Kokain zu Benzoylecgonin bei 100°C während 1 h erfolgt; und
16 ist ähnlich zu 15 und zeigt den Fall, bei dem die Reaktion bei 150°C während 1 h erfolgt.
Genaue Beschreibung von Ausgestaltungen der Erfindung
Das Verfahren gemäß der Erfindung ist ein Verfahren zur quantitativen Extraktion und Umwandlung von Kokain zu Benzoylecgonin und zur Extraktion ähnlicher Alkaloide, insbesondere giftiger, missbräuchlicher Substanzen und/oder Medikamente, die in einer Probe vorhanden sind, die ausgehend von einem festen Material vorbereitet ist.
Im folgenden genauen Beispiel ist die Probe erhalten ausgehend von fein unterteiltem Haar.
Das Verfahren ermöglicht insbesondere die Dosierung von Kokain mittels einer screeningartigen Technik, wobei gleichzeitig die Dosierung möglicher anderer toxischen Substanzen und ähnlichem, das vorhanden ist im Haar ermöglicht wird, indem im Handel verfügbare und für die Analyse im Urin bestimmte Reagenzgeräte verwendet werden.
Die folgenden Schritte werden durchgeführt:

– Zertrümmern von Haar in Bruchstücke von zwei – drei mm Länge;
– Wiegen der Fragmente, um eine Probe zu bilden mit einer Masse von 50 bis 300 mg;
– Waschen der Probe mit Methanol in einem geschlossenen Prüfrohr bei Zimmertemperatur um mögliche äußere Substanzen zu beseitigen, die auf die Ergebnisse einwirken könnten, wie zum Beispiel Spuren von Medikamenten, die dem Haar nicht angehören und sich darauf abgesetzt haben wegen deren vorhanden sein in der Luft (hierdurch ist es möglich zu unterscheiden, ob das Haar, das war von einem, der mit dem Medikament umgeht oder von einem Verbraucher des Medikaments);
– Wiederholen des Schritts Waschen mit Methanol falls erforderlich;
– Waschen der Probe mit Ethanol in einem geschlossenen Prüfrohr um Spuren von Methanol oder Wasser zu entfernen;
– Trocknen in einem Ofen bei ungefähr 45°C unter Strömung von inertem Gas, wie zum Beispiel Nitrogen;
– Hinzufügen von 0,5 bis 2 ml des Reagens wie oben definiert in das Prüfrohr und falls erforderlich Schütteln;
– Erhitzen des Prüfrohrs auf 100°C und Halten bei dieser Temperatur für 1 Stunde, zum Beispiel mittels einem temperierten Bad oder einem Ofen;
– Kühlen des Prüfrohrs auf Zimmertemperatur, zum Beispiel durch Eintauchen des Rohrs in kaltes Wasser oder einfach Belassen bei Zimmertemperatur für eine geeignete Zeitdauer;
– Nehmen der Flüssigkeit und Giessen in ein Prüfrohr von der Art, die verwendet werden für Urinuntersuchungen (falls erforderlich Zentrifugieren des Prüfrohrs zur Beseitigung von Trübung);
– Einsetzen des Rohrs in eine „erstklassige screening Vorrichtung" für die mengenmäßige Bestimmung der gesuchten Substanzen (Benzoylecgonin, Morphin, Methadon, etc);
– Anpassen der Einstellungen der erstklassigen Vorrichtung auf eine Weise, die geeignet ist für kleine Mengen (das kann erfoderlich sein, wenn die Vorrichtung alternativ genutzt wird für Bestimmung in Haar oder Urin);
– Durchführen der screeningartigen Analyse, wobei die Reagenzien verwendet werden, die mit dem Gerät vorgesehen sind, das normalerweise verwendet wird für die Untersuchung von Urin;
– Lesen der Daten, die sich ergeben aus der erstklassigen Analyse und Festlegen von positiv oder negativ mit Bezug auf den Ausscheidungswert.

Das obige Verfahren kann dann vervollständigt werden mit den folgenden zusätzlichen Schritten, wenn Bestätigungsanalysen erforderlich sind:

– Anordnen der Proben in der Ordnung ansteigender Konzentration der interessierenden Substanzen, die wie oben beschrieben bestimmt sind,
– Durchführen von Bestätigungsanalysen durch Analysieren der Proben, die genommen werden in der vorbereiteten Ordnung (auf diese Weise wird das oben genannte Problem des Ziehens von Spuren von Medikamenten aus einer Probe in die andere überwunden).

Das Verfahren der Erfindung sieht die Verwendung eines Reagens vor (im Folgenden bezeichnet als VMA), das eine Pufferlösung ist. Der Puffer dient zum Umwandeln des Kokains, das im Haar vorliegt, in sein Metabolit Benzoylecgonin, wie dargestellt in dem Schema von 14. Kokain wird in der Gegenwart von Hydroxyl-Gruppen und bei einer geeigneten Temperatur erst umgewandelt in ein Zwischenprodukt und dann zu Benzoylecgonin plus Methanol.
Pufferlösungen werden erhalten, indem ein Salz reagiert mit seiner schwachen Base. Diese Lösungen haben einen stabilen pH; deshalb ist das VMA-Reagens in der Lage Hydroxyl-Gruppen zu erzeugen auf stetige Weise. Die Verwendung von Lösungen, in denen die Erzeugung von Hydroxyl-Gruppen nicht regelmäßig ist, verursacht Probleme, wenn die Konzentration des Kokains nahe der Ausscheidungs-Grenze ist.
Wie oben gesagt ist die Zusammensetzung des Puffers zur Verwendung in dem Verfahren vorzugsweise wie folgt: VMA = 0,2 M (NH4)2HPO4 + 5 ml/L 25% NH4OH
Alternativ kann VMA ersetzt werden durch eine Lösung, in der die Komponente, die der Ursprung ist für die Hydroxyl-Gruppen, aus der folgenden nicht beschränkenden Liste von Substanzen ausgewählt ist: Aluminiumhydroxyd, Bariumhydroxyd, Octahydrat, Benzyltriethylammoniumhydroxyd, Benzyltrimethylammoniumhydroxyd, Kalziumhydroxyd, Lithiumhydroxyd, Lithiumhydroxyd-Monohydrat, Magnesiumhydroxyd, Potassiumhydroxyd, Potassiumhydroxyantimoniat, Sodiumhydroxyd, Sodiumhydroxydmonohydrat, Strontiumhydroxydoctahydrat, Tetramethylammoniumhydroxyd, Tetrapropylammoniumhydroxyd, Trimethylvinylammoniumhydroxyd.
Als Lösung kann irgendeines der folgenden alternativ genutzt werden: Ethanol, Methanol, Wasser, monobasisches Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat, Ammoniumbenzoat, Ammoniumbikarbonat, Ammoniumbichromat, Ammoniumbisulfat, Ammoniumbromid, Ammoniumkarbamat, Ammoniumkarbonat, bibasisches Ammoniumzitrat, Ammoniumchromat, Ammoniumjodid, Molybdat, Ammoniummonovanadat, Ammoniumnitrat, Ammoniumoxalatmonohydrat, Ammoniumpersulfat, Ammoniumsulfat, Ammoniumsulfamat, Ammoniumsulfit, Ammoniumsulfid, Ammoniumtartrat, Ammoniumthiocyanat, Ammoniumthioglycolat, Ammoniumthiosulfat, Ammoniumchlorid, monobasisches Sodiumphosphat, bibasisches Sodiumphosphat, monobasisches Potassiumphosphat, bibasisches Potassiumphosphat.
15 zeigt einen Graphen, in dem der prozentuale Anteil von in Benzoylecgonin umgewandeltes Kokain aufgetragen ist über der Konzentration von OH, wenn die Reaktion durchgeführt ist bei einer Temperatur von 100°C während einer Stunde. Aus dem Graphen ergibt sich offensichtlich, dass die Umwandlung aufrecht erhalten bleibt auf hohem Niveau (mindestens 70%) für einen Bereich an OH Konzentration von 0,03 bis 0,5 M.
Aus dem Graph von 16, der Hydroxyl-Gruppen zeigt nach jeweils 0, 15, 30 und 60 Minuten in einer bei 150°C durchgeführten Reaktion, ergibt sich als offensichtlich, dass der prozentuale Anteil an umgewandelten Kokain nur hoch ist um den Abszissenpunkt von 15 Minuten.
Aus allem oben und zahlreichen anderen Versuchen ergeben sich die optimalen Werte für die Reaktionstemperatur und -zeit als jeweils 100°C und 1 Stunde.
Die unten beschriebenen Beispiele zeigen die mengenmäßige Bestimmung von Kokain in Haar, die durchgeführt wurden mit beiden, der bekannten Technik und mit dem Verfahren gemäß der Erfindung. Analysen wurden durchgeführt unter Verwendung der folgenden Instrumente: für die screening Analyse, die Roche Instrumente mit dem Namen COBAS MIRA PLUS, die Reagenzien verwenden, die von dem selben Unternehmen bereit gestellt und mit „ABUSCREEN ON LINE" bezeichnet werden, für GC/MS das von dem Unternehmen bereit gestellte Instrument VARIAN, das bezeichnet wird mit „SATURN GC/MS", Modell 4D.
Beispiele
Bevor zu den verschiedenen screening Analysen übergegangen wird, wurde die Vorrichtung kontrolliert mit einer Probe, die positiv ist für beides, sowohl Kokain und Morphin um die Machbarkeit der Methode zu verifizieren.
Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ergab sich die Probe als positiv für beide, Kokain und Morphin:
TABELLE 1
Die von der Vorrichtung ermittelten Konzentrationswerte ergaben sich als 0,16 für Morphin und 0,15 für Kokain gemäß den erwarteten Werten für beide in der Prüfprobe vorhandenen Substanzen.
Beispiel 1
In diesem Beispiel wurde eine Probe analysiert, die sich schließlich als positiv erwies für beide Kokain und Morphin.
Die Probe wurde herkömmlicher Analyse unterzogen mit Säurehydrolyse und dann einer screening Analyse unterzogen, die folgende Ergebnisse ergab:
TABELLE 2
Wie ersichtlich war die Säurehydrolyse in der Lage eine Menge an Morphin zu extrahieren, die höher war als die Grenze, aber die Menge an Kokain erwies sich als zu gering um Erfassung durch die screening Vorrichtung zu erlauben. Der Grund ist, dass das Kokain als solches extrahiert wurde und nicht umgewandelt wurde in sein Metabolit Benzoylecgonin, welches letztere genau das ist, was screening Verfahren erfassen.
Die selbe Probe wurde dann bestätigender Analyse mittels GC/MS unterzogen mit den in 1 bis 4 dargestellten Ergebnissen. Insbesondere aus 1 ist ersichtlich, dass das Chromatogramm der ersten Probe eine hohe Spitze zeigt an der Stelle von Kokain und eine sehr kleine Spitze an der Stelle von Benzoylecgonin. Die selbe 1 stellt auch die Bestätigung des Vorhandenseins von Morphin dar.
Zusätzliche Bestätigungen des Vorhandenseins von beiden, Kokain und Morphin ergeben sich aus den Graphen von 2, 3 und 4.
Die Probe von Beispiel 1 wurde dann dem Verfahren gemäß dieser Erfindung unterzogen, um die in Tabelle 3 gezeigten Ergebnisse zu erbringen.
TABELLE 3
Es wird unmittelbar klar, dass die für beide, Morphin und Kokain ermittelten Werte höher sind als die jeweiligen Grenzen, deshalb ist die Probe für beide positiv.
Der für Kokain ermittelte hohe Wert ist dem Benzoylecgonin zu zu schreiben, das während der Umwandlungsreaktion erzeugt wurde.
Die selbe Probe von Beispiel 1, die behandelt wurde mit dem Verfahren gemäß der Erfindung, wurde einer GC/MS Bestätigungsanalyse unterworfen mit den in 5 bis 7 dargestellten Ergebnissen. Wie aus 5 ersichtlich kann die Kokain Spitze praktisch nicht mehr gesehen werden, weil das Kokain vollständig umgewandelt wurde in Benzoylecgonin, dessen Spitze gut ersichtlich ist in der selben 5.
Beispiel 2
In diesem Beispiel wurde wieder eine Probe, die sich schließlich als positiv erwies für beide Kokain und Morphin analysiert zuerst mit dem herkömmlichen Analyseverfahren der Säurehydrolyse und einer screening Analyse mit den in Tabelle 4 dargestellten Ergebnissen.
TABELLE 4
Wie in dem vorhergehenden Beispiel war die Säurehydrolyse in der Lage eine Menge an Morphin zu extrahieren, die höher war als die Grenze, aber die Menge an extrahiertem Kokain erwies sich als zu gering um Erfassung durch die Vorrichtung zu erlauben.
Die Probe wurde dann bestätigender Analyse mittels GC/MS unterzogen mit den in 8 dargestellten Ergebnissen, aus denen ersichtlich ist, dass das Chromatogramm eine hohe Spitze zeigt an der Stelle von Kokain und eine vernachlässigbare Spitze an der Stelle von Benzoylecgonin.
Die Probe von Beispiel 2 wurde dann dem Verfahren gemäß dieser Erfindung und einer screening Analyse unterzogen, um die in Tabelle 5 gezeigten Ergebnisse zu erbringen.
TABELLE 5
Beide, die Kokain- und die Morphinwerte sind höher als die jeweiligen Grenzen, so dass die Probe für beide positiv ist.
Die Probe dieses Beispiels, die behandelt wurde mit dem Verfahren gemäß der Erfindung, wurde auch einer GC/MS Bestätigungsanalyse unterworfen mit den in 9 dargestellten Ergebnissen, wo ersichtlich ist, dass die Kokain Spitze praktisch nicht mehr vorhanden ist, wohingegen die Benzoylecgonin Spitze hoch ist.
Beispiel 3
In diesem Beispiel wurde eine Probe analysiert, die sich schließlich als positiv erwies nur für Kokain und nicht für Morphin.
Die Probe wurde erst der Säurehydrolyse und screening mit den herkömmlichen Verfahren unterzogen mit den in Tabelle 9 dargestellten Ergebnissen.
TABELLE 6
Mittels Säurehydrolyse wurde eine Menge an Morphin unterhalb des Grenzwerts extrahiert. Die Menge an Kokain war auch zu klein, um es der Ausrüstung zu ermöglichen, diese zu erfassen. Mittels Verwendung der auf dem Gebiet bekannten Techniken kann deshalb nichts gesagt werden hinsichtlich des positiven oder negativen Befunds der Probe und es war erforderlich zurück zu greifen auf GC/MS Bestätigungsanalyse, die die in 10 dargestellten Ergebnisse erbrachte. In einer solchen Figur zeigt das Chromatogramm der Probe von diesem Beispiel eine hohe Spitze an der Stelle von Kokain und eine vernachlässigbare Spitze an der Stelle von Benzoylecgonin. Dies bestätigt noch einmal, dass Säurehydrolyse Kokain als solches extrahiert ohne irgend eine Umwandlung.
Die selbe Probe von diesem Beispiel wurde auch mit dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt und screening Analyse unterzogen. In Tabelle 7 sind die Ergebnisse dargestellt.
TABELLE 7
Es wird unmittelbar klar, dass während der Wert für Morphin niedriger ist als die Grenze, der von Kokain etwas höher ist als der Ausschluss und deshalb ist die Probe nur positiv für Kokain.
Die selbe Probe nach Behandlung mit dem Verfahren gemäß der Erfindung wurde einer GC/MS Bestätigungsanalyse unterworfen mit den in 11 dargestellten Ergebnissen. In dieser Figur ist die Kokain Spitze praktisch verschwunden, weil diese vollständig umgewandelt wurde in Benzoylecgonin, dessen Spitze statt dessen sehr hoch und gut ersichtlich ist.
Beispiel 4
Das 4. Beispiel analysiert ebenfalls eine Probe, die sich schließlich als positiv erwies für Kokain und nicht für Morphin.
Die Analyse wurde mit den selben Verfahren durchgeführt, wie mit den vorhergehenden Beispielen.
Tabelle 8 zeigt, dass nach Analyse mit der Säurehydrolyse die Probe vollständig negativ zu sein scheint sowohl für Morphin und für Kokain, wohingegen 12 das Vorhandensein von Kokain mit einer größeren Menge als der Grenze anzeigt.
TABELLE 8
Die selbe Probe mit dem erfindungsgemäßen Verfahren (VMA Reagens) behandelt, zeigt schon bei der ersten screening Analyse das Vorhandensein von Kokain mit einer größeren Menge als der Grenze, siehe Tabelle 9.
TABELLE 9
Wie üblich wurde dieses Ergebnis mit einer GC/MS Analyse bestätigt, wie in 13 dargestellt. Die große Spitze von Benzoylecgonin zeigt an, dass die Probe vor der Behandlung Kokain mit einem höheren prozentualen Anteil enthält als der Ausschlusswert.

Claims

Analytisches Verfahren zur mengenmäßigen Bestimmung von Kokain und anderen Alkaloiden, die in einer festen Probe vorliegen, mit den folgenden Schritten: a) Vorbereiten einer festen Probe in fein unterteilter oder pulvriger Form, b) Auswählen eines flüssigen Reagens, das konstante Konzentration von Hydroxyl-Gruppen bereitstellt, die geeignet sind, Kokain zu extrahieren und in Benzoylecgonin um zu wandeln und zum extrahieren anderer ähnlicher Substanzen, c) Extrahieren von Kokain und anderer ähnlicher Substanzen, die in der Probe enthalten sind und Umwandeln des extrahierten Kokains in Benzoylecgonin, wobei die Probe vollständig untergetaucht in dem flüssigen Reagens gehalten wird bei einer Temperatur zwischen 10°C bis 250°C für eine Zeitdauer zwischen wenigen Sekunden bis 48 Stunden, und d) Analysieren der Flüssigkeit, die aus der festen Probe separiert wurde, um die Konzentration des in der Flüssigkeit enthaltenen Benzoylecgonin zu bestimmen relativ zu der Abscheidungs-Grenze, wobei ein herkömmliches Analysegerät verwendet wird für die Bestimmung von Benzoylecgonin im Urin.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Probe eine Haarprobe ist.
Verfahren gemäß Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur zwischen 100°C bis 150°C ist.
Verfahren gemäß Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zeitdauer zwischen 15 min bis 24 Stunden ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur bei 100°C gehalten wird für 1 Stunde.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das flüssige Reagens ein Ammoniakpuffer ist, der 0,2 M (NH4)2HPO4 mit dem Zusatz von 5 ml von 25% NH4OH zu jedem Liter davon enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Hydroxyl-Gruppen in dem Ammoniakpuffer im Bereich von 0,0001 M bis 5 M ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Hydroxyl-Gruppen in dem Ammoniakpuffer im Bereich von 0,03 M bis 0,5 M ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Hydroxyl-Gruppen in dem Ammoniakpuffer im Bereich von 0,04 M bis 0,33 M ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die analysierten Proben in ansteigender Folge der Konzentration an Kokain oder anderen Alkaloiden angeordnet sind.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Proben Bestätigungsanalysen mit Standardtechniken, wie zum Beispiel GC oder GC/MS, unterliegen.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass jede Haarprobe hergestellt ist aus ungefähr 50 mg bis 300 mg fein geteiltem und/oder pulverisiertem Haar.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das flüssige Reagens eine Lösung ist mit einem gelösten Stoff, der ausgewählt ist aus Aluminiumhydroxyd, Bariumhydroxyd, Octahydrat, Benzyltriethylammoniumhydroxyd, Kalziumhydroxyd, Lithiumhydroxyd, Lithiumhydroxyd-Monohydrat, Magnesiumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Kaliumhydroxydantimoniat, Sodiumhydroxyd, Sodiumhydroxydmonohydrat, Strontiumhydroxydoctahydrat, Tetramethylammoniumhydroxyd, Tetrapropylammoniumhydroxyd, Trimethylvinylammoniumhydroxyd, das gelöst ist in einer Lösung, die ausgewählt ist aus Ethanol, Methanol, Wasser, monobasischem Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat, Ammoniumbenzoat, Ammoniumbikarbonat, Ammoniumbichromat, Ammoniumbisulfat, Ammoniumbromid, Ammoniumkarbamid, Ammoniumkarbonat, bibasischem Ammoniumzitrat, Ammoniumchromat, Ammoniumjodid, Molybdat, Ammoniummonovanadat, Ammoniumnitrat, Ammoniumoxalatmonohydrat, Ammoniumpersulfat, Ammoniumsulfat, Ammoniumsulfamat, Ammoniumsulfit, Ammoniumsulfid, Ammoniumtartrat, Ammoniumthiocyanat, Ammoniumthioglycolat, Ammoniumthiosulfat, Ammoniumchlorid, monobasi sches Sodiumphosphat, bibasisches Sodiumphosphat, monobasisches Kaliumphosphat, bibasisches Kaliumphosphat.
Diagnosegerät zum Ausführen des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 mit einem flüssigen Reagens mit konstanter Konzentration von Hydroxylgruppen, die geeignet sind zum Extrahieren von Kokain und anderen Alkaloiden und Umwandeln von Kokain in Benzoylecgonin und einem herkömmlichen Analysegerät für die Bestimmung von Benzoylecgonin im Urin.