DE2703645B2

DE2703645B2 - Verfahren zur Herstellung eines Gemischs aus Androsta-l,4-dien-3,17-dion und Androst-4-en-3,17-dion

Info

Publication number: DE2703645B2
Application number: DE2703645A
Authority: DE
Inventors: Candice Brenda Biggs; Thomas R. Portage Pyke; Merle Gene Wovcha
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1976-03-01
Filing date: 1977-01-28
Publication date: 1980-08-07
Also published as: PL111029B1; NL170435C; FR2345464A1; IL51370A0; JPS60133884A; MX6932E; DE2703645A1; NL170435B; IL51370A; PL196355A1; NL7701346A; FR2345464B1; CH637993A5; MX4503E; JPS6141547B2; IL60476A; MX6933E; CH638563A5; IL60476A0; DD130789A5

Description

oder in Kombination mit einem anderen Steroid zugesetzt werden. Der bevorzugte, jedoch nicht zwingend erforderliche Konzentrationsbereich für das Steroid in der Kultur beträgt etwa 0,1 bis etwa 100 g/L Die Kultur wird in einem Nährmedium mit einem Kohlenstofflieferanten, beispielsweise einem assimilierbaren Kohlenhydrat, und einem Stickstofflieferanten, beispielsweise einer assimilierbaren Stickstoffverbindung oder einem eiweißartigen Material, wachsen gelassen bzw. gezüchtet Bevorzugte Kohlenstofflieferanten sind Glukose, brauner Zucker, Rohrzucker, Glycerin, Stärke, Maisstärke, Laktose, Dextrin, Melasse und dergleichen. Bevorzugte Stickstofflieferanten sind Maiseinweichflüssigkeit, Hefe, autolysierte Brauhefe mit Müchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, Pankreasverdauungsprodukte von Kasein, Fischmehl, Brennereirückstände, Tierpeptonfiüssigkeiten, Fleisch- und Knochenabfälle, Ammoniumsalze und dergleichen. In vorteilhafter Weise können Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stick-Stofflieferanten zum Einsatz gelangen. Den Gär- bzw. Fermerualionsmedien brauchen keine Spurenmetalle, z. B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergleichen, zugesetzt zu werden, da vor der Sterilisation des Mediums Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile als Komponenten des Mediums zum Einsatz gelangen.

Das Umwandlungsverfahren dauert etwa 72 h bis !5 Tage. Die Inkubationstemperatur reicht von etwa 25° bis etwa 37°C, für M. fortium DSM 1036 vorzugsweise so 30° C und für M. phlei DSM 936 vorzugsweise 35° C. Der Inhalt des Umwandlungsgefäßes wird mit sterilisierter Luft belüftet und zum leichteren Wachstum des jeweiligen Mikroorganismus bewegt. Auf diese Weise läßt sich der Wirkungsgrad des Umwandlungsverfah- )^r> rens erhöhen.

Nach beendeter Umwandlung, ermittelt durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von handelsüblichen Silikagelplatten und eines Lösungsmittelsystems aus zwei Volumina Äthylacetat und drei Volumina Cyclohexan, wird das umgewandelte Steroid in üblicher bekannter Weise isoliert. So kann beispielsweise das Gär- bzw. Fermentations- oder Umwandlungsgemisch einschließlich der Gärbrühe und der Mikroorganismenzellen mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel für Steroide extrahiert werden. Geeignete Lösungsmittel sind vorzugsweise Dichlormethan, Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylenchlorid, Trichlorethylen, Äther, Amylacetat, Benzol und dergleichen. so

Andererseits können die Gär- bzw. Fermentationsbrühe und die Zellen zunächst in üblicher bekannter Weise, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren, voneinander getrennt und dann getrennt mit geeigneten Lösungsmitteln extrahiert werden. Die Zellen können entweder mit einem mit Wasser mischbaren oder mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert werden. Die zellenfreie Gär- oder Fermentationsbrühe läßt sich mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln extrahieren. t>o

Die Extrakte können durch Diatomeenerde filtriert werden, worauf das Filtrat im Vakuum zur Trockene destilliert wird. Der die gewünschten umgewandelten Steroide enthaltende Destillationsrückstand läßt sich in einer Mindestmenge eines 20 : eO-Äthylacetat/Cyclohexan-Gemischs lösen. Die erhaltene Lösung kann dann auf trockenem Silikagel unter Verwendung eines 20: SQ-Äth.^laeetat/Benzol-Gemischs als Entwickler Chromatographien werden. ADD und AD lassen sich aus dem Silikagel durch Eluieren mit einem Ί5:85-Äthylacetat/Chloroform-Gemisch abtrennen. Die Einzelverbindungen lassen sich aus dem Gemisch durch Verdampfen des Lösungsmittels und Umkristallisieren aus Hexan isolieren.

Die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren als gewünschte Endprodukte anfallenden Verbindungen ADD und AD stellen bekannte Steroidzwischenprodukte dar. So eignen sich diese Verbindungen als Zwischenprodukte bei der Synthese geeigneter Steroidhormone. Aus ADD läßt sich beispielsweise nach dem aus der US-PS 32 74 183 bekannten Verfahren östron herstellen. Aus AD kann man gemäß den Lehren der US-PS 21 43 453, 22 53 798, 22 64 888 und 23 56 154 Testosteron gewinnen.

Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren gemäß der Erfindung näher veranschaulichen. Sofern nicht anders angegeben, bedeuten sämtliche Prozentangaben »Gewichtsprozente«. Ferner bedeuten sämtliche Mengenangaben bei Lösungsmittelgemischen, sofern nicht anders angegeben, Volumenangaben.

Beispiel 1

Herstellung der Mutante M. fortuitum DSM 1036
aus M. fortuitum ATCC 6842

(a) Nitrosoguanidin-Mutagenese

Zellen von M. fortuitum ATCC 6842 werden bei einer Temperatur von 28° C in einem sterilen Saatmedium der folgenden Zusammensetzung wachsen gelassen:

Nährbrühe	8 g/l
Hefeextrakt	lg/l
Glyzerin	5 g/l
Mit destilliertem Wasser
aufgefüllt auf	11

Der pH-Wert des Mediums wird mit 1 n-NaOH vor einer 20minütigen Sterilisation bei 121°C auf 7,0 eingestellt.

Die Zellen werden bis zu einer Dichte von etwa 5 χ lOVrnl wachsen gelassen, durch Zentrifugieren in Kügelchen überführt und dann mit einem gleichen Volumen sterilen 0,1m-Natriumcitrat eines pH-Werts von 5,6 gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden in demselben Volumen Citratpuffer resuspendiert, worauf ein aliquoter Teil zur Titerfeststellung (d. h. zur Zellenzählung) abgetrennt wird. Schließlich wird Nitrosoguanidin bis zu einer Endkonzentration von 50 ng/ml zugesetzt. Die Zellensuspension wird in einem Wasserbad 30 min lang bei einer Temperatur von 37° C inkubiert, worauf erneut ein aliquoter Teil zur Titerfeststellung abgetrennt wird. Der Rest wird abzentrifugiert und mit einem gleichen Volumen sterilen O.lm-Kaliumphosphats eines pH-Werts von 7,0 gewaschen. Schließlich werden die Zellen in einem sterilen Minimalsalzmedium ohne Kohlenstofflieferant der folgenden Zusammensetzung:

NH4NO3	1,0 g/l
K₂HPO,	0,25 g/l
MgSO₄ · 7 H₂O	0,25 g/l
NaCI	0,005 g/l
FeSO₄ ■ 7 H₂O	0,001 g/l
Mit destilliertem Wasser
aiifiTpfüllt auf	1 I

resuspendiert Der pH-Wert dieses Mediums wird vor einem 20minütigen Sterilisieren bei 121°C mit In-HCl auf 7,0 eingestellt Endlich werden die Zellen zur Auswahl der Mutante ausgebreitet.

(b) Auswahl und Isolierung der Mutante
Mfortuitum DSM 1036

Die in der geschilderten Weise mutierten Zellen werden verdünnt und auf Platten verstrichen, die ein Medium der folgenden Zusammensetzung enthalten (modifiziert nach Fräser und Jerre!, 1963 »J. Biol. Chem.«, 205,291 bis 295):

Glyzerin	10,0 g/l
K₂HPO₄	0,5 g/l
NH₄Cl	1.0 g/l
MgSO₄ · 7 H₂O	0,5 g/l
FeCI₃ ■ 6 H₂O	0,05 g/l
Mit destilliertem Wasser
aufgefüllt auf	11

Nach Zugabe von 15 g/l Agar wird das Medium 30 min lang in einem Autoktaven auf eine Temperatur von 12 TC erhitzt und dann in sterile Petri-Schalen gegossen. Das Wachsen bzw. die Züchtung auf diesem Medium eliminiert die meisten durch das Mutageneseverfahren gebildeten Nährauxotrophe. So werden beispielsweise Kulturen, die zum Wachsen 2 uf chemisch definierten Medien Vitamine, Wachstumsfaktoren und dergleichen erfordern, eliminiert. Nach etwa 7tägiger Inkubation bei einer Temperatur von 28° C werden die gebildeten Kolonien auf zur Auswahl von Mutanten geeignete Testplatten und dann zurück auf das auf Glyzerin basierende Medium enthaltende Kontrollplatten repliziert. Die Testplatten werden entsprechend der Veröffentlichung von G. E. Peterson, H. L Lewis und J. R. Davis »Preparation of uniform dispersions of cholesterol and other water-insoluble carbon sources in agar media«, J. Lipid Research 3, 275 bis 276 (1962) hergestellt. Das Minimalsalzmedium auf diesen Platten ist unter (a) von Beispiel 1 beschrieben. Nach Zugabe von 15 g/l Agar und 1,0 g/l eines geeigneten Kohlenstofflieferanten werden Steroide, wie Sitosterin oder Androstendion (AD), zugesetzt, worauf die erhaltene Suspension 30 min lang bei 121°C im Autoklaven erhitzt wird. Das sterile, heiße Gemisch wird hierauf in ein steriles Mischgefäß gegossen, mehrere min lang durchgemischt und schließlich in sterile Petri-Schalen gegossen. Bei diesen Maßnahmen kann es infolge Schaumbildung zu Schwierigkeiten kommen, diese lassen sich jedoch durch Durchmischen des heißen Gemischs und durch Abflammen der Oberfläche der geschmolzenen Agarplatten verringern. Auf diese Weise erhält man gleichmäßige Dispersionen wasserunlöslicher Kohlenstofflieferanten, wodurch die Herstellung sehr homogener, jedoch opaker Agarplatten erleichtert wird.

Die auf den Kontrollplatten gewachsenen Kolonien, jedoch nicht die auf den AD als einzigen Kohlenstofflieferanten enthaltenden Testplatten gewachsenen Kolonien, werden durch Ausstreichen auf Nähragarplatten gereinigt. Nach dem Wachsen bei einer Temperatur von 28°C werden mit Hilfe steriler Zahnstocher Einzelklonen von den Nähragarplatten gepflückt und durch Beimpfen netzartig gemusterter Platten mit AD als Kohlenstofflieferanten erneut getestet. Gereinigte Isolate, die noch einen von der Mutterkultui unterschiedlichen Phenotypus aufweisen, werden dann in Schüttelflaschen ausgewertet.

(c) Schüttelflaschenaus wertung

Es werden 500 ml fassende Schüttelflaschen mit 100 ml eines Biotransformationsmediums der folgenden Zusammensetzung verwendet:

NH₄Cl 3,0 g/l

Harnstoff 0,5 g/lCe-

relose 10,0 g/l

KH₂PO₄ 0,5 g/l

MgSO₄ -7 H₂O 0,5 g/l

FeCl₃ · 6 H₂O 0,5 g/l

CaCO₃ 3,0 g/l

Handelsüblicher Emulgator 0,5 g/l
Mit Leitungswasser

aufgefüllt auf 11

Hierauf werden in das Medium 1 g/l Sojamehl und dann 30 g/l Sitosterin eingemischt. Nach 30minütigem Erhitzen der Flaschen in einem Autoklaven auf 121°C werden sie auf 28^CC abgekühlt und dann mit 10 ml eines wie folgt hergestellten Saatguts beimpft

Die gereinigten Isolate aus Stufe (b) werden bei einer Temperatur von 28° C auf geneigtem Agar wachsen gelassen. Zum Beimpfen einer 500 ml fassenden Flasche mit 100 ml eines sterilen Saatguts der folgenden Zusammensetzung:

Nährbrühe	8 g/l
Hefeextrakt	tg/i
Glyzerin	5 g/l
Mit destilliertem Wasser
aufgefüllt auf	11

wird eine von einem geneigten Agar entnommene öse voll Zellen verwendet. Der pH-Wert des Saatmediums wird vor dem 30minütigen Erhitzen der Flaschen auf 121°C in einem Autoklaven mit In-NaOH auf 7,0 eingestellt. Die Saatflaschen werden 72 h lang bei einer Temperatur von 38° C inkubiert.

Wie bereits erwähnt, werden 10 ml gewachsene Saat zum Beimpfen sämtlicher 50O-ml-FIaschen mit jeweils 100 ml sterilen Transformationsmediums verwendet. Hierauf werden die Flaschen bei einer Temperatur von 28° bis 30⁰C auf einem Drehrüttler inkubiert, wobei von Zeit zu Zeit aliquote Proben entnommen werden. Diese Proben umfassen jeweils 10 ml und werden nach dem Austragen durch Schütteln mit drei Volumina Methylenchlorid extrahiert. Teile der Extrakte werden durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silikagel und des beschriebenen Lösungsmittelsystems, d. h. zwei Volumina Äthylacetat und drei Volumina Cyclohexan, sowie durch Gas/Flüssig-Chromatographie analysiert. Ein Nachweis der Anwesenheit von ADD und AD bestätigt den selektiven Abbau von Sitosterin durch den neuen Mutanten aus dem Muttermycobacterium M. fortuitum ATCC 6842.

Beispiel 2
Umwandlung von Sitosterin in ADD und AD

Das verwendete Medium entspricht dem Medium von Beispiel 1 (c). Dieses Medium wird durch 30minütiges Erhitzen im Autoklaven auf 121⁰C sterilisiert, dann auf 30⁰C abgekühlt und schließlich mit 10 Teilen einer Saatkultur der Mutante Mycobacterium M. fortuitum DSM 1036, die entsprechend Beispiel 1 (c) hergestellt worden war, beimpft. Das beimpfte Gemisch wird unter Bewegung 336 h lang bei einer Temperatur von 30⁰C zur Begünstigung eines submersen Wachstums inku-

biert. Nach der Inkubation wird das Gemisch mit Dichlormethan extrahiert. Der erhaltene Extrakt wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann durch Vakuumdestillation vom Lösungsmittel befreit. Hierauf wird der erhaltene Destillationsrückstand in einer Mindestmenge eines 20 :80-Äthylacetat/Cyclohexan-Gemischs gelöst, worauf die Lösung auf trockenem Silikagel unter Verwendung eines 20 :80-Äthylacetat/ Benzol-Lösungsmittelsystems Chromatographien wird. Die Anwesenheit von Androst-4-en-3,17-dion und Androsta-l,4-dien-3,17-dion ergibt sich aus einem Diinnschichtchromatogramm. Die erhaltenen Verbindungen werden aus dem Silikagel durch Eluiren mit einem 15:85-Äthylacetat/Chloroform-Lösungsmittelsystems abgetrennt, worauf die Einzeiverbindungen durch Verdampfen des Lösungsmittels und Umkristallisieren des Verdampfungsrückstands aus Hexan isoliert werden.

Beispiel 3

Durch Ersatz von M. fortuitum DSM 1036 durch M. phlei DSM 936 in Beispiel 2 und Ändern der Inkubationstemperatur von 30⁰C auf 35⁰C erhält man ebenfalls ein Gemisch aus ADD und AD.

Beispiel 4

Durch Ersatz des Sitosterins durch Cholesterin in der Beispielen 2 und 3 erhält man ein Gemisch aus ADD unc ■ AD.

Beispiel 5

Durch Ersatz des Sitosterins durch Stigmasterin ir den Beispielen 2 und 3 erhält man ein Gemisch aus ADC

in und AD.

Beispiel 6

Durch Ersatz des Sitosterins durch Campesterin ir den Beispielen 2 und 3 erhält man ein Gemisch aus ADC ü und AD.

Beispiel 7

Durch Zugabe einer Kombination aus beliebiger Steroiden der Beispiele 2 bis 6 zu dem Sitosterin in -¹H Beispiel 2 und 3 oder durch Ersatz des Sitosterins in dei Beispielen 2 und 3 durch eine Kombination au: beliebigen Steroiden der Beispiele 2 bis 6 erhält mar ebenfalls ein Gemi ;ch aus ADD und AD.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines Gemisches aus Androsta-l,4-dien-3,17-dion und Androst-4-en-3,17-dion, dadurch gekennzeichnet, daß man Mycobacterium fortuitum DSM 1036 oder Mycobacterium phlei DSM 936 in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart von Sitosterin und/oder Cholesterin und/oder Stigmasterin und/oder Campesterin züchtet

Die Umwandlung von Steroiden durch Mikroorganismen wurde bereits recht weitgehend untersucht und in der Literatur veröffentlicht Die früheste einschlägige Arbeit stammt offensichtlich von Mamoli und Vercellone aus dem Jahre 1937 »Berichte« 70, 470 und »Berichte« 70, 2079. A. a. O. wird über die Reduktion von 17-Ketosteroiden zu 17/?-Hydroxysteroiden mit Hilfe von Gä.hefe berichtet Im Jahre 1952 (vgl. US-PS 26 02 769) berichten Peterson und Murray über die 11ä-Hydroxylierung von Progesteron mit Hilfe des Pilzes Rhizopus nigricans. 1972 (vgl. US-PS 36 84 657) berichten Kraychy und Mitarbeiter über den selektiven mikrobiologischen Abbau von steroidischen 17-Alkylresten durch Vergären von Steroiden mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Alky!seitenkette mit Mycobacterium sp. NRRL B-3683 unter Bildung von Androst-4-en-3,17-dion, Androst-l,4-dien-3,17-dion und 20ac-Hydroxymethyl-pregna-l,4-dien-3-on. 1973 (vgl. US-PS 37 59 791) berichteten Marsheck und Mitarbeiter über die selektive mikrobiologische Darstellung von Androst-4-en-3,l 7-dion durch Vergären eine:, Steroids der Cholestan- oder Stigmastanreihe mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette mit Mycobacterium sp. NRRL B-3805.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden neue Mikroorganismenmutanten, nämlich beispielsweise Mycobacterium fortuitum DSM 1036 und Mycobacterium phlei DSM 936 zum selektiven Abbau von Steroiden mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen, nämlich Sitosterin, Cholesterin,' Stigmasterin UTid Campesterin, zu ADD und AD benutzt. Diese Steroidsubstrate können entweder in reiner Form oder in Rohform zum Einsatz gelangen.

Zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung wurden in der später beschriebenen Weise die Arten Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 und Mycobacterium phlei UC 3533 zu neuen Labormikroorganismusmutanten mutiert. Der ATCC-Katalog von 1974 erläutert neben der Auflistung von ATCC 6842 folgendes: »J. C. Cruz 2, Cold abscess. Acta Med. Rio de Janeiro 1:1 (1936). Medium 90 37C«. M. fortuitum ATCC 6842 baut Sterine nicht selektiv zu niedrigmolekularen Verbindungen, beispielsweise CO2 + H2O, ab. Somit eignet sich dieser Mikroorganismus nicht zum selektiven Steroidabbau.

Bei der Mutation von M. fortuitum ATCC 6842 und M. phlei UC 3533 (UC steht für »Kultursammlung der Firma The Upjohn Company«) mittels Nitrosoguanidin erhält man neue Mutanten, die selektiv Steroide der

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Die neuen Mikroorganismus-Mutanten von M. Fortuitum und M. phlei wurden bei der deutschen Sammlung von Mikroorganismen der Gcsellschalft für Strahlen- und Umweltforschung mbH München, Grisebachstraße 8, D-3400 Göttingen unter den Hinterlegungsnummern DSM 1036 bzw. DSM 936 hinterlegt

Die im Rahmen der Verfahren gemäß eier Erfindung verwendeten Mikroorganismen unterscheiden sich von der aus der genannten US-PS 37 59 791 bekannten Art Mycobacterium NRRL B-3805. Die Mycobacterium-Art NRRL B-3805 zeigt die allgemeinen Eigenschaften von Mycobacterium vaccae. Bei letzterer Art handelt es sich um eine von den erfindungsgemäß verwendeten Mycobacterium-Arten M. fortuitum und M. phlei deutlich verschiedene Art Bezüglich eines Vergleichs dieser Mikroorganismen siehe »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology«, 8. Ausgabe, The Williams and Wilkins Company, 1974, Seiten 695 und 696.

Die Morphologie und die Chemikalien- bzw. Drogenempfindlichkeit von M. fortuitum DSM 1036 und M. phlei DSM 936 sind von den entsprechenden Eigenschaften der Ausgangsarten M. fortuitum ATCC 6842 und M. phlei UC 3533 nicht zu unterscheiden. Beide M.-Fortuitum- und M.-Phlei-Kulturen stellen säurefeste, unbewegliche, nicht-sporenbildende Bacilli aus der Familie Mycobacteriaceae der Ordnung Actinomycetales dar. Nach der Runyons-Klassifizierung (vgl. E H. Runyon »Med. din. North America«, 43, 273 (1959)) handelt es sich bei M. fortuinum urn ein nicht-chromogenes, der Gruppe IV angehörendes Mycobacterium, d. h. es wächst rasch bei niedriger Temperatur unter Bildung nicht-pigmentierter Kolonien auf relativ einfach zusammengesetzte Medien. M. phlei stellt ebenfalls ein der Gruppe IV angehörendes Mycobacterium dar, das jedoch bei Züchtung auf einfach zusammengesetzte Medien tief gelbe bis orange Kolonien bildet.

M. fortuitum ATCC 6842 und M. foituitum DSM 1036 lassen sich hinsichtlich ihrer Wirkung auf Steroidmoleküle eindeutig voneinander unterscheiden. Wie bereits ausgeführt, kommt es beim Einsatz von M. fortuitum ATCC 6842 zu einem nichtselektiven Abbau von Steroiden, bei Einsatz von M. fortuitum DSM 1036 erfolgt dagegen ein selektiver Steroidabbau. Diese Eigenschaft von M. fortuitum DSM 1036 stellt eine in hohem Maße wertvolle Eigenschaft dar. Auch M. phlei UC 3533 und M. phlei DSM 936 unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Wirkung auf Steroidmoleküle. M. phlei UC 3533 bewirkt einen nicht-selektiven Steroidabbau. während M. phlei DSM 936 einen selektiven Abbau von Steroiden bewirkt.

Die Mutation von M. fortuitum ATCC 6842 und M. phlei UC 3533 zu M. fortuitum DSM 1036 und M. phlei DSM 936 erfolgt mit Hilfe von Nitrosoguanidin. Die Einzelheiten der Mutationsmaßnahmen werden im folgenden noch näher erläutert werden. Obwohl Mutationsverfahren allgemein bekannt sind, gibt es auf dem einschlägigen Fachgebiet keine Lehren oder sogar Vermutungen bezüglich der möglicherweise bei Durchführung der im vorliegenden Falle eingehaltenen Mutationsmaßnahmen erhältlichen Arten von Mutanten.

Die erfindungsgemäße selektive Umwandlung läßt sich in einer wachsenden Kultur von M. fortuitum DSM 1036 oder M. phlei DSM 936 entweder durch Zugabe des jeweiligen Steroidsubstrats zu der Kultur während der Inkubationsdauer oder durch Zusatz des jeweiligen Steroidsubstrats zu dem Nährmedium vor dem Beimpfen bewerkstelligen. Das Steroid kann entweder aiieme