DE2910707C2 - Reagens zur Durchführung von Immunoassays - Google Patents
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Reagens zur Durchführung von Immunoassays, enthaltend einen mit
einem Immunoadsorbens beschichteten festen Träger.
Der Festphasen- Radioimmunoassay (RIA) ist das bevorzugte diagnostische System zur Bestimmung von
Hepatitis A und B-Antigenen und Antikörpern. Diese Verfahrensweise ermöglicht eine einfache und rasche
Trennung der gebundenen und ungebundenen Immunoreagentien, die bei den meisten Immunountersuchungen
verwendet werden. Ein Nachteil der Festphasen RIA für die praktische Hepatitisdiagnose lag jedoch in der
relativen Unbeständigkeit der Hepatitisimmunoreagentien bei direktem oder indirektem Auftrag auf das
festphasige Material.
Garrisaon et al. beschreiben in der US-PS 37 90 663 ein Reagens zur Feststellung von Antigenen, das in
einem Festphasen RIA verwendet wird. Ihre Technik besteht darin, ein organisches Polymeres mit Antisemit!
zu überziehen und an der Luft zu trocknen, unter Bildung eines lagerungsstabilen Reagens, das eine
Anziehungskraft für Antigene aufweist, die vergleichbar ist mit ungetrockneten, frisch bereiteten, mit Antiserum
überzogenen Reagentien.
Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Reagens zur Feststellung und Bestimmung von Immunoreagentien,
wie Antikörpern und Antigenen bei <>o Immunoassays. Dieses Reagens soll in fester Phase
vorliegen und während mehrerer Monate stabil sein. Besonders soll das Reagens für eine Immunountersuchung
zur Diagnose von Hepatitis A und B geeignet sein. b5
Diese Aufgabe wird ausgehend von einem Reagens der eingangs genannten Art dadurch gelöst, daß das
Immunoadsorbens mit Zucker überzogen ist.
Durch die Erfindung wird das Stabilitätsproblem gelöst, das auftritt wenn Antigene und Antikörper
direkt oder indirekt auf ein festphasiges Material aufgeschichtet werden. Es wurde festgestellt daß
aufgetragene Antikörper oder Antigene ihre Reaktionsfähigkeit bzw. antigene Wirkung während einiger
Stunden verlieren und für eine Untersuchungsmethode zur Feststellung der entsprechenden Antikörper oder
Antigene im wesentlichen unwirksam werden. Wenn man den überzogenen festen Träger unter nassen oder
feuchten Bedingungen in einer gepufferten Salzlösung bzw. Kochsalzlösung lagert, bleibt zwar die Reaktionsfähigkeit
und antigene Wirkung in adäquater Weise erhalten, jedoch liegen die Nachteile und Kosten, die
sich durch eine derartige Aufbewahrung ergeben, auf der Hand.
Erfindungsgemäße Reagentien sind dagegen lagerungsstabil, wodurch die Anwendung eines festphasigen
Immunoassays für die Praxis klinischer Routinebestimmungen erleichtert wird.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Patentansprüchen 2 — 5 beschrieben.
Besonders geeignet ist das erfindungsgemäße lagerungsstabile Reagens für Immunoassays zur Feststellung
und Bestimmung von Hepatitis A und B-Antigenep und Antikörpern. So ist beispielsweise ein mit Zucker
überzogener Hepatitis B-Kern-Antikörper, der an einen festen Träger gebunden ist, geeignet zur Feststellung
und Bestimmung von Hepatitis B-Kernantigen in einer unbekannten Probe, während ein mit Zucker überzogener
Hepatitis-B-Oberflächen-Antikörper, der an einen festen Träger gebunden ist, zur Feststellung und
Bestimmung von Hepatitis B-Oberflächenantigen in einer unbekannten Probe geeignet ist.
Bei einem indirekten Auftrag des Antikörpers oder Antigens auf einen festen Träger wird der feste Träger
zunächst mit einem Antigen oder Antikörper vorbeschichtet um die Haftung des entsprechenden Antikörpers
oder Antigens zu ermöglichen. Soll beispielsweise der feste Träger zuletzt mit dem Hepatitis A-Antigen
überzogen werden, so kann der Träger mit dem Hepatitis Α-Antikörper vorbeschichtet werden.
Sowohl bei der direkten als auch bei der indirekten Befestigung des Antigens oder Antikörpers auf dem
festen Träger müssen natürlich die Reaktionsfähigkeit des Antikörpers bzw. die Antigenwirkung des Antigens
erhalten bleiben.
Bei dem festen Träger kann es sich um Perlen bzw. Kügelchen, Rohre, Behälter und Stäbe handeln, die aus
einer Vielzahl von Materialien hergestellt werden können, einschließlich Glas, Metall oder Kunststoff.
Bevorzugt werden Polystyrolperlen verwendet. Dieses Material ist leicht zugänglich, leicht mit den Immunoadsorbentien
zu überziehen und leicht zu handhaben. Besonders geeignet sind solche Träger zur Bindung von
Hepatitis-Antigen.
Die erfindungsgemäß in Betracht kommenden Immunoadsorbentien
umfassen alle Antikörper und Antigene, die immunoreaktive Eigenschaften aufweisen.
Als Zucker kommen Mono-, Di- und Polysaccharide in Frage. Zwar zeigen die nachstehenden Beispiele die
besondere Wirksamkeit von Saccharose, jedoch erwiesen sich auch andere Zucker als wirksam zur Erhaltung
der Reaktionsfähigkeit und antigenen Wirkung. Beispielsweise wurden folgende Zuckerlösungen hergestellt:
(In der folgenden Beschreibung bedeutet PBS eine phosphatgepufferte Salzlösung.)
Lactose
Glucose
Mannit
PBS (wäßrige Lösung)
Sorbit
Dextran
Dextran
10% in PBS
10% in PBS
10% in PBS
10% in PBS
P04-Konzentration
0,01 m;
10% in PBS
10% in PBS
10% in PBS
P04-Konzentration
0,01 m;
Salzkonzentration 0,15 m
10% in PBS
10% in PBS
10% in PBS
10% in PBS
Polystyrolperlen, die mit Hepatitis Α-Antikörper vorbeschichtet waren und anschließend einer Quelle für
Α-Antigen ausgesetzt worden waren, wurden dreimal in PBS gewaschen. Sie wurden in den Formulierungen der
Tabelle I während 30 Minuten bei Raumtemperatur getränkt Mit Ausnahme einiger weniger Perlen, die nur
in PBS getränkt wurden, wurden alle Perlen entnommen und bei Raumtemperatur über Nacht trocknen gelassen.
Am Morgen wurden sie während zwei Stunden bei 37°C in einen Inkubator eingesetzt Die Untersuchung auf die
antigene Wirkung wurde unter Verwendung eines radiomarkierten Antikörpers an drei negativen Kontrollproben
und drei positiven Kontrollproben für jeden Ansatz durchgeführt
Das Verhältnis der durchschnittlichen Zählungen pro Minute für die negativen und positiven Kontroll proben
ergibt einen Anhaltspunkt für die auf der Perle verbleibende Antigenwirkung. In der folgenden Tabelle
sind diese Verhältnisse aufgeführt, die die relative Wirksamkeit der verwendeten Zuckerüberzüge angeben.
1. PBS nass 36,9
2. Glucose 32,7
3. Lactose 29,8
4. Sucrose bzw. Saccharose 28,5
5. Xylit 26,8
6. Dextran 26,8
7. Sorbit 25,9
8. Mannit 22,4
9. PBS 7,9
(Die mit Antigen überzogene Perle wurde in PBS gewaschen und getrocknet.)
Die vorstehenden Ausführungen zeigen, daß eine Vielzahl von Zuckern geeignet ist zur Überzugsbildung
und zum Schutz und zur Konservierung der Aktivität eines mit Antigen überzogenen festen Trägers.
Antiserum, das anti-HAV enthielt, wurde mit 0,1 m Tris-Puffer (Tris steht für Trihydroxy-äthanolamin) vom
pH-Wert 9,5 von 1 :500 bis 1 :6000 verdünnt. Zu dieser
Verdünnung wurden Polystyrolperlen bzw. -kügelchen von etwa 0,7 cm Durchmesser gefügt. Die Überzugsbildung
konnte bei Raumtemperatur während etwa 2 Stunden erfolgen. Anschließend wurden die Perlen in
dem Tris-Puffer gewaschen und entweder mit Leberoder Fäkalextrakten in Kontakt gebracht, die positiv auf
HAV-Ag waren und die mit 0,lm-Phosphat mit 0,3m-Salzlösung unter Bildung einers Puffers (PBS) von
7,5, von 1 :5 bis 1 :100 verdünnt worden waren. Das HAV-Ag kann vor der Anwendung durch Formalin und
Wärmebehandlung nach üblichen Verfahrensweisen inaktiviert werden. Über die Zentrifugenklärung hinaus
ist keine Reinigung des HAV-Ag enthaltenden Extraktes notwendig. Die Perlen konnten sich mit HAV-Ag
überziehen, das an die Perlen über den anti-HAV-Vorj
überzug gebunden wird Dieses HAV-Ag-Überzugsverfahren
wurde bei Raumtemperatur während 24 Stunden durchgeführt Anschließend wurden die Perlen in PBS
gewaschen, in dem die Perlen stabil sind und zur weiteren Verwendung gelagert Zur Erzielung stabiler
ίο trockener Perlen wurden die mit PBS gewaschenen Perlen mit 5% Sucrose- bzw. Saccharoselösung bei
Raumtemperatur während etwa 30 Minuten überzogen und anschließend an der Luft getrocknet
Herstellung eines mit ' ^-markierten
Antikörperreagens
Antikörperreagens
Mit 125I-markierte Antikörper (anti-HAV) wurden
nach einem üblichen Verfahren hergestellt und verdünnt in 50% fötalem Kälberserum, enthaltend PBS, 2%
normales menschliches Serum und 0,2% 0,005 m Polyoxyäthy'en-sorbitanmonolaurat, bei 45°C während
24—48 h. Wurde eine höhere Temperatur verwendet, wie 56" C, so konnte die Inkubation auf 0,5 —3 h
herabgesetzt werden.
Untersuchungsverfahrensweise
Serum oder rekalzifiziertes Plasma wurden vorzugsweise als Probe verwendet, die auf Hepatitis A-Antikörper
(anti-HAV) untersucht werden sollte.
Die Untersuchung zur Bestimmung des Antikörpers für Hepatitis Α-Antigen basiert auf dem Prinzip der
kompetitiven Bindung von Serum-anti-HAV mit radioaktiv markiertem anti-HAV an Hepatitis A-Antigen
(HAV-Ag). In einem Teströhrchen wurde anti-HAV125I
ir> mit dem Serum des Patienten vermischt, und anschließend
wurde ein stabiles festphasiges Reagens zugefügt, an das HAV-Ag gebunden war. Nach dem Inkubieren
über Nacht bei Raumtemperatur oder während 4 Stunden bei 45° C und anschließendem Waschen wurde
das Zählungsausmaß der Perlen in einem y-Strahlungszähler
bestimmt und aufgezeichnet
Ein Zählungsausmaß über dem feststehenden Grenzwert wurde als negativ für Antikörper gewertet,
wohingegen eine geringe Zählung eine kompetitive bzw. konkurrierende Bindung zwischen zugesetztem
radiomarkierendem Antikörper und endogenem bzw. in dem Serum enthaltenen Antikörper anzeigt. Die
Anwesenheit von anti-HAV kann ebenfalls durch Berechnen der prozentualen Neutralisation der Probe
;o des Patienten im Vergleich mit Testproben bestimmt
werden. Prozentuale Neutralisationen über dem 50% Grenzwert zeigen aus dem gleichen Grunde wie
vorstehend die Anwesenheit von Antikörpern an.
Herstellung des stabilen Festphasenreagens
Daneteilchen-Präparate verschiedener Reinheitsstufen wurden mit 2-Mercaptoäthanol (0,30-0,75%) und
nicht-ionischem Detergens, in einer Konzentration von etwa 1,0 bis 2,5% bei 37° C während 1 h behandelt Der
Zweck dieser Behandlung lag darin, den Lipoproteinüberzug zu entfernen und den Antigenkern der
Dane-Teilchen freizusetzen. Die vorstehenden Bedingungen für die Behandlung sind bevorzugt, jedoch
können sie ohne Nachteil variiert werden. Nach der Behandlung wurde das Gemisch in geeigneter Weise
mit einer Pufferlösung verdünnt, vorzugsweise mit
0,01m Tris-HCl vom pH-Wert 7,1, in physiologischer Salzlösung, enthaltend 0,001 m Äthylendiamintetraessigsäure.
Die Lösung wurde unmittelbar zur Überzugsbildung der festen Oberfläche von Gegenständen, wie
Perlen, Rohren oder Gefäßen aus Kunststoff oder Glas verwendet Dane-Kerne (HBtAf), die auf diese Weise
hergestellt wurden, sind sehr klebrig und haften leicht durch Adsorbtion an festen Oberflächen. Sind Präparate
von Dane-Teilchen stark verunreinigt und enthalten sie
groß? Mengen an von außen hinzugekommenen '<) Proteinen, so ist es notwendig, die festen Gegenstände
mit anti-HBc vorzubeschichten, bevor wie vorstehend die Reaktion mit den Dane-Kernen erfolgt. Mit den
erfindungsgemäßen Präparaten waren bei Inkubierung von Polystyrolperlen mit der Danekern-Lösung während
24 — 72 Stunden mehr Danekerne auf den bloßen Perlen, als auf mit anti-HBc vorbeschichteten Perlen,
insbesondere wenn sehr geringe Konzentrationen an Dane-Kernen verwendet wurde. Es hat sich gezeigt, daß
in der Überzugslösung die Detergenskonzentration sehr -"
gering sein sollte (vorzugsweise unter 0,005%), wenn feste Oberflächen direkt mit Dane-Kernen überzogen
werden.
Zur Stabilisierung der resultierenden mit HBcAg
überzogenen Perle wurde eine 5— 10%ige Saccharose- ^ lösung verwendet. Die HBcAg-Perle wurde in der
gleichen Saccharoselösung während etwa 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend an der
Luft getrocknet.
Herstellung eines Beispiels für ein mi ι
125I-markiertes Antikörperreagens
125I-markiertes Antikörperreagens
Mit 125I-markierte Danekernantikörper (anti-HB<.) für
HBcAg wurden nach üblichen Methoden hergestellt und in 0,005 m Tris mit 0,04 m Äthylendiamintetraessigsäure
vom pH-Wert 7,3 verdünnt, der 50% fötales Kälberserum und 2% rekalzifiziertes normales menschliches
Plasma und 0,4% Polyoxyäthylen-sorbitanmonolaurat enthielt.
40
Untersuchungsverfahrensweise
Serum und rekalzifiziertes Plasma wurden vorzugsweise als auf Hepatitis B-Antikörper (anti-HBc) zu
untersuchende Probe verwendet. Die Untersuchung zur Feststellung von anti-HBc basiert auf dem Prinzip der
konkurrierenden bzw. kompetitiven Bindung an mit Hepatitis B Kern-Antigen (HBcAg) überzogenen Perlen
zwischen vnit 125I-radiomarkiertem anti-HBc und in der
Probe des Patienten vorhandenem anti-HBo In einem Testrohr wird die Probe des Patienten zusammen mit so
125I-radiomarkiertem anti-HBc und einer mit HBcAg
überzogenen Perle während etwa 20 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation und
30
35 dem Waschen wird das Zählungsausmaß der Perle in einem geeigneten ^-Strahlungsdetektor bestimm» und
aufgezeichnet Ein Zählungsausmaß über dem feststehenden Grenzwert zeigt die Abwesenheit von anti-HBc
oder die Anwesenheit von nicht-feststellbaren Mengen an anti-HBc in der Probe auf, wohingegen ein
Zählungsausmaß unter dem feststehenden Grenzwert die Anwesenheit von anti-HBc in dem Serum anzeigt
Man kann nach der gleichen Verfahrensweise, wie vorstehend aufgezeigt zur Stabilisierung einer festen
Phase vorgehen, wenn Hepatitis B Oberflächen-Antigen direkt oder indirekt auf ein festphasiges Material
aufgeschichtet wird und der RIA für Antikörper für das Hepatitis B-Oberflächen-Antigen bestimmt ist. Die
beiden Verfahrensweisen in den Beispielen hängen vorwiegend von der Reinheit des Antigens ab, mit dem
die feste Phase zu überziehen ist. Hochreines Antigen kann direkt auf die Perle überzogen werden, ohne daß
eine Vorbeschichtung mit dem Antikörper für dieses Antigen notwendig ist
Antiserum von Meerschweinchen, das anti-HBs
enthielt, wurde in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, 0,01m Natriumphosphat, 0,15 m Natriumchlorid, pH
7,2) auf 1 :1750 verdünnt Diese Lösung wurde in einen
Kolben gefügt, der Polystyrolperlen mit einem Durchmesser von 0,64 cm enthielt. Diese Überzugslösung, die
die Perlen enthielt, wurde durch Eintauchen in ein Wasserbad von 45° C während 2 Stunden auf 45° C
erwärmt. Die Perlen wurden anschließend zweimal mit PBS (das sich bei Raumtemperatur befand) gewaschen.
Die Perlen wurden anschließend mit einer Lösung von PBS, die 2% Saccharose enthielt, bei Raumtemperatur
während etwa 15 Minuten überzogen. Die Perlen wurden dann an der Luft getrocknet.
Unter Anwendung dieser Verfahrensweise wurden weitere Perlen in gleicher Weise mit 2% Lactose, 2%
Glucose und PBS allein durch Tränken während etwa 15 Minuten überzogen. Alle Perlen wurden anschließend
an der Luft getrocknet.
Es wurde ein Radioimmunoassay zur Bestimmung von Hepatitis B-Oberflächen-Antigens durchgeführt,
unter Anwendung radiomarkierter Antikörper in negativen Kontrollproben, Proben, die HBjAg/ad-Antigen
enthielten und Proben, die H BjAg/ay-Antigen enthielten. Das Verhältnis der Zählungen der Antigen
enthaltenden Proben zu denen der negativen Kontrollproben ist in der folgenden Tabelle für Polystyrolperlen
aufgeführt, die mit den verschiedenen Zuckern überzogen sind.
| Tabelle III | Verhältnis ί | 3Tage-45"C | Verhältnis ay/negative | gelagert bei |
| Für den Perlüberzug | 36,1 | Kontrollperlen, | 3 Tage - 45°C | |
| verwendeter Zucker | id/negative | 38,3 | 40C | 30,1 |
| Kontrollperlen, gelagert bei | 379 | 30,4 | 31,9 | |
| Lactose | 40C | 31,7 | 31,0 | |
| Saccharose | 36,3 | 21,0 | 31,3 | |
| Glucose | 33,6 | 31,0 | 9,6 | |
| (PBS allein) | 37,2 | 15,1 | 28,5 | |
| kein Zucker | 28,1 | |||
| Saccharose | 24,5 | |||
| fin Wasser) | 36,1 | |||
7 8
Die Daten in der Tabelle III zeigen, daß viele Zucker Perlen, die keinen Zucker-Schutzüberzug aufweisen,
zur Oberzugsbildung, zum Schutz und zur Konservie- eine verringerte Aktivität gegenüber HBjAg/ad und
rung der Aktivität auf einem mit Antikörper überzöge- HBjAg/ay-Antigenen nach Wärmebehandlung aufweinen
festen Träger dienen. Die Daten der Tabelle III sen und daß die Aktivität gegen HBjAg/Ay-Antigen
zeigen auch, daß die mit Antikörper überzogenen > sogar vor einer Wärmebelastung verringert wird.
Es wurde ein Enzym-Immunoassay zur Bestimmung Differenz zwischen der optischen Dichte bei 492 rim in
von Hepatitis B-Oberflächenantigen durchgeführt, un- i<
> den Antigen enthaltenden Proben und in den negativen
ter Anwendung eines Antihepatitis B-Oberflächenanti- Kontrollproben ist in der folgenden Tabelle für
gen-Peroxidase-Konjugats. Die Proben bestanden aus Polystyrolperlen aufgeführt, die mit den verschiedenen
negativen Kontrollproben, Proben, die HB^Ag/ad-Anti- Zuckern überzogen sind:
gen und Proben, die HBjAg/ay-Antigen enthielten. Die
gen und Proben, die HBjAg/ay-Antigen enthielten. Die
| laoene iv | Ad minus negative Konlroll- perlen, gelagert bei |
3 Tage - | - 45 t | Ay minus negative Kontroll perlen, gelagert bei |
3 Tage - | - 45 C |
| Für den Perlüberzug verwendeter Zucker |
4 (. | 0,488 | 4 C | 0,390 | ||
| 0,520 | 0,527 | 0,426 | 0,396 | |||
| Lactose | 0,486 | 0,503 | 0,401 | 0,365 | ||
| Saccharose | 0,479 | 0,257 | 0,413 | 0,121 | ||
| Glucose (PBS allein) |
0,339 | 0,420 | 0,2'7 | 0,374 | ||
| kein Zucker | 0,513 | 0,496 | ||||
| Saccharose (in Wasser) |
||||||
Die Daten der Tabelle IV zeigen, daß eine Vielzahl von Zuckern für den Überzug, den Schutz und die Konservierung
der Aktivität eines mit Antikörpern überzogenen festen Träger"; dient. Die Daten der Tabelle IV zeigen auch,
daß mit Antikörper überzogene Perlen, die keinen Zucker-Schutzüberzug aufweisen, eine geringere Wirkung gegen
HBsAg/ay-Antigen vor und nach Wärmebelastung der Perlen aufweisen.
Claims (5)
1. Reagens zur Durchführung von Immunoassays, enthaltend einen mit einem Immunoadsorbens
beschichteten festen Träger, dadurch gekennzeichnet,
daß das Immunoadsorbens mit Zucker überzogen ist
2. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Immunoadsorbens ein Antigen aus
der Gruppe Hepatitis Α-Antigen, Hepatitis B-Oberflächenantigen,
Hepatitis B-Kernantigen und Hepatitis e-Antigen ist
3. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Immunoadsorbens ein Antikörper
aus der Gruppe Hepatitis Α-Antikörper, Hepatitis B-Oberflächenantikörper, Hepatitis B-Kernantikörper
und Hepatitis e-Antikörper ist
4. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß der feste Träger zunächst mit Antigen
beschichtet ist und an dieses Antigen mit dem Zucker überzogener Antikörper als Immonoadsorbens
gebunden ist oder daß der feste Träger zunächst mit Antikörper beschichtet ist und an
diesen Antikörper mit dem Zucker überzogene Antigen gebunden ist.
5. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der feste Träger eine Polystyrolperle
ist.
30
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