DE2703645A1 - Verfahren zur herstellung eines gemischs aus androsta-1,4-dien-3,17- dion und androst-4-en-3,17-dion - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines gemischs aus androsta-1,4-dien-3,17- dion und androst-4-en-3,17-dion

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DE2703645A1 DE19772703645 DE2703645A DE2703645A1 DE 2703645 A1 DE2703645 A1 DE 2703645A1 DE 19772703645 DE19772703645 DE 19772703645 DE 2703645 A DE2703645 A DE 2703645A DE 2703645 A1 DE2703645 A1 DE 2703645A1
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    • C07J1/0011—Androstane derivatives substituted in position 17 by a keto group
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Description

2703645 Henkel, Kern, Feiler fr Hänzel Patentanwälte
_. TT . . „ Möhlstraße37
The Upjohn Company D-80OO München 80
Kalamazoo, Mich., V.St.A. Tel.:089/982085-87
Telex: 0529802 hnkJd Telegramme: ellipsoid
28. Jaa
Verfahren zur Herstellung eines Gemische aus Androsta-1,4-dien-3,17-dion und Androst-4~en-3,17-dion
Die Umwandlung von Steroiden durch Mikroorganismen wurde bereits recht weitgehend untersucht und in der Literatur veröffentlicht. Die früheste einschlägige Arbeit stammt offensichtlich von Mamoli und Vercellone aus dem Jahre 1937 "Berichte" 70, 470 und "Berichte" 70, 2079. AaO wird über die Reduktion von 17-Ketosteroiden zu 17ß-Hydroxysteroiden mit Hilfe von Gärhefe berichtet. Im Jahre 1952 (vgl. US-PS 2 602 769) berichten Peterson und Murray über die 11a-Hydroxylierung von Progesteron mit Hilfe des Pilzes Rhizopus nigricans. 1972 (vgl. US-PS 3 684 657) berichten Kraychy und Mitarbeiter über den selektiven mikrobiologischen Abbau von steroidischen 17-Alkylresten durch Vergären von Steroiden mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette mit Mycobacterium sp. NRRL B-3683 unter Bildung von Androst-4-en-3,17-dion, Androst-1,4-dien-
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3,17-dion und 20oc-Hydroxymethyl-pregna-1 ^-dien^-on. 1973 (vgl. US-PS 3 759 791) berichten Marsheck und Mitarbeiter über die selektive mikrobiologische Darstellung von Androst-4-en-3,17-dion durch Vergären eines Steroids der Cholestan- oder Stigmastanreihe mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette mit Mycobacterium sp. NRRL B-3805.
Mutanten, die durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen gekennzeichnet sind und in der Gärbrühe (fermentation beer) Androsta-1,4-dien-3,17-dion (im folgenden als ADD bezeichnet) und Androst-4-en-3,17-dion (im folgenden als AD bezeichnet) anhäufen, erhält man nach den im folgenden näher erläuterten Mutationsmaßnahmen oder anderen Mutationsmaßnahmen aus Mikroorganismen der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces, vorzugsweise Mycobacterium. Beispiele für Arten dieser Gattungen sind M. phlei, M. smegmatis, M. rhodochrous, M. mucosum, M. fortuitum und M. butyricum.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden insbesondere neue Mikroorganismenmutanten, nämlich Mycobacterium fortuitum NRRL B-8153 und Mycobacterium phlei NRRL B-8154 zum selektiven Abbau von Steroiden mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen zu ADD und AD benutzt. Beispiele für geeignete Steroidsubstrate sind Sitosterine, Cholesterine, Stigmasterine, Campesterin und
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ähnliche Steroide mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen. Diese Steroidsubsträte können entweder in reiner Form oder in Rohform zum Einsatz gelangen.
Wie bereits erwähnt, erhält man durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen gekennzeichnete und in der Nährbrühe ADD und AD anhäufende Mutanten durch Mutation von Mikroorganismen der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces.
Zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung wurden in der später beschriebenen Weise die Arten Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 und Mycobacterium phlei UC 3533 zu neuen Labormikroorganismusmutanten mutiert. Der ATCC-Katalog von 1974 erläutert neben der Auflistung von ATCC 6842 folgendes: "J.C. Cruz 2. Cold abscess. Acta Med. Rio de Janeiro 1:1 (1936). Medium 90 37C". M. fortuitum ATCC 6842 baut Sterine nicht selektiv zu niedrigmolekularen Verbindungen, beispielsweise COg + HgO, ab. Somit eignet sich dieser Mikroorganismus nicht zum selektiven Steroidabbau.
Bei der Mutation von M. fortuitum ATCC 6842 und M. phlei UC 3533 (UC steht für "Kultursammlung der Firma The Upjohn Company") mittels Nltrosoguanidin erhält man neue Mutanten, die selektiv Steroide mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen zu ADD und AD abzubauen vermögen. Diesen Mikroorganismusmutanten wurde
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durch das Northern Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA (die Mikroorganismusmutanten wurde^an dieser Hinterlegungsstelle in der Dauersammlung hinterlegt) die Nummern NRRL B-8153 und NRRL B-8I5A zugeteilt. Eine Subkultur dieser Mikroorganismen ist auf Anfrage von dieser Hinterlegungsstelle frei erhältlich. Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß die Verfügbarkeit bzw. Aushändigung der Kulturen keine Lizenz an einem etwa auf die vorliegende Patentanmeldung erteilten Patent begründet.
Die im Rahmen der Verfahren gemäß der Erfindung verwendeten Mikroorganismen unterscheiden sich von der aus der genannten US-PS 3 759 791 bekannten Art Mycobacterium NRRL B-3805. Die Mycobacterium-Art NRRL B-3805 zeigt die allgemeinen Eigenschaften von Mycobacterium vaccae. Bei letzterer Art handelt es sich um eine von den erfindungsgemäß verwendeten Mycobacterium-Arten M. fortuitum und M. phlei deutlich verschiedene Art. Bezüglich eines Vergleichs dieser Mikroorganismen siehe "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology"» 8· Ausgabe, The Williams and Wilkins Company, 1974, Seiten 695 und 696.
Die Morphologie und die Chemikalien- bzw. Drogenempfindlichkeit von M. fortuitum NRRL B-8153 und M. phlei NRRL B-8154 sind von den entsprechenden Eigenschaften der Ausgangsarten M. fortuitum ATCC 6842 und M. phlei UC 3533 nicht zu unterscheiden. Beide M. fortuitum- und M. phlei-Kultüren stellen säurefeste, unbewegliche, nicht-sporenbildende Bacilli aus der Familie Mycobacteriaceae der Ordnung Actinomycetales dar. Nach der Runyons-Klassifizierung (vgl. E.H.
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Runyon »Med. Clin. North America", 43, 273 (1959)) handelt es sich bei M. fortuitura um ein nicht-chromogenes, der Gruppe IV angehörendes Mycobacterium, d.h. es wächst rasch bei niedriger Temperatur unter Bildung nicht-pigmentierter Kolonien auf relativ einfach zusammengesetzten Medien. M. phlei stellt ebenfalls ein der Gruppe IV angehörendes Mycobacterium dar, das jedoch bei Züchtung auf einfach zusammengesetzten Medien tief gelbe bis orange Kolonien bildet.
M. fortuitum ATCC 6842 und M. fortuitum NRRL B-8153 lassen sich hinsichtlich ihrer Wirkung auf Steroidmoleküle eindeutig voneinander unterscheiden. Wie bereits ausgeführt, kommt es beim Einsatz von M. fortuitum ATCC 6842 zu einem nichtselektiven Abbau von Steroiden, bei Einsatz von M. fortuitum NRRL B-6153 erfolgt dagegen ein selektiver Steroidabbau. Diese Eigenschaft von M. fortuitum NRRL B-8153 stellt eine in hohem Maße wertvolle Eigenschaft dar. Auch M. phlei UC 3533 und M. phlei NRRL B-8154 unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Wirkung auf Steroidmoleküle. M. phlei UC 3533 bewirkt einen nicht-selektiven Steroidabbau, während M. phlei NRRL B-8154 einen selektiven Abbau von Steroiden bewirkt.
Die Mutation von M. fortuitum ATCC 6842 und M. phlei UC 3533 zu M. fortuitum NRRL B-8153 und M. phlei NRRL B-8154 erfolgt mit Hilfe von Nitrosoguanidin. Die Einzelheiten der Mutationsmaßnahmen werden im folgenden noch näher erläutert werden. Obwohl Mutationsverfahren allgemein bekannt sind, gibt es auf dem einschlägigen Fachgebiet keine Lehren
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• JfO-
oder sogar Vermutungen bezüglich der möglicherweise bei Durchführung der im vorliegenden Falle eingehaltenen Mutationsmaßnahmen erhältlichen Arten von Mutanten. Die im folgenden näher erläuterten Mutations- und Umwandlungsbzw. Transformationsmaßnahmen werden zwar im einzelnen für ein Mycobacterium beschrieben, es ist jedoch ohne weiteres möglich, ähnliche oder equivalente Maßnahmen bei Mikroorganismen der anderen genannten Gattungen anzuwenden.
Die erfindungsgemäße selektive Umwandlung läßt sich in einer wachsenden Kultur von M. fortuitum NRRL B-8153 oder M. phlei NRRL B-8154 entweder durch Zugabe des jeweiligen Steroidsubstrats zu der Kultur während der Inkubationsdauer oder durch Zusatz des jeweiligen Steroidsubstrats zu dem Nährmedium vor dem Beimpfen bewerkstelligen. Das Steroid kann entweder alleine oder in Kombination roit einem anderen Steroid zugesetzt werden. Der bevorzugte, jedoch nicht zwingend erforderliche Konzentrationsbereich für das Steroid in der Kultur beträgt etwa 0,1 bis etwa 100 g/l. Die Kultur wird in einem Nährmedium mit einem Kohlenstofflieferanten, beispielsweise einem assimilierbaren Kohlenhydrat, und einem Stickstofflieferanten, beispielsweise einer assimilierbaren Stickstoffverbindung oder einem eiweißartigen Material, wachsen gelassen bzw. gezüchtet. Bevorzugte Kohlenstofflieferanten sind Glukose, brauner Zucker, Rohrzucker, Glyzerin, Stärke, Maisstärke, Laktose, Dextrin, Melasse und dergleichen. Bevorzugte Stickstofflieferanten sind Maiseinweichflüssigkeit, Hefe, autolysierte Brauhefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, Pankreasverdauungsprodukte von Kasein, Fischmehl, Brennereirückstände, Tierpeptonflüssig-
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keiten, Fleisch- und Knochenabfälle, Ammoniumsalze und dergleichen. In vorteilhafter Weise können Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstofflieferanten zum Einsatz gelangen. Den Gär- bzw. Fermentationsmedien brauchen keine Spurenmetalle, z.B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Elsen und dergleichen, zugesetzt zu werden, da vor der Sterilisation des Mediums Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile als Komponenten des Mediums zum Einsatz gelangen.
Das Umwandlungsverfahren dauert etwa 72 h bis 15 Tage. Die Inkubationstemperatur reicht von etwa 25° bis etwa 37°C, für M. fortuitum NRRL B-8153 vorzugsweise 3O°C und für M. phlei NRRL B-8154 vorzugsweise 350C. Der Inhalt des Umwandlungsgefäßes wird mit sterilisierter Luft belüftet und zum leichteren Wachstum des jeweiligen Mikroorganismus bewegt. Auf diese Weise läßt sich der Wirkungsgrad des Umwandlungsverfahrens erhöhen.
Nach beendeter Umwandlung, ermittelt durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von handelsüblichen Silikagelplatten und eines Lösungsmittelsystems aus zwei Volumina Äthylacetat und drei Volumina Cyclohexan, wird das umgewandelte Steroid in üblicher bekannter Weise isoliert. So kann beispielsweise das Gär- bzw. Fermentations- oder Umwandlungsgemisch einschließlich der Gärbrühe und der Mikroorganismenzellen mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel für Steroide extrahiert werden. Geeignete Lösungsmittel sind vorzugsweise Dichlormethan, Methyl enchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylenchlorid, Trichloräthylen, Äther, Amylacetat, Benzol und dergleichen.
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Andererseits können die Gär- bzw. Fermentationsbrühe und die Zellen zunächst in üblicher bekannter Weise, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren, voneinander getrennt und dann getrennt mit geeigneten Lösungsmitteln extrahiert werden. Die Zellen können entweder mit einem mit Wasser mischbaren oder mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert werden. Die zellenfreie Gär- oder Fermentationsbrühe läßt sich mit mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln extrahieren.
Die Extrakte können durch Diatomeenerde filtriert werden, worauf das Filtrat im Vakuum zur Trockene destilliert wird. Der die gewünschten umgewandelten Steroide enthaltende Destillationsrückstand läßt sich in einer Mindestmenge eines 20:80-Äthylacetat/Cyclohexan-Gemischs lösen. Die erhaltene Lösung kann dann auf trockenem Silikagel unter Verwendung eines 20:80-Äthylacetat/Benzol-Gemischs als Entwickler chromatographiert werden. ADD und AD lassen sich aus dem Silikagel durch Eluieren mit einem 15:85-Äthylacetat/Chloroform-Gemisch abtrennen. Die Einzelverbindungen lassen sich aus dem Gemisch durch Verdampfen des Lösungsmittels und Umkristallisieren aus Hexan isolieren.
Die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren äs gewünschte Endprodukte anfallenden Verbindungen ADD und AD stellen bekannte Steroidzwischenprodukte dar. So eignen sich diese Verbindungen als Zwischenprodukte bei der Synthese geeigneter Steroidhormone. Aus ADD läßt sich beispielsweise nach dem aus der US-PS 3 274 183 bekannten Verfahren Östron herstellen. Aus AD kann man gemäß den Lehren der US-PS 2 143 453, 2 253 798, 2 264 888 und 2 356 154 Testosteron gewinnen.
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Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren gemäß der Erfindung näher veranschaulichen. Sofern nicht anders angegeben, bedeuten sämtliche Prozentangaben "Gewichtsprozente11. Ferner bedeuten sämtliche Mengenangaben bei Lösungsm^btelgemischen, sofern nicht anders angegeben, Volumenangaben.
Beispiel 1
Herstellung des Mutanten M. fortuitum NRRL B-8153 aus M. fortuitum ATCC 6842:
(a) Nitrosoguanidin-Mutagenese:
Zellen von M. fortuitum ATCC 6842 werden bei einer Temperatur von 28°C in einem sterilen i
sammensetzung wachsen gelassen:
tür von 28°C in einem sterilen Saatmedium der folgenden Zu-
Nährbrühe (Difco) 8 g/l
Hefeextrakt 1 g/l
Glyzerin 5 g/l
mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 1
Der pH-Wert des Mediums wird mit In-NaOH vor einer 20-minütigen Sterilisation bei 1210C auf 7,0 eingestellt.
Die Zellen werden bis zu einer Dichte von etwa 5 x 10 /ml wachsen gelassen, durch Zentrifugieren in Kügelchen überführt und dann mit einem gleichen Volumen sterilen 0,1m-Natriumcitrat eines pH-Werts von 5,6 gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden in demselben Volumen Citratpuffer resuspendiert, worauf ein aliquoter Teil zur Titerfeststellung (d.h. zur Zellenzählung) abgetrennt wird. Schließ-
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lieh wird Nitrosoguanidin bis zu einer Endkonzentration von 50 Ii g/ml zugesetzt. Die Zellensuspension wird in einem Wasserbad 30 min lang bei einer Temperatur von 37°C inkubiert, worauf erneut ein aliquoter Teil zur Titerfeststellung abgetrennt wird. Der Rest wird abzentrifugiert und mit einem gleichen Volumen sterilen 0,1m-Kaliumphosphats eines pH-Werts von 7,0 gewaschen. Schließlich werden die Zellen in einem sterilen Minimalsalzmedium ohne Kohlenstofflieferant der folgenden Zusammensetzung:
NH4NO3 1,0 g/l
K2HPO4 0,25 g/l
MgSO4.7H2O 0,25 g/l
NaCl 0,005 g/i
FeSO4YH2O 0,001 g/l
mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 1
resuspendiert. Der pH-Wert dieses Mediums wird vor einem 20-minütigen Sterilisieren bei 1210C mit In-HCl auf 7,0 eingestellt. Endlich werden die Zellen zur Auswahl der Mutanten ausgebreitet.
(b) Auswahl und Isolierung des Mutanten M. fortuitum NRRL B-8153:
Die in der geschilderten Weise mutagenisierten Zellen werden verdünnt und auf Platten verstrichen, die ein Medium der folgenden Zusammensetzung enthalten (modifiziert nach Fräser und Jerrel, I963 "J. Biol. Chern.", 205, 291 bis 295):
Glyzerin 10,0 g/l
K2HPO4 0,5 g/l
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1,0 g/l
TH2O 0,5 g/l
FeCl3.6H2O 0,05 g/l
mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 1
Nach Zugabe von 15 g/l Agar wird das Medium 30 min lang in einem Autoklaven auf eine Temperatur von 1210C erhitzt und dann in sterile Petri-Schalen gegossen. Das Wachsen bzw. die Züchtung auf diesem Medium eliminiert die meisten durch das Mutageneseverfahren gebildeten Nährauxotrophe. So werden beispielsweise Kulturen, die zum Wachsen auf chemisch definierten Medien Vitamine, Wachstumsfaktoren und dergleichen erfordern, eliminiert. Nach etwa 7-tägiger Inkubation bei einer Temperatur von 28°C werden die gebildeten Kolonien auf zur Auswahl von Mutanten geeignete Testplatten und dann zurück auf das auf Glyzerin basierende Medium enthaltende Kontrollplatten repliziert. Die Testplatten werden entsprechend der Veröffentlichung von G.E. Peterson, H.L. Lewis und J.R. Davis "Preparation of uniform dispersions of cholesterol and other water-insoluble carbon sources in agar media", J. Lipid Research 3, 275 bis 276 (1962) hergestellt. Das Minimalsalzmedium auf diesen Platten ist unter (a) von Beispiel 1 beschrieben. Nach Zugabe von 15 g/l Agar und 1,0 g/l eines geeigneten Kohlenstofflieferanten werden Steroide, wie Sitosterin oder Androstendion (AD), zugesetzt, worauf die erhaltene Suspension 30 min lang bei 1210C im Autoklaven erhitzt wird. Das sterile, heiße Gemisch wird hierauf in ein steriles Mischgefäß gegossen, mehrere min lang durchgemischt und schließlich in sterile Petri-Schalen gegossen. Bei diesen Maßnahmen kann es infolge Schaumbildung zu Schwierigkeiten kommen, diese lassen sich jedoch
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durch Durchmischen des heißen Gemischs und durch Abflammen der Oberfläche der geschmolzenen Agarplatten verringern. Auf diese Weise erhält man gleichmäßige Dispersionen wasserunlöslicher Kohlenstofflieferanten, wodurch die Herstellung sehr homogener, jedoch opaker Agarplatten erleichtert wird.
Die auf den Kontrollplatten gewachsenen Kolonien, jedoch nicht die auf den AD als einzigen Kohlenstofflieferanten enthaltenden Testplatten gewachsenen Kolonien, werden durch Ausstreichen auf Nähragarplatten gereinigt. Nach dem Wachsen bei einer Temperatur von 28°C werden mit Hilfe steriler Zahnstocher Einzelklonen von den Nähragarplatten gepflückt und durch Beimpfen netzartig gemusterter Platten mit AD als Kohlenstofflieferanten erneut getestet. Gereinigte Isolate, die noch einen von der Mutterkultur unterschiedlichen Phenotypus aufweisen, werden dann in Schüttelflaschen ausgewertet.
(c) Schüttelfla schenauswertung:
Es werden 500 ml fassende Schüttelflaschen mit 100 ml eines Biotransformationsmittels der folgenden Zusammensetzung verwendet:
Glyzerin 10,0 g/l
K2HPO4 0 ,5 g/l
MH4Cl 1 ,0 g/l
MgSO4-7H2O 0 ,5 g/l
FeCl,·6Η20 0 ,05 g/i
mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 1
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Hierauf werden in das Medium 1 g/l Sojamehl und dann 10 g/l Sitosterin eingemischt. Nach 30-minütigem Erhitzen der Flaschen in einem Autoklaven auf 1210C werden sie auf 28°C abgekühlt und dann mit 10 ml eines wie folgt hergestellten Saatguts beimpft:
Die gereinigten Isolate aixs Stufe (b) werden bei einer Temperatur von 280C auf geneigtem Agar wachsen gelassen. Zum Beimpfen einer 500 ml fassenden Flasche mit 100 ml eines sterilen Saatguts der folgenden Zusammensetzung:
Nährbrühe (Difco) 8 g/l
Hefeextrakt 1 g/l
Glyzerin 5 g/l
mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 1
T.'ird eine von einem geneigten Agar entnommene Öse voll Zellen verwendet. Der pH-Wert des Saatmediums wird vor dem 30-minütigen Erhitzen der Flaschen auf 1210C in einem Autoklaven mit In-NaOH auf 7,0 eingestellt. Die Saatflaschen werden 72 h lang bei einer Temperatur von 28°C inkubiert.
Wie bereits erwähnt, werden 10 ml gewachsene Saat zum Beimpfen sämtlicher 500-ml-Flaschen mit jeweils 100 ml sterilen Transformationsmediums verwendet. Hierauf werden die Flaschen bei einer Temperatur von 28° bis 300C auf einem Drehrüttler inkubiert, wobei von Zeit zu Zeit aliquote Proben entnommen werden. Diese Proben umfassen jeweils 10 ml und v/erden nach dem Austragen durch Schütteln mit drei Volumina Methylenchlorid extrahiert. Teile der Extrakte werden durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von
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Silikagel und des beschriebenen Lösungsmittelsystems, d.h. zwei Volumina Äthylacetat und drei Volumina Cyclohexan, sowie durch Gas/Flüssig-Chromatographie analysiert. Ein Nachweis der Anwesenheit von ADD und AD bestätigt den selektiven Abbau von Sitosterin durch den neuen Mutanten aus dem Muttermycobacterium M. fortuitum ATCC 6842.
Beispiel 2
!Anwandlung von Sitosterin in ADD und AD:
Das verwendete Medium entspricht dem Medium von Beispiel 1 (c). Dieses Medium wird durch 30-minütiges Erhitzen im Autoklaven auf 121°C sterilisiert, dann auf 3O0C abgekühlt und schließlich mit 10 Teilen einer Saatkultur des Mutanten Mycobacterium M. fortuitum NRRL B-8153, die entsprechend Beispiel 1 (c) hergestellt worden war, beimpft. Das beimpfte Gemisch wird unter Bewegung 336 h lang bei einer Temperatur von 30°C zur Begünstigung eines submersen Wachstums inkubiert. Nach der Inkubation wird das Gemisch mit Dichlormethan extrahiert. Der erhaltene Extrakt wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann durch Vakuumdestillation vom Lösungsmittel befreit. Hierauf wird der erhaltene Destillationsrückstand in einer Mindestmenge eines 20:80-Ä"thylacetat/Cyclohexan-Gemischs gelöst, worauf d:.e Lösung auf trockenem Silikagel unter Verwendung eines 20:80-Äthylacetat/Benzol-Lösungsmittelsystems chromatographiert wird. Die Anwesenheit von Androst-4-en-3,17-dion und Androsta-1,4-dien-3,17-dion ergibt sich aus einem Dünnschichtchromatogramm. Die erhaltenen Verbindungen werden aus dem Silikagel durch Eluieren mit einem 15:85-Äthylacetat/Chlo-
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roform-Lösungsmittelsystems abgetrennt, worauf die Einzelverbindungen durch Verdampfen des Lösungsmittels und Umkristallisieren des Verdampfungsrückstands aus Hexan isoliert werden.
Beispiel 3
Durch Ersatz von M. fortuitum NRRL B-8153 durch M. phlei IiRRL B-8154 in Beispiel 2 und Ändern der Inkubationstemperatur von 3O°C auf 35°C erhält man ebenfalls ein Gemisch aus ADD und AD.
Beispiel k
Durch Ersatz des Sitosterins durch Cholesterin in den Beispielen 2 und 3 erhält man ein Gemisch aus ADD und AD.
Beispiel 5
Durch Ersatz des Sitosterins durch Stigmasterin in den Beispielen 2 und 3 erhält man ein Gemisch aus ADD und AD.
Beispiel 6
Durch Ersatz des Sitosterins durch Campesterin in den Beispielen 2 und 3 erhält man ein Gemisch aus ADD und AD.
Beispiel 7
Durch Zugabe einer Kombination aus beliebigen Steroiden der Beispiele 2 bis 6 zu dem Sitosterin im Beispiel 2 und
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oder durch Ersatz des Sitosterins in den Beispielen 2 und 3 durch eine Kombination aus beliebigen Steroiden der Beispiele 2 bis 6 erhält man ebenfalls ein Gemisch aus ADD und AD.
Beispiel 8
Durch Ersatz von Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 bzw. Mycobacterium phlei UC 3533 im Beispiel 1 durch einen Mikroorganismus der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia oder Streptomyces erhält man Mikroorganismusmutanten, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit 17-Alky]seitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen und zur Anhäufung von ADD und AD in der Gärbrühe auszeichnen.
Beispiel 9
Durch Ersatz des M. fortuitum NRRI B-8153 "bzw. M. phlei NRRL B-8154 in den Beispielen 2 bis 7 durch die gemäß Beispiel 8 erhaltenen Mutanten erhält man ebenfalls ein Gemisch aus ADD und AD.
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Claims (20)

Patentansprüche
1. yerfahren zur Herstellung eines Gemischs aus Androsta- ^-' Λ ,4-dien-3,17-dion und Androst-4-en-3,17-dion, dadurch gekennzeichnet, daß man Mycobacterium fortuitum NRRL B-8153 in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette züchtet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Sitosterin verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Cholesterin verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Stigmasterin verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Campesterin verwendet.
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ORlQtNAL tNSPECTED
6. Verfahren zur Herstellung eines Gemischs aus Androsta-1,4-dien-3,17-dion und Androst-4-en-3,17-dion, dadurch gekennzeichnet, daß man Mycobacterium fortuitum NRRL B-8153 in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Gemischs aus zwei oder mehr Steroiden mit jeweils 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette züchtet.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Steroidgemisch aus Sitosterin und/oder Cholesterin und/oder Stigmasterin und/oder Campesterin verwendet.
8. Verfahren zur Herstellung eines Gemischs aus Androsta-1,4-dien-3,17-dion und Androst-4-en-3,17-dion, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismusmutanten aus der Gruppe Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces, der sich durch seine Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen und zur Bildung bzw. Ansammlung von Androsta-1,4-dien-3,17-dion und Androst-4-en-3,17-dion in der Gärbrühe auszeichnet, in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette züchtet.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismusmutarten in einer wäßrigen Nährbrühe unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Gemischs aus zwei oder mehr Steroiden mit jeweils 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette züchtet.
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10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß
man als Steroid Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin oder Campesterin verwendet.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Steroidgemisch aus Sitosterin und/oder Cholesterin und/oder Stigmasterin und/oder Campesterin verwendet .
12. Verfahren zur Herstellung eines Gemischs aus Androsta-1,4-dien-3,17-dion und Androst-4-en-3,17-dion, dadurch gekennzeichnet, daß man Mycobacterium phlei NRRL B-8154 in einem wäßrigen HährmediuiE unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit 2 bis einschließlich Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette züchtet.
13. Verfahren- nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Sitosterin verwendet.
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Cholesterin verwendet.
15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Stigmasterin verwendet.
16. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Campesterin verwendet.
17. Verfahren zur Herstellung eines Gemischs aus Androsta-1,4-dien-3,17-dion und Androst-4-en-3,17-dion, dadurch gekennzeichnet, daß man Mycobacterium phlei NRRL B-8154 in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Gemischs aus zwei oder mehr Steroiden
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mit jeweils 2 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette züchtet.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Steroidgemisch aus Sitosterin und/oder Cholesterin und/oder Stigmasterin und/oder Campesterin verwendet.
19. Neuer Laboratoriumsmutant Mycobacterium fortuitum NRRL B-8153.
20. Neuer Laboratoriumsmutant Mycobacterium phlei NRRL B-8154-.
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