DE2821403A1 - Sesquiterpenderivate, verfahren zu deren herstellung und arzneimittel, welche diese enthalten - Google Patents

Description

30 603 o/va

ZETRQ3

OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD., TOKYO/JAPAN

Sesquiterpenderivate, Verfahren zu deren Herstellung und Arzneiinittel, welche diese enthalten

Die Erfindung betrifft Sesquiterpenderivate und deren pharmazeutisch annehmbaren Salze, die eine inhibierende Aktivität und Antitumoraktivität gegenüber dem komplementären System von Lebewesen haben (eine antikomplementäre Aktivität), die als aktive Bestandteile in therapeutisch wirksamen Mitteln gegen autoimmune Krankheiten, Nephritis, Rheumatismus, Kalloagen-Rrankheiten, allergische Erkrankungen, Cancer und dergleichen anwendbar sind* Die Erfindung betrifft auch Zwischenprodukte zur Herstellung solcher aktiven Bestandteile.

Der Ausdruck "komplementär" bezieht sich auf eine komplexe

- 2

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-Λ -

Gruppe von Proteinen in der KÖrperflüssigkeit, die mit den Antikörpern und anderen Faktoren zusammenarbeitet und eine wichtige Rolle als Zwischenträger bei immunen, allergischen, immuno-chemischen und/oder immuno-pathologischen Reaktionen spielt. Reaktionen, bei denen eine komplementäre Verbindung teilnimmt, finden im Blutserum oder in anderen Körperflüssigkeiten statt und werden deshalb als humorale Reaktionen bezeichnet.

Es wurde berichtet, dass das komplementäre System eine Rolle spielt bei Entzündungen, Koagulation, Fibrinolyse, Antikörper-Antigen-Reaktionen und anderen metabolischen Verfahren (siehe US-PS 4 021 544, Bull World Kealts Org. , 39, 935-938 (1968), Scientific American, S29, (Nr. 5), 54-56 (1973), Medical World News, 11. Oktober, 53-58, 64-66 (1974), Harvey Lectures, 66, 75-1O4 (1972), The New Englang Journal of Medicin, 287, 489-495, 545-549, 592-596, 642-646 (1972), The John Hopkins Medical Journal, 128, 57-74 (1971) und Federation Proceedings, 32, 134-137 (1973).

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282 K03

Verschiedene Verbindungen sind als Verbindungen mit antikomplementärer Aktivität bekannt, wie Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA), Saldox, Phlorizin (wie beschrieben von Borsos. J. Immunol. 94 (4), 628 (1964)), Hydroxybenzolderivate (wie beschrieben in Shir. Mayer: Biochemistry N.Y. 7,' 3003 (1968)), Guanidine und Phenoxyacetamide (wie beschrieben von B. R. Baker in J. Med. Chem. 12, .408 (1968)), Phosphonatester (wie beschrieben von E. L. Becker in B.B.A. 147, 289" (1967)), Chlorophyillin, Glyzerrhizin und dergleichen. Diese Verbindungen sind jedoch aus praktischen Gründen nicht geeignet, weil sie sehr toxisch sind und nur eine niedrige antikomplementäre Aktivität aufweisen,. Nach dem bisherigen Wissen sind keine antikomplementären Verbindungen oder Mittel bisher im Handel erhältlich.

Deshalb ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, neue Sesquiterpenderivate und deren Salze zur Verfügung zu stellen, die eine hohe antikomplementäre Aktivität und eine niedrige Toxizität aufweisen.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von Sesquiterpenderivaten und deren Salzen zu zeigen, die eine hohe antikomplementäre Aktivität und niedrige Toxizität haben.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, pharmazeutische Zusammensetzungen, welche solche Sesquiterpenderivate und deren Salze enthalten, aufzuzeigen.

Ein. weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Behandlung von Nephritis unter Verwendung von Sesquiterpenderivaten oder deren Salzen zu zeigen.

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Die Erfindung betrifft neue Sesquxterpenderivate der allgemeinen Formel (1}

■R'

(D

VH 3 CH

worin bedeuten:

R ein Wasserstoffatom, eine Niedrigalkylgruppe oder eine Niedrigalkanoylgruppe,

3

R und R , die gleich oder verschieden sein können, jeweils eine Formy!gruppe, eine Hydroxymethylgruppe, eine Hydroxylgruppe, eine Carboxylgruppe, eine Niedrigalkanoyloxy-

"7 8 methylgruppe oder eine Gruppe der Formel -CH=CR R ,

7 R

worin R und R , die gleich oder verschieden sein können, jeweils ein Wasserstoffatom, eine Cyanogruppe, eine

-S-

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Niedrigalkoxycarbonylgruppe oder eine Carboxylgruppe bedeuten,

oder worin

. R⁹ 2 3 ι Ii

R und R zusammengenommen einen Lactonring der Formel -CH-O-C-

bedeuten, worin R ein Wasserstoffatom "oder eine.Hydroxylgruppe bedeutet,

4 6
R und R , die gleich oder verschieden sein können, .jeweils eine Hydroxylgruppe oder eine Niedrigalkanoyloxygruppe darstellen,

R ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe darstellt

4 wobei R und R zusammen eine Oxogruppe (=0) bilden können, und

4 6

R und R zusammen eine Niedrigalkylidendioxygruppe bilden können.

Die Erfindung betrifft auch die pharmazeutisch annehmbaren Salze dieser Verbindungen, Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen der allgemeinen Formel (I) und deren Salze, pharmazeutische Zusammensetzungen, welche Verbindungen der allgemeinen Formel (I) und deren Salze enthalten, und die Anwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) und deren Salze.

Die Erfindung betrifft auch Salze der Sesguiterpenderivate der allgemeinen Formel (I), die man durch Umsetzung dieser Derivate mit basischen Verbindungen erhält.

- β

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282Ί403

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstel-

lung von Sesquiterpenderivaten der allgemeinen Formel (I) , wobei man, wie später noch ausführlich beschrieben wird, als 'Ausgangsmaterial· eine Verbindung der allgemeinen Formel (Ia) verwendet.

Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine therapeutisch wirksame Menge des Sesquiterpenderivates der allgemeinen Formel (I) zur Erzielung einer antikomplementären Aktivität bei Lebewesen enthalten, insbesondere für die Behandlung von nephritischen Störungen bei Lebewesen, denen man, wenn sie unter einer solchen Störung leiden, eine pharmazeutische Zusammensetzung der genannten Art verabreicht.

Fig. 1 und 2 sind Mikrofotografien von Stachybotrys

complementi nov sp. K-76, welcher die Fähigkeit hat, die Verbindung der Formel (Ia) der Erfindung herzustellen.

Fig. 3 ist eine Mikrofotografie von Stachybotrys

complementi nov sp. T-789.

Fig. 4 - ist eine Mikrofotografie von Stachybotrys

echinata yar sp. T-791.

Fig. 5 ist ein kernmagnetisches Resonanzspektrum der

Verbindung der Formel (Ia), die gemäss Beispiel 1 der Erfindung erhalten wird.

Fig. 6 bis 8 sind kernmagnetische Resonanzspektren der

Verbindung (Ib) gemäss der Erfindung, die im Beispiel 5 erhalten wird und die in drei verschiedenen Lösungsmitteln geinessen wurden.

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"'" ■ 28 2UÖ3

Fig. 9 ist ein kernmagnetisches ResonanzSpektrum

der gemäss Beispiel 9 der vorliegenden Erfindung erhaltenen Verbindung.

Nachfolgend wefden die erfindungsgemässen Sesquiterpenderivate der allgemeinen Formel (I) näher erläutert. Niedriga'lkylgruppen für R schliessen lineare und verzweigte Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Äthyl, n-Propyl, Isopropyl, η-Butyl und tert-Butyl ein.

Stellt R eine Niedrigalkanoylgruppe dar, se sind eingeschlossen lineare oder verzweigte Alkanoylgruppen mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie Acetyl, Propionyl, Butyryl und Isobutyryl.

2 3

Die Niedrigalkanoyloxymethylgruppe, die für R und R stehen kann, schliesst Oxymethylgruppen ein, die mit den vorher erwähnten Niedrigalkanoylgruppen substituiert sind, wie Äcetyloxymethyl, Propionyloxymethyl, Butyryloxymethyl und Isobutyryl-

1 P

oxymethyl. Die Nxedrigalkoxycarbonylgruppen bei R und R schliessen lineare oder verzweigte Alkoxycarbony!gruppe mit 2 bis 5 (insgesamt) Kohlenstoffatomen ein, wie Methoxycarbonyl, Äthoxycarbonyl, n-Propoxycarbonyl, n-Butoxycarbonyl und tert-Butoxycarbonyl.

Die Niedrigalkanoyloxygruppen für R und R schliessen lineare oder verzweigte Alkanoyloxygruppen mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen ein, wie Acetyloxy, Propionyloxy, Butyryloxy und Isobutyryloxy.

Die Niedrigalkylidendioxygruppen für die Reste R und R schliessen lineare oder verzweigte Alkylidengruppen mit 1 bis

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Ai*

4 Kohlenstoffatomen, die mit 2 Sauerstoffatomen substituiert sind, wie Methylidendioxy, Xthylidendioxy, Isopropylidendioxy und Butylidendioxy, ein.

Spezifische Beispiele für die Sesquiterpenderivate der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend angeführt. Die Erfindung soll aber durch den Umfang dieser Beispiele in keiner Weise limitiert werden.

(1) 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1-spiro-2¹-(6',7'-diformyi-4'-hydrcxy-2',3'-dihydrobenzofuran)

(2) 6,7-Dihydroxy-2,5,5,Sa-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1-spiro-2·-(4',6',7'-trihydroxy- 2' , 3'-dihydrobenzofuran)

(3) 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1-spiro-2'-(JS',7'-di-(2,2-dicyanovinyl)-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran/

(4) 6,7-Dihydroxy-2,5,5,Sa-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthaün-1 -spiro-2 · -(JS ' , 7 ' -di- (2-cyano-2~ äthoxycarbonylvinyl)-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran/

(5) 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,43,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1-spiro-2 '' -(Ja ' ,7 ' -di- (2-cyano-2-isopropoxycarbonylvinyl)-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran/

(6) 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1 -spiro-2 ' -(Jo ' ,7 ' -di- (2-cyano-2-carboxyvinyl)-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran/

— 9 "~

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(7) 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,43,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1 -spiro-2 ' -(Ja ' ,7 '-di- (2-carboxyvinyl)-4'-hydroxy-2' , 3'-dihydrobenzofuran/

(8) 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1 --spiro-_2 ' - (7 ' -carboxy-6 ' -hydroxymethy1-4'-hydroxy-2',3*-dihydrobenzofuran)

(9) 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a-5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1 -spiro-2 ' -ß>' , 7 · -di- (2 ,2-diäthoxycarbonylvinyl)-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran/

(10) 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1 -spiro~2 ' ~/_6 ' , 7 ' -di- (2,2-butoxycarbony lvinyl)-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuranj

(11) 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1 -spiro-2 ' - (6 ' ,7' "-dihydroxymethyl-

4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran)

(12) 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethy1-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1-spiro-2'-(6',7'-dihydroxymethyl-4'-methoxy-2',3'-dihydrobenzofuran)

(13) 6,7~Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1-spiro-2'-(7'-carboxy-6'-formyl-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran)

(14) e^-Dihydroxy-^^^jSa-tetramethyl-i ,2,3,4, 4a-5,6 , 7, 8 ,8adecahydronaphthalin-1-spiro-2'-(6'~carboxy-7'-formyl-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran)

- 1O -

8Ö9884/0624

(15) 6 ,7-Dihydroxy-2,5,5, 8a-tetraniethyl-1 ,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1-spiro-2'-(7'-carboxy-6'-formyl-4'-methoxy-2',3'-dihydrobenzofuran)

(16) 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1-spiro-2 ' -ß>' ,7 ' ~di- (2 ,2-dicyanovinyl)-4'-äthoxy-2',3'-dihydrobenzofuran/

(17) 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1 -spiro-2 ^l-[Z^x ,7 ' -di- (2-cyano-2-carboxyvinyl)-4'-propoxy-2¹ ,3'.-dihydrobenzofuran/ ■'

(18) 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6 _r 7,8,8a~ decahydrcnaphthalin-1-spiro-2'-[J·-carboxy-6'-)2,2-dicyanovinyl)-4·-hydroxy-2·,3'-dihydrobenzofuran/

(19) 6,7-Dihyurcx<y-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1-spiro-2'-[J¹ -carboxy-6'-(2-cyano-2-carboxyvinyl)-4'-äthoxy-2',3'-dihydrobenzofuran7

(20) 6,7-Dipropionyloxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1 -spiro-2 ' -) 6 ' ,7 ' -dif orniyl-4 ' -propionyloxy-2¹,3'-dihydrobenzofuran)

(21) 6,7- Diacetyloxy-2 ,5,5,8a-tetramethyl-1 ,2,3,4,4a,5,6,7,8, 8adecahydronaphthalin-1 -spiro-2' -[β ' , 7 ' - (2,2-dicycinoviny 1) 4'-acetyloxy-2',3'-dihydrobenzofuran/

(22) 6,7-Dibutyryloxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8.8a- -1~spiro-2'~^6'_f7'-di-(2-cyano-2-äthoxycarbonylvinyl)-4'-butyryloxy-2',3'-dihydrobenzofuran/

11 -

809884/0624

(23) -6,7~Diacetyloxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1, 2 ,3,4,4a,5,6,7,8,8a~ decahydronaphthalin-1 -spiro-2' --/6 ' , 7 ' --di- (2-cyano-2-carboxyvinyl)-4'-acetyloxy-2',3'-dihydrobenzofuran/

(24) 6,7-Diacetyloxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-. deca'nydronaphthalin-1 -spiro-2 ' -ft ' , 7' -di- (2,2-diäthoxycarbonylvinyl)-4'-acetyloxy-2 *,3'-dihydrobenzofuran/

(25) 6,7-Diacetyloxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1-spiro-2'-(6',7'-diacetyloxymethyl-4'-acetyloxy-2',3'-dihydrobenzofuran)

(26) 7-Acetyloxy-6-hydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1^2,3,4,4a_f-5,6,7,8,8a-decahydronaphthalin-1-spiro-2'-(6',7'-diacetyloxymethyl-4 ' -acetyloxy-2^f,3'-dihydrobenzofuran)

(27) 6,7-Diacetyloxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1-spiro-2'-(7'-carboxy-6'-formyl-4'-acetyloxy-2',3'-dihydrobenzofuran)

(28) 6,7-Dipropionyloxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1 -spiro--2' - (7 ' -carboxy-6' -f ormyl-4 ' methoxy-2',3'-dihydrobenzofuran)

(29) 6,7-Diacetyloxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3_ri,Aa,5,6,1,S,8adecahydronaphthalin-1 -spiro-2 ' ~/Jo' ,7 ' -di- (2,2-dicyanovinyI) 4·-äthoxy-2',3'-dihydrobenzofuran/

(30) 6,7-Diisobutyryloxy-2,5,5,8a-te.tramethyl-1,2,3,4, 4a, 5,6 ,7,8, 8adecahydronaphthaliri-1 -spiro-2' -/6 ' ,7' -di- (2~cyano-2-carboxy~ vinyl)-4'-propoxy-2',3'-dihydrcbenzofuran/

- 12 -

2ο

~™~ 282H03

(31) 6,7-Diacetyloxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1-spiro-2'-/"7'-carboxy-6' - (2,2-dicyanovinyl)~4·-acetyloxy-2',3'-dihydrobenzofuran/

(32) 6,7-Isopröpylidendioxy-2,5,5,8a-tetramethyl-l,2,3,4,4a,-5,6,7,8, 8a-decahydronaphthalin-1 -spiro-2 ' -) 6 ' , 7 '--dif ormyl-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran)

(33)' 6,7-Isopropylidenaioxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3}4,4a,-5,6,7,8,8a-decahydronaphthalin-1-spiro-2'-££·,7'-di-(2,Z-dicyanovinyl)-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzof uranj?

(34) 6,7-Äthylidendioxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,43,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1-spiro-2'-/£',7'-di-(2-cyano-2-äthoxy carbonylvinyl)-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuranY

(3 5) 6,7-Isopropylidendioxy-2,5,5,8a-tetramethy1-1,2,3,4,4a,-5,6,7,8,8a-decahydronaphthalin-1-spiro-2·-/6',7'-di-(2-cyano-2-isopropoxycarbonylvinyl)-4·-acetyloxy-2',3'-dihydrbenzofuranj

(36) 6,7-Methylendioxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1-spiro-2¹ -£B',7'-di-(2-cyano-2~carboxyvinyl)-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuranj"

(37) 6,7-Isopropylidendioxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,-5,6,7,8,8a-decahydronaphthalin-1 -spiro-2 · -£jo · , 7 * -di- (2,2-dicyanovinyl)-4'-acetyloxy -2·,3'-dihydrobenzofuran^

(38) 6,7-Propylidendioxy-2,5,5,8a-tetramethy1-1,2,3,4,4a,5,-6,7,8,ea-decahydronaphthalin-1-spiro-2'-{%',7'-di-(2-carboxy-Vinyl) -4 ' -hydroxy-2' , 3 ' -dihydrobenzof uranj^

- 13 -

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282U03

(39) 6_#7-Isopropylidendioxy-2₇5,5_f8a-tetramethyl-l ,2,-3,4,4a,-5,6,7,8,ea-decahydronaphthalin-i-spiro-2 *-/ti',7'-di-(2,2-diäthoxycarbonylvinyl)-4'-hydroxy-2·,3'-dihydrobenzofuran7

(40) 6,7-Isopropylidendioxy-2,5,5,8a-tetramethyl~1,2,3,4,4a,- ' 5,6,7,8,ea-decahydronaphthalin-1-spiro-2·-(6',7'-dihydroxymethyl-4'-hydroxy-2·,3'-dihydrobenzofuran)

(41) 6,7-Isopropylidendioxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,-5,6,7,8,ea-decahydronaphthalin-1-spiro-2'-(6^f,7'-diacetyloxymethyl-4'-acetyloxy~2',3'-dihydrobenzofuran)

(42) 6,7-Isopropylidendioxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,-5,6,7,8,ea-decahydronaphthalin-1-spiro-2'-(6',7'-dihydroxymethyl-4'-methoxy-2',3'-dihydrobenzofuran)

(43) 6,7-Isopropylidendioxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,-5,6,7,8,8a-1-spiro-2'-(7'-carboxy-6'-formyl-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran)

(44) 6,7-Propylidendioxy-2,5,5,8a-tetramethy1-1,2,3,4,4a,5,6,7,-8,ea-decahydronaphthalin-1-spiro-2·-(7'-carboxy-6'-formyl-4'-acetyloxy-2',3'-dihydrobenzofuran)

(45) 6,7-Butylidendioxy-2,5,5,8a-tetramethy1-1,2,3,4,4a,5,6,-7,8,8a-decahydronaphthalin-1-spiro-2·-(7'-carboxy~6'-formyl-4'-methoxy-2',3'-dihydrobenzofuran)

(46) 6,7-Isopropylidendioxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,-. 5,6,7,8,ea-decahydronaphthalin-i-spiro-2·~f6 ',7'-di-(2,2-dicyanovinyl) -4'. -äthoxy-2 ·, 3' -dihydrobenzof uran/

- 14 -ÖQ988A/062A

282KQ3

(47) 6,7-Isopropylidendioxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,- 5,6,7,8,ea-decahydronaphthalin-1-spiro-2'-£& ',7'-di-

• (2,-cyano-2-carboxyvinyl)-4ⁱ-acetyloxy-2',3'-dihydrobenzofuranj

(48) 6,7-Isopropylidendioxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,·- 5,6,7,8,8a-decahydronaphthalin-1-spiro-2'-/7·-carboxy-6'-(2-cyano-2-carboxyvinyl)-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran J

(49) 7-Acetyloxy-6-oxo-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1-spiro-2'-(6',7'-diacetyloxymethyl- 4'-acetyloxy-2',3'-dihydrobenzofuran)

(50) 7-Acetyloxy-6-oxo-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1 -spiro-2 · -/TS ' ,7 ' -di- (2 ,2-dicyanovinyl) 4'-acetyloxy-2^f,3 *-dihydrobenzofuran/

(51) 7-Acetyloxy-6-oxo-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1 -spiro-2 ' -/Ja ' ,7' -di- (2-cyano-2-äthoxycarbonylvinyl)-4'-acetyloxy-2',3'-dihydrobenzofuran/

(52) 7-Acetyloxy-6-oxo-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1 -spiro-2 ' -/JS ',7' -di- (2-cyano-2-isopropoxycarbony!vinyl)-4'-methoxy-2',3'-dihydrobenzofuran/

(53) 7-Propionyloxy-6-oxo-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4_f4a,5,-6,7,8, ea-decahydronaphthalin-1 -spiro-2 ' -β,' , 7' -di- (2,2-butoxycarbonylvinyl)-4'-propionyloxy-2',3'-dihydrobenzofuran/

(54) 7-Acetyloxy-6-oxo-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8ailecahydronaphthalin-1 -spiro-2' -(JS', 7' -di- (2-cyano-2-carboxyvinyl)-4"-propoxy-2',3'-dihydrobenzofuran/

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-ä³-

(55} 4-Hydroxy-3-oxo-2,3,6,8-tetra-hydro-furo/3,4-gJ-benzofuran-2-spiro-1'-(6',7'-dihydroxy-2',5',5',8'a-tetramethyl 1 ', 2' ,3' , 4' , 4 ' a, 5', 6^f ,7 * , 8' , 8'a-decahydronaphthalin)

(56) 4,6-Dihydroxy-8-0X0-2,3,6,8-tetrahydro-furijO ,4-q/-benzofuran-2-spiro-1'-(6¹,7'-dihydroxy-2',5',5';8'a-tetramethyl-1',2',3',4',4^,5',6',7',8',S¹ a-decahydronaphthalin)

(57) 6-Hydroxy-4-isopropoxy-8-oxo-2,3,6,8-tetrahydro-furd-/"3,4-g7~benzofuran-2-spiro-1'-(6¹,7'-dihydroxy-2¹,5',5^f,8'atetramethyl-1',2',3',4',4'3,5',6',7',8',S¹a-decahydronaphthalin)

(58) 4~Propionyloxy-8-oxo-2,3,6,8-tetrahydro-furo/3 ,4-g7~t>enzofuran-2-spiro-1'-(6¹ _/7'-dipropionyloxy-2^I,5",5',8'a-tetramethyl-1' ,2' ,3* ,4· ,4Ma^¹,6' ,7' ,8' ,8'a-decahydronaphthalin)

(59) 4-Acetyloxy-6-hydroxy-8-oxo-2,3,6,8-tetrahydro-furo/3,4-g/-benzofuran-2~spiro-1'-(6¹,7'-diacetyloxy-2',5',5',8'atetramethyl-1·,2'_r3'_f4 ^f _r4'a,5',6'₁7',8',8'a-decahydronaphthalin)

(60) 4-Butyryloxy-6-hydroxy-8-oxo-2,3,6,8-tetrahydro-furo/3,4-g/-benzbfuran-2-spiro-1'-(7'-butyryloxy-6^l-hydroxy-2^l,5',5',8'atetramethyl-t',2",3',4",4'a,5',6',7',8',8'a-decahydronaphthalin)

(6t) 6-Hydroxy-4-propoxy-8-oxo-2,3,6,8-tetrahydro-furo/3,4-g/-benzofuran-2-spiro-1'-(6¹,7'-propionyloxy-2¹,5',5",8'atetramethyl~1^l,2^l,3^l,4^I _r4^la^5¹ _f6^l _r7^t _#8',8·a-decahydronaphthalin)

(62) 4-Hydroxy-8-oxo-2,3,6,8-tetrahydro-furo/3,4-g/-benzofuran-

2-spiro-1'-(6^f,7'-isopropylidendioxy-2',5',5',8'a-tetra-• methyl- 1'-,2',3',4',4'3,5',6',7',8',S¹ a-decahydronaphthalin)

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- 16 -

282HQ3

(63) 4 ,6-Dihydroxy-8-oxo-2,3,6,8-tetrahydro-furo/3,4-g/-benzofuran-2-spiro-1'-(6',7'-isopropylidendioxy-2',5',5',8' atetraraethyl-1',2',3',4',4'a_f5',6',7',8^f,8'a-decahydronaphthalin)

(64) 6-Hydroxy-4-isopropoxy-8-oxo-2,3,6,8-tetrahydro-furo-/3 ^-gy-benzOfurari^-spirO-i '-(6¹ ,7^T-propylidendioxy-2¹ ,5' ,5' ,8'a-tetramethyl-i ',2',3¹^¹ _f4'a,5',6',7',8',8^!adecahydronaphthalinj

(65) 6-Hydroxy~4-acetyloxy-8-oxo-2,3,6,8-tetrahydro-furo-

/3,4-g7-benzofuran-2-spiro-1'-(6¹,7'-isopropylidendioxy-2¹ ,5' ,5« ,8'a-tetramethyl-i ',2',3',4',4'3,5',6',7',8',S^- decahydronaphthalinJ

(66) 4-Hydroxy-8-oxo-2,3 ,6 ,8-tetrahydro-furo/3 ,4-gJ'-benzofuran-2-spiro-l'-(7'-acetyloxy-6-oxo-2',5',5',8'atetramethyl-1 ' ,2' ,3¹^¹ ,4*3,5' ,6' ,7' ,8' ,8 'a-decahydronaphthalin)

(67) Dinatrium von 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethy1-

1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-decahydronaphthalin-1-spiro-2'-(7'-carboxylat-6'-fonnyl—4'-oxid-2',3'-dihydrobenzofuran)

- 17 -

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-Yl-

Die Nomenklatur der vorgenannten Verbindungen basiert auf den Stellungsbezeichnungen bei der allgemeinen Formel (I). Solche Verbindungen der allgemeinen Formel (I), in denen

2 3

R und R zusammen mit den beiden Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, einen Lactonring bilden, werden in Übereinstimmung mit der Stellungszahl, die in der folgenden Formel gezeigt wird, bezeichnet.

Nachfolgend werden Verfahren zur Herstellung der Sesquiterpenderivate der allgemeinen Formel (I) gemäss der Erfindung beschrieben.

Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel (Ia)

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Die Sesquiterpenderxvate der allgemeinen Formel (I) gemäss der Erfindung können nach verschiedenen Verfahren, je nach der Art der Substituenten, hergestellt werden. Beispielsweise kann man eine Verbindung der allgemeinen Formel (I), in welcher sowohl R¹

5 2

als auch R Wasserstoffatome sind, R

und R beide Formylgruppen bedeuten, und R und R beide
Hydroxylgruppen sind, wie dies in der allgemeinen Formel (Ia) gezeigt wird

(IJO-

CHO

■rCIW

(Ia)

herstellen unter Verwendung der folgenden bekannten Mikroorganismen, die zum Genus Stachybotrys gehören oder von Mikroorganismen vom Genus Stachybotrys, die neu aufgrund der vorliegenden Erfindung isoliert wurden:

Stachybotrys albernans IFO 9355,.
Stachybotrys chart arum IFO 5369,.

- 19 -

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- V9 -

Stachybotrys chartarum IFO 7222,
Stachybotrys cylindrospora 8858,
Stachybotrys echinata 7525, und
Stachybotrys reniformis 7067.

Die Mikroorganismen, die neu isoliert wurden, sind neue Stämme, die zum Genus Stachybotrys gehören und werden nachfolgend beschrieben. Sie sind genannt worden Stachybotrys sp. K-76, Stachybotrys sp. T-789 und Stachybotrys sp. T-791. Sie sind beim American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt worden und haben die Nummern ATCC 20511, ATCC 20 512 bzw. ATCC 20513 erhalten.

A. Fundort

(1.) Stachybotrys complement! nov sp. K-76 (nachstehend als Stachybotrys sp. K-76 bezeichnet). Dieser Stamm wurde vom Boden bei Ishigaki City, Okinawa, Japan isoliert.

(2.) Stachybotrys complement! nov sp. T-789 (nachstehend als Stachybotrys sp. T-789 bezeichnet). Dieser Stamm wurde vom Boden bei Naruto City, Tokushima, Japan, isoliert.

(3.) Stachybotrys echinata var sp. T-798 (nachstehend als Stachybotrys sp. T-791 bezeichnet). Dieser Stamm wurde vom Boden bei Tokushima City, Tokushima, Japan, isoliert.

B. Eigenschaften der verschiedenen Kulturmedien (1.) Stachybotrys sp. K-76

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"^" 282U03

Die Kultureigenschaften dieses Stammes auf verschiedenen Kulturmedien wurden visuell und durch mikroskopische Untersuchungen (Fig. 1 und 2) festgestellt und sind die folgenden:

(a) i§§i_

Es wird ein sehr gutes Wachstum auf verschiedenen Kulturmedien, wie man sie üblicherweise zum Kultivieren von Schimmelpilzen verwendet, festgestellt, aber die Adhäsion von Phialosporen ist nicht immer gut, ausgenommen auf einem Hafermehl-Ägarmedium. Die Wachstumsbedingungen auf typischen Medien werden nachfolgend gezeigt:

i. Malzextrakt-Agarmedium

Das Wachstum ist verhältnismässig langsam; bei der Kultivierung bei 27°C während 30 Tagen bildet sich eine grosse Kolonie einer Grosse von 30 bis 35 mm. Die Kolonie wächst kreisförmig und der Umfang --■ hat eine grosse gezackte Form. Die Oberfläche der Kolonie ist glatt und der Luft ausgesetzte Micelfäden erstrecken sich dick wie ein kreisförmiges Geflecht im Zentrum der Kolonie und wachsen dort dicht. Die Kolonie verändert sich allmählich von weiss,im AnfangsStadium der Kultivierung, zu hell-elfenbeinfarben (Li Elfenbein, 2ca). Zwei Wochen nach Beginn der Kultivierung beginnen sich Phialosporen allmählich zu bilden, aber sie sind mit dem blossen Auge kaum erkennbar. Sclerotium und andere sporogene

"™ 21 "*

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-a?- 282U03

Geschlechtsorgane werden nicht gefunden. Die Farbe der Rückseite der Kolonie liegt im Bereich von farblos bis kupferfarben (Kupfer Tan, 5ie). Ein kupferfarbenes (Kupfer Tan, 5ie) lösliches Pigment wird gebildet.

ii. KartoffeiglucGse-Agarmedium

Das Wachstum ist gut und nach 30-tägiger Kultivierung bei 27 C erreicht die Kolonie eine Grosse von 45 bis 47 mm. Das Kolonienwachstum ist konvex im Kolonienzentrum und der Umfang der Kolonie ist gezackt . Die Kolonie ist ein konzentrischer Kreis oder eine Falte, die i.m Zentrum der Kolonie entspringt. . Im Anfangsstadium der Kultivierung ist die Kolonie dicht bedeckt mit weissen bis perlrosafarbenen (Perlrosa, 4ca) Micelfäden. Mit Fortschreiten der Kultivierung wird die Farbe der Kolonie schwarznrau (Grau, i). Es bildet sich ein grosser Teil an sterigmatischer Sporenmasse. Es werden grosse Mengen an flüssigen Tröpfchen beobachtet. Die Farbe der Rückseite liegt im Bereich von rostfarben (Rostfarbe, Sie) bis hellrosabraun (Li Rosa-Braun, 6^ Ig). Ein gebildetes lösliches Pigment hat eine Butterbonbon-Farbe (Butter Scotch, 3ne) aber ist sehr schwachfarbig.

iii, Czapek's dox Agarmedium

Das Wachstum ist gut und durch Kultivierung während 30 Tagen bei 27°C erreicht die Kolonie

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^Ά - 282U03

eine Grosse von 40 bis 45 mm. Die Kolonie bildet eine konzentrische Falte und die Kolonie hat im Kolonienzentrum eine wellige Form. Der Umfang der Kolonie ist wellig. Die Farbe der Rückseite der Kolonie ist "luggage tan" (Luggage Tan, 4ne). An der Oberfläche der Kolonie haften farblose bis weise Micelfäden dünnen in konzentrischer Form vom mittleren Teil der nicht mit der Luft ausgesetzten' Micelfäden bedeckt ist und die eine Toast-Farbe (Toast Tan, 41g) haben. Man beobachtet keine flüssigen Tröpfchen aber der zentrale Teil der Kolonie ist sehr hygroskopisch. Man findet kaum sterigmatische Sporen. Das lösliche Pigment ist schwach und hat eine Gold-Farbe (Gold, 2Ie).

iv. Hafermehl-Agarrr.edium

Sehr schnelles Wachstum und bei 30-tägiger Kultivierung bei 27°C erreicht die Kolonie eine Grosse von 60 bis 70 mm. Die Kolonie ist dünn und flach und vom Anfangsstadium der Kultivierung werden farblose bis weisse Micelfäden an der gesamten Oberfläche der Kolonie gebildet. Nur im zentralen Bereich der Kolonie findet man aufrechte Micelfäden in einer Länge? von 3 bis 4 mm, die jedoch nicht dicht sind. Zwei Wochen nach Beginn der Kultivieruay verbreiten sich Phialosporen über die gesamte Oberfläche der Kolonie und die Farbe der Kolonie verändert sich nach helloliv-farben (Li Olive Drab, 1Ii). Die Farbe der Rückseite der

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282H03

Kolonie ist beige-braun (Beige Brown, 3ig) bis sonnenbraun (Tan, 3ie). Das gebildete lösliche Pigment ist schwach-kolonialgelb (Colonial Yellow, 2ca).

(2.) Stachybotrys sp. T-789

Es wurden die Kultivierungseigenschaften vom T-789 Stamm, der Fungi-Imperfecti ist, auf verschiedenen Kulturmedien visuell· und mikroskopisch beobachtet (wie in Fig. 3 gezeigt wird) und die Ergebnisse werden nachfolgend beschrieben. Die morphologischen Eigenschaften des T-789 Stammes unter mikroskopischer Beobachtung stimmen gut mit denen von Stachybotrys sp. K-76 überein. Jedoch sind Unterschiede in den Eigenschaften auf den Kulturmedien vorhanden. Auf den folgenden beiden Medien treten die charak teristischen Unterschiede am stärksten auf.

i. Malzextrakt-Agarmedium

Das Wachstum ist sehr langsam und nach 30-tägiger Kultivierung bei 27 C erreicht die Kolonie eine Grosse von 17 bis 20 mm. Der Umfang der Kolonie wächst wellenförmig und ist begrenzt. Die Kolonie zeigt eine wellige Form im Zentrum der Kolonie und eine radiale Falte an der Peripherie der Kolonie. Micelfäden die der Luft ausgesetzt sind, breiten sich dünn über die gesamte Oberfläche der Kolonie aus. Im Anfangsstadium sind die Micelfäden

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2-82H03

weiss und Conidia werden nur graduell gebildet. Der Zentralteil der Kolonie nimmt eine Leberfarbe (Mole, 1) an und die Conidia wachsen dicht. Zum Umfang der Kolonie hin • ist die Conidiabildung ringförmig. Die Farbe der Rückseite ist kork-farben (Cork Tan, 4ie). Das lösliche Pigment ist* stark entwickelt und bernstein-farben (Amber, 3Ie).

ii. Czapek's Agarmedium

Das Wachstum ist gut und nach 30-tägiger Kultivierung bei 27°C erreicht es 45 mm. Das Zentrum der Kolonie ist konvex und die Kolonie bildet eine radiale Falte. Der periphere Teil der Kolonie zeigt ein welliges Wachstum. Der Luft ausgesetzte, weisse Micelfäden haften dünn in konzentrischer Kreisform aussen vom zentralen konvexen Teil der Kolonie und Conidia bilden sich konzentrisch nur am peripheren Teil der Kolonie. Die Micelfäden sind im konvexen Teil im aufgelösten Zustand und ser hygroskopisch. Die Farbe der Rückseite der Kolonie ist senf-farben braun (Mustar Brown, 2pi). Es bildet sich kein lösliches Pigment.

(3.) Stachybotrys sp. T-791

Die Kultivierungseigenschaften von T-7 91 _r einem Fungi-Imperfecti, auf verschiedenen Kulturmedien, wurden visuell und mikroskopisch untersucht (wie in Fig. 4 gezeigt) und sind die folgenden:

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282HQ3

i. Malzextrakt-Agarmedium

Das Wachstum ist schnell und unregelmässig. Die Farbe der Rückseite der Kolonie ist sonnenbraun {Tan, 3ie) bis dunkelbraun (Dk Brown, 2pn). Die Kolonie ist flach und die Conidiabildung gut. Die Farbe der Micelfäden ist bisquit (Biscuit, 2ec) bis sonnen-farbig (Tan, 3ie) und es werden flüssige abgeschiedene Tröpfchen beobachtet. Es bildetet sich kein lösliches Pigment.

ii. Kartoffel-Glucose-Medium

Das Wachstum ist sehr schnell und nach 30·- tägiger Kultivierung bei 27°C erreicht die Kolonie eine Grosse von 70 mm. Der periphere Teil der Kolonie ist verästelt und anhaftende verdünnte weisse Micelfäden werden beobachtet. Es treten flüssige Tröpfchen hervor. Man beobachtet kaum eine Sporenbildung. Die Rückseite der Kolonie ist hell-bernstein-farben (Li Amber, 3ie). Es wird kein lösliches Pigment gebildet.

iii. Czapek¹s dox Agarmedium

Das Wachstum ist schwach.

iv. Synthetisches Mucor-Agarmedium Das Wachstum ist schlecht.

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-K-

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v. Hafermehl-Agarmedium

Das Wachstum ist sehr gut, so dass innerhalb von 2 Wochen die Petri-Schale bedeckt ist. Die Kolonie ist dünn und flach. Es findet eine übermässige Bildung von Micelfäden vom Anfangs stadium der Kultivierung an. statt und die Conidiabildung ist auch sehr schnell. Die Farbe der Kolonie verändert seih von weiss bis dunkelbraun (Dk Brown, 3pn), mit Fortschreiten der Kultivierung. Es erscheinen grosse Mengen an flüssigen Tröpfchen auf den Micelfäden. Es wird kein lösliches Pigment gebildet.

C. Physiologische Eigenschaften

Stachybotrys K-76, T-789 und T-791 sind alle aerobe Stämme und haben die folgenden physiologischen Eigenschaften:

(1.) Stachybotrys sp. K-76

pH Temperatur

Wachstumsbedingungen 3,5-11,5 15- 35 C optimale Wachstumsbe-

dingungen 6,0 - 9,5 20 - 32°C

(2.) Stachybotrys sp. T-789

- 27 -

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2B2UQ3

Wachstumsbedingungen

3,5 - 11,5

optimale Wachstumsbedingungen 4,5 - 10,5

Temperatur 15 - 38°C

20 - 32^UC

Stachybotrys sp. T-791 Wachstumsbedingungen

optimale Wachstumsbedingungen

3,5 - 11,5
4,5 - 9,5

Temperatur 15 - 38°C

20 - 30⁰C

Morphologische Eigenschaften

Stachybotrys sp. K-76

Aus den Fig. 1 und 2 lässt sich das folgende klar erkennen: Auf den verschiedenen Kulturmedien sind Sclerotium und andere geschlechtliche reproduzierende Organe nicht erkennbar, aber man kann die Bildung von asexualen Sporen der Phialosporenart erkennen.

Micelfäden werden auf den verschiedenen Kulturmedien gebildet, die vollständig verzweigt sind und sich in der Länge und Breite zu einer Grosse von 2 bis 4 um erstrecken.

Phialophoren verzweigen sich einfach von den Micelfäden (keine Verzweigung von einem Phialophor zum anderen) und haben 3 bis 4 Septa von den Fusszellen im Basisbeil. Die Phialophoren erstrecken

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- rs -

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sich aufrecht oder leicht gekrümmt. Die Breite der Micelfäden der Phialophoren ist 4,3 bis 4,7 um am Grundteil und 3,6 bis 4,5 um im zentralen Teil. Die Enden der Phialophoren sind leicht aufgebauscht und an den äussersten Enden der Phialophoren bilden sich 3 bis 7 elliptische bis obclavate, aufrecht stehende Phialide mit einer Grosse von 7,9 bis 9,3 χ 3,6 bis 4,7 um. Die Phialide sind glatt und haben eine Farbe im Bereich von farblos bis schwach gelblichbraun. Die Phialosporen werden von den Enden der Phialide in Richtung zur Basis gebildet. Die Phialosporen bilden keine geraden Ketten,sondem warden eine schleimige hängende halbkreisförmige Masse, deren Zahl 7 bis 26 beträgt. Die Phialophoren sind kugelförmig (sub-glubose) bis oval mit einer Grosse von 4,9 bis 8,0 χ 3,3 bis 4,7 um und die Oberflächen der Phialophoren sind rauh bis warzig. Die Farbe der Phialophoren ist dunkelbernstein-farbig (Dk Ivy 24po) bis grau-schwarz. Keine Membranen aufgrund von schleimigen Massen ist auf den Phialosporenmassen erkennbar.

Der taxonomische Zustand der vorliegenden Stämme mit den vorerwähnten mikorbiologischen Eigenschaften ist erforscht worden durch G. L. Barron The Genera Of Hyphomycetes From Soil, The Williams & Wilkins Company, Baltimore (1968); J. C. Gilman, A Manual Of Soil Fungi, The Iowa State University Press, Arnes, Iowa (1971); and J. A. von Arx, The Genera Of Fungi Sporelating In Pure Culture, Verag von J. Cremer 3301 Lehre (1970). Nach dem taxonomischen System von Saccardo gehören die vorliegenden Stämme zur Klasse Hyphomycetes, Familie Dematiaceae,

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Genus Stachybotrys■ Mit anderen Worten stimmen . . die Eigenschaften der vorliegenden Stämme, nämlich die Abwesenheit vom Ascocarpien und anderen geschlechtlich reproduzierenden Organen, die Bildung von dunkelbraunen Phialosporen aus Phialide, und die Sammlung der entstehenden Phialosporen in halbkreisförmiger Form an den oberen Enden der Phialide gut mit den Eigenschaften von Genus Stachybotrys überein.

Die verschiedenen Eigenschaften der vorliegenden Stämme wurden identifiziert aufgrund der folgenden Literaturstellen: G. R. Bisby, Trans. Brit. Mycol. Soc. , 26: 133-143 (1943); R. K. Zuck, Mycologia.. 38: 69-76 (1946); G. L. Barron, Can. J. Bot., 39: 153-157 (1961) und in Übereinstimmung mit den Standardstämmen, die vom Institute for Fermentation (IFO), Osaka, Japan aufbewahrt werden. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass der vorliegende Stamm K-76 ähnlich dem Stachybotrys lobulata IFO 5369 ist, v/eil die Phialosporen des vorliegenden Stammes K-76 rauhe warzige Vorsprünge haben und oval bis ellipsenförmig sind. Es bestehen aber Unterschiede darin, dass Stachybotrys lobulata ein Phialophor hat, das 1 mm Dicke erreichen kann und während der K-76 Stamm einfache Verzweigung zeigt, hat der Stachybotrys lobuleta Stamm die Eigenschaft, dass ein anderes Phialophor abzweigt und sich von einem Phialophor erstreckt. Hinsichtlich des Wachstums auf verschiedenen Kulturmedien erzeugt der K-76 Stamm eine grosse Menge an einem löslichen Pigment

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und die Conidiablldung ist sehr schlecht auf ' einem Agarmedium, ausgenommen auf einem Kartoffel-Glucose-Agarmedium und Hafermehl-Agarmedium. Andererseits wächst Stachybutrys lobulata sehr schnell auf verschiedenen Kulturmedien und bildet eine faltenfreie flache Kolonie. Die Conidiabildung ist auf fast allen Madien, mit ausnähme von Czapek's dox Agarmedium, gut, so dass die Farbe der Kolonie typisch ist. Es wird kein lösliches Pigment gebildet oder zumindest nur sehr schwach.

Aus den obigen Unterschieden schliesst man, dass der vorliegende Stamm K-76 ein neuer Stamm ist, der unterschiedlich ist von Stachybotrys lobulata und der vorliegende Stamm wurde als Stachbotrys sp. K-76 bezeichnet.

(2.) Stachybotrys sp. T-789

Aus Fig. 3 kann man folgendes erkennen: Dieser Stamm hat im wesentlichen die gleiche Morphologie wie Stachybotrys sp. K-76, obwohl Unterschiede der Koloniengrösse vorliegen. In gleicher Weise wie bei Stachybotrys sp. K-76 wurden die mikrobiologischen Eigenschaften verglichen mit Nachschlagewerken und Literaturverweisen, die vorher erwähnt wurden und mit IFO-Typ Stämmen. Es wurde festgestellt, dass dieser Stamm ausserordentlich ähnlich Stachybotrys lobulata IFO 5369 und Stachybotrys sp. K-76 ist. Der vorliegende Stamm r-eigt eine gute Bildung von Phialosporen auf Czapek's dox Agar-Medium. Jedoch wird bei den

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ersten beiden Stämmen die Bildung von Phialosporen
auf Czapek's dex Agarmedium kaum beobachtet. Dies
ist ein Unterschied in der Kultur.

Ebenso wie dies hinsichtlich Stachybotrys K-76 vorher festgestellt wurde, unterscheidet sich der vorliegende Stamm evident vom Stachybotrys lobulata
hinsichtlich der morphologischen Eigenschaften.
Darüber hinaus ist der pH-Bereich für ein optimales Wachstum für den vorliegenden Stamm bei pH 4,5 bis
10,5. Auch in dieser -Hinsicht unterscheidet sich
der vorliegende Stamm vom Stamm K-76.

Deshalb wurde der vorliegende Stamm als neuer
Stamm bezeichnet und Stachybotrys sp. T-789 genannt .

(3.) Stachybotrys sp. T-791

Aus Fig. 4 ist folgendes ersichtlich: Die Phialophoren sind einfach verzweigt und stehen aufrecht. Die Enden der Phialophoren sind leicht aufgewölbt und
stäbchenförmig. Das Aufwölben ist aber nicht so
stark wie man es bei dem Stamm vom Typ Stachybotrys echinata IFO 7525 und 8856 beobachtet. Dieser Stamm hat Micelfäden einer Breite von 4,0 bis 4,5 um, was etwas breiter ist als die Phialophoren. Die Phialophoren die sich aufrecht verzweigen mit Fussiicllcn
von vegetativen Micelfäden oder der Luft ausgesetzten Micelfäden, hat zwei bis drei Septa und eine Grosse von 40 bis 80 χ 3,0 bis 3,5 um. Die Zellwände der

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Phialophoren sind nicht stachelig, sondern glatt.

Drei bis sechs Phialide bilden sich von den aufgewölbten Teilen an den Enden der Phialophoren. Weiterhin bilden sich zur Basis hin sphärische bis kugelförmige Phialosporen aus einer Zelle mit stacheligen Ausbuchtungen und einer Grosse von 4,3 bis 5,2 χ 3,0 bis 4,2 um kontinuierlich an den Spitzen der Phialide, und eine Kette von 24 bis 70 Conidia wird gebildet. Die Phialide haben eine obclavate Form und eine Grosse von 6,9 bis 10,7 χ 3,5 bis 4,7 pm. Die Phialophoren und Phialide sind farblos und die Phialide haben eine kaffe- (Coffee, 3pn) bis schwarze Farbe.

Der taxonomische Status der vorliegenden Stämme mit den vorerwähnten mikrobiologischen Eigenschaften wurde mit Nachschlagewerken, wie dies beim Stamm K-76 erläutert wurde, verglichen. Als Ergebnis hat man festgestellt, dass der vorliegende Stamm zum Genus Stachybotrys (Genus Menmoniella) gehört. Genau gesagt, besitzt der vorliegende Stamm keine Ascocarps und andere geschlechtlich reproduzierende Organe und es bilden sich kontinuierlich aus den Phialosporen dunkelbraune Phialide. Es werden langkettige Sporen gebildet. Die Eigenschaften des vorliegenden Stammes T-791 stimmen mit denen des Genus Stachybotrys (Genus Menmoniella) überein.

Die verschiedenen Eigenschaften des vorliegenden Stammes sind mit den vorher erwähnten Nachschlagewerken und Literaturhinweisen verglichen worden, wie

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232UQ3

R. K. Zuck, Mycologia, 38: 69-76 (1964) und G. Smith, Trans. Brit. Mycol. Soc. , 45: 387-394 (1962) und wurden auch verglichen mit bei der IFO hinterlegten stammen. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass, da kontinuierlich und zur Basis hin Phialosporen aus den Phialide gebildet werden, der Stamm T-791 zu Menmoniella echinata (Bezeichnung von Höhnel) gehört. Aus den Berichten von R. K. Zuck und G. Smith geht hervor, dass der vorliegende Stamm T-791 als ein Stamm angesehen wird,' der analog zu Stachybotrys echinata ist. Daher wurde er verglichen mit Stachybotrys echinata IFO 7525 und 8856.

Morphologisch werden bei dem vorliegenden Stamm T-791 auf den Zellwandungen der Phialophoren keine stacheligen Vorsprünge, wie sie spezifisch für die beiden Stämme sind, beobachtet. Weiterhin sind bei den Stämmen, die Spitzen der Phialophoren aufgebauscht um das 2- bis 3-fache der Breite der Miceifäden der Phialophoren, jedoch wird keine merkliche Ausbuchtung bei dem vorliegenden Stamm beobachtet. Die beiden Stämme weisen ein gutes Wachstum auf verschiedenen Kulturmedien auf, insbesondere auf Kartoffel-Glucose-Agarmedium und bilden kreisförmige, etwas erhöhte Kolonien und es haften Micelfäden sehr stark an. Weiterhin wird eine merkliche Conidiabildung beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigt der vorliegende Stamm ein dendritisches unregelmässiges Wachstum, wie bereits erwähnt, und eine schlechte MiceIfädenbildung und eine schlechte Conidiabildung wird beobachtet. Aus diesen mikrobiologischen

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Ml

" ^ ' 282U03

Unterschieden schliesst man, dass es sich um einen neuen Stamm handelt, der als Stachybotrys sp. T-791 bezeichnet wird.

Die Farbbezeichnungen wie sie vorher und nachstehend verwendet werden, stimmen überein mit den im Color Harmony Manual, Container Corporation of America (1958) bezeichneten.

Proben der neuen Stämme Stachybotrys sp. K-76, Stachybotrys sp. T-789 und Stachybotrys sp. T-791 sind beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan unter den Hinterlegungsnuminern FERM-P Nr. 3801 , FERM-P Nr. 3802 bzw. FERM-P Nr. 3803 hinterlegt worden.

(1b) Herstellung der Verbindung der allgemeinen Formel (Ia) durch Mikroorganismen vom Genus Stachybotrys

Die Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel (Ia) durch Mikroorganismen vom Genus Stachybotrys, wie er vorher beschrieben wurde, wird in der nachfolgenden Weise durchgeführt.

Zunächst wird der Mikroorganismus in einem Medium kultiviert, welches übliche Nährquellen und Zusätze enthält. Stickstoffquellen, die man im allgemeinen als Kultursubstrat verwendet, schliessen beispielsweise ein Sojabohnenpulver, Sojabohnenöl, Maismeische, Hefeextrakt, getrocknete Hefe, Hafermehl, Fleischextrakt, hydrolysiertes Kasein, Ammoniumsalze und Nitratsalze. Beispiele für geeignete Kohlenstoffquellen sind Glukose, Glyzerin, Maltose, Stärke, Lactose, Succrose und Melasse. Beispiele für Additive zum Kulturmedium schliessen ein anorganische

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Ml

282H03

Salze, wie Kaliumcarbonat, Natriumchlorid, Magnesiumsulfat und Phosphorsäure. Gewünschtenfalls kann das Kulturmedium weiterhin geringere Anteile an Metallslazen, wie von Eisen, Kupfer, Mangan und Zink, enthalten. Die Kultivierung kann in einem gewöhnlichen wässrigen Medium, welches das oben erwähnte Substrat enthält, unter Anwendung von Oberflächenkulturverfahren oder durch eine untergetauchte Kultur unter Belüften und Rühren erfolgen. Eine untergetauchte Kultivierung mit Belüftung und Rührung wird bevorzugt. Die Kultivierung kann vorteilhaft durchgeführt werden bei Temperaturen von etwa 15 bis etwa 35°C, vorzugsweise 20 bis 32°C während einer Zeit, die im allgemeinen bei etwa 3 bis etwa 7 Tagen liegt, und zwar unter üblichen Belüftungsbedingungeri, während man einen pH im Kulturmedium von etwa 3,5 bis etwa 11,5, vorzugsweise 4,5 bis 9,5, aufrecht erhält.

Nach dieser Kultivierung wird die gebildete Substanz aus der Kulturbrühe gewonnen. Das Verfahren zur Gewinnung ist nicht in irgendeiner Weise beschränkt und die verschiedenen Verfahren, bei denen die physiko-chemischen Eigenschaften der gebildeten Substanz angewendet werden, können verwendet werden. Die Gewinnung erfolgt beispielsweise durch ein Verfahren, bei dem man die unterschiedlichen Löslichkeiten zwischen den Produkten und den Verunreinigungen ausnutzt, oder bei einem Verfahren bei dem die Unterschiede in der Adsorptionskraft und die Affinität gegenüber gewöhnlichen Adsorbentien, wie Aktivkohle, XAD-2, Kieselgel, Ionenaustauschharze oder Sephadex (Handelsname für ein Produkt der Pharmacia Fine Chemicals), oder unter Anwendung eines Verfahrens, bei dem die Unterschiede des Verteilungskoeffizienten zwischen zwei flüssigen Phasen ausgenutzt wird, oder auch indem man solche Verfahren kom~ biniert.

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^x " 282U03

Genauer gesagt wird die Kulturbrühe filtriert oder zentrifugiert in üblicher Weise, um die Zellen zu entfernen. Dann gibt man zu der überstehenden Flüssigkeit Methanol und rührt die Mischung und lässt sie 2 bis 3 Stunden stehen. Der Niederschlag wird' durch eine weitere Zentrifugentrennung entfernt. Der Rückstand wird mit dem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert und das Lösungsmittel wird abdestilliert. Das Extrakt wird zu Methanol gegeben und die methanolische Lösung wird durch eine Säule mit Aktivkohle geschickt und das Lösungsmittel wird aus dem Eluat abdestilliert. Der Rückstand wird gelfiltriert unter Verwendung von Sephadex LH-2O. Die erhaltenen Fraktionen werden jeweils einen Antikomplementär-Aktivitätstest, wie er nachfolgend noch beschrieben wird, unterworfen. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und das Lösungsmittel wird abdestilliert. Auf diese Weise kann 6/7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1-spiro-2¹-(6',7'-diformyl-4'-hydroxy-2¹,3'-dihydrobenzofuran) der Strukturformel (Ia) isoliert werden.

(2) Herstellung anderer Verbindungen der allgemeinen Formel (I)

Sesquiterpenderivate der allgemeinen Formel (I) der vorliegenden Erfindung, die unterschiedlich sind von der Verbindung der Formel (Ia), können hergestellt werden aus der Verbindung der Formel (Ia) als Ausgangsmaterial nach einem der nachfolgend beschriebenen Verfahren oder durch eine Kombination von zwei oder mehr dieser Verfahren. Die hier angewendeten Verfahrensbedingungen und Verbindungen werden nachfolgend angegeben.

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»«5

*⁷~ 282U03

(A) Verfahren_Xl).

Verbindungen der allgemeinen Formel (I) in denen ein oder

2 4

beide Reste R und R eine Carboxylgruppe darstellen (nachfolgend als Verbindungen (IB) bezeichnet, kann man erhalten, indem man Verbindungen der Formel (I) , in denen ein

2 3

oder beide R und R eine Formylgruppe bedeuten (nachfolgend als Verbindung (IA) bezeichnet, beispielsweiso Verbindung (Ia) oxidiert.

Die Oxidationsreaktion kann erfolgen nach üblichen Verfahren zum Herstellen von aromatischen Carbonsäuren aus aromatischen Aldehydverbindungen. Beispiele für anwendbare Oxidati.onsverfahren sind Verfahren unter Anwendung eines Oxidationsmittels, Verfahren bei denen Bestrahlung mit Licht in Abwesenheit eines Katalysators erfolgt, ein Kontakt-Oxidationsverfahren in Gegenwart eines Katalysators unter Verwendung von Luft oder Sauerstoff, ein elektrolytisches Oxidationsverfahren in Gegenwart einer Kupferverbindung oder von Schwefelsäure, und ein Oxidationsverfahren unter Verwendung eines Enzyms. Aufgrund der Einfachheit der Verfahrensweisen und dergleichen und der Einfachheit der Abtrennung und Reinigung der Reaktionsprodukte und der Ausbeute und dergleichen, sind Verfahren unter Anwendung eines Oxidationsmittels und Kontakt-Oxidations-Verfahren unter Verwendung von Luft oder Sauerstoff besonders vorteilhaft.

Hinsichtlich der Oxidationsmittel, die für die Durchführung der Verfahrensweise mit einem Oxidationsmittel verwendet werden können, liegen keine besonderen Beschränkungen vor. Alle üblichen anorganischen und organischen Oxidationsmittel

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282K03

können verwendet werden. Typische Beispiele für anorganische Oxidationsmittel sind Permanganatsalze, Manganoxid, Manganpyrophosphat; Chromsäure, Chromsalze, Silberoxid, Silbernitrat, Tollens-Reagenz, Goldoxid, Nickelperoxid, Selendioxid, Chlor, Brom, Jod, unterchlorige Säure, unterbromige Säure, Perchlorsäure, Perjodsäure, Salze der erwähnten unterhalogenigen Säuren und Perhalogensäuren, salpetrige Säure, Salpetersäure, Stickstofftetroxid. Stickstoffdioxid, Cobaltsalze, wie Cobaltsulfat oder Cobaltacetat, Cersalze, wie Cersulfat, Ceroxid und Cerperchlorat, Wasserstoffperoxid und Ozon. Beispiele für organische Oxidationsmittel sind n-Bromsuccinimid, n-Chlorsuccinimid, Natrium-N-chlor-ptcluolsulfonaitiid, Natrium-N-chlorbenzolsulfonamid, Azoverbindungen, wie Athylazodicarboxylat und 4-Phenyl-1,2,4-triazolin-3,5-dion und Percarbonsäuren, wie Perameisensäure, Peressigsäure, Monoperphthalsäure, Trifluorperessigsäure, Perbenzoesäure und m-Chlorbenzoesäure.

Von diesen Oxidationsmitteln v/erden besonders bevorzugt Permanganatsalze, Silberoxid, Wasserstoffperoxid, Chromsäure.. Peressigsäure und Perbenzoesäure, wobei ganz besonders werden Permanganatsalze und Silberoxid.

Vorzugsweise wird das Oxidationsverfahren unter Anwendung eines Oxidationsmittels in einem geeigneten Lösungsmittel durchgeführt. Beispiele für geeignete Lösungsmittel sind Wasser und trockene oder feuchte organische Lösungsmittel, beispielsweise Alkohole, wie Methanol und Äthanol, Pyridin_f Äther, wie Dioxan, Tetrahydrofuran und Diäthylather, Ketone wie Acetone, Methyläthy!keton. Carbonsäuren, wie Essigsäure und Propionsäure, Ester, wie Äthylacetat, aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol und Chlorbenzol, Hexamethylphosphoramid, Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid. Eine geeignete

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-JP-

282HQ3

Menge an Oxidationsmittel beträgt etwa 1 bis etwa 10 Äquivalente, vorzugsweise 1 bis 2 Äquivalente pro Formylgruppe der Ausgangsverbindung (Ia). Die Reaktion kann bei etwa -10 bis etwa 100⁰C, vorzugsweise 0 bis 50°C, während 30 Minuten bis etwa 24 Stunden durchgeführt werden.

Bei einem Kontakt-Oxidations-Verfahren unter Verwendung eines Sauerstoff enthaltenden Gases, wie Luft oder Sauerstoff, kann man beispielsweise Sauerstoff oder Luft in eine wässrige Lösung von Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid in Abwesenheit eines Katalysators durchperlen lassen oder Luft oder Sauerstoff in eine wässrige Lösung in Gegenwart eines anorganischen Salzkatalysators, wie Kobaltnitrat, Manganacetat oder Kobaltacetat, oder in Gegenwart eines Radikalinitiators, wie Benzoylperoxid,oder unter Bestrahlung von Licht durchperlen lassen. Von diesem Verfahren wird ein Kontakt-Autooxidations-Verfahren, bei dem man Luft oder Sauerstoff in Abwesenheit eines Katalysators in eine wässrige alkalische Lösung leitet, besonders bevorzugt. Diese Umsetzung kann unter Rühren des Reaktionssystems gewöhnlich bei normaler Temperatur (etwa 1 bis 30°C) bis etwa 100⁰C, vorzugsweise 40 bis 50°C während etwa 30 Minuten bis etwa 24 Stunden, gewöhnlich etwa 30 Minuten bis 2 Stunden, beendet werden.

Nach der vorgenannten Oxidationsreaktion wird das Oxidationsmittel, sofern eines verwendet wurde, mit einem Reduktionsmittel zersetzt und dann werden anorganische Nebenprodukte durch Filtrieren, Neutralisation, Vakuumdestillation und dergleichen entfernt. Wird Luft oder dergleichen in das Reaktionssystem eingeperlt, so wird die Reaktionsmischung vorzugsweise mit Aktivkohle behandelt und dann angesäuert, beispielsweise mit Chlorwasserstoffsäure, um Kristalle auszufällen. Das

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282U03

Reaktionsmedium wird dann mit einem organischen Lösungsmittel, wie Äthylacetat, extrahiert und dann in üblicher Weise einem Reinigungs-Trennverfahren unterworfen, wie Säulenchromatografie oder fraktionierte Kristallisation. Auf diese Weise kann die gewünschte Verbindung (IB) abgetrennt und gewonnen werden.

Von den Verbindungen , die nach dem vorerwähnten Verfahren erhalten werden, hat eine Verbindung, in welcher eine der

2 3

R und R Gruppen eine Formylgruppe und die andere der

2 3

R und R Gruppen eine Carboxylgruppe ist (diese Verbindung wird nachfolgend als Verbindung (1b) bezeichnet, die Struktur (Ib), die in kristallinen Zustand einen Lactolring hat. In einem Lösungsmittel, insbesondere in einem basischen Lösungsmittel, liegt die Verbindung (Ib) als Gleichgewichtsmischung der Verbindung (Ib..) und deren tautomeren Form, der Monocarbonsäure (Ib₂) vor, wie nachfolgend gezeigt wird.

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HO

. HO

• C7/₃

282U03

(Ib₁)

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μ- 282U03

Die obigen Formeln sind ein Beispiel für eine Verbindung

15 ?

der Formel (I), worin R und R Wasserstoffatome, R eine Formylgruppe, R eine Carboxylgruppe und R und R Hydroxylgruppen sind.

Diese Struktur wurde bestätigt durch Auflösen der Verbindung (Ib₁) (kristallin) in Dimethylsulfoxid und Messung des kernmagnetischen Resonanzspektrums im laufe der Zeit. 20 Minuten nach dem Auflösen wurde eine Peak bei 9,89 ppm beobachtet, der ein charakteristisches Signal für ein Aldehydproton (-CHO) ist, neben einem Peak bei 6,36 ppm, der charakteristisch für ein Lactol ist. Das integrierte Verhältnis des ersteren Peaks zu dem letzteren Peak betrug etwa 73 zu etwa 27. Zwei Stunden nach dem Auflösen nahm der Peak bei 9,89 ppm etwas zu und das integrierte Verhältnis zeigte etwa 70 : 30. Danach hat sich dieses integrierte Verhältnis im laufe von 2 Stunden nach dem Auflösen kaum verändert. Dieses Ergebnis beweist, dass die Verbindung (Ib₁) und die Verbindung (Ib2) als eine 7:3 molare Gleichgewichtsmischung in dem obigen Lösungsmittel vorlagen. Wird Methanol oder Pyridin als Lösungsmittel verwendet, konnte eine Bestätigung für die Verbindung (Ib-) die tautomer zu Verbindung (Ib₁) ist, durch eine ähnliche NMR-spektroskopische Analyse nicht erfolgen.

Verbindungen der Formel (I), in denen wenigstens ein R und

R eine Hydroxymethylgruppe darstellen (nachfolgend als Verbindungen (1C) bezeichnet, können hergestellt werden, indem man (1) die Formyl-oder Carboxylgruppen der Verbindungen (IA)

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5λ

282KQ3

oder (IB) reduziert oder (2) indem man die Verbindungen der

2 3

allgemeinen Formel (I),in denen R und R in Form eines Lac-

tonrings der Formel
R⁹ 0

f ir Q

-CH-O-C- verbunden sind, wobei R" ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe bedeutet (nachfolgend als Verbindungen (ID) bezeichnet) reduziert.

Diese vorstehend erwähnte Reduktion kann nach den folgenden beiden Verfahren durchgeführt werden.

Man kann die Reduktion der Formylgruppen durchführen unter Anwendung verschiedener üblicher Reduktionsverfahren für aromatische Aldehyde zu aromatischen Alkoholen, beispielsweise durch Anwendung eines Reduktionsmittels, einer katalytischen Reduktionsmethode oder einer elektrolytischen Reduktionsmethode .

Verwendet man ein Reduktionsmittel, so sind Beispiele für geeignete Reduktionsmittel Aluminiumhydrid-Verbindungen, wie Lithiumaluminiumhydrid, Natriumaluminiumhydrid, Natriumtriäthoxyaluminiumhydrid und Natrium-bis(2-methoxyäthoxy)-aluminiumhydrid, Borhydridverbindungen, wie Natriumborhydrid, Lithiumborhydrid, Natriumborhydridcyanid und Diboran, organische Zinnhydride, wie Tri-n-butylzinnhydrid, Diphenylzinnhydrid und Triäthylzinnhydrid, und Hydrosilane, wie Dimethylphenylsilan und Triäthylsilan.

Verschiedene übliche Katalysatoren können bei einer katalytischen Reduktion verwendet werden. Beispiele für geeignete Katalysatoren sind Palladiumschwarz, Palladium auf Kohle, Raney-Nickel und Platinoxid. Annehmbare Mengen des Katalysators

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liegen im Bereich von etwa 1 bis etwa 50 Gew.%, vorzugsweise 5 bis 15 Gew.%, bezogen auf das Gewicht der Ausgangsverbindung der Formeln (IA), (IB) oder (ID).

Die elektrolytische Reduktion kann durchgeführt werden unter Verwendung von beispielsweise Quecksilber, Blei, Platin, Zinn, Nickel, Palladium, Graphit und dergleichen als Kathode, und indem man einen Gleichstrom einer Grosse von etwa 2 bis etwa 12 V, vorzugsweise 4 bis 6 V, durch eine neutrale oder alkalische, die Verbindung enthaltende Lösung, schickt.

Besonders vorteilhaft ist unter den angegebenen Reduktionsverfahren ein Verfahren, bei dem ein Reduktionsmittel angewendet wird, weil hier die Handhabung und auch die Kosten der Durchführung günstig sind. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von Natriumborhydrid als Reduktionsmittel. Im einzelnen kann dieses Verfahren durchgeführt werden in einem inerten Lösungsmittel, beispielsweise in einer wässrigen Lösung eines Alkalis, wie Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, in Wasser, in einem niedrigen Alkohol, wie Methanol oder Äthanol, in einem Äther, wie Tetrahydrofuran oder Diaoxan, oder einer Mischung solcher Lösungsmittel. Die geeignete Menge an Reduktionsmittel, die man im allgemeinen verwendet, beträgt im allgemeinen wenigstens 1 Äquivalent, vorzugsweise 1 bis 8 Äquivalente, bezogen auf die zu reduzierenden Forcnylgruppen der Ausgangsverbindung, Die Reaktionstemperatur liegt im allgemeinen bei etwa 0 bis etwa 6O°C, vorzugsweise 5 bis 25°C. Im aligemeinen kann die Umsetzung in etwa 30 Minuten bis etwa 10 Stunden beendet werden.

Wird die Verbindung (Ib) als Ausgangsverbindung bei der

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Reduktionsreaktion verwendet, muss ein basisches Material in das Reaktionssystem im voraus eingeführt werden, um den Lactolring zu öffnen. Dies ist erforderlich, weil unter neutralen oder sauren Bedingungen, die Verbindung (Ib) als Lactolverbindung vorliegt, mit der Struktur (Ib₁), die sehr stabil ist und nicht leicht reduziert werden kann. Aus diesem Grund sollten die Reduktionsmittel,Lösungsmittel und die Reaktionsbedingungen die vorher angegeben wurden, in Gegenwart eines basischen Materials, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat oder Natriumhydrogen carbonat durchgeführt werden. Verwendbare Mengen des basischen Materials liegen bei etwa 1 mol oder mehr pro Mol des Ausgangsmaterials.Vorzugsweise wird die oben erwähnte Äusgangsverbindung in Gegenwart einer basischen Substanz unter Rühren auf etwa O bis etwa 8O°C, vorzugsweise 40 bis 60 C, während etwa 1 bis 8 Stunden, zusammen mit wenigstens etwa 4 Äquivalenten, vorzugsweise 4 bis 16 Äquivalenten Natriumborhydrid als Reduktionsmittel erhitzt und zwar in einem üblichen inerten Lösungsmittel, wie Wasser, Methanol, Äthanol, Tetrahydrofuran oder Dioxan oder einer Mischung dieser Lösungsmittel.

Man kann die Reduktion der Carboxylgruppen in der Verbindung (IB) oder einer Verbindung (IC), die nach der vorher erwähnten Verfahrensweise erhalten wurde und in welcher einer der 2 3

R und R Reste eine Hydroxymethylgruppe ist und der andere eine Carboxylgruppe ist, und die zur Ausbildung eines Lactonrings verbunden sind (nachfolgend als Verbindung .(Id) bezeichnet, in folgender Weise durchführen. Eine Verbindung (Id) wird mit wenigstens etwa 1 Äquivalent, vorzugsweise 1 bis 8 Äquivalenten pro Äquivalent der Verbindung (Id) Lithiumaluminiumhydrid als Reduktionsmittel in einem üblichen inerten

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282H03

Lösungsmittel, wie Dioxan oder Diäthyläther, bei etwa 0 bis etwa 60⁰C, vorzugsweise 5 1
bis etwa 1O Stunden umgesetzt.

bis etwa 60 C, vorzugsweise 5 bis 25°C während etwa 30 Minuten

2 3

Verbindungen der Formel (I), in denen R und R unter Ausbildung eines Lactonrings der Formel
0

Il

-CH₂-O-C- verbunden sind und die als Verbindungen (Id) bez-eichnet werden, kann man leicht durch Cyclisierung unter Freigabe von Wasser herstellen, indem man Verbindungen der Formel (IC), die nach der vorher erwähnten Verfahrensweise erhalten wurden und in

2 3
denen einer der Reste R und R eine Hydroxymethylgruppe und der andere dieser Reste eine Carboxylgruppe bedeutet, in Abwesenheit eines Lösungsmittels oder in Gegenwart eines geeigneten Lösungsmittels dehydrocyclisiert.

Die obige Cyclisierungsreaktion durch Cyclisierung unter Freigabe von Wasser kann durch Direkterhitzen des Ausgangsmaterials auf etwa 100 bis etwa 200 C erfolgen. Alternativ kann man das Ausgangsmaterial in einem geeigneten inerten Lösungsmittel lösen und in Gegenwart einer katalytischen Menge einer sauren Verbindung von etwa 0,01 bis etwa 50 Gew.%, vorzugsweise 0,01 bis 10 Gew.%, bezogen auf das Gewicht des Ausgangsmaterials, bei etwa 0 bis etwa 200⁰C, vorzugsweise 60 bis 15O°C während etwa 10 Minuten bis etwa 24 Stunden, im allgemeinen 2 bis 10 Stunden, erhitzen. Beispiele für geeignete Lösungsmittel, die verwendet werden können, sind aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol und Toluol, halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Dich ormethan, Dichloräthan

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SS
- *7 -

282U03

und Chloroform, Äther wie Dimethyläther, Tetrahydrofuran und Dioxan, Glycole, wie Äthylenglykol, und niedrige Alkohole, wie Äthanol und Methanol. Geeignete saure Verbindungen, die man verwenden kann, sind beispielsweise Chlorwasserstoff, konzentrierte Salzsäure, Phosphorsäure, Polyphosphorsäure, Bortrifluorid, Perchlorsäure, Trichlormethansulfonsäure, Trifluoressigsäure, Naphthalinsulfonsäure, p-Toluoisulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Thionylchlorid und Acetondimethylacetal.

(D) Verfahren (4)

Verbindungen der allgemeinen Formel (I), in denen einer oder

2 3 7 8

beide Reste R und R eine Gruppe der Formel -CH=CR R be-

7 8
deuten, worin R und R die vorher angegebenen Bedeutungen haben (die nachfolgend als Verbindungen (IE) bezeichnet werden) kann man herstellen, indem man Verbindungen (IA) rait aktiven Methylenverbindungen der allgemeinen Formel (II)

7 8
worin R und R die vorher angegebenen Bedeutungen haben, in Gegenwart eines Katalysators dehydrokondensiert.

Die Dehydrokondensierungsreaktion kann in Abwesenheit eines Lösungsmittels vorgenommen werden. Verteilhaft wird die Deny drokenden sat ion aber in einem üblichen inerten Lösungsmittel, beispielsweise in wässriger Lösung eines Alkalis, wie Natriumhydroxid, Wasser, einem Alkohol, wie einem Methanol oder

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282 U 03

Äthanol, einem Äther, wie Dioxan oder Tetrahydrofuran, einem aromatischen Kohlenwasserstoff, wie Benzol oder Toluol, einem tertiären Amin, wie Pyridin oder Triäthylamin, oder einem halogenierten Kohlenwasserstoff, wie Methylenchlorid, Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff, durchgeführt. Wird eine wässrige alkalische Lösung verwendet und nimmt man Pyridin und Triäthylamin als Lösungsmittel, so wirken diese auch katalytisch und es ist deshalb nicht erforderlich, einen weiteren Katalysator zuzufügen. Werden andere Lösungsmittel verwendet, so wird ein Katalysator, beispielsweise eine Aminosäure, wie ß-Alanin, ein cyclisches Amin, wie Piperidin oder Morpholin, Ammoniak, ein Amin, wie Äthylamin, Diäthylamin oder Butylamin, Acetatsalze dieser Amine, ein Alkaliacetat, wie Natriumacetat od^r Kaliumacetat, oder ein Alkalialkoholat, wie Natriumäthylat oder Methylat in einer Menge von etwa 0,01 bis zu einem Überschuss, vorzugsweise O,05 bis 30 Gew.%, bezogen auf das Gewicht des Ausgangsmaterials, verwendet.

Die Reaktionstemperatur und die Zeit werden in Abhängigkeit von dem verwendeten Lösungsmittel bestimmt. Wird ein unpolares Lösungsmittel, wie Benzol oder Chloroform verwendet, so wird die Reaktion im allgemeinen unter Erhitzen des Reaktionssystems auf eine Temperatur in der Nähe des Siedepunktes des Lösungsmittels durchgeführt und während das bei der Reaktion gebildete Wasser als Azeotrop abgetrennt wird, wird die Umsetzung weitergeführt, bis die theoretische Menge an Wasser abgetrennt ist. Verwendet man ein gut mit Wasser lösbares Lösungsmittel, wie Äthanol, Pyridin oder Dioxan, so kann die Umsetzung gewöhnlich bei Raumtemperatur bis etwa 120°C, vorzugsweise bei 30 bis 60°C, während etwa 30 Minuten bis etwa 24 Stunden, im

grossen

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allgemeinen 30 Minuten bis 3 Stunden durchgeführt werden, ohne dass man das während der Reaktion gebildete Wasser abtrennt .

Die Menge an verwendeter aktiver Methylenverbindung der Formel (II) bei der vererwähnten Dehydrokondensationsreaktion, beträgt wenigstens etwa 1 Äquivalent, vorzugsweise 1 bis 2 Äquivalente, bezogen auf die Formylgruppen in der Ausgangsverbindung (IA) .

Verbindungen der allgemeinen Formel (I), in denen einer

2 3

oder beide Reste R und R Hydroxylgruppen sind (nachfolgend als Verbindungen (IF) bezeichnet) kann man leicht herstellen, indem man Verbindungen der Formel (IA) mit Peroxiden in einem inerten Lösungsmittel umsetzt,

Beispiele für geeignete inerte Lösungsmittel sind wässrige Lösungen von Alkalien, wie Natriumhydroxid und Kaliumhydroxid, Wasser, Pyridin, Methanol, Äthanol, Essigsäure, Propionsäure, Chloroform, Methylenchlorid, Methylenacetat, Äthylacetat, Benzol und Toluol. Geeignete Peroxide sind organische oder anorganische Peroxide, wie Wasserstoffperoxid, Peressigsäure, Trxfluorperessxgsäure, m-Chlorperbensoesäure, Perbenzoesäure Perfumarsäure.

Die Reaktionstempe atur liegt im allgemeinen bei'etwa 0 bis etwa 100⁰C, vorzugsweise 0 bis 50⁰C, und die Umsetzung wird unter Rühren des Reaktionssystems in etwa 1 bi etwa 24 Stunden beendet. Die Menge an Peroxid beträgt wenigstens etwa

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2 Mol, vorzugsweise 2 bis 3 Mol pro Mol der Ausgangsverbindung (IA). Nach der Umsetzung gibt an ein geeignetes Neutralisationsmittel hinzu und die Mischung wird unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wird zu Eiswasser gegeben und die ausgefallenen Rohkristalle v/erden durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Die getrockneten Rohrkistalle werden in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Chloroform, gelöst und durch Säulenchromatografie getrennt. Die gewünschte Verbindung (IF) erhält man gewöhnlich in.einer mit Methanol eluierten Fraktion.

Verbindungen der allgemeinen Formel (I), in denen beide

2 3

Reste R und R Niedrigalkanoyloxymethylgruppen sind (nachfolgend als Verbindungen (IG) bezeichnet), erhält man, indem man Verbindungen (IF), die nach dem Verfahren (5) erhalten wurde, acyliert.

Niedrige Alkansäuren, wie Essigsäure , Propionsäure, Butyrsäure, Isobutyrsäure, und dergleichen, deren Säureanhydride oder die Säurehalogenide hiervon, wie Acetylchlorid, Propionylbromid, Butyrylbromid, Iscbutyrylbromid und dergleichen, können beispielsweise als Acylierungsmittel bei dieser Reaktion verwendet werden. Niedrige Alkansäureanhydride und -säurehalogenide werden bevorzugt. Die Acylierungsreaktion kann in Abwesenheit eines Lösungsmittels oder in Gegenwart eines üblichen inerten Lösungsmittels in Gegenwart einer basischen Verbindung durchgeführt werden. Beispiele für geeignete inerte Lösungsmittel sind aromatische Kohlenwasserstoffe.

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wie Benzol, Toluol, Äther, wie Diäthyläther, Dioxan oder Tetrahydrofuran, halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform und Methylenchlorid, tertiäre Amine, wie Pyridin und Diäthylamin, Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid. Geeignete basische Verbindungen schliessen beispielsweise ein Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat, Natriumhydrogencarbonat und tertiäre Aminie, wie Pyridin, Chinolin, N,N-Dimethyl~ anilin oder Triäthylamin.

Die Menge an basischer Verbindung liegt bei 1 Mol, vorzugsweise 1 bis 2 Mol pro Mol der Ausgangsverbindung, wenn Säurehalogenid als Acylierungsmittel verwendet wird, und bei etwa 0,01 bis 10 Gew.%, bezogen auf das Gewicht der Ausgangsverbindung, wenn Säureanhydrid als Acylierungsmittel verwendet wird.

Die Umsetzung kann bei einer Temperatur von etwa -60°C bis etwa 150°C, vorzugsweise 0 bis 100⁰C, durchgeführt werden und ist in etwa 1 bis etwa 20 Stunden beendet. Die Menge an Acylierungsmittel soll wenigstens etwa 1 Äquivalent, gewöhnlich 1 bis 10 Äquivalente, bezogen auf die Hydroxylgruppen der Ausgangsverbindung (IF) betragen.

Wird eine Verbindung der Formel (IF), in denen nicht nur

2 3 14

R und R sondern auch wenigstens eine von -OR _r R oder R eine Hydroxylgruppe darstellen, als Ausgangsverbindung bei der vorerwähnten Acylierungsreaktion verwendet, so wird oder werden diese andere(n) Hydroxylgruppe(n) manchmal in Abhängigkeit von den Acylierungsbedingungen acyliert in Abhängigkeit von der Wahl der Reaktionstemperatur und der

ο 3 Menge des Acylierungsmittels. Wünscht man R"¹ und R selektiv zu acylieren, und verwendet man als Ausgangsverbindungen solche der vorgenannten Art, so kann man die anderen Hydroxylgruppen (oder die Gruppe) unter Verwendung von üblichen

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(,ο

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Verfahren vor der Umsetzung schützen und nach der Acylie-

2 3

rung von R und R können die Schutzgruppen entfernt werden.

(G) Verfahren_X21

Verbindungen der Formel (IA) bis (IG), die man nach den vorher beschriebenen Verfahren erhalten hat und in denen R eine Niedrigalkylgruppe bedeutet, kann man erhalten, indem man die entsprechenden Verbindungen, in denen R ein Wasserstoff atom bedeutet, mit bekannten Alkylierungsmitteln umsetzt.

Beispiele für geeignete Alkylierungsmittel sind Alkylhalogenide, wie Methyljodid, Äthylbromid, Propylbromid, Isopropylbromid, Butyljodid und tert-Butylbromid, Dialkylsulfate, wie Dimethylsulfat oder Diäthylsulfat, und Diazoalkane, wie Diazomethan oder Diazoäthan.

Die Alkylierung wird bei Raumtemperatur bis etwa 1OQ°C, vorzugsweise bei 30 bis 70°C durchgeführt und zwar in einem üblichen inerten Lösungsmittel, beispielsweise einem Keton, wie Aceton oder Methyläthylketon, einem Äther, wie Tetrahydrofuran oder Dioxan, oder einem niedrigen Alkohol, wie Methanol Oder Äthanol, und zwar in Gegenwart einer basischen Verbindung, wie Kaliumcarbonat, Natriumcarbonat, Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid und zwar in einer Menge von etwa 0 bis etwa 10 Mol, vorzugsweise 1 bis 2 Mol pro Mol des Acylierungsmittels. Die Umsetzung ist gewöhnlich in etwa 1 bis etwa 8 Stunden beendet. Die Menge an Alkylierungsmittel soll wenigstens etwa 1 Mol, gewöhnlich 1 bis 5 Mole pro Mol der Ausgangsverbindung (IA) bis (IG) ausmachen. Verwendet man Diazomethan als

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Alkylierungsmittel, so entfällt die Verwendung einer basischen Verbindung.

Verbindungen der Formel (IA) bis (IG), bei denen R eine niedrige Alkanoylgruppe ist, kann man erhalten unter Anwendung einer bekannten Acylierungsreaktion der entsprechenden Verbindungen, bei denen R Wasserstoff bedeutet.

Die Acylierungsreaktion kann in Übereinstimmung mit dem vorher beschriebenen Verfahren (6) durchgeführt werden.

Verwendet man Verbindungen der allgemeinen Formel (I), in denen eine Hydroxylgruppe an anderer Position als in der 4-Stellung ist, als Ausgangsmaterial, so findet leicht eine Acylierung der Hydroxylgruppe unter den Acylxerungsbedingungen des vorher erwähnten Verfahrens (6) statt. Infolgedessen muss man beim Acylieren solcher Ausgangsverbindungen die Hydroxylgruppe, die an einer anderen Position als in 4-Stellung steht, vorzugsweise in üblicher Weise mit einer geeigneten Schutzgruppe schützen.

Verbindungen der allgemeinen Formel (IA) bis (IG), in denen R und R Niedrigaikanoyioxygruppen bedeuten, erhält man durch

Acylieren der entsprechenden Verbindungen, in denen R^ und R Hydroxylgruppen sind. Bei dieser Umsetzung können die gleichen

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(Λ

-STA-

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Acylierungsbedingungen, Schutzmassnahmen und nachfolgende Abspaltung der Schutzgruppen für andere funktioneile Gruppen
angewendet werden, wie beim Verfahren (6). .

Verbindungen der allgemeinen Formeln(IA) bis (IG), in denen

4 6

R und R Niedrigalkylidendioxygruppen bedeuten, erhält man durch Umsetzung der entsprechenden Verbindungen, in denen
R und R Hydroxylgruppen bedeuten, mit Aldehyden oder Keto nen der allgemeinen Formel

C=O (Hl)

worin R und R , die gleich oder verschieden sein können, jewe Is ein Wasserstoffatom oder eine Niedrigalkylgruppe
bedeuten,

oder mit Acetalen oder Ketal.en der folgenden allgemeinen
Formel

(IV)

worin R und R , die gleich oder verschieden sein können, die vorher erwähnte Bedeutung haben.

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Diese Umsetzung kann in Gegenwart eines Katalysators in Gegenwart oder in Abwesenheit eines Lösungsmittels durchgeführt werden. Beispiele für geeignete Lösungsmittel sind aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol und Toluol, Äther, wie Diäthyläther und Dioxan, halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform und Methylenchlorid, und Ketone, wie Aceton und Methyläthylketon. Beispiele für geeignete Katalysatoren sind Halogenwasserstoffe, wie Chlorwasserstoff und Bromwasserstoff, Lewis-Säuren, wie konzentrierte Schwefelsäure, wasserfreies Aluminiumchlorid, wasserfreies Zinkchlorid und Bortrifluorid,und p-Toluolsulfonsäure. Die Menge an verwendetem Katalysator liegt bei etwa 0,1 bis etwa 20 Gew.%, vorzugsweise 5 bis 10 Gew.%, bezogen auf das Gewicht des Ausgangsmaterials. Die Verbindungen der allgemeinen Formeln (III) und (IV), die bei der Umsetzung verwendet werden, werden im allgemeinen im Überschuss eingesetzt, gegenüber den Verbindungen der allgemeinen Formeln (IA) bis (IG), weil sie auch als Lösungsmittel dienen. Geeignete Reaktionstemperaturen sind etwa 30 bis etwa 70°C, vorzugsweise 0⁰C bis Raumtempe atur. Unter diesen Bedingungen ist die Umsetzung in etwa 30 Minuten bis etwa 6 Stunden beendet.

Verbindungen der allgemeinen Formeln (IA) bis (IG), in denen

4 5
R und R zusammengenommen eine Oxogruppe (-0) bedeuten, erhält man durch Oxidieren der entsprechenden Verbindungen, in denen R eine Hydroxylgruppe und R ein Wasserstoffatom ist. Die Oxidationsreaktion kann unter Anwendung zahlreicher bekannter Oxidationsmittel, wie sie zum Oxidieren von sekundären Alkoholenzueiner Oxogruppe verwendet werden, durchgeführt

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232H03

werden. Beispiele für geeignete Oxidationsmittel sind Chromsäure, Bichromsäure, Salze dieser Säuren mit Metallen wie Natrium oder Kalium, Salpetersäure, Halogene, wie Brom oder Chlor, Oppenauer-Oxidationsmittel und Jones-Reagenz.

Die Umsetzung wird vorzugsweise in einem geeigneten Lösungsmittel durchgeführt. Beispiele für geeignete Lösungsmittel sind Wasser, Alkohole, wie Methanol und Äthanol, Äther, wie Dioxan, Tetrahydrofuran und Diäthyläther, Ketone, wie Aceton und Methylathylketon, organische Säuren, wie Essigsäure und Propionsäure, Ester, wie Äthylacetat, aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol und Chlorbenzol, halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Dichlormethan und Dichloräthan, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Pyridin.

Die Menge an ausgewähltem Oxidationsmittel kann in einem weiten Bereich gewählt werden. Gewöhnlich wird das Oxidationsmittel im überschuss angewendet.

Die Umsetzung kann bei etwa -1O bis 1O0°C, vorzugsweise

bei O⁰C bis Raumtemperatur, während etwa 30 Minuten bis etwa Stunden durchgeführt werden.

Wenn in der vorerwähnten Oxidationsreaktion Ausgangsverbindungen verwendet v/erden mit Gruppen, die leicht durch die Oxidationsreaktion verändert werden, wie Formyl- oder Hydroxylgruppen, so ist es wünschenswert, diese Gruppen mit geeigneten Schutzgruppen in üblicher Weise wie beim Verfahren (6) zu schützen. Die Entfernung der Schutzgruppen nach der Reaktion kann dann in einfacher üblicher Weise erfolgen.

Die Sesquiterpenderivate der allgemeinen Formel (I) der Erfindung kann man erhalten, indem man mehr als eines der Verfahren

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(1) bis (11) in geeigneten Reihenfolgen anwendet und gewünschtenfalls, indem man reaktive Stellen schützt und anschliessend die Schutzgruppen entfernt. Dabei kann man zahlreiche" Trenn- und Reinigungsverfahren anwenden.

Von den Sesquiterpenderivaten der Formel (I) der Erfindung können solche, welche saure Gruppen enthalten, d.h. eine phenolische Hydroxylgruppe und/oder eine Carboxylgruppe mit basischen Verbindungen zur Bildung von Salzen, umgesetzt werden. Die Erfindung schliesst auch die Salze der Sesquiterpenderivate der allgemeinen Formel (I) ein.

Beispiele für basische Verbindungen, die man für die Herstellung von Salzen der Sesquiterpenderivate der allgemeinen Formel (I) verwenden kann, sind Hydroxide und Carbonate von Alkalimetallen und Erdalkalimetallen, wie Natriumhydroxid, Kaiiumhydroxid, Kalziumhydroxid, Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat und Natriumhydrogencarbonat. Auch organische Amine, wie Methylamin, Äthylamin, Isopropylamin, Morpholin, Piperazin, Piperidin und 3,4-Dimethoxyphenäthylamin, können als basische Verbindungen verwendet werden.

Die Salzbildung unter Verwendung der basischen Verbindungen kann leicht in einem organischen Lösungsmittel unter Anwendung üblicher Verfahren zur Salzbildung erfolgen. Beispiele für geeignete Lösungsmittel sind Wasser, niedrige Alkohole, wie Methanol, Äthanol und Propanol, Äther, wie Dioxan und Tetrahydrofuran, Aceton, Benzol, Ä'thylacetat, Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Methylenchlorid und Chloroform. Die Salzbildung kann bei Raumtemperatur bis etwa 1OO°C, vorzugsweise bei Raumtemperatur bis 5O°C, während etwa 5 Minuten bis etwa 6 Stunden ungewöhnlich an der offenen Atmosphäre oder unter

- 58 -

809884/0624

se -

282U03

sauerstoffreien Bedingungen, vorzugsweise aber in einer Atmosphäre eines inerten Gases, wie Stickstoff oder Argon, durchgeführt werden." Die Menge an basischer Verbindung ist nicht besonders beschränkt, aber im allgemeinen liegt eine geeignete Menge bei wenigstens etwa 1 Äquivalent, vorzugsweise 1 bis 2 Äquivalenten, bezogen auf die sauren Gruppen in der Ausgangsverbindung.

Nach Beendigung der vorher angegebenen Umsetzungen kann man die Endprodukte leicht unter Anwendung üblicher Trennverfahren abtrennen und reinigen. Beispielsweise kann man als Trennverfahren das Destillieren des Lösungsmittels, Lösungsmittelextraktion, Ausfällen, Umkristallisieren, Säulenchromatografie und präparative Chromatografie, anwenden.

III. Therapeutische Mittel

Die Sesquiterpenderivate der allgemeinen Formel (I) und deren Salze sind als Mittel zur Behandlung von Nephritis geeinget und bei ihrer Anwendung als Behandlungsmittel gegen Nephritis werden sie zu pharmazeutischen Produkten, zusammen mit üblichen pharmazeutisch annehmbaren Trägern, verarbeitet. Geeignete Träger sind beispielsweise Verdünnungsmittel oder Exzipientien, wie.Füllstoffe, Extender, Bindemittel, Befeuchtungsmittel, Mittel die den Zerfall vereinfachen, oberflächenaktive Mittel und Schmiermittel, soweit diese Mittel je nach der Verabreichungsmethode zugesetzt werden.

Es können verschiedene Dosierungsverabreichungsformen für die therapeutischen Mittel als Mittel für die Behandlung von

- 59 -

809884/0824

232H03

Nephritis, je nach dem Zweck der Therapie, verwendet werden. Typische Doseriungsformen sind Tabletten, Pillen, Pulver, flüssige Zubereitungen, Suspensionen, Emulsionen, Granulate, Kapseln, Suppositorien, und injizierbare Zubereitungen (Lösungen, Emulsionen, Suspensionen und dergleichen).

Beim Verformen einer pharmazeutischen Zubereitung, welche die Sesquiterpenderivate der allgemeinen Formel (I) oder deren Salze als aktiven Bestandteil enthalten, zu einer Tablette, kann eine grosse Zahl von Trägern, wie sie bekannt sind, verwendet werden. Beispiele für geeignete Träger sind Exzipientien, wie Lactose, Succrose, Natriumchlorid, Glucoselösungen, Harnstoff, Stärke, Kaliumcarbonat, Kaolin, kristalline Zellulose und Kieselsäure, Bindemittel, wie Wasser, Äthanol, Propanol, einfacher Sirup, Glukose, Stärkelösungen, Gelatinelösungen, Carboxymethylzellulose, Shellac, Methylzellulose, Kaliumphosphat und Polyvinylpyrrolidon, Zerfallmittel, wie getrocknete Stärke, Natriumalginat, Agarpulver, Laminariapulver, Natriumbicarbonat, Kaliumcarbonat, Tween, Natriumlaurylsulfat, Stearinsäuremonoglyzerid, Stärke und Lactose, Zerfallsinhibitoren, wie Succrose, Stearinsäure, Glyzerinester, Kakaobutter und hydrierte Öle, Absorptionsbeschleuniger, wie quaternäre Ammoniumbasen und Natriumlaurylsulf at, Mittel zum Beibehalten der Feuchtigkeit, wie Glyzerin und Stärke, Adsorbentien, wie Stärke, Lactose, Kaolin, Bentonit und kolloidale Kieselsäure, und Schmiermittel, wie gereinigter Talk, Stearinsäuresalze, Borsäurepulver, Macragol und festes Polyäthylenglykol.

Beim Verformen der pharmazeutischen Zusammensetzungen zu Pillen kann eine grosse Anzahl von üblichen Trägern verwendet

809884/0624

282UQ3

werden. Beispiele für geeignete Träger sind Exzipientien, wie Glucose, Lactose, Stärke, Butterfett, gehärtete Pflanzenöle, Kaolin und Talk, Bindemittel, wie Gummiarabikumpulver, Tragaganthpulver, Gelatine und Äthanol, und Zerfallsmittel, wie Laminaria und Agar. Gewünschtenfalls können die Tabletten beschichtet sein und zu Zucker-beschichteten, Gelatine-beschichteten, enterisch-beschichteten, Film-beschichteten Tabletten oder Tabletten, die mit zwei oder mehr Schichten beschichtet sind, verarbeitet werden. Beim Verformen der pharmazeutischen Zusammensetzung zu Suppositorien kann eine grosse Zahl von bekannten Trägermaterialien verwendet werden. Geeignete Träger sind beispielsweise Polyäthylenglykol, Kakaobutter, höhere Alkohole, Ester von höheren Alkoholen, Gelatine und halbsynthetische Glyzeride.

Werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen zu injizierbaren Zubereitungen formuliert, so können die flüssigen Lösungszubereitungen und Suspensionen vorzugsweise sterilisiert werden und im Hinblick auf das Blut isotonisch gemacht werden. Bei der Formulierung der pharmazeutischen Zusammensetzungen zu flüssigen Lösungen oder Suspensionen, können alle für diesen Zwecke übliche Verdünnungsmittel verwendet werden. Beispiele für geeignete Lösungsmittel sind Wasser, Äthylalkohol, PrO-pylenglykol, äthoxylierter Isostearylalkohol, Polyoxyäthylonsorbitol und Sorbitester. Natriumchlorid, Glykose oder Glyzerin können in Mengen, die zur Herstellung von isotor.ir.chon Lösungen ausreichen, in ein therapeutisches Mittel cinyarbeitet werden, beispielsweise in ein Mittel zur Bekämpfung der Nephritis. Das therapeutische Mittel kann auch ««.«wohnliche Auflösungshilfen, Puffer, schmerzlindernde Mittel und Konservierungsmittel, sowie gewünschtenfalls Farbstoffo, IMrfür.*,

808884/082* bad o_R1Q,nal

2S2H03

Geschmacksstoffe, Süsser und andere Arzneimittel enthalten.

Die Menge der Verbindung der allgemeinen Formel (I) und deren Salze, die man als aktive Bestandteile in einer pharmazeutischen Zubereitung verwendet, die zur Bekämpfung der Nephrit s beabsichtigt ist, ist nicht besonders beschränkt und kann im weiten Bereich variieren. Eine therapeutisch wirksame Menge, liegt gewöhnlieh bei etwa 1 bis etwa 70 Gew.%, vorzugsweise 5 bis 50 Gew.%, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung.

Es gibt keine spezielle Beschränkung für die Anwendung als Bekämpfungsmittel gegen Nephritis und das therapeutische Mittel kann in der jeweils für das therapeutische Mittel geeigneten Form verabreicht erden. Beispielsweise können Tabletten, Pillen, flüssige Zubereitungen, Suspensionen, Emulsionen, Granulate oder Kapseln oral verabreicht werden. Die injizierbaren Zubereitungen werden intravenös verabreicht und zwar entweder allein oder zusammen mit üblichen Hilfsmitteln, wie Glukose und Aminosäure. Weiterhin können gcwünschtenfalls die therapeutischen Mittel intramuskulär, intracutan, subcutan oder intraperitoneal verabreicht werden. Suppositorien werden intrarektal verabreicht.

Die Dosierung der Nephritis-Behandlungsmittel wird dem Verwendungszweck und den Symptomen und dergleichen angi-pasot.. Im allgemeinen werden die Verbindungen der Erfindung in Mengen von etwa 0,5 bis 20 mg/kg Körpergewicht pro Taq verabreicht.

Die erfindungsgemaesen Verbindungen haben oino A Aktivität und sind wirksam als therapeutische Mit toi für auto immune Krankheiten, Kollagen-Krankheiten und r ho «.-.at lache Krankheiten, bei denen jeweils komplementäre r.yai«-« betroffen sind.

- 62 -

80988A/0S24 _ßAD

282H03

Die Ergebnisse bei pharmakologischen Versuchen mit den erfindungsgemässen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) und deren Salze werden nachfolgend gezeigt.

Geprüfte Verbindungen

Die Verbindungen 1 bis 12 der Erfindung, die nachfolgend gezeigt werden, wurden geprüft. Dabei werden die Verbindungen 1 bis 10 durch die Bezugnahme auf die allgemeine Formel (I) beschrieben, bei denen die verschiedenen Substituenten, wie in Tabelle 1 vorliegen.

ClJ₃ CH₃

worin die Verbindungen der nachstehenden Tabelle 1 die folgenden sind R⁴ = -OH, R⁵ = -H und R⁶ = -OH¹.

809884/0624

- 93 - 282H03

Tabelle

Verbindung
Nr.

-H

-CHO -CHO

-Na

-CHO -COONa

-H

-OH -OH

-H

-CH=C'

,CN

'CN -CH=C

.CN

CN

-H

-CH=C

,CN

COOC₂H₅

-CH=C'

CN

COOC₂K₅

-H

-CH=C;

•C00H -CH=C"

CN

COOH

-H

-CH=CHCOOH -CH=CHCOOH

-H

-CH₂OH -COOH

_| TT

-CH₂OH -CH₂OH

10

-CH-

-CH₂OH -CH₂OH

Die Verbindung Nr. 11 hat die folgende Strukturformel

809884/0624

-OT-

Il

■cn _zoccii₃

ιι
ο

CH₃

Die Verbindung Nr. 12 hat die folgende Strukturformel

HO

809884/0624

282U03

(2) Antikomplementäre Aktivität

Die antikomplementaren Aktivitäten wurden gemessen und bestätigt nach der in der japanisch-sprachigen Veröffentlichung "Meneki Kagaku" (Immuno-chemistry), Yuichi Yamanura et al. S. 830-834, Asakura Shoten, Tokyo, Japan (1973) beschriebenen Methode. Im einzelnen wurde wie folgt gearbeitet: In ein Reagenzglas wurden O,5 ml einer wässrigen Dispersion jeder der zu prüfenden Verbindungen gegeben, 0,5 ml sensitiväerte

Erythrocyten (EA) , enthaltend 1 χ 10 Zellen/ml, 1 ml einer 5-fach verdünnten Lösung eines Veronal-Puffers enthaltend Gelatine, Ca und Mg (GVB ) und 0,5 ml Komplement-Serum, verdünnt auf das 150-fache mit der GVB Verdünnungsflüssigkeit. Die Mischung wurde 60 Minuten bei 37°C gehalten« Dann wurden 5 ml einer eis — kalten physiologischen Kochsalzlösung zugegeben und die Mischung wurde zentrifugiert. Das Absorbanz der überstehenden getrennten Flüssigkeit wurde mit OD₄₁₃ gemessen und das Ausmass, in dem die Versuchsverbindung die Hämolyse der sensitivierten Erythrocyten inhibierte, wurde bestimmt. Die 50 % Hämolyse-Inhibierungsaktivitätszahl (YVmI) die nach der vorerwähnten Methode bestimmt wurde, wird für jede der geprüften Verbindungen, in der nachfolgenden Tabelle 2 angegeben.

(3) Akute Toxizität

Die LD₅₀ Werte (mg/kg) der geprüften Verbindungen bei intravenöser Verabreichung bei Mäusen wurde gemessen und die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 angegeben.

809884/0624

- as -

282H03

Tabelle 2

Verbindung Nr.	Antikomplementärer Aktivitätswert (-f/ml)	LD50 Wert (mg/kg)
1	10	40
2	60	500
3	80	150
4	40	200
5	80	2OO
6	40	250
7	80	150
8	125	-
9	500	-
10	250	-
11	6OO	-
12	450	-
Chlorophyllin	40	—

Therapeutische Wirkung bei nephrotoxinartigsr
Nephritis

Ratten-Nephrotoxin (abgekürzt als "NT")) wurde in der vorher erwähnten Weise erhalten. Rattennierencortex wurde mit einer gleichen Menge physiologischer Kochsalzlösung homogenisiert. Die homogenisierte Mischung wurde mit Freund's Complete
Adjuvants (ein Produkt der Difco Company) im Volumenverhältnis von 1:1 vermischt. Zwei ml der entstandenen Mischung

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282H03

wurden intramuskulär einem Kaninchen (Körpergewicht 3100 g) zur Immunisierung verabreicht. Nach 1 1/2 Monaten wurde Blut aus dem Herz des Kaninchens entnommen und das Serum wurde gewonnen. Das erhaltene Serum wurde 30 Minuten bei 56 C inaktiviert, dann mit einer 40 %-igen wässrigen Lösung von Ammoniumsulfat ausgesalzen und fraktioniert. Die ^-Globulin (IgG) Fraktion wurde zur Bestimmung von NT gesammelt.

Die Bewertung erfolgte unter Verwendung von männlichen Wister-Ratten mit einem Körpergewicht von 150 bis 160 g, wobei jede Prüfverbindung 3 mal eingesetzt wurde. Die Prüfverbindung wurde intraperitoneal verabreicht und zwar 1 mal alle 24 Stunden während 7 Tagen. Eine stunde nach der Verabreichung der Prüfverbindung am dritten Tag wurde die NT verabreicht. NT wurde intravenös injiziert in einer Menge von 1 ml in die Schwanzvene. Chlorophyllin (CP) wurde als Vergleichsverbindung verwendet und eine physiologische Kochsalzlösung wurde als Kontrolle verwendet.

Die Proteinharnstoffmenge (Gesamtmenge die innerhalb 24 Stunden mit dem Urin ausgeschieden wurde) wurde gemessen nach der Trübungsmethode unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Kontrolle mittels Sulfosalicylsäure. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 3 angezeigt.

809804/0624

- ββ -

282U03

Tabelle 3

Verbindung Nr.	Dosierung (mg/Ratte)	Wieder holungen	Anzahl der	1	4	Tage	10
Verbindung Nr. 1	3	1 2	2,5* 4,3	1,5 ' 2,1	7	8 10
		3	1,7	1,1	0,8 1,8	7
		Durch schnitt	2,8	1,6	0,9	8
Verbindung Nr. 2	5	r- CN	2,7 4,1	1,8 2,0	1,2	9 12
		3	2,3	1,3	0,7 1,5	7
		Durch schnitt	3,0	1,7	1,2	9
Verbindung Nr. 6		1	2,1	1,9	1,1	13
	5	2	1,5	1,2	0,8	7
		3	3,7	2,3	0,9	9
		Durch schnitt	2,5	1,8	1,4	10
Chlorophyll! (Vergleich)	.n 5	1 2	2,4 4,4	1,5 2,6	1,0	9 8
		3	3,2	2,1	0,9 1,7	6
		Durch schnitt	3,4	2,1	3,5	8
...	-	1	13	16	2,0	29
		2	19	23	21	35
(Kontrolle)		3	11	18	25	40
		Durch schnitt	14	19	24	35
23

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2S2H03

# Die Zahl der Tage in Tabelle 3 wird berechnet von der Zeit der Verabreichung der geprüften Verbindung, was eine Stunde vor der Anwendung von NT erfolgte.

** Die Menge an Proteinharnstoff wird in Einheiten von mg/Tag angegeben.

Die Proteinharnstoffmenge bei einer gesunden Ratte beträgt 0,5 bis 5 mg/Tag. Übersteigt die Proteinharnstoffmenge diesen Bereich, insbesondere wenn die Proteinharnstoffmenge mehr als 10 mg/Tag beträgt, kann man mit Sicherheit sagen, dass eine Nephritis vorliegt. Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 3 ersichtlich wird, lag Nephritis bei den Kontrolltieren vor, während im Fall der Verbindungen der vorliegenden Erfindung und CP die Menge an Proteinharnstoff von der Zeit der Verabreichung von NT bis 10 Tage nach der Verabreichung im wesentlichen die gleiche ist, wie bei gesunden Ratten. Somit ist ersichtlich, dass bei Verabreichung der erfindungsgemässen Verbindungen primäre und sekundäre Reaktionen inhibiert werden.

Wird der gleiche Versuch mit den Verbindungen Nr. 3 bis 5 uncl 7 bis 12 gemäss der Erfindung durchgeführt, so stellt man in allen Fällen fest, dass die primäre Reaktion einer nephrotoxin-artigen Nephritis inhibiert wird.

(5) Therapeutische Wirkung bei Heymann-artiger Nephritis

Xn diesem Versuch wurden männliche Wistar-Ratten mit einem Körpergewicht von 180 bis 200 g verwendet. Die Hattenniere

£09884/0624

™- 282U03

wurde extrahiert und mit einer gleichen Volumenmenge einer physiologischen Kochsalzlösung homogenisiert. Das Homogenisat wurde mit einer Schwerkraft von 1500 G 1 Stunde zentrifu- · giert. Die überstehende Flüssigkeit wurde nach dem Verfahren von T. S. Edgington et al, Journal of Experimental Medicins, 127, 555 (1968) gereinigt und mit Freund¹s-Complete-Adjuvant 37 Ra (ein Produkt der Difco Company) in einem Volumenverhältnis von 0,4 : 1 vermischt. Die erhaltene Mischung wurde intraperitoneal isologen Ratten in einer Menge von 0,5 ml/Ratte injiziert. Anschliessend wurde die gleiche Menge des Adjuvants alle 2 Wochen verabreicht, bis die Proteinharnstoffmenge 10ü mg/Tag überstieg. (Diese Zeit beträgt etwa 6 bis δ Wochen.)

Jede der in der Tabelle 4 gezeigten Prüfverbindungen wurde an die Ratten verabreicht, die mit Nephritis vom Heymann-Typ befallen waren und die ein Körpergewicht von 300 bis 3 5Og hatten ,wurden die Verabreichung 1 mal täglich während 7 Tagen vorgenommen wurde und die Menge an Proteinharnstoff (mg/Tag) wurde in gleicher Weise wie vorher angegeben gemessen, CP wird als Vergleichsverbindung verwendet und die physiologische Kochsalzlösung wurde als Kontrolle verwendet. Es wurden 3 Wiederholungen für jede Prüfverbindung durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 4 gezeigt.

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- ΤΛ -

232H03

Tabelle 4

Verbin dung Nr.	Dosie rung (mg/ Ratte)	Wieder holun gen	Anzahl	vor der Verab reichung	1	der Tage	7	14	21
Verbin		1	95	90	4	17	9	10
dung Nr. 1	3	2	132	125	47	35	15	12
		3	121	120	65	27	10	9
		Durch schnitt	116	111	70	26	11	10
Verbin dung Nr. 2	5	1 2	117 132	109 127	61	23 41	13 17	U) vo
		3	105	114	59 67	25	11	12
		Durch schnitt	118	117	51	30	14	11
Verbin		1	98	113	59	36	18	S
dung Nr. 6	5	2	127	121	48	47	21	15
		3	139	116	63	29	13	14
		Durch schnitt	121	116	57	37	17	12
Chloro phyll in (Ver gleich)	5	1 2 3 Durch schnitt	123 117 129 123	116 108 121 115	56	32 29 22 28	16 12 15 14	10 8 13 10
-		1	135	127	72 63 52 62	135	114	126
(Kon trolle)	—	2 3	121 137	105 117	132	103 121	105 109	109 132
		Durch schnitt	131	116	121 135	119	109	122
129

80988A/0624

" ⁿ ~ 2-82HQ3

Zwei oder drei Wochen nach Beginn der Prüfung hatte sich das Körpergewicht der Ratten auf 400 bis 500 g erhöht und die normalen Proteinharnstoffmengen betrugen etwa 5 bis 15 mg/Tag. Wie aus den Ergebnissen der Tabelle 4 ersichtlich wird, können die Verbindungen gemäss der Erfindung eine Nephritis vom Heymann-Typ heilen.

Wird der gleiche Versuch durchgeführt mit den Verbindungen Nr. 3 bis 5 und 7 bis 12 gemäss der Erfindung, stellt man fest, dass sie im wesentlichen die gleiche Aktivität haben bei der Heilung von einer Nephritis vom Heymann-Typ.

IV. BEISPIELE

Zur besseren Beschreibung der vorliegenden Erfindung wird die Herstellung der Verbindungen gemäss der Erfindung der allgemeinen Formel (I) in den nachfolgenden Beispielen näher erläutert. In den Referenzbeispielen erfolgt die Erläuterung der Herstellung von die erfindungsgemässen Verbindungen enthaltenden Mitteln zur Bekämpfung von Nephritis.

Wenn nicht anders angegeben sind alle Teile, Prozentsätze und Verhältnisse auf das Gewicht bezogen; die hierin verwendete Raumtemperatur liegt bei etwa 15 bis 25 C.

Beispiel 1

In einen 500 ml Sakaguchi-Kolben wurden 100 ml eines

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2-S2U03

Kulturmediums folgender Zusammensetzung vorgelegt und Stachy botrys sp. K-76 wurde bei 28°C um
Tagen unter Schütteln kultiviert.

botrys sp. K-76 wurde bei 28°C und einem pH von 6 während 4

Glyzerin	0,5
Stärke	1,0
Lactose	0,2
Soj abohnenpulver	0,5
Hefeextrakt	0,1
Mazextrakt	0,2
CaCO3	0,3
MgSO4	0,05

In einen 30-Liter-Giasfermentator wurden 20 1 eines Kulturmediums der obigen Formulierung gegeben und ein Kolben der erhaltenen Saatkultur wurde in dem Kulturmedium bei 28°C während 5 Tagen unter Rühren mit 300 Upm an der Luft kultiviert, wobei die Umlaufgeschwindigkeit 1 1/5 1 des Kulturmediums pro Minute betrug. Die erhaltene Kulturbrühe wurde mit einer Geschwindigkeit von 8000 Upm zentrifugiert zur Entfernung der Mikrobenzellen. Zu der überstehenden Flüssigkeit wurden 5 1 Methanol gegeben und die Mischung wurde gerührt und dann 3 Stunden stehen gelassen. Die Mischung wurde zur Entfernung des Niederschlages zentrifugiert , die gebildeten Feststoffe wurde von der überstehenden Flüssigkeit entfernt und der Rückstand wurde mit einer gleichen Volumemnentie Äth^xrlacetat extrahiert. Das Lösungsmittel wirde aus der Äthylacetatschicht unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde in Methanol gelöst und durch eine Säule mit Aktivkohle geleitet. Das

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Eluat wurde zur Trockene unter vermindertem Druck konzentriert. Die getrocknete Masse wurde in einer Mischung aus Chloroform/ Äthylacetat (1:1 V/V) gelöst und durch eine Säule von Sephadex LH-2O gelfiltriert. Das Filtrat wurde einer Dünnschichtchromatografie unterworfen unter Verwendung einer Mischung aas Äthylacetat, Chloroform und Essigsäure (Volumenverhältnis 50:50:20) als Entwicklungsmittel,und es wurde eine Fraktion mit einer antikomplementären Aktivität entsprechend Rf = 0,34 gesammelt. Als Alternative wurde das Filtrat einer Dünaschichtchromatografie unter Verwendung einer Mischung aus Benzol, Butanol und Essigsäure(im Volumenverhältnis von 60:50:5) als Entwicklungsmittel unterworfen und es wurde eine Fraktion mit einer antikomplementären Aktivität entsprechend einem Rf = 0,58 gesammelt. Beim Verdampfen des Lösungsmittels aus der Fraktion erhielt man 2,0 g 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,-5,6,7,8,8a-decahydronaphthalin-1-spiro-2'-(6',7'-diformyl-4·- hydroxy-2¹,3'-dihydrobenzofuran), eine hellgelbe, schwach-saure Substanz mit einer antikomplementären Aktivität. Die Bildung dieser Verbindung wurde durch Messung der folgenden physikochemischen Eigenschaften bestätigt.

= -48° (C = 2,5, Methanol) (2) Elementaranalyse für C_o-jH-._n0_c

Berechnet %:	68	,64	H	7	,51
Gefunden %:	68	,58		7	,55
: C

(3) Ultraviolettes Absorptionsspektrum (UV-Analyse) -x Äthanol _{= 246 nm (e = 16474)}

= 307 nm (£ = 6659)

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282U03

(4) Kernmagnetisches ResonanzSpektrum (NMR):

Die NMR-Analyse wurde unter Verwendung von Pyridin-d₅ /Natrium-2,2-dimethyl-2-silapentan-5-sulfonat/ (DSS) als Lösungsmittel durchgeführt. Das so erhaltene kernmagnetische Spektrum wird in Fig. 5 gezeigt. Die Bedingungen zum Messen des NMR-Spektrums waren die folgenden:

Spektralamplitude: 4 χ 100

Filter 0,1 sek.

RF-Output: 0,05 mG

Abtastzeit: 5 min.

Abtastbreite: 10 ppm

Abtastende: 0 ppm

Beispiel 2

In einen 500 ml Sakaguchi-Kolben wurden 100 ml eines Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung vorgelegt und Stachybotrys chartarum IFO 5369, ein bekannter Stamm, wurde in 4 Tagen bei einem pH von 6 unter Schütteln bei 28°C kultiviert.

Glyzerin	0,5
Stärke	1,0
Lactose	0,2
Soj abohnenpulver	0,5

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Hefeextrakt 0,1

Malzextrakt 0,1

CaCO₃ 0,3

MgSO₄ 0,05

In einen 30-Liter-Glasfermentator wurden 20 1 eines Kulturmediums der obigen Zusammensetzung gegeben und 2 Kolben der entstandenen Saatkultur wurden bei 28°C während 5 Tagen unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 300 Upm mit einer '■ Luftzirkulationsmenge von 11/11 des Mediums pro Minute kultiviert. Die erhaltene Kulturbrühe wurde mit einer Geschwindigkeit von 8000 Upm zur Entfernung der Mikrobenzellen zentrifugiert. Zu der überstehenden Flüssigkeit wurden 5 1 Methanol gegeben und die Mischung wurde gerührt und 3 Stunden stehen gelassen. Die Mischung wurde zur Entfernung des Niederschlages zentrifugiert , die festen Bestandteile wurden entfernt und die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt. o_er Rückstand wurde mit einer gleichen Volumentmenge Äthylacetat extrahiert. Das Lösungsmittel aus der Äthylacetatschicht wurde unter vermindertem Druck entfernt und das Produkt zur Trockene konzentriert. Der Rückstand wurde in Methanol gelöst und durch eine Säule mit Aktivkohle geschickt. Das Eluat wurde zur Trockene unter vermindertem Druck konzentriert, in einer Mischung aus Chloroform und Äthylacetat (1:1 V/V) gelöst und durch eine Kolonne aus Sephadex LH-20 gelfiltriert. Es wurden Fraktionen mit aktivenPeaks entsprechend den Rf-Werten der in Beispiel 1 beschriebenen Dünnschichtchromatografie gesammelt. Beim Verdampfen des Lösungsmittels erhielt man 2,2 g 2,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-decahydronaphthalin-1-spiro-2'-(6^l,7'-diformyl-4'-hydroxy-2¹,3'-dihydrobenzofuran), einer hellgelben, schwach-sauren Substanz mit antikomplementärer Aktivität. Diese Verbindung hat die gleichen physiko-chemischen

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Eigenschaften wie das Produkt gernäss Beispiel 1 und die Bildung dieser Verbindung wurde aus diesen Eigenschaften bestätigt.

Beispiel 3

Stachybotrys sp. T-789 wurde kultiviert und in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben gereinigt, mit der Ausnahme, dass ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung, eingestellt auf einen pH von 7,5 verwendet wurde, und dass die Kultivierungstemperatur bei 32 C gehalten wurde:

Glyzerin	0,5
Glucose	1,2
Kornmeische	0,5
getrocknete Hefe	0,1
Malzextrakt	0,2
MgSO4	0,05
NaCl	0,3

Auf diese Weise wurde 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-decahydronaphthalin-1-spiro-2'-(6',7'-diformyl-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran) erhalten, eine hellgelbe, schwach-saure Substanz mit antikompleincntäror Aktivität. Die physiko-chemischen Eigenschaften dieser Verbindungen stimmten mit denen der gemäss Beispiel 1 isolierten und gereinigten überein.

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282UQ3

Beispiel 4

Stachybotrys sp. T-791 wurde kultiviert und gereinigt, in glei cher WEise wie in Beispiel 1, mit der Ausnahme, dass ein Kulturmedium der nachfolgenden Zusammensetzung, das auf einen pH von 5,5 eingestellt worden war, verwendet wurde und dass die KuItivierungstemperatur bei 25°C gehalten wurde:

Glyzerin	0,5
Stärke	IfO
Sucrose	0,2
Soj abohnenpulver	0,5
Pepton	0,1
Malzextrakt	0,2
MgSO4	0,3
HCl	0,05

Man erhielt so 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,-5,6,7,88a-decahydronaphthalin-1-spiro-2'-(6',7'-diformyl-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran), eine hellgelbe, schwach-saure Substanz mit antikomplementärer Aktivität. Die physiko-chemischen Eigenschaften dieser Verbindung stimmten mit denen der in Beispiel 1 erhaltenen überein.

Beispiel 5

Silbernitrat (2,1 g) wurden in 1 ml Wasser gelöst und daszu wurden 3,5 ml einer 5,8 m wässrigen Lösung von Natriumhydroxid

8098ΘΛ/0624

gegeben. Die Mischung wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde eine Lösung aus 1,0g 6,7-Dihydroxy-2_/5_/5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-decahydronaphthalin-1-spiro-2'-(6',7'-deformyl-4'-hydroxy-2 ^f,3'-dihydrobenzofuran) hergestellt,gemäss Beispiel 1 und 2 ml Äthanol wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 1,5 Stunden gerührt und der pH wurde mit 2 η Chlorwasserstoff säure auf etwa 2 eingestellt. Das Reaktionsgemisch wurde mit einer gleichen Volumenmenge Äthylacetat extrahiert und das Lösungsmittel in dem Extrakt wurde unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wurde durch Kieselgelchromatografie (Kieselgel "Wako C-200", ein Produkt der Wako Junyaku Kabushiki Kaisha; unter Verwendung von Chloroform/Äthylacetat/ Essigsäure (100:50:2 auf das Volumen bezugen) als Eluiermittel) gereinigt. Es wurde eine Fraktion entsprechend einem Rf = 0,37 durch Dünnschichtchromatografie (unter Verwendung einer Mischung von Äthylacetat, Chloroform und Essigsäure im Volumenverhältnis von 50:50:2 als Entwicklungslösungsmittel) bzw. einer Fraktion entsprechend einem Rf = 0,71 durch Dünnschichtchromatografie (unter Verwendung einer Mischung von Benzol, Butanol und Essigsäure im Volumenverhältnis von 60:15:5 als Entwicklungsmittel) gesammelt. Beim Verdampfen des Lösungsmittels aus der Fraktion erhielt man 700 mg 4 ,6-Dihydroxy-8-oxo-2 ,3 .. 6, S-tetrahydrofuro^S ^-gy-benzofuran^-spiro-i '-(6*,7'-dihydroxy-2',5',5',8'atetr?.methyl-1 ' _f2',3',4',4'8,5',6',7',B' ,8 ' a-decahydronaphthalin) als hellgelbe amorphe Kristalle. Das Produkt hatte die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften und die Bildung dieser Verbindung wurde durch diese Eigenschaften bestätigt.

(1) Z^.7n° ⁼ -⁴⁴/8° (^c = °/⁹ Methanol)

809884/0624

282H03

Elemetaranalyse für

Berechnet %:	C	66	,03	H	7	,18
Gefunden %:		65	,93		7	,21

(3) Kernmagnetisches Resonanzspektrum:

(i) Die NMR-Analyse wurde unter Verwendung von
CD₃OD (DSS) als Lösungsmittel durchgeführt und
das erhaltene MRC-Spektrum wird in Fig. 6 gezeigt.

(ii) Die NMR-Analyse wurde durchgeführt unter
Verwendung von Pyridin-dg (DSS) als Lösungsmittel und das entsprechende NMR-Spektrum wird in Fig. 7 gezeigt.

(iii) Es wurde Dimethylsulfoxid-dg als Lösungsmittel verwendet und die NMR-Analyse wurde 2 Stunden und 63 Stunden nach dem Auflösen durchgeführt. Das erhaltene NMR-Spektrum wird in Fig. 8 gezeigt (die NMR-Spektren, die nach 2 Stunden nach Auflösung bzw. 63 Stunden nach Auflösung erhalten worden waren, stimmten miteinander überein).

Die Messbedingungen zum Erhalten dieser NMR-Spektren waren
die folgenden:

Fig. 6

Fig. 7

Fig. 8

Spektralamplitude	9 χ 100	5 χ 100	8 χ 100
Filter	0,1 sek	0,1 sek	0,1 sek
RF-Output	0,05 mG	0,05 mG	0,05 mG
Abtastzeit	5 min	5 min	5 min
Abtastbreite	10 ppm	10 ppm	10 ppm
Abtastende	0 ppm	0 PE*»	0 PPm

809884/0624

282U03

Beispiel 6

Silberoxid (0,65 g) wurden in einer 1 η wässrigen Lösung von Natriumhydroxid suspendiert und unter Rühren bei Raumtemperatur wurde 1,0 g 6 ,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1 ,2 ,3 ,4 ,4 a,-5,6,7,8,ea-decahydronaphthalin-1-spiro-2'-(6',7'-diformyl-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran) zugegeben. Die Mischung wurde bei der gleichen Temperatur 1 Stunde gerührt und der Niederschlag wurde 5 mal mit je 10 ml Wasser gewaschen. Die Waschwässer und das Filtrat wurden kombiniert und dazu wurde konzentrierte Salzsäure (36%-ig)gegeben bis zur Einstellung des pH-Wertes auf etwa 2 bis 3 und anschliessend wurde auf 0 bis 1OC gekühlt. Die ausgefallenen Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt, mit 10 ml Eiswasser 5 mal gewaschen und getrocknet. Die getrockneten pulverförmigen Kristalle wurden in 50 ml Äthylacetat gelöst und unlösliche Substanz wurde durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat wurde auf ein Volumen von 5 ml unter vermindertem Druck konzentriert. Zu der konzentrierten Lösung wurden 50 ml Ligroin gegeben und die Mischung wurde gerührt und auf 0 bis 10°C abkühlen gelassen. Die ausgefallenen Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt, 2 mal mit 20 ml Ligroin gewaschen und getrocknet, wobei man 1,01 g 4,6-Dihydroxy-8-oxo-2,3,6,8-tetrahydro-furo/3 ,4~27~benzof uran-2-spiro-1 '-(6¹^¹ -dihydroxy-2¹ ,5',O¹ ,S'a-tetramethyl-T^¹ ,3 ' ,4 ' ,4a¹ ,5 · ,6 ' ,7 ' ,8 · ,8 "adecahydronaphthalin) erhielt. Die physiko-chemischen Eigenschaften der erhaltenen Verbindung stimmten mit denen der in Beispiel 5 erhaltenen Verbindung überein.

Beispiel 7

1,0 g 6_/7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-

- 82 -

809884/0624

- 82 -

282U03

decahydronaphthalin-1-spiro-2'-(6'.7'-diformyl-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran) wurden in 50 ml einer 10 %-igen wässrigen Lösung von Natriumhydroxid gelöst und unter Einblasen. von 50⁰C wärme Luft in die Lösung wurde diese 30 Minuten lang gerührt. Die Lösung wurde mit Chlorwasserstoffsäure auf einen pH von etwa 2 bis 3 angesäuert und die ausgefallenen Kristalle wurde durch Filtrieren gesammelt. Die Kristalle wurden mit 10 ml kaltem Wasser 5 mal gewaschen und getrocknet. Die Kristalle wurde in 5O ml Äthylacetat gelöst und unlösliche Substanz wurde durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat wurde mit Aktivkohle behandelt und unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 5 ml konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurda zu 50 ml Ligroin unter kräftigem Rühren gegeben. Die ausgefallenen Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt, und Ligroin gewaschen und getrocknet, wobei man 0,72 g 4,6-Dihydroxy-8-OXO-2,3,6,8-tetrahydro-furo/3 ,4-gy-benzohydrofuran-2-spiro-1'-(β¹,7'-dihydroxy-2',5',5',8'a-tetramethyl-1',2',3',4',4'a,-5',6',7',8',S¹a-decahydronaphthalin) erhielt. Die physikochemischen Eigenschaften der erhaltenen Verbindung stimmten mit der ders Beispiels 5 überein.

Beispiel 8

1,0 g 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1-spiro-2'-(6',7'-diformyl-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran) wurden in 25 ml einer 1 η wässrigen Lösung von Kaliumhydroxid gelöst und dazu wurdai portionsweise unter Rühren 50 ml einer wässrigen Lösung aus 0,578 g Kaliumpermanganat gegeben. Nachdem die Farbe des Permanganats verschwand, wurde mit Rühren aufgehört. Der Niederschlag wurde durch

609884/0624

2-82U03

Filtrieren unter Verwendung von Celite als Filterhilfe abgetrennt. Das Filtrat wurde mit Chlorwasserstoffsäure auf einen pH von etwa 2 bis 3 angesäuert. Die ausgefallenen Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt, mit 10 ml Wasser 3 mal gewaschen und dann getrocknet. Die getrockneten Kristalle wurden in 30 ml Äthylacetat gelöst. Unlösliche Substanz wurde durch Filtrieren entfernt und das Filtrat wurde unter Verwendung von Aktivkohle entfärbt und unter vermindertem Druck konzentriert. Zu der konzentrierten Lösung wurden 50 ml Ligroin gegeben und die Mischung wurde gerührt. Die ausgefallenen Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt, mit Ligroin gewaschen und bei 60⁰C unter vermindertem Druck getrocknet, wobei man 0,9 g 4,6-Dihydroxy-8-oxo-2,3,6,8-tetrahydro-furo^3,4-g7" benzofuran-2-spiro-1'-(6¹,7'-dihydroxy-2',5',5',8'a-tetramethyl-1 · ,2' ,3",4" ,4'a,5',6',7',8',8'a-decahydronaphthalin) erhielt. Die physiko-chemischen Eigenschaften der erhaltenen Verbindung stimmten mit der Verbindung, die gemäss Beispiel 5 erhalten wurde, überein.

Beispiel 9

Zu 5 ml einer 0,4 η wässrigen Lösung aus Natriumhydroxid und 5 ml Äthanol wurden 418 rag 4,6-Dihydroxy-8-oxo-2,3,6,8-tetrahydrofuro/3,4-2?-t>enzofuran-2-spiro-1 '-(6¹ ,7'-dihydroxy-2' ,5' ,5' ,8'atetramethyl-1',2',3',4',4'3,5',6',7',S',8'a-decahydronaphthalin) gegeben. Die Mischung wurde in einem Stickstoffstrom 30 Minuten bei 30 bis 40°C gerührt. Nach der Umsetzung wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde getrocknet und es wurden 10 ml Aceton zugegeben. Der

- 84 -

809884/0624

J«

2*21403

acetonlösliche Teil wurde durch Filtrieren entfernt. Die entstandenen rohen Kristalle wurden aus Wasser/Aceton durch portionsweise Zugabe von Aceton zu einer wässrigen Lösung umkristallisiert, bis Kristalle ausgefällt wurden, wobei man 342 mg des Dinatriumsalzes von 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8atetramethy1-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,ea-decahydronaphthalin-ispiro-2 '- (7 '-carboxylat-6 '-formyl-4 '-oxid-2 ' ,3 '-dihydroben/'.ofuran) als hellgelbe, amorphe Kristalle erhielt. Die erhaltene Verbindung hatte die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften und die Bildung dieser Verbindung wurde durch diese Eigenschaften bestätigt.

(2) Elementaranalyse für C₇JL

Berechnet %:	C	59	,74	H	6,	10
Gefunden Z:		59	,48		5,	91

(3) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (UV-Analyse)

λ, ^H2° --= 252 nm (£ = 20500)
max

= 330 nm (ί = 45900)

(4) Kernmagnetisches Resonanzspektrum (NMR-Analyse): Die NMR-Analyse wurde unter Verwendung von D₂O (DSS) als Lösungsmittel durchgeführt. Das erhaltene NfIR-Spektrum wird in Fig. 9 gezeigt. Die Testbedingungen für da:; NilR-Spektrum waren die folgenden:

Spektral amplitude: 9 χ 1ΟΟ

Filter: 0,1 sek

RF-OuI put: O,O5 mG

Abi a:;f :-l i t : 5 min

Abt a:;! brei te: 1O ppm

Abt .KSt(Mi(Ie: 0 ppm

8 0 9 8 8 4/0624

- 85 -

1 .: 14

Beispiel 10

418 mg 4,6-Dihydroxy-8-oxo-2,3,6,8-tetrahydro-furo/3,4-g7~ benzofuran-2-spiro-i'-(6¹,7'-dihydroxy-2',5',5",8'a-tetramethyL-1 ',2',3',4^f,4'a,5·,6',7',8',8'a-decahydronaphthaLin) wurden in 10 ml Äthylacetat gelöst und unter Mischen v/urden 0,33 mol einer 6 η wässrigen Lösung aus Natriumhydroxid hinzugegeben. Die Mischung wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur in einem Stickstoffstrom gerührt. Die ausgefallenen Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt, mit 10 ml Äthylacetat 3 mal gewaschen und getrocknet, wobei man 390 mg des Dinatriumsalzes von 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronapthalin-1-spiro-2'-(7'-carboxylat-6'-formyl-4'-oxid-2',3'-dihydrobenzofuran) als hellgelbe, amorphe Kristalle erhielt. Die physiko-chemischen Eigenschaften der entstandenen Verbindungen stimmten mit denen des Beispiels 9 überein.

Beispiel 11

4,02 g 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2 ,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-i-spiro-2'-(6',7'-diformyl-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran) wurden in einer 1 η wässrigen Lösung von Natriumhydroxid gelöst und dazu v/urden 14,2 g einer 3 2-igen wässrigen Lösung von Wasserstoffperoxid gegeben. Die Mischung wurde 18 Stunden bei 50°C gerührt. Dann wurde Essigsäure zum

des pH—Viertes der Losung aui. 3 bis ι zugegeben, ausgefallenen Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet.

^809884/0624

- 86 -

Die rohen Kristalle wurden chromatografiert über einer mit Kieselgel gefüllten Säule unter Verwendung einer Mischung aus Chloroform und Methanol (mit einem Volumenverhältnis von 9:1) als Eluiermittel. Das letzte Eluat wurde gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockene konzentriert. Zu dem Rückstand wurde Wasser gegeben und die erhaltenen Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und anschliessend wurde mit V/asser gewaschen und getrocknet. Man erhielt so O₇SO g G,7-Dihydroxy-2,5,5_/8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydrunaphthalin-1-spiro-2'-(4',6',7'-trihydroxy-2',3'-dihydroLuniiofuran) als braunes amorphe Kristalle. Diese Verbindung zersetzt sich allmählich bei der Bestimmung des Schmelzpunktes bei 250 C. Die physiko-chemischen Eigenscharten des entstandenen Produktes sind die folgenden und die Bildung dieser Verbindung wurde durch diese Eigenschaften bestätigt:

(1) Schmelzpunkt: Zersetzt sich allmählich bei etwa 250 C und zeigt keinen definitiven Schmelzpunkt.

(2) Elementaranalyse für C^₁H₃₀Og

Berechnet
Gefunden

(3) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (UV-Analyse)

λ Methanol „_in . _{c on}~n\ A_max = 219 nm (t= 8700)

= 260 nm (£ = 2300)

(4) Infrarotabsorptionsspektrum (IR-Analyse):

Auf KBr-Tabletten zeigte das Produkt die folgenden

%: C	66	,64	H	7	,99
%:	66	,43		8	,13

609884/0624

- atf -

2-2U03

3450 (s). 2980 (s), 2980 (sh), 1640 (m), 1480 (m), 1400 (W), 1330 (w), 1260 (w), 1220 (w), 1140 (w), 1120 (w), 1060 (w), 1O2O (w), 1010 (w), 910 (w), 890 (w), 760 (w),

(s bedeutet eine starke Absorption, m eine mittlere Absorption, w eine schwache Absorption und sh eine Schulter).

Diese Abkürzungen werden auch nachfolgend gebracht.

Beispiel 12

2.01 g 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a--tetramethyl-1 ,2,3,4 ,4 a-5 ,G ,7 ,3 , Sadecahydronaphthalin-i-spiro-2^l-(6',7'-diformyl-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran) wurden in 50 ml Äthanol gelöst und dazu wurden 1,45 g Malonitril und ein Tropfen Piperidin als Katalysator gegeben. Die Mischung wurde 30 Minuten bei 5O C gerührt. Nach der Umsetzung wurde die Reaktionsmi :;chutiq unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 10 ml konzentriert und abkühlen gelassen. Die ausgefal1enen Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und mit eiskaltem Äthanol gewaschen (etwa 2 bis 5 C). Die erhaltenen rohen Kristalle wurden in 50 ml einer 1 η wässrigen Lösung aus Natriumhydroxid gelöst und mit Aktivkohle behandelt. Unter Eiskühlung wurde Chlorwasserstoff fsäure zugegeben, um die Lösung anzusäuern (pH 2 bis 3) . Die ausgefallenen Kristalle wurden durch Filti-ieren gesammelt, gründlich mit Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhielt so

.,02 g 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-totramethyl-1, 2 , 3 , 4 , 4a , 5 , G , 7 , 8 , Oadecahydronaphthal n-1-spiro-2'-/G¹,7'-di-(2,2-dicyanoviny])-4'-hydroxy-2', 3 '-dihydrobenzof uran/ als go Ibt? amorphe Kristalle.

809884/0624

-OT-

2-S2K03

Diese Verbindung zeigte die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften:

(1) Schmelzpunkt: Zersetzt sich allmählich bei 23O°C und zeigt keinen definitiven Schmelzpunkt.

(2) Elementar analyse für C-gll-^O-N .

Berechnet 1:	C 69	,86	H	6	,07	N	11	,24
Gefunden %:	69	,58		6	,32		11	,09

(3) Infrarot-Absorptionsspektrum unter Verwendung der KBr-Tablettenmethode: Das Produkt zeigte die folgenden ^_max(cm ) :

3450 (s), 2980 (s), 2900 (sh), 2210 (s), 1720 (w), 1660 (sh), 164O (s), 1580 (sh), 1520 (w), 1470 (m), 1400 (m), 1380 (m), 1360 (m), 1340 (m), 1260 (m), 1200 (w), 111O (w), 1050 (m), 1020 (w), 1000 (w), 98O (w), 960 (w), 940 (w), 900 (w), 840 (w), 760 (w)

Beispiel 13

2,01 g 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphLiial in-1-spiro-2 ' - ( 6 ' ,7 '-diformyl-4 '-hydroxy-2' , 3 ' -dihydrobenzof uran) wurden in 5O ml Äthanol gelöst und dazu wurden ' r\L Mth'-lciinoacetiit cjecoben.. Dszu '/.'urden 3 Tro^r^fon Piperidin air; Katalysator gegeben und die Mischung wurde 2 Stunden bei (>>'/V ;<»rührt. Nach der Umsetzung wurde die Reaktionsmischung zur Trockene unter vermindertan Druck konzentriert. Der

B0988W0624

2-2H03

Rückstand wurde mit einer geringen Menge verdünnter Chlorwasserstoff säure (1 n) gewaschen, dann mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei man rohe Kristalle erhielt. Die rohen Kristalle wurden in 50 ml einer Mischung aus Methanol und Wasser (1:1 V/V) gelöst und mit Aktivkohle behandelt. Dazu wurde eine gleiche Volumenmenge Wasser zum Ausfällen der Kristalle gegeben. Die Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhielt so 1,89 g 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1 -spiro-2 ' -ß>' , 7 ' -di- (2-cyano-2-ät:hoxycarbonylvinyl)-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran/ als helle amorphe Kristalle. Die Bildung der Kristalle wurde durch die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften bestätigt.

(1) Schmelzpunkt: 161,0 bis 167,0°C

(2) Elementaranalyse für C-.-.H. 0_RN_

Berechnet %:	C	66	,87	H	6	,80	N	4	,73
Gefunden ο:		66	,63		7	,02		4	,51

(3) Infrarot-AbsorptLonsspektrum (IR-Analyse) auf KBr-Tabletten: Das Produkt zeigte die folgenden

3450 (s), 2970 (sh), 2950 (m) , 29OO (sh) , 22-1Ο (w) , 1740 (s) , 1630 (s), 1470 (s), 1460 (r.h), MOO (w) , 1300 (w), 1250 (s), 1100 (m) , 1050 (in), U)JO (m) , 1020 (sh), 970 (W). 950 (sh), 940 (w), 900 (sh), 890 (w), 860 (w) .

0 ü 9 8 8 U I ü 6 2 4

- 80 -

2^:ϊ21403

Beispiel 14

3,00 mg 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1 -spiro-2 ' - (6 ' ,7 '-dif ormyl-4 ' -hydroxy-2 ' , 3 '-dihydrobenzofuran) wurden in 20 ml Piperidin gelöst und dazu wurden H),O g Cyanoess igiiäure und 1 Tropfen Piperidin als Katalysator gegeben. Die Mischung wurde 5 Stunden bei 50⁰C gerührt. Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgeiniscn zur Trockene konzentriert. 50 ml Wasser wurden zu dem Rückstand gegeben, wobei man einen kristallinen Rückstand erhielt. Die Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt mit Hasser gewaschen, dann mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure (1 n) und dann wiederum mit Wasser gewaschen. Die rohen Kristalle wurden in 100 ml einer 10 %-igen wässrigen Lösung von Natriumbicarbonat gelüüt. Unlösliche Substanz wurde durch Filtrieren abgetrennt und deis Filtrat wurde mit Chlorwasserstoff säure unter Eiskühlung angesäuert: (pH 2 bin 3). Die ausgefallenen Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei man 1,1 g 6,7~Dihydroxy-2,5,5,Ba-tetramcthyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-decahydronaphthalin-1-spiro-2'-/6' ,7 ' di-(2-cyar.o-2-carboxyr.iethy L ) -··! ' -hydroxy-2 ' , 3 ' -dihydrobonzofurai}7 al;; hellgelbe amorphe Kristalle erhielt. Die ßildung dieser Verbindung wurde durch die folgenden physiko-chemischen Eigenschaf ten bestätigt:

(1) Schmelzpunkt: 217 bis 223°C

(2) /ok/-²⁰ = 23,2° (C = 0,8, Methanol)

(3) KLementaranalyse für C„„H-.₂N₂Og

Berechnet έ: C 61,91 H 6,01 N 5,22 Gefunden I: 64,63 6,25 5,01

8 09884/0624

- 91 -

2-.2H03

(4) IR-Analyse auf KBr-Tabletten:

_ -1

Das Produkt zeigte die folqenden A- (cm ) : ^a ^ max

3450 (s), 2950 (m), 2870 (sh), 2240 (w), 1710 (s),

1660 (m), 1610 (s), 1580 (m), 1460 (m), 1440 (m),

1400 (m), 1300 (m) , 1250 (m) , 1200 (sh) , 1120 (w) ,

1100 (w), 1040 (w) 880 (w)«

Beispiel 15

1,0 g 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1, 2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1-spiro-2'-(6',7'-diformyl-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran) wurden in 10 ml Pyridin und 1,Og Malonsäure gelöst und dazu wurden 3 Tropfen Piperidin als Katalysator gegeben. Die Mischung wurde 4 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Nach der Umsetzung wurden zum Reaktionsgemisch 200 ml Wasser gegeben und die Mischung wurde auf einen pH von 2 bis 3 angesäuert mit Chlorwasserstoffsäure und abkühlen gelassen. Das ausgefallene teerartige Materia] wurde geπamme]t, mit Wasser gewaschen und in 100 ml Methanol gelöst und mit Aktivkohle behandelt und dann unter vermindertem Druck zur Trockene konzentriert. Der Rückstand wurde aus einer Mischung aus Methanol und Wasser (1:1 V/V) umkristallisiert, wobei man 0,58 g 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-i-spiro-2 ' ~/Z '■ ,1' -di- (2-carboxyvinyl) -4 ' hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran/ als hellbraune amorphe Kristalle erhielt. Die Bildung dieser Verbindung wurde durch die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften bestätigt.

(1) Schmelzpunkt: 190 bis 196°C

809884/0624

AOO
- afc -

282U03

(2) Elementaranalyse für ^C27^H34°a

Berechnet %: C 66,65 H 7,O4 Gefunden %: ^_{36 η} ^

(3) IR-Spektrum auf KBr-Tabletten:

Das Produkt zeigte die folgenden A. (cm ):

max

- 3450 (s)_t 2970 (m)_f ⁺239O (sh) , 1690 (s) , 162O (s), 1470 (s), 139O (s), 1350 (m) , 1330 (m), 1290 (w) , 1260 (m) , 1200 (w) , 1120 (w) , 1070 (w) , 1050 (m) , 96O (w), 950 (m). ^ 29 5o (m)

Beispiel 16

1,Og Natriumborhydrid wurden in 20 ml einer 0,1 η wässrigen Lösung von Natriumhydroxid gelöst. Eine Lösung aus 0,9 g 4,6-Dihydroxy-8-oxo-2,3,6,8-tetrahydro-furo/3, 4-gy-benzof uran-2-spiro-1·-(6',7'-dihydroxy-2',5',5^f,8'a-tetramethyl-1',2',-3·,4',4'a,5·,6',7',8",8'a-decahydronaphthalin) in 10ml einer 1 %-igen wässrigen Lösung von Natriumhydroxid wurde zugegeben. Die gemischte Lösung wurde 18 Stunden bei 60⁰C gerührt, mit Eis (etwa 2 bis 5°C) gekühlt und mit Chlorwasserstoffsäure (1 n) angesäuert. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck zur Trockene konzentriert und der Rückstand wurde in 50 ml Äthylacetat gelöst. Die unlöslichen Substanzen wurden durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat wurde mit Wasser, gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Natriumsulfat wurde durch Filtrieren entfernt und der Rückstand wurde unter vermindertem Druck zur Trockene konzentriert. Der Rückstand

809884/0624

AOA

2-82U03

wurde aus 10 ml einer Mischung aus Methanol und Wasser (1:1 V/V) umkristallisiert, wobei man 0,28 g 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8atetramethy1-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-decahydronaphthalin-1-spiro-2'-(7'-carboxy-6'-hydroxymethyl-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran) als farblose amorphe Kristalle erhielt. Die Bildung dieser Verbindung wurde durch die folgenden physikochemischen Eigenschaften bestätigt:

(1) Schmelzpunkt: 212 bis 216°C

(2) Elementaranalyse für ^C ₂3^H32°7

Berechnet %: C 65,71 H 7,62 Gefunden %: 65,74 7,47

(3) IR-Spektrum auf KBr-Tabletten:

Das Produkt zeigte die folgenden 7<- (cm ) :

3450 (s), 2950 (sh), 2920 (m), 2900 (sh), 1740 (s), 1620 (m), 1475 (s) , 1400 (w), 1360 (w), 1340 (m), 1260 (w), 1140 (w), 1O80 (m) , 1050 (w), 1030 (w), 960 (sh), 950 (m), 78O (w).

Beispiel 17

4,02 g 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2 ,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydrcnaphthalin-1-spiro-2'-χ6',7'-diformyl-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran) wurden unter Erhitzen auf etwa 60 bis 70 C in 100 ml Benzol gelöst. Dann wurden 10 ml Diäthylmalonat und als Katalysator 1 Tropfen Pyridin zugegeben» Wasser wurde durch

809884/0624

1*2

-OT-

282H03

azeotrope Destillation entfernt. Die Destillation wurde 4 Stunden durchgeführt und nachdem nahezu die stöchiometrisch theoretische Menge Wasser entfernt war, wurde die Mischung unter vermindertem Druck konzentriert. Das zurückbleibende teerartige Material wurde mit Diäthyläther gewaschen und der ätherunlösliche Anteil wurde durch Filtrieren gesammelt, getrocknet und aus einer Mischung aus Diäthyläther und Wasser (1:2 V/V) umkristallisiert. Man erhielt so 1,32 g 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethy1-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1-spiro-2'-/6',7'-di-(2,2-diäthoxycarbonylvinyl)-4'-hydroxy-2 ', 3 ' -dihydrobenzofuran/ als farblose amorphe Kristalle. Die Bildung dieses Produktes wurde durch die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften bestätigt.

(1) Schmelzpunkt: 138 bis 142°C

(2) Elementaranalyse für C₃₇H₅₀O ₂

Berechnet %:	C	64	,70	H	7	,34
Gefunden %:		64	,43 .		7	,59

(3) IP-Absorptionsspektrum auf KBr-Tabletten:

Das Produkt zeigte die folgenden λ. (cm ):

nicix

3450 (s), 2980 (sh), 2950 (s), 2900 (s), 2880 (sh), 1730 (s), 1680 (m), 1630 (sh), 160Ö (s), 1470 (m), 1440 (m), 1400 (m), 1320 (m), 1250 (s), 1120 (w), 11OO (w), 1080 (w), 1O5O (w), 1020 (w), 970 (w), 950 (w), 890 (w), 760 (m).

Beispiel 18

1#0 g Natriumborhydrid wurden in 50 ml einer 1 η wässrigen.

809884/0624

282UQ3

Lösung von Natriumhydroxid gelöst und bei Raumtemperatur wurde dazu eine Lösung aus 4,02 g 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8atetramethy1-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-decahydronaphthalin-1-spiro-2·-(6',7'-diformyl-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran) in 20 ml einer 1 η wässrigenLösung von Natriumhydroxid gegeben. Die gemischte Lösung wurde 3 Stunden gerührt. Nach der Umsetzung wurde die Reaktionsmischung angesäuert mit Chlorwasserstoff säure (auf einen pH von 2 bis 3) unter Eiskühlung (etwa 2 bis 5°C). Die ausgefallenen Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Die rohen Kristalle wurden aus 50 ml einer Mischung aus Methanol und Wasser (1:5 V/V) umkristallisiert, wobei man 2,51 g 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalain-1-spiro-2¹-(6',7'-dihydroxymethyl-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran) als hellbraune amorphe Kristalle erhielt. Die Bildung dieser Verbindung wurde durch die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften bestätigt.

etwa 270 C und zeigte keinen definitiven Schmelz-

(1) Schmelzpunkt: zersetzte sich allmählich bei etwa 2

punkt.

(2) Elementaranalyse für ^

Berechnet %:	C	67,	95	H	8	/43
Gefunden %:		67,	71		8	,66

(3) IR-Absorptionsspektrum auf KBr-Tabletten: Das Produkt zeigte die folgenden Tv. (cm ):

max

3450 (s), 2920 (m), 2880 (m), 162Ο (m), 1600 (sh),

1440 (m), 1390 (w), 1320 (w), 1260 (m), 1200 (w),

" 1100 (m), 1040 (w), 1000 (w), 980 (w), 940 (w), 830 (w) .

809884/0624

282KQ3

Beispiel 19

1,00 g 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1-spiro-2'-(6',7'-dihydroxymethyl-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran) wurden in 50 ml Methanol gelöst. Zu der Lösung wurden tropfenweise 20 ml einer frisch zubereiteten diäthylätherischen Lösung, die 1,0 g Diazomethan erhielt durch einen Trofptrichter bei Raumtemperatur zugegeben. Die Mischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann mit Eis gekühlt (etwa 2 bis 5 C). In die Mischung wurde zur Zersetzung des überschüssigen Diazomethans Chlorwasserstoff eingeblasen. Dann wurden 100 ml Wasser zugegeben und die Mischung wurde unter vermindertem Druck zur Trockene konzentriert. Zum Rückstand wurden 10 ml einer 0,1 η wässrigen Lösung von Natriumhydroxid gegeben und der unlösliche Teil wurde durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhielt so 0,87 g 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1-spiro-2¹-(6',7'-dihydroxymethyl-4'-methoxy-2¹,3'-dihydrobenzofuran) als farblose amorphe Kristalle. Die Bildung dieses Produktes wurde durch die folgenden physikochemischen Eigenschaften bestätigt.

(1) Schmelzpunkt: 107 bis 115°C

(2) Elementaranalyse für ^C24^H36°6

Berechnet %: C 68,54 H 8,63 Gefunden %: 68,31 8,90

(3) IR-AbsorptionsSpektrum auf KBr-Tabletten:

max

Das Produkt zeigte die folgenden Λ- (cm ):

- 97 -

809884/0624

AOS

3320 (s), 2920 (m), 2880 (m), 1720 (w), 1620 (m),

1600 (s), 1500 (sh), 1450 (m), 1420 (m), 1390 (w),

1320 (m), 1230 (m), 1200 (w), 1120 (s), 1040 (m),

1000 (m), 940 (w), 820 (w).

Beispiel 20

2,00 g 6,7-Dihydroxy-2 _f 5,5,ea-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-i-spiro-2¹-(7'-carboxy-6'-hydroxymethy1-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran) wurden in 50 ml Äthylacetat gelöst und dazu wurden 10 ml p-Toluolsulfonsäure gegeben. Die Mischung wurde unter Rückfluss erhitzt. Nach der Umsetzung wurde die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur gekühlt, mit 10 ml einer 1 η wässrigenLösung Natriumhydroxid gewaschen, gründlich mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Natriumsulfat wurde durch Filtrierenabgetrennt und der Rückstand wurde unter vermindertem Druck zur Trockene konzentriert. Man erhielt so 1,45 g 4-Hydroxy-8-OXO-2,3,6,8-tetrahydro-furo^3,4-g/-benzofuran-2-spiro-1'-(6¹,7'-dihydroxy-2',5',5',8'a-tetramethyl-i',2',3',4',4'a,5',-6',7',8',8'a-decahydronaphthaiin) in Form von farblosen amorphen Kristallen. Die Bildung des Produktes wurde durch die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften bestätigt.

(1) Schmelzpunkt: 187 bis 193°C

(2) ElementaranaIyse für ^C23^H3o°6

Berechnet %:	C	68	,63	H	7	,51
Gefunden %:		68	,47		7	,70

809884/0624

282H03

(3) IR-Absorptions spektruin auf KBr-Tabletten. Das Produkt zeigte die folgenden Λ. (cm ):

max

3280 (s) , 2950 (m), 2890 (m), 1730 (s), 1610 (m), 1460 (S), 1330 (s), 1240 (w), 1130 (w), 1080 (m), 1040 (w), 1000 (w) _r 940 (m), 75O (m)

Beispiel 21

1OO mg 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-i-spiro-2'—(6',7'-dihydroxymethyl-4¹-hydroxy-2¹,3'-dihydrobenzofuran) wurden in 2 ml trockenem Pyridin gelöst und dazu wurde 1 ml Essigsäureanhydrid gegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Eiswasser wurde zu der Reaktionsmischung gegeben. Der Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt und aus einer Mischung aus Äthylacetat und η-Hexan durch portionsweise Zugabe von η-Hexan zu der Äthylacetat-Lösung umkristallisiert, bis Kristalle ausgefällt wurden. Es wurden 105 mg 7-Acetoxy-6-hydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-decahydronaphthalin-1-spiro-2'-(6',7'-diacetyloxymethyl-4'-acetyloxy-2*,3'-dihydrobenzofuran) als weisse Kristalle gewonnen. Die Bildung dieser Verbindung wurde durch die folgenden physikochemischen Eigenschaften bestätigt.

(1) Schmelzpunkt: 78 bis 83°C

(2) Elementaranalyse für ^C3i^H42^Oin

Berechnet %:	C	64	,79	H	7	,37
Gefunden %:		64	,51		7	,19

809884/0624

_ 99 -

2-82U03

(3) IR-Absorptionsspektrum auf KBr-Tabletten:

Das Produkt zeigte die folgenden A- (cm ):

iu ax

3400 (W)₇ 2900 (m), 2860 (sh), 1763 (sh), 1730 (s), 1715 (sh), 1620 (m), 1600 (m), 1465 (sh), 1447 (sh) , 1430 (s), 1378 (sh), 1364 (s), 1302 (m), 1250 (sh), 1220 (s),^195 (s), 1160 (sh), 1126 (m), 1096 (s), 1020 (s), 1000 (sh), 980 (m), 950 (m), 915 (sh), 895 (sh), 865 (sh), 830 (sh), 810 (sh), 763 (w), 690 (sh), 592 (w) .

Beispiel 22

100 mg 6,7-Dihydroxy-2₇5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1-spiro-2'-(6',7'-dihydroxymethyl-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran) wurden in 2 ml trockenem Pyridin gelöst und dazu wurde 1 ml Essigsäureanhydrid gegeben. Die Mischung wurde 2 Stunden auf 100°C erhitzt. Der entstandene Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt und aus einer Mischung aus Äthylacetat und η-Hexan durch portionsweise Zugabe von η-Hexan zu der Äthylacetat-Lösung umrkistallisiert, bis Kristalle ausfielen, wobei man 115 mg 6,7-Diacetyloxy-2,5,5,8atetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-decahydronaphthalin-1-spiro-2'-(6',7^I-acetylxymethyl-4'-acetyloxy-2^l,3'-dihydrobenzofuran) als weisse Kristalle erhielt. Die Bildung dieser Verbindung wurde durch die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften bestätigt.

(1) Schmelzpunkt: 76 bis 80°C

- 100 -

80 §§> 84/0624.

40%

- veo -

282H03

(2) Elementaranalyse für ^C33^H44°-i-t

Berechnet %: C 64,27 H 7,19 Gefunden %: 64,12 7,03

(3) IR-Absorptionsspektrum auf KBr-Tabletten:

Das Produkt zeigte die folgenden 2~ (cm ):

max

2920 (m), 2880 (sh), 1760 (sh), 1750 (sh), 1730 (s), 1624 (sh), 1603 (m), 1473 (sh), 1457 (sh), 1447 (sh), 1428 (s), 1376 (sh), 1363 (s), 13OO (s), 1260 (sh), 1220 (s), 1195 (s), 1150 (sh), 1125 (w), 1095 (s), 1035 (sh), 1020 (s), 980 (sh), 953 (s), 915 (m), 895 (sh), 870 (sh), 820 (w), 765 (w), 715 (w), 686 (w), 657 (w), 618 (sh), 596 (m), 583 (m).

Beispiel 23

100 mg 6-Acetyloxy-6-hydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,-5,6,7,8,8a-decahydronaphthalin-1-spiro-2'-(6',7'-diacetyloxymethyl-4'-acetyloxy-2',3'-dihydrobenzofuran) wurden in 5 ml Aceton gelöst und unter Eiskühlung wurden 0,1 ml Jones-Reagenz tropfenweise zugegeben. Die Mischung wurde 1 Stunde gerührt. Isopropanol wurde zu der Reaktionsmischung tropfenweise zum Zersetzen des Überschusses von Jones-Reagenz gegeben. Dann wurde Wasser dazugegeben und die Mischung wurde mit Äthylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen und das Lösungsmittel wurde abdestilliert. Der Rückstand wurde aus einer Mischung aus Aceton und η-Hexan umkristallisiert, wobei man 72 mg 7-Acetyloxy-6-oxo-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,-4,4a,5,6,7,8,8a-decahydronaphthalin-1-spiro-2'-(6',7·-deacetoxymethyl-4¹-acetyloxy-2¹,3'-dihydrobenzofuran) als weisse Kristalle

— 101 —

ÖQ9884/0624

2-82H03

erhielt. Die Bildung dieser Verbindung wurde durch die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften bestätigt.

(1) Schmelzpunkt: 140 bis 143°C

(2) Elementaranalyse für ^C3i^H4o°io

Berechnet %: C 65_#O2 H 7,04 Gefunden %: 65,17 7,13

<3) IR-Absorptionsspektrum auf KBr-Tabletten: Das Produkt zeigte die folgenden X (cm ):

max

2900 (m), 2880 (sh), 1766 (sh), 1750 (s), 1720 (s) , 1628 (m), 1600 (m), 1456 (s) , 1427 (s), 1380 (sh), 1363 (S)₇ 1340 (sh), 1300 (s), 1265 (sh) , 1220 (s), 1185 (s), 1120 (m), 1083 (s), 1070 (sh), 1030 (s), 1013 (sh) , 1O00 (sh), 970 (m), 950 (s), 936 (sh), 926 (sh), 905 (m), 895 (m), 870 (m), 854 (sh) , 827 (w) , 780 (w), 766 (w), 738 (w), 712 (w), 666 (w), 610 (w), 588 (W).

Beispiel 24

100 mg 4-Hydroxy-8-oxo-2,3,4,6,8-tetrahydro-furo^3,4-2?- benzofuran-2-spiro-1'-(6',7'-dihydroxy-2',5",5',8'a-tetramethyl-1',2',3',4',4^,5',6',7',8',S¹ a-decahydronaphthalin) wurden in 2 ml trockenem Aceton gelöst und 1 ml 2,2-Dimethoxypropan und dann 5 mg wasserfreie p-Toluolsulfonsäure wurden dazugegeben. Die Mischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur

- 102 -

309884/0624

AAO

- VB2 -

gerührt. Wasser wurde zu der Reaktionslösung gegeben und die Mischung wurde mit Äthylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumbicarbonat gewaschen und dann mit Wasser. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rückstand wurde aus einer Mischung aus Äthylacetat und η-Hexan umkristallisiert, wobei man 83 mg 4-Hydroxy-8-oxo-2,3,6,8-tetrahydro-furo/3,4-g/-benzofuran-2-spiro-1'-(6¹,7'-isopropylidendioxy-2¹,5',5',8'atetramethyl-1',2',3',4',4'3,5',6',7',S¹,8'a-decahydronaphthalin) in Form von weissen Kristallen erhielt. Die Bildung dieser Verbindung wurde durch die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften bestätigt.

(1) Schmelzpunkt: 142 bis 150°C

(2) Elementaranalyse für ^C2^^H33°6

Berechnet %: C 70,73 H 7,53 Gefunden %: 70,51 7,38

(3) IR-Absorptionsspektrum auf KBr-Tabletten:

_-« Das Produkt zeigte die folgenden Tl (cm ):

ΙΠ clX

3280 (W), 2920 (m), 2880 (sh), 1760 (sh), 1733 (s), 1620 (sh),1608 (m), 1463 (s), 1387 (sh), 1368 (m), 1354 (s), 1330 (s), 1300 (sh), 1255 (sh) , 1238 (m) , 1216 (s), 1178 (w), 1153 (w), 1124 (w), 1106 (w), 1080 (m), 1060 (m), 1043 (s), 1016 (m), 1005 (sh), 985 (sh), 950 (m), 923 (w), 895 (w), 870 (sh), 858 (m), 784 (sh), 768 (sh), 753 (m).

- 103 -

809884/0624

Beispiel 25

100 mg 6,7-Dihydroxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1-spiro-2'-(6',7'-dihydroxymethyl-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran) wurden in 2 ml trockenem Aceton gelöst und dazu wurden 1 ml 2,2-Dimethoxypropan und 5 mg wasserfreie p-Toluolsulfonsäure gegeben. Die Mischung wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Zu der Reaktionslösung wurde Eiswasser gegeben und die Mischung wurde mit Äthylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumbicarbonat und dann mit Wasser gewaschen und das Lösungsmittel wurde abdestilliert. Der Rückstand wurde durch Kieselgelsäulenrchromatografie gereinigt und aus einer Mischung aus Äthylacetat und η-Hexan durch portionsweise Zugabe von η-Hexan zu der Äthylacetat-Lösung umkrisvällisiert, bis Kristalle ausfielen, wobei man 21 mg 6,7-lsopropylidendioxy-2,5,5,8a-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-decahydronahphthalin-1 -spiro-2' - (6 ' ,T-hydroxymethyl)-4'-hydroxy-2¹,3'-dihydrobenzofuran) in Form von weissen Kristallen erhielt. Die Bildung dieser Verbindung wurde durch die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften bestätigt.

200°C unter Verfärbung und zeigt keinen genauen

(1) Schmelzpunkt: Zersetzt sich allmählich bei etwa 200°C unter V

Schmelzpunkt.

(2) E lernen tar analyse für

Berechnet %:	C	69	/93	H	8	/58
Gefunden %:		69	/71		8	/39

- 104 -

8Ö9ÖÖ4/061

ΛΑ*

- >04 -

2S2U03

(3) IR-Absorptionsspektrum auf KBr-Tabletten:

Das Produkt zeicrte die folgenden Λ. (cm ) : ~ inax

3360 (m), 3040 (m), 2920 (m), 2880 (sh), 1735 (w), 1700 (W), 1618 (m), 1458 (sh), 1440 (s), 1386 (sh), 1368 (S), 1346 (m) , 1313 (m) ., 1253 (m) , 1237 (m) , 1215 (m), 1180 (w), 1150 (w), 1106 (s), 1083 (m) , 1052 (sh), 1047 (s), 1026 (m), 1000 (s), 974 (s), 952 (m), 920 (w), 895 (w), 870 (sh), 857 (m), 837 (m), 785 (w), 765 (sh), 700 (w), 670 (w).

Beispiel 26

100 mg 4-Hydroxy-8-oxo-2,3,6, 8-tetrahydro-furo^3 ,4-gybenzofuran-2-spiro-1'-(6¹,7'-isopropylidendioxy-2',5',5',8'atetramethyl-1·,2',3',4',4'a,5',6',7',8',8'a-decahydronaphthalin) wurden in 5 ml trockenem Diäthyläther gelöst und unter Eiskühlung wurden 5 mg Lithiumaluminiumhydrid zugegeben. Die Mischung wurde 1 Stunde gerührt. Zu der Reaktionslösung wurde Wasser gegeben und die Lösung wurde schwach sauer (pH 3 bis 5) mit 1 η Chlorwasserstoffsäure eingestellt und dann mit Äthylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen und das Lösungsmittel wurde abdestilliert. Der Rückstand wurde aus einer Mischung aus Äthylacetat und n-Hexan, durch portionsweise Zugabe von η-Hexan zu der Äthylacetat-Lösung umkristallisiert, bis Kristalle ausfielen, wobei man 75 mg Isopropylidenuioxy-2,5,5,Sa-tetramethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8adecahydronaphthalin-1-spiro-2' - (6',7'-hydroxymethyl-4'-hydroxy-2',3'-dihydrobenzofuran) als weisse Kristalle erhielt. Die physiko-chemisehen Eigenschaften der entstandenen Verbindung stimmten mit der des Beispiels 25 überein.

- 105 -

809884/0624

Referenzbeispiel 1

143

- 1βΓ5 -

Verbindung Nr der Erfindung

Glucose

destilliertes Wasser für Injektionszwecke

500 mg 250 mg

bis zur Gesamtmenge von 5 ml

Das Dinatriumsalz (III) der Verbindung (I) und Glucose wurden in destilliertem Wasser zu Injektionszwecken gelöst. Die Lösung wurde in 5 ml-Ampullen gegeben. Die Atmosphäre wurde mit Stickstoff gespült und zum Sterilisieren der Lösung wurde die Ampulle 15 Minuten auf 121⁰C erhitzt, wobei man eine injizierbare Zubereitung erhielt.

Referenzbeispiel 2

Verbindung Nr. der Erfindung

Natriumsulfit

destilliertes Wasser für Injektionszwecke

500 mg 5 mg

bis zur Gesamtmenge von 5 ml

In gleicher Weise wie im Referenzbeispiel 1 wurde eine injizierbare Zubereitung hergestellt.

Referenzbeispiel 3

Verbindung Nr. der Erfindung

Natriumsulfat

<Kas*se=t ί Sr

500 mg 5 mg

z*ur Gesamtiseirge

von S ail

- IGS -

2Ü2H03

In gleicher Weise wie im Referenzbeispiel 1 wurde eine injizierbare Zubereitung hergestellt.

Referenzbeispiel 4

Verbindung Nr. 6 der Erfindung

halbsynthetische Glyzeridbase

750 mg

bis zu einer Gesamtmenge von 2000 mg

Die Verbindung Nr- 6 gemäss der Erfindung wurde zu der halbsynthetischen Glyzeridbase gegeben und bei 50 C vermischt
und suspendiert. Die Mischung wurde in eine Form gegeben und abkühlen gelassen. Das Produkt wurde aus der Form entnommen, wobei man ein Suppositorium erhielt.

Referenzbeispiel 5

Verbindung Nr. 2 der Erfindung

Vitamin E

halbsynthetische Glyzeridbase

750 mg 90 mg

bis zu einer Gesamtmenge von 2000 mg

In gleicher Weise v/ie im Referenbeispiel 4 wurden Suppositorien hergestellt.

- 107 -

- 1^7 -

Referenzbeispiel 6

Verbindung Nr. 2

der Verbindung 150 g

Avicell (Handelsname für ein

Produkt der Asahi Kasai Kabu-

shiki Kaisha) 40 g

Maisstärke 30 g

Magnesiumstearat 2 g

TC-5 (Handelsname für Hydroxypropylmethylzellulose) 10 g

Polyäthylenglykol 6000 3 g

Castor-öl 40 g

Methanol 40 g

Die Verbindung Nr. 2, Avicell, Maisstärke und Magnesiumstearat wurden abgemischt und fein vermählen und tablettiert und mit Zucker beschichtet (R = 10 mm). Die erhaltenen Tabletten wurden mit einem dünnen Überzug aus Hydroxypropylmethylzellulose, Polyäthylenglykol 6000, Castor-öl und Methanol unter Ausbildung von filmbeschichteten Tabletten beschichtet.

Referenzbeispiel 7

Verbindung Nr. 6 der Erfindung

Avicell

Maisstärke Magnesiumstearat

Methylacrylat/Methylacrylsäure-

Copolymer 5,7 g

100	g
40	g
30	g
2	g

80Ö884/062A

4 Ab

- K?8 -

282U03

Triacetin O₇6 g

Äthanol 50,4 g

Verbindung Nr. 6, Avicell, Maisstakre und Magnesiumstearat wurden vermischt und fein zermahlen und dann tablettiert für eine Beschichtung mit Zucker (R 10 mm). Die erhaltenen Tabletten wurden mit einem Filmbeschichtungsmittel aus Methylacrylat/ Methacrylsäure-Copolymer, Triacetin und Äthanol beschichtet, vrabei man enterisch-beschichtete Tabletten erhielt.

Referenzbeispiel 8

Verbindung Nr. 6

der Erfindung 150/0 g

Zitronensäure 1,0 g

Lactose 33,5 g

Dikalziumphosphat 70,0 g

Plon F-68 (Pluronic F-68) . 30,0 g

Natriumlaurylsulfat 15/0 g

Polyvinylpyrrolidon 15,0 g

Polyäthylenglykol

(Carbowax 1500) 4,5 g

Polyäthylenglykol

(Carbowax 6000) 45,0 g

Maisstärke 30,0 g

trockenes Natriumlaurylsulfat 3,0 g

trockenes Magnesiumstearat 3,0 g

Äthanol eine geeignete Menge

Die Verbindung Nr. 6, Zitronensäure, Lactose, Dikalziumphosphat, Pluronic F-68 und Natriumlaurylsulfat wurden vermischt.

- 109 -

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232H03

Die Mischung wurde auf ein Sieb Nr. 60 gesiebt und nassgranuliert mit einer alkoholischen Lösung aus Polyvinylpyrrolidon, Carbowax 1500 und Carbowax 6000. Äthylalkohol wurde in gewünschter Menge zugegeben, um das Pulver in eine pastenartige Masse zu überführen. Dann wurde Maisstärke zugegeben und es wurde weitergemischt, bis man gleichförmige Teilchen erhielt. Die Teilchen wurden durch ein Sieb Nr. 10 gegeben, auf ein Blech gelegt und in einem Ofen bei 100°C 12 bis 14 Stunden getrocknet. Die getrockneten Teilchen wurden durch ein Sieb Nr. gesiebt und mit trockenem Natriumlaurylsulfat und trockenem Magnesiumstearat vermischt. Die Mischung wurde in einer Tablettiermaschine in gewünschter Weise verformt.

Die so erhaltenen Kerne wurden mit einem Überzug versehen und darauf auch Talk gesprüht, um Feuchtigkeitsabsorbtion zu vermeiden. Der Kernteil wurde mit einer Primärschicht und dann mit einem Lack beschichtet in der für periodische Verabreichung erforderlichen Häufigkeit. Um die Tabletten vollständig abzurunden und zu glätten, wurde weiterer Primer aufgebracht und dann ein Farbüberzug bis die gewünschte Farbe vorlag.

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Leerseife

Claims (15)

1. 282UQ3

   30 603 o/wa

   OTSüKA PHASMACEÜTICAL CO. LTD., TOKYO/JAPAN

   Sesquiterpenderivate, Verfahren zu deren Herstellung und Arzneimittel,· welche diese enthalten

   PATENTANSPRÜCHE

   Sesquiterpenderivate der allgemeinen Formel (I)

   §09884/0624

   worin bedeuten:

   R ein Wasserstoffatom, eine Niedrigalkylgruppe oder eine Niedrigalkanoylgruppe,

   3

   R und R , die gleich oder verschieden sein können, jeweils eine Formylgruppe, eine Hydroxymethylgruppe, eine Hydroxylgruppe, eine Carboxylgruppe, eine Niedrigalkanoyloxymethylgruppe oder eine Gruppe der Formel -CH=CR R , worin R und R , die gleich oder verschieden sein können,jeweils ein Wasserstoff atom, eine Cyanogruppe, eine Niedrigalkoxycarbonylgruppe oder eine Carboxylgruppe bedeuten,

   oder worin

   3

   R und R zusammengenommen einen Lactonring der Formel

   R⁹ O

   * η - g

   -CH-O-C- bedeuten, worin R ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe bedeutet,

   R und R / die gleich oder verschieden sein können, jeweils eine Hydroxylgruppe oder eine Niedrigalkanoyloxygruppe darstellen,

   R ein Wasserstoffatom; oder eine Hydroxylgruppe darstellt,

   4 5

   wobei R und R zusammen eine Oxogruppe (=O) bilden können, und

   R und R zusammen eine Niedrigalkylidendioxygruppe bilden können,

   809384/0824

   282U03

   sowie deren pharmakologisch annehmbaren Salze.
2. 2. Eine Verbindung gemäss Anspruch 1 der allgemeinen Formel (Ia)

   CUO

   CHO

   ^CÄ?;i

   und deren pharmakologisch annehmbaren Salze.
3. 3. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel (Ia)

   CHO

   CUO

   80988A/0624

   2-82UQ3

   dadurch gekennzeichnet , dass man aerobisch einen Mikroorganismus vom Stamme Stachybotrys in einem Kulturmedium, das Quellen von Stickstoff, Kohlenstoff, anorganischen Salzen und Spurenraineralien enthält, bei einem pH von etwa 3,5 bis etwa 11,5 und einer Tempe'-ratur vcn etwa 15 bis etwa 35°C kultiviert und das erhaltene Produkt der Formel (Ia) aus der Kulturbrühe gewinnt.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man das erhaltene Produkt in ein pharmakologisch annehmbares Salz überführt.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Stachybtroys altermans IFO 9355, Stachybotrys chariarum IFO 5369, Stachybotrys chartarum IFO 7222, Stachybotrys cylindrospora 8858, Stachybotrys echinata 7525, Stachybotrys rentformis 7067, Stachybotrys sp- K-76 (Al¹CC 20511), Stachybotrys sp. T-739 (ATCC 20512) und Stachybotrys sp. T-791 (ATCC 20513).
6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe Stachybotrys sp. K.-76 (ATCC 20511), Stachybotrys sp. T-789 (ATCC 20512) und Stachybotrys sp. T-7S1 (ATCC 20513}
7. 7. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass mann

   (1) zur Herstellung einer Verbindung der allgemei-

   2 3

   nen Formel (I), in welcher R , R oder beide eine Carboxylgruppe bedeuten, eine Verbindung der Formel (I), in welcher

   809884/0624

   2 3

   R , R oder beide eine Formylgruppe bedeuten (Verbindung IA) oxidiert,

   (2) oder zur Herstellung einer Verbindung der For-

   2 3
   mel (I), in welcher R₇R oder beide eine Hydroxymethylgruppe bedeuten (Verbindung IC), die Formylgruppen der Verbindung (IA) oder die Carboxylgruppen der Verbindung (IB) reduziert oder eine Verbindung der Formel (I), in

   2 3

   v/elcher R und R miteinander verbunden sind unter Ausbildung eines Lactonrings

   R⁹ O
   ι η

   -CH-O-C- (Verbindung ID) reduziert, oder

   (3) zur Herstellung einer Verbindung der Formel

   2 3

   (I), in welcher R und R miteinander verbunden sind,

   unter Ausbildung eines Lactonrings der Formel 0

   -CH₀-O-C- (Verbindung ID) eine Verbindung (IC), in welcher

   2 3

   einer der Reste R und R eine Hydroxymethylgruppe bedeutet und der andere eine Carboxylgruppe bedeutet, dehydrocyclisiert, oder

   (4) zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I), in welcher R², R³ oder beide die Gruppe -CH=CR⁷R⁸ (Verbindung (ID) bedeuten, eine Verbindung der Formel (IA) mit einer aktiven Methylenverbindung der Formel (II)

   (II)

   7 8
   in welcher R und R die vorgenannten Bedeutungen haben, in Gegenwart eines Katalysators dehydrokondensiert, oder

   30938A/0624

   282H03

   (5) zur Herstellung einer Verbindung der Formel

   2 3

   (I) , in welcher R , R oder beide eine Hydroxylgruppe (Verbindung (IF) bedeuten, die Verbindung (IA) mit einem Peroxid in einem inerten Lösungsmittel umsetzt, oder

   (6) zur Herstellung einer Verbindung der Formel

   2 1

   (I), in welcher R , R oder beide eine Niedrigalkanoyloxymethy1gruppe (Verbindung IG) bedeuten, die Verbindung (IF) acyliert,

   und gewünschtenfalls das Produkt gemäss (1) bis (6) in ein Salz überführt.
8. 8. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung (IA) bis (IG) in welcher R eine Niedrigalkylgruppe bedeutet, dadurch gekennzeichnet , dass man eine entsprechende Verbindung, in welcher R ein Wasserstof bedeutet, mit einem Alkylierungsmittel umsetzt.
9. 9- Verfahren zur Herstellung einer Verbindung (IA) bis (IG), in welcher R eine Niedrigalkanoyloxygruppe bedeutet, dadurch gekennzeichnet , dass man die entsprechende Verbindung, in welcher R ein Wasserstoffatom bedeutet, acyliert.
10. 10. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung (IA) bis (IG), in welcher R und R Niedrigalkanoyloxygruppen bedeuten, dadurch gekennzeichnet , das man die entsprechenden Verbindungen, in denen R und eine Hydroxylgruppe bedeuten, acyliert.

    80988A/0624
11. 11. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung (IA) bis (IG),in welcher R und R eine Alkylidendioxygruppen bedeuten, dadurch gekennzeichnet , dass man die entsprechende Verbindung, in welcher R und R eine Hydroxylgruppe bedeuten, mit einem Keton der Formel

    C=O (III)

    in welcher R und R ein Wasserstoffatom oder eine Niedrigalkylgruppe bedeuten, oder mit einem Acetal der Formel

    worin R und R die vorher angegebenen Bedeutungen haben, in Gegenwart eines Katalysators umsetzt.
12. 12. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung (IA) bis

    4 5

    (IG), in welcher R und R zusammen eine Oxogruppe bedeuten, dadurch gekennzeichnet , dass man eine entsprechende Verbindung, in welcher R eine Hydroxylgruppe und R ein Wasserstoffatom bedeuten, oxydiert.
13. 13. Pharmazeutische Zusammensetzung mit antikomplementärer Aktivität für Lebewesen, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge eines Sesquiterpenderivates gemäss Anspruch

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    1 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon", neben einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
14. 14. Zusammensetzung gemäss Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , dass der Gehalt des Sesquiterpenderivates oder dessen pharmazeutisch annehmbaren Salzes darin etwa 1 bis etwa 70 Gew.%, bezogen auf die gesarate pharmazeutische Zusammensetzung, beträgt.
15. 15. Verfahren zur Behandlung von Nephritis, dadurch gekennzeichnet , dass man die Zusammensetzung gemäss Anspruch 13 oder 14 einem nephritischen Patienten in einer Menge von etwa 0,5 bis etwa 2O mg/kg Körpergewicht pro Tag verabreicht.

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