CH637993A5

CH637993A5 - Process for the preparation of a mixture of androsta-1,4-diene-3,17-dione and androst-4-ene-3,17-dione

Info

Publication number: CH637993A5
Application number: CH234077A
Authority: CH
Inventors: Merle Gene Wovcha; Candice Brenda Biggs
Original assignee: Upjohn Co
Priority date: 1976-03-01
Filing date: 1977-02-24
Publication date: 1983-08-31
Also published as: NL7701346A; FR2345464A1; PL111029B1; NL170435B; FR2345464B1; JPS6141547B2; IL51370A0; MX6932E; JPS60133884A; PL196355A1; CH638563A5; MX4503E; IL51370A; IL60476A; DE2703645A1; MX6933E; DE2703645B2; IL60476A0; PL113212B1; DE2703645C3

Description

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden insbesondere neue Mikroorganismenmutanten, nämlich Mycobacterium fortuitum NRRL B-8153 und Mycobacterium phlei NRRL B-8154 zum selektiven Abbau von Steoriden mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen zu ADD und AD benutzt. Beispiele für geeignete Ste-roidsubstrate sind Sitosterine, Cholesterine, Stigmasterine, Campesterin und ähnliche Steroide mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen. Diese Ste-roidsubstrate können entweder in reiner Form oder in Rohform zum Einsatz gelangen.

Wie bereits erwähnt, erhält man durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen gekennzeichnete und in der Nährbrühe ADD und AD anhäufende Mutanten durch Mutation von Mikroorganismen der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces.

Zur Durchführung des Verfahrens gemäss der Erfindung wurden in der später beschriebenen Weise die Arten Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 und Mycobacterium phlei UC 3533 zu neuen Labormikroorganismusmutanten mutiert. Der ATCC-Katalog von 1974 erläutert neben der Auflistung von ATCC 6842 folgendes: «J.C. Cruz 2. Cold abscess. Acta Med. Rio de Janeiro 1:1 (1936). Medium 90 37C». M. fortuitum ATCC 6842 baut Sterine nicht selektiv zu niedrigmolekularen Verbindungen, beispielsweise CO2 + H2O, ab. Somit eignet sich dieser Mikroorganismus nicht zum selektiven Steroidabbau.

Bei der Mutation von M. fortuitum ATCC 6842 und M. phlei UC 3533 (UC steht für «Kultursammlung der Firma The Upjohn Company») mittels Nitrosoguanidin erhält man neue Mutanten, die selektiv Steroide mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen zu ADD und AD abzubauen vermögen. Diesen Mikroorganismusmutanten wurde durch das Northern Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA (die Mikroorganismusmutanten wurden an dieser Hinterlegungsstelle in der Dauersammlung am 12. Februar 1976 hinterlegt) die Nummern NRRL B-8153 und NRRL B-8154 zugeteilt. Eine Subkultur dieser Mikroorganismen ist auf s

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Anfrage von dieser Hinterlegungsstelle frei erhältlich. Es sei jedoch daraufhingewiesen, dass die Verfügbarkeit bzw. Aushändigung der Kulturen keine Lizenz an einem etwa auf die vorliegende Erfindung erteilten Patent begründet.

Die im Rahmen der Verfahren gemäss der Erfindung verwendeten Mikroorganismen unterscheiden sich von der aus der genannten US-PS 3 759 791 bekannten Art Mycobacterium NRRL B-3805. Die Mycobacterium-Art NRRL B-3805 zeigt die allgemeinen Eigenschaften von Mycobacterium vaccae. Bei letzterer Art handelt es sich um eine von den erfindungsgemäss verwendeten Mycobacterium-Arten M. fortuitum und M. phlei deutlich verschiedene Art. Bezüglich eines Vergleichs dieser Mikroorganismen siehe «Bergey's Manual of Determinative Bacteriology», 8. Ausgabe, The Williams and Wilkins Company, 1974, Seiten 695 und 696.

Die Morphologie und die Chemikalien- bzw. Drogenempfindlichkeit von M. fortuitum NRRL B-8153 und M. phlei NRRL B-8154 sind von den entsprechenden Eigenschaften der Ausgangsarten M. fortuitum ATCC 6842 und M. phlei UC 3533 nicht zu unterscheiden. Beide M. fortuitum- und M. phlei-Kulturen stellen säurefeste, unbewegliche, nicht-spo-renbildende Bacilli aus der Familie Mycobacteriaceae der Ordnung Actinomycetales dar. Nach der Runyons-Klassifi-zierung [vgl. E.H. Runyon «Med. Clin. North America», 43, 273 (1959)] handelt es sich bei M. fortuitum um ein nicht-chromogenes, der Gruppe IV angehörendes Mycobacterium, d.h., es wächst rasch bei niedriger Temperatur unter Bildung nicht-pigmentierter Kolonien auf relativ einfach zusammengesetzten Medien. M. phlei stellt ebenfalls ein der Gruppe IV angehörendes Mycobacterium dar, das jedoch bei Züchtung auf einfach zusammengesetzten Medien tief gelbe bis orange Kolonien bildet.

M. fortuitum ATCC 6842 und M. fortuitum NRRL B-8153 lassen sich hinsichtlich ihrer Wirkung auf Steroidmoleküle eindeutig voneinander unterscheiden. Wie bereits ausgeführt, kommt es beim Einsatz von M. fortuitum ATCC 6842 zu einem nicht-selektiven Abbau von Steroiden, bei Einsatz von M. fortuitum NRRL B-8153 erfolgt dagegen ein selektiver Steroidabbau. Diese Eigenschaft von M. fortuitum NRRL B-8153 stellt eine in hohem Masse wertvolle Eigenschaft dar. Auch M. phlei UC 3533 und M. phlei NRRL B-8154 unter- -scheiden sich hinsichtlich ihrer Wirkung auf Steroidmoleküle. M. phlei UC 3533 bewirkt einen nicht-selektiven Steroidabbau, während M. phlei NRRL B-8154 einen selektiven Abbau von Steroiden bewirkt.

Die Mutation von M. fortuitum ATCC 6842 und M. phlei UC 3533 zu M. fortuitum NRRL B-8153 und M. phlei NRRL B-8154 erfolgt mit Hilfe von Nitrosoguanidin. Die Einzelheiten der Mutationsmassnahmen werden im folgenden noch näher erläutert werden. Obwohl Mutationsverfahren allgemein bekannt sind, gibt es auf dem einschlägigen Fachgebiet keine Lehren oder sogar Vermutungen bezüglich der möglicherweise bei Durchführung der im vorliegenden Falle eingehaltenen Mutationsmassnahmen erhältlichen Arten von Mutanten. Die im folgenden näher erläuterten Mutationsund Umwandlungs- bzw. Transformationsmassnahmen werden zwar im einzelnen für ein Mycobacterium beschrieben, es ist jedoch ohne weiteres möglich, ähnliche oder equivalente Massnahmen bei Mikroorganismen der anderen genannten Gattungen anzuwenden.

Die selektive Umwandlung lässt sich in einer wachsenden Kultur von M. fortuitum NRRL B-8153 oder M. phlei NRRL B-8154 entweder durch Zugabe des jeweiligen Steroidsub-strats zu der Kultur während der Inkubationsdauer oder durch Zusatz des jeweiligen Steroidsubstrats zu dem Nährmedium vor dem Beimpfen bewerkstelligen. Das Steroid kann entweder alleine oder in Kombination mit einem anderen Steroid zugesetzt werden. Der bevorzugte, jedoch nicht zwingend erforderliche Konzentrationsbereich für das Steroid in der Kultur beträgt etwa 0,1 bis etwa 100 g/1. Die Kultur wird in einem Nährmedium mit einem Kohlenstofflieferanten, beispielsweise einem assimilierbaren Kohlenhydrat, und einem Stickstofflieferanten, beispielsweise einer assimilierbaren Stickstoffverbindung oder einem eiweissar-tigen Material, wachsen gelassen bzw. gezüchtet. Bevorzugte Kohlenstofflieferanten sind Glukose, brauner Zucker, Rohrzucker, Glyzerin, Stärke, Maisstärke, Laktose, Dextrin, Melasse und dergleichen. Bevorzugte Stickstofflieferanten sind Maiseinweichflüssigkeit, Hefe, autolysierte Brauhefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maismehl, Milchfeststoffe, Pankreasverdauungsprodukte von Kasein, Fischmehl, Brennereirückstände, Tierpepton-flüssigkeiten, Fleisch- und Knochenabfälle, Ammoniumsalze und dergleichen. In vorteilhafter Weise können Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstofflieferanten zum Einsatz gelangen. Den Gär- bzw. Fermentationsmedien brauchen keine Spurenmetalle, z.B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergleichen, zugesetzt werden, da vor der Sterilisation des Mediums normalerweise Leitungswasser und ungereinigte Bestandteile als Komponenten des Mediums zum Einsatz gelangen.

Das Umwandlungsverfahren dauert im allgemeinen etwa 72 h bis 15 Tage. Die Inkubationstemperatur reicht gewöhnlich von etwa 25° bis etwa 37°C, für M. fortuitum NRRL B-8153 vorzugsweise 30°C und für M. phlei NRRL B-8154 vorzugsweise 35°C. Der Inhalt des Umwandlungsge-fässes wird mit sterilisierter Luft belüftet und zum leichteren Wachstum des jeweiligen Mikroorganismus vorzugsweise bewegt. Auf diese Weise lässt sich der Wirkungsgrad des Umwandlungsverfahrens erhöhen.

Nach beendeter Umwandlung, ermittelt durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von handelsüblichen Silikagelplatten und eines Lösungsmittelsystems aus zwei Volumina Äthylacetat und drei Volumina Cyclohexan kann das umgewandelte Steroid in üblicher bekannter Weise isoliert werden. So kann beispielsweise das Gär- bzw. Fermentations- oder Umwandlungsgemisch einschliesslich der Gärbrühe und der Mikroorganismenzellen mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel für Steroide extrahiert werden. Geeignete Lösungsmittel sind vorzugsweise Dichlormethan, Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylenchlorid, Trichloräthylen, Äther, Amylacetat, Benzol und dergleichen.

Andererseits können die Gär- bzw. Fermentationsbrühe und die Zellen zunächst in üblicher bekannter Weise, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren, voneinander getrennt und dann getrennt mit geeigneten Lösungsmitteln extrahiert werden. Die Zellen können entweder mit einem mit Wasser mischbaren oder mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert werden. Die zellenfreie Gär- und Fermentationsbrühe lässt sich mit mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln extrahieren.

Die Extrakte können durch Diatomeenerde filtriert werden, worauf das Filtrat im Vakuum zur Trockene destilliert wird. Der die gewünschten umgewandelten Steroide enthaltende Destillationsrückstand lässt sich in einer Mindestmenge eines 20:80-Äthylacetat/Cyclohexan-Gemischs lösen. Die erhaltene Lösung kann dann auf trockenem Silikagel unter Verwendung eines 20:80-Äthylacetat/Benzol-Gemischs als Entwickler chromatographiert werden. ADD und AD lassen sich aus dem Silikagel durch Eluieren mit einem 15:85-Äthylacetat/Chloroform-Gemisch abtrennen. Die Einzelverbindungen lassen sich aus dem Gemisch durch Verdampfen des Lösungsmittels und Umkristallisieren aus Hexan isolieren.

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Die bei der Durchführung der erfindungsgemässen Verfahren als gewünschte Endprodukte anfallenden Verbindungen ADD und AD stellen bekannte Steroidzwischenpro-dukte dar. So eignen sich diese Verbindungen als Zwischenprodukte bei der Synthese geeigneter Steroidhormone. Aus ADD lässt sich beispielsweise nach dem aus der US-PS 3 274183 bekannten Verfahren Östron herstellen. Aus AD kann man gemäss den Lehren der US-PS 2 143 453,2 253 798, 2 264 888 und 2 356 154 Testosteron gewinnen.

Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren gemäss der Erfindung näher veranschaulichen. Sofern nicht anders angegeben, bedeuten sämtliche Prozentangaben «Gewichtsprozente». Ferner bedeuten sämtliche Mengenangaben bei Lösungsmittelgemischen, sofern nicht anders angegeben, Volumenangaben.

Beispiel 1

Herstellung des Mutanten M. fortuitum NRRL B-8153 aus M. fortuitum ATCC 6842:

(a) Nitrosoguanidin-Mutagenese:

Zellen von M. fortuitum ATCC 6842 werden bei einer Temperatur von 28°C in einem sterilen Saatmedium der folgenden Zusammensetzung wachsen gelassen:

Nährbrühe (Difco) 8 g/1

Hefeextrakt 1 g/1

Glyzerin 5 g/1

mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 11

Der pH-Wert des Mediums wird mit 1 n-NaOH vor einer 20minütigen Sterilisation bei 121°C auf 7,0 eingestellt.

Die Zellen werden bis zu einer Dichte von etwa 5 x 108/ml wachsen gelassen, durch Zentrifugieren in Kügelchen überführt und dann mit einem gleichen Volumen sterilen 0,1m-Natriumcitrat eines pH-Werts von 5,6 gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden in demselben Volumen Citratpuffer resuspendiert, worauf ein aliquoter Teil zur Titerfeststellung (d.h. zur Zellenzählung) abgetrennt wird. Schliesslich wird Nitrosoguanidin bis zu einer Endkonzentration von 50 ug/ml zugestzt. Die Zellensuspension wird in einem Wasserbad 30 min lang bei einer Temperatur von 37°C inkubiert, worauf erneut ein aliquoter Teil zur Titerfeststellung abgetrennt wird. Der Rest wird abzentrifugiert und mit einem gleichen Volumen sterilen O,lm-Kaliumphosphats eines pH-Werts von 7,0 gewaschen. Schliesslich werden die Zellen in einem sterilen Minimalsalzmedium ohne Kohlenstofflieferant der folgenden Zusammensetzung:

NH4NO3 1,0 g/1

K2HPO4 0,25 g/1

MgS04-7H20 0,25 g/1

NaCl 0,005 g/1

FeS04-7H:0 0,001 g/1

mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 11

resuspendiert. Der pH-Wert dieses Mediums wird vor einem 20minütigen Sterilisieren bei 121 °C mit ln-HCl auf 7,0 eingestellt. Endlich werden die Zellen zur Auswahl der Mutanten ausgebreitet.

(b) Auswahl und Isolierung des Mutanten M. fortuitum NRRL B-8153:

Die in der geschilderten Weise mutagenisierten Zellen werden verdünnt und auf Platten verstrichen, die ein Medium der folgenden Zusammensetzung enthalten (modifiziert nach Fraser und Jerrel, 1963 «J. Biol. Chem.», 205,291 bis 295):

Glyzerin 10,0 g/1

K2HPO4 0,5 g/1

NH4C1 1,0 g/1

MgSC>4 • 7H2O 0,5 g/1

5 FeCb • 6H2O 0,05 g/1

mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 11

Nach Zugabe von 15 g/1 Agar wird das Medium 30 min lang in einem Autoklaven auf eine Temperatur von 121°C 10 erhitzt und dann in sterile Petri-Schalen gegossen. Das Wachsen bzw. die Züchtung auf diesem Medium eliminiert die meisten durch das Mutageneseverfahren gebildeten Nähr-auxotrophe. So werden beispielsweise Kulturen, die zum Wachsen auf chemisch definierten Medien Vitamine, Wachs-15 tumsfaktoren und dergleichen erfordern, eliminiert. Nach etwa 7tägiger Inkubation bei einer Temperatur von 28°C werden die gebildeten Kolonien auf zur Auswahl von Mutanten geeignete Testplatten und dann zurück auf das auf Glyzerin basierende Medium enthaltende Kontrollplatten 20 repliziert. Die Testplatten werden entsprechend der Veröffentlichung von G.E. Peterson, H.L. Lewis und J.R. Davis «Préparation of uniform dispersions of cholesterol and other water-insoluble carbon sources in agar media», J. Lipid Research 3,275 bis 276 (1962) hergestellt. Das Minimalsalz-25 medium auf diesen Platten ist unter (a) von Beispiel 1

beschrieben. Nach Zugabe von 15 g/1 Agar und 1,0 g/1 eines geeigneten Kohlenstofflieferanten werden Steroide, wie Sitosterin oder Androstendion (AD), zugesetzt, worauf die erhaltene Suspension 30 min lang bei 121°C im Autoklaven erhitzt 30 wird. Das sterile, heisse Gemisch wird hierauf in ein steriles Mischgefäss gegossen, mehrere min lang durchgemischt und schliesslich in sterile Petri-Schalen gegossen. Bei diesen Massnahmen kann es infolge Schaumbildung zu Schwierigkeiten kommen, diese lassen sich jedoch durch Durchmi-35 sehen des heissen Gemischs und durch Abflammen der Oberfläche der geschmolzenen Agarplatten verringern. Auf diese Weise erhält man gleichmässige Dispersionen wasserunlöslicher Kohlenstofflieferanten, wodurch die Herstellung sehr homogener, jedoch opaker Agarplatten erleichtert wird. 40 Die auf den Kontrollplatten gewachsenen Kolonien, jedoch nicht die auf den AD als einzigen Kohlenstoffliefe-* ranten enthaltenden Testplatten gewachsenen Kolonien, werden durch Ausstreichen auf Nähragarplatten gereinigt. Nach dem Wachsen bei einer Temperatur von 28°C werden 45 mit Hilfe steriler Zahnstocher Einzelklonen von den Nähragarplatten gepflückt und durch Beimpfen netzartig gemusterter Platten mit AD als Kohlenstofflieferanten erneut getestet. Gereinigte Isolate, die noch einen von der Mutterkultur unterschiedlichen Phenotypus aufweisen, werden dann in 50 Schüttelflaschen ausgewertet.

(c) Schüttelflaschenauswertung:

Es werden 500 ml fassende Schüttelflaschen mit 100 ml 55 eines Biotransformationsmittels der folgenden Zusammensetzung verwendet:

NH4C1

3,0 g/1

Harnstoff

0,5 g/1

Cerelose

10,0 g/1

KH2PO4

0,5 g/1

MgS04-7H20

0,5 g/1

FeCb•6H2O

0,5 g/1

CaCOs

3,0 g/1

Tween 80*

0,5 g/1

mit Wasser aus dem Hahn aufgefüllt auf

1 Liter

* Atlas Refinery, Inc., Newark, New Jersey

Hierauf werden in das Medium 1 g/1 Sojamehl und dann 30 g/1 Sitosterin eingemischt. Nach 30minütigem Erhitzen der Flaschen in einem Autoklaven auf 121°C werden sie auf 28°C abgekühlt und dann mit 10 ml eines wie folgt hergestellten Saatguts beimpft:

Die gereinigten Isolate aus Stufe (b) werden bei einer Temperatur von 28°C auf geneigtem Agar wachsen gelassen. Zum Beimpfen einer 500 ml fassenden Flasche mit 100 ml eines sterilen Saatguts der folgenden Zusammensetzung:

Nährbrühe (Difco) 8 g/1

Hefeextrakt 1 g/1

Glyzerin 5 g/1

mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 11

wird eine von einem geneigten Agar entnommene Öse voll Zellen verwendet. Der pH-Wert des Saatmediums wird vor dem 30minütigen Erhitzen der Flaschen auf 121°C in einem Autoklaven mit ln-NaOH auf 7,0 eingestellt. Die Saatflaschen werden 72 h lang bei einer Temperatur von 28°C inkubiert.

Wie bereits erwähnt, werden 10 ml gewachsene Saat zum Beimpfen sämtlicher 500-ml-Flaschen mit jeweils 100 ml sterilen Transformationsmediums verwendet. Hierauf werden die Flaschen bei einer Temperatur von 28° bis 30°C auf einem Drehrüttler inkubiert, wobei von Zeit zu Zeit aliquote Proben entnommen werden. Diese Proben umfassen jeweils 10 ml und werden nach dem Austragen durch Schütteln mit drei Volumina Methylenchlorid extrahiert. Teile der Extrakte werden durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silikagel und des beschriebenen Lösungsmittelsystems, d.h. zwei Volumina Äthylacetat und drei Volumina Cyclohexan, sowie durch Gas/Flüssig-Chromatographie analysiert. Ein Nachweis der Anwesenheit von ADD und AD bestätigt den selektiven Abbau von Sitosterin durch den neuen Mutanten aus dem Muttermycobacterium M. fortuitum ATCC 6842.

Beispiel 2

Umwandlung von Sitosterin in ADD und AD:

Das verwendete Medium entspricht dem Medium von Beispiel 1 (c). Dieses Medium wird durch 30minütiges Erhitzen im Autoklaven auf 121°C sterilisiert, dann auf 30°C abgekühlt und schliesslich mit 10 Teilen einer Saatkultur des Mutanten Mycobacterium M. fortuitum NRRL B-8153, die entsprechend Beispiel 1 (c) hergestellt worden war, beimpft. Das beimpfte Gemisch wird unter Bewegung 336 h lang bei einer Temperatur von 30°C zur Begünstigung eines sub-mersen Wachstums inkubiert. Nach der Inkubation wird das Gemisch mit Dichlormethan extrahiert. Der erhaltene Extrakt wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann durch Vakuumdestillation vom Lösungsmittel befreit. Hierauf wird der erhaltene Destillationsrückstand in einer Mindestmenge eines 20:80-Äthylacetat/Cyclohexan-

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Gemisches gelöst, worauf die Lösung auf trockenem Silikagel unter Verwendung eines 20:80-Äthylacetat/Benzol-Lösungsmittelsystems chromatographiert wird. Die Anwesenheit von Androst-4-en-3,17-dion und Androsta-l,4-dien-3,l7-dion ergibt sich aus einem Dünnschichtchromatogramm. Die erhaltenen Verbindungen werden aus dem Silikagel durch Eluieren mit einem 15:85-Äthylacetat/Chloroform-Lösungs-mittelsystems abgetrennt, worauf die Einzelverbindungen durch Verdampfen des Lösungsmittels und Umkristallisieren des Verdampfungsrückstands aus Hexan isoliert werden.

Beispiel 3

Durch Ersatz von M. fortuitum NRRL B-8153 durch M. phlei NRRL B-8154 in Beispiel 2 und Ändern der Inkubationstemperatur von 30°C auf 35°C erhält man ebenfalls ein Gemisch aus ADD und AD.

Beispiel 4

Durch Ersatz des Sitosterins durch Cholesterin in den Beispielen 2 und 3 erhält man ein Gemisch aus ADD und AD.

Beispiel 5

Durch Ersatz des Sitosterins durch Stigmasterin in den Beispielen 2 und 3 erhält man ein Gemisch aus ADD und AD.

Beispiel 6

Durch Ersatz des Sitosterins durch Campesterin in den Beispielen 2 und 3 erhält man ein Gemisch aus ADD und . AD.

Beispiel 7

Durch Zugabe einer Kombination aus beliebigen Steroiden der Beispiele 2 bis 6 zu dem Sitosterin im Beispiel 2 und 3 oder durch Ersatz des Sitosterins in den Beispielen 2 und 3 durch eine Kombination aus beliebigen Steroiden der Beispiele 2 bis 6 erhält man ebenfalls ein Gemisch aus ADD und AD.

Beispiel 8

Durch Ersatz von Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 bzw. Mycobacterium phlei UC 3533 im Beispiel 1 durch einen Mikroorganismus der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia oder Strepto-myces erhält man Mikroorganismusmutanten, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen und zur Anhäufung von ADD und AD in der Gärbrühe auszeichnen.

Bèispiel 9

Durch Esatz des M. fortuitum NRRL B-8153 bzw. M. phlei NRRL B-8154 in den Beispielen 2 bis 7 durch die gemäss Beispiel 8 erhaltenen Mutanten erhält man ebenfalls ein Gemisch aus ADD und AD.

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1. Verfahren zur Herstellung eines Gemischs aus Androsta-l,4-dien-3,17-dion und Androst-4-en-3,17-dion, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismusmutanten von Mycobacterium fortuitum oder von Mycobacterium phlei, der sich durch seine Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen und zur Bildung bzw. Ansammlung von Androsta-l,4-dien-3,17-dion und Androst-4-en-3,17-dion in der Gärbrühe auszeichnet, in einem wäss-rigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit 2 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette züchtet.

2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Gemischs aus Androsta-1,4-dien-3,17-dion und Androst-4-en-3,17-dion, dadurch gekennzeichnet, dass man Mycobacterium fortuitum NRRL B-8153 in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit 2 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen in der

17-Alkylseitenkette züchtet.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Steroid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin und Cam-pesterin.

4. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Gemischs aus Androsta-1,4-dien-3,17-dion und Androst-4-en-3,17-dion, dadurch gekennzeichnet, dass man Mycobacterium phlei NRRL B-8154 in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit 2 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkyl-seitenkette züchtet.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Steroid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin und Cam-pesterin.

6. Mittel zur Durchführung des Verfahrens gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismusmutanten von Mycobacterium fortuitum oder von Mycobacterium phlei einsetzt.

7. Mittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man Mycobacterium fortuitum NRRL B-8153 einsetzt.

8. Mittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man Mycobacterium phlei NRRL B-8154 einsetzt.

Die Umwandlung von Steroiden durch Mikroorganismen wurde bereits recht weitgehend untersucht und in der Literatur veröffentlicht. Die früheste einschlägige Arbeit stammt offensichtlich von Mamoli und Vercellone aus dem Jahre 1937 «Berichte» 70,470 und «Berichte» 70,2079. AaO wird über die Reduktion von 17-Ketosteroidenzu 17ß-Hydroxy-steroiden mit Hilfe von Gärhefe berichtet. Im Jahre 1952 (vgl. US-PS 2 602 769) berichten Peterson und Murray über die 1 la-Hydroxylierung von Progesteron mit Hilfe des Pilzes Rhizopus nigricans. 1972 (vgl. US-PS 3 684 657) berichten Kraychy und Mitarbeiter über den selektiven mikrobiologischen Abbau von steroidischen 17-Alkylresten durch Vergären von Steroiden mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette mit Mycobacterium sp. NRRL B-3683 unter Bildung von Androst-4-en-3,17-dion, Androst-l,4-dien-3,l7-dion und 20a-Hydroxymethyl-pregna-l,4-dien-3-on. 1973 (vgl. US-PS 3 759 791) berichten Marsheck und Mitarbeiter über die selektive mikrobiologische Darstellung von Androst-4-en-3,17-dion durch Vergären eines Steroids der Cholestan- oder Stigmastanreihe mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette mit Mycobacterium sp. NRRL B-3805.

Mutanten, die durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen gekennzeichnet sind und in der Gärbrühe (fermentation beer) Androsta-l,4-dien-3,17-dion (im folgenden als ADD bezeichnet) und Androst-4-en-3,17-dion (im folgenden als AD bezeichnet) anhäufen, erhält man nach den im folgenden näher erläuterten Mutations-massnahmen oder anderen Mutationsmassnahmen aus Mikroorganismen der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Strepto-myces, vorzugsweise Mycobacterium. Beispiele für Arten dieser Gattungen sind M. phlei, M. smegmatis, M. rhodo-chrous, M. mucosum, M. fortuitum und M. butyricum.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung eines Gemischs aus Androsta-l,4-dien-3,l7-dion und Androst-4-en-3,17-dion ist dadurch gekennzeichent, dass man einen Mikroorganismusmutanten von Mycobacterium fortuitum oder von Micobacterium phlei, der sich durch seine Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit 17-Alkylseitenketten mit 2 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen und zur Bildung bzw. Ansammlung von Androsta-1,4-dien-3,17-dion und Androst-4-en-3,17-dion in der Gärbrühe auszeichnet, in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit 2 bis einschliesslich 10 Kohlenstoffatomen in der 17-Alkylseitenkette züchtet.