Przedmiotem wynalazku jest sposób mikrobiolo¬ gicznego wytwarzania mieszaniny androstadieno- -l,4-dionu-3,17 (ADD) i androsteno-4-dionu-3,17 (AD) za pomoca nowych mutanów.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze prowadzi sie hodowle nowych mutanów mikirooir- ganizmów rodzaju Mycobacterium phlei NRRL B- -8154 charakteryzujacych sie zdolnoscia selektyw¬ nego degradowania steroidów o lancuchu bocznym w .pozycji 17 stanowiacych alfcil o 2—10 atomach wegla i akumulowania androstadieno-l,4-dionu-3,17 i androsteno-4-dionu-3,17 w brzeczce pofermenta¬ cyjnej, w wodnym roztworze pozywki przy doste¬ pie powietrza, w obecnosci jednego lub kilku ste¬ roidów o lancuchu bocznym stanowiacym alkil za¬ wierajacy 2—17 atomów wegla.Wytworzone sposobem wedlug wynalazku ADD i AD sa cennymi pólproduktami do wytwarzania innych pochodnych steroidów.Proces przeksztalcania steroidów przez mikro-^ organizmy badano i udokumentowano w szerokim zakresie. Pierwszymi pracami na ten temat byly opracowania Mamoli i Vercellone z 1937 r., Ber 79, 470 i Ber 70, 2079. Opisali oni redukcje 17-keto- steroidów do 17-0-hydroksysteroidów przez fer¬ mentujace drozdze. Pózniej Petersom i Munray opi¬ sali hydroksylowanie progesteronu w pozycji lla za pomoca plesniaka Rhizopus nigricans opis pa¬ tentowy St. Zjedn. Am. nr. 2 602 769 z 1952 r.).Nastepnie Kraychy i inni, w opisie patentowym 10 15 20 Stanów Zjednoczonych Ameryki nr. 3 684 657 z 1972 r. podali sposób selektywnego, mikrobiologicz¬ nego odszczepiania alkilu z pozycji 17 steroidów przez fermentacje steroidu zawierajacego w lan¬ cuchu bocznym w pozycji 17 alkil o co najmniej 8 atomach wegla za ipomoca Mycobacterifum nr NRRL B-3683 w celu otrzymania androsteno-4-dio- nu-317, androstad4eno-l,4-dnionu-3,17 i 20 a-hy- drok^ymeitylopregna sheck i inni, w opisie patentowym Stanów Zjedno¬ czonych Ameryki nr. 3 759 791 (1973), ujawnili spo¬ sób selektywnego, mikrobiologicznego wytwarzania androsteno-4Hdionu-3,17, polegajacy na fermenta¬ cji steroidu szeregu cholestanu lub stygmastanu, zawierajacego w lancuchu bocznym w pozycji 17 alkil o co najmniej 8 atomach wegla, za pomoca Mycobacterium NRRL B-3805.Mutanty stosowane do przeprowadzenia sposobu wedlug wynalazku, charakteryzuja sie zdolnoscia selektywnego degradowania steroidów posiadaja¬ cych w pozycji 17 lancuch boczny stanowiacy o 2—10 atomach wegla i akumulowania androstadie- no-l,4-dionu-3,17 oznaczonego w skórcie jako ADD i androsteno-4-dionu-3,17 oznaczonego jako AD w cieczy pofermentacyjnej. Te mutanty mozna otrzy¬ mac w sposób podany w niniejszym opisie dla otrzymywania M-phlei NRRL B-8154 lub w inny sposób z mikroorganizmów nastepujacych rodza¬ jów: Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Cory- nebacterium, Microbacteriu, Mycobacterium, No- 113 212113 212 cardia, Protaminobacter, Serratia i Stroptomyces, przy czym szczególnie korzystnym rodzajem jest Mycobacterium, jak M-fortuitum, M-phlei, M. ¦smegmatis, M. rhodochrous, M. mucosum i M. buty- rioum. Odpowiednimi steroidami wyjsciowyimi dla wytwarzania z nich ADD i AD sa: sitosterole, cho¬ lesterol, stygmasterol, kampesterol i inne podobne steroidy o loncuchu bocznym w pozycji 17 stano¬ wiacym alkil o 2—10 atomach wegla. Te wyjsciowe steroidy mozna stosowac w postaci substancji czy¬ stych lub nieoczyszczonych.W katalogu ATCC 1974 podano przy pozycji ATCC 6842 co nastepuje: „J. C. Cruz 2. ropien zim¬ ny. Acta Med. Rio de Janeiro 1 :1 (1936). Medium 90 370". M. fortuitum ATCC 6342 degraduje sterole nieselektywnie do zwiazków o malym ciezarze cza¬ steczkowym, na przyklad do dwutlenku wegla i wody. Tak wiec ten mikroorganizm nie jest od¬ powiedni do selektywnej degradacji steroidów.Przez mutacje M. phlei UC 3553 (UC oznacza kolekcje firmy The Upjohn Company) za pomoca nltrozoguanidyny otrzymano nowe mutanty, które degraduja steroidy o lancuchu bocznym w pozycji 17 stanowiacym alkil o 2—10 atomach .wegla wy¬ twarzajac ADD i AD. Tym mikroorganizmom — mutantom zostal nadany kolejny numer NRRL B-8154 przez laboratorium The Northern Regional Research Laboratory, U. S. Department of Agricul- ture, Peoria, Illinois, U.S.A., gdzie zostaly zde¬ ponowane w stalej kolekcji.Mikroorganizmy stosowane do przeprowadzenia sposobu wedlug wynalazku róznia sie od gatunku Mycobacterium NRRL B-3805 wymienionego w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Amery¬ ki nr. 3 759 791 uwazanego za nadgatunek (supra).NRRL B-3805 ma glówne cechy charakterystyczne jak Mycobacterium Vaceae, który jest od/miennym gatunkiem od M. fortuitum i M. phlei stosowanych w niniejszym wynalazku. Porównanie tych mikro¬ organizmów przeprowadzono w ksiazce Bergy'ego pt. „Manual of Determinative Bacteriology", Sth Edition, The William and Wilkins Company, 1974, str. 695 i 696.Wrazliwosc morfologiczna M. phlei NRRL B-8154 aie rózni sie od miecierzystego szczepu M. phlei UC 3553. Kultury M. phlei sa kwasoopornymi, nie¬ ruchliwymi, niezarodnikujacymi laseczkami naleza¬ cymi do rodziny Mycobacteriaceae rzedu Actino- mycetales. Wedlug klasyfikacji Runyon'a. Runyon E. H. 1959, Med. Clin. North America 43,273. M. fortuitum nalezy do niechromogenicznych kultur Mycobacterium IV-tej grupy, to 'znaczy, ze rosnie szybko w niskich temperaturach tworzac niebarw- ne kolonie na stosunkowo prostych pozywkach.M. phlei nalezy równiez do kultur Mycobacterium IV-(tej grupy ale tworzy kolonie o barwie aiemnio zóltej do pomaranczowej, kiedy sa dorosle, na pro¬ stych pozywkach.Mycobaoterium phlei UC 3533 i M. phlei NRRL B-8154 róznia sie w dzialaniu na czasteczki steroi¬ dów. M. phlei UC 3533 degraduje je nieselektyw¬ nie, a NRRL B-8154 selektywnie.Mutacji M. phlei dokonano przy uzyciu nitrozo- guanidyny. Proces ten szczególowo opisano ponizej.Chociaz sposób dokonywania mutacji jest ogólnie znany, jednak nie jest znany sposób pozwalajacy okreslic czy nawet tylko przewidywac typ mutan¬ ta, który mozna otrzymac przeprowadzajac podsta- 5 wowy proces mutacji. Takze, chociaz procesy mu¬ tacji i przeksztalcania, podane w niniejszym opisie dotycza Mycobacterium, jednak nalezy rozumiec, ze mozna je przeprowadzic w podobny lub taki sam sposób przy uzyciu mikroorganizmów innego io rodzaju.Proces selektywnego przeksztalcania sposobem wedlug wynalazku prowadzi sie w rozmnazajacej sie kulturze M. phlei NRRL B-8154 przez dodanie wybranego steroidu wyjsciowego do kultury w 15 okresie inkubacji lub wprowadzenie go do pozywki przed zaszczepieniem. Mozna wprowadzic jeden steroid lub polaczyc go z innym steroidem. Ko¬ rzystnym, ale nie ograniczonym zakresem stezen steroidu w kulturze sa stezenia od okolo 0,1 do 20 okolo 100 gramów na litr. Kulture hudiije sie na pozywce zawierajacej zródlo wegla, na przyklad przyswajalny weglowodan i zródlo azotu, na przy¬ klad przyswajalny zwiazek azotowy lub substancje proteinowa. Korzystnym zródlem wegla jest gluko- 25 za, cukier surowy, sacharoza, gliceryna, skrobia, skrobia kukurydziana, laktoza, dekstryna, melas i podobne. Korzystnym zródlem azotu jest ciecz, w której moczono kukurydze, drozdze, autolizowane drozdze browarniane ze skladnikami mleka, maka sojowa, maka otrzymana z nasion bawelny ysklad- niki mleka, wyciag z kezeiny zawierajacy pankrea- tyne, maczka rybna, pozostalosci gorzelniane, cie¬ cze zawierajace peptony zwierzece, pozostalosci miesne i kostne, sole amonowe i ipodobne. Koinzysit- ne jest stosowanie kombinacji zródel wegla i azo¬ tu. Do fermentujacej cieczy nie nalezy dodawac metali sladowych, jak na przyklad cynk, magnez, mangan, kobalt, zelazo i podobne, poniewaz przed sterylizacja pozywki stosuje sie do jej przyrzadza¬ nia wode wodociagowa i nieoczyszczone skladniki.Proces przeksztalcania trwa od okolo 72 godzin do 15 dni lub dluzej. Temperatura, w której zacho¬ dzi inkubacja, waha sie od okolo 25°C do okolo 3r<°C, przy czym dla NRRL B-8154 korzystna tem¬ peratura jest 35°C. Zawartosc reaktora napowietrza sie sterylizowanym powietrzem i miesza, co sprzyja wzrostowi mikroorganizmów, a wiec powoduje zwiekszenie efektywnosci procesu przeksztalcania.Po zakonczeniu procesu przeksztalcania, co stwierdza sie metoda chromatografii cienkowarst¬ wowej na zelu krzemionkowym (E. Merck, Darm¬ stadt) i ukladu rozpuszczalników octan etylu — cykloheksan 2 :3 (objetosciowo), przeksztalcone ste- 55 roidy wyodrebnia sie znanymi metodami. Na przy¬ klad, mieszanine pofermentacyjna, zawierajaca ciecz fermentacyjna i komórki mikroorganizmów mozna poddac ekstrakcji za pomoca nie mieszaja¬ cego sie z woda organicznego rozpuszczalnika dla 60 steroidów. Odpowiednim rozpuszczalnikiem jest, korzystnie dwuchlorometan, chlorek metylenu,* chloroform, czterochlorek wegla, chlorek etylenu, trójchloroetylen, eter, octan amylu, benzen i tym podobne. es Alternatywnie, ciecz fermentacyjna i komórki 30 35 40 45113 212 mozna najpierw rozdzielic zwyklymi metodami, na przyklad przez filtracje lub odwirowanie, a nastep¬ nie poddac ekstrakcji odpowiednim rozpuszczalni¬ kiem. Komórki poddaje sie ekstrakcji za pomoca rozpuszczalników mieszajacych sie lub nie mie¬ szajacych sie z woda. Ciecz fermentacyjna, nie za¬ wierajaca komórek, poddaje sie ekstrakcji za po¬ moca rozpuszczalników nie mieszajacych sie z wo¬ da.Ekstrakty filtruje sie przez ziemie okrzemkowa i otrzymany filtrat odparowuje pod próznia do su¬ chosci. Otrzymana pozostalosc zawierajaca prze¬ ksztalcone steroidy rozpuszcza sie w jak najmniej¬ szej ilosci octanu etylu i cykloheksanu (20 :80).Roztwór chromatografuje sie na suchym zelu krze¬ mionkowym stosujac uklad rozpuszczalników octan etylu — benzen .(20 :80). ADD i AD eluuje sie z ze¬ lu krzemionkowego za pomoca ukladu octan etylu — chloroform (15 :85). Nastepnie wyodrebnia sie poszczególne zwiazki przez odparowanie i reakry- stalizacje z heksanu.Produktami otrzymywanymi w procesie przeksz¬ talcenia sposobem wedlug wynalazku sa znane ste¬ roidy przejsciowe ADD i AD. Te zwiazki stosuje sie jako pólprodukty do syntezy hormonów steroi- dowych. Na przyklad, ADD mozna uzyc do wy¬ twarzania estronu wedlug sposobu podanego w Opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr. 3 274 183. Takze AD mozna zastosowac do wy¬ twarzania testosteronu wedlug sposobu podanego w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 2 143 453, 2 253 798, 2 264 888 i 2 256 154.Procenty oznaczaja procenty wagowe, a propor¬ cje dla mieszanin rozpuszczalników sa objetoscio¬ we, chyba ze zaznaczono inaczej, przy czym w przykladzie I podano sposób otrzymywania mutan¬ ta M. fortuitum NRRL B-8153 z M. fortuitum ATCC/6842. Wedlug tego sposobu, zastepujac M. fortuitum ATCC/6842 Mycobacterium phlei UC 3553 mozna uzyskac mikroorganizmy M. phlei NRRL B-8154, tak jak i mutanty odpowiednich wyzej wymienionych mikroorganizmów.Przyklad I. a) mutageneza za pomoca nitrozoguanidyny.Komórki M. fortuitum ATCC/6842 hoduje sie w temperaturze 28°C na nastepujacej sterylnie zasz¬ czepionej pozywce: bulion pozywkowy (Difco) 8 g/litr bulion drozdzowy 1 g/litr gliceryna 5 g/litr woda destylowana 1 litr Przed sterylizacja prowadzona w ciagu 20 minut w temperaturze 121°C /nastawia sie pH = 7,0 za pomoca In NaCH.Komórki hoduje sie do gestosci 5Xl08 na ml, za¬ geszcza przez odwirowanie i przemywa taka sama objetoscia sterylnego 0,1 m roztworu cytrynianu sodowego o pH 5,6 . Przemyte komórki zawiesza sie w takiej samej objetosci buforowego roztworu cytrynianu, pobiera sie próbke do oznaczenia (li¬ czenia komórek) i dodaje introzoguanidyne do kon¬ cowego stezenia SOpg/ml. Zawiesine poddaje sie in¬ kubacji w temperaturze 37°C na lazni wodnej przez 30 minut, nastepnie znów pobiera sie próbke do liczenia komórek, a reszte odwirowuje i prze¬ mywa taka sama objetoscia sterylnego 0,1 m roz¬ tworu fosforanu potasowego o pH 7,0. Ostatecznie, a komórki zawiesza sie w sterylnej cieczy zawieraja¬ cej minimalne ilosci soli, ubogiej w zródlo wegla, o nastepujacym skladzie.NH4NO, 1,0 g/litr K3HPO4 0,25 g/litr 10 MgS04-7H20 0,25 g/litr • NaCl 0,005 g/litr FeS04-7H20 0,001 g/litr woda destylowana • 1 litr 15 Przed sterylizacja prowadzona w ciagu 20 minut w temperaturze 121°C odczyn doprowadza sie do wartosci pH 7,0 za pomoca In HC1. Komórki wy¬ klada sie na plytki aby wyselekcjonowac mutanty. b) Selekcja i izolacja mutaotu. M phlei NRRI B- 20 -8153- Komórki po mutacji, opisanej powyzej rozrzedza sie i rozposciera na plytkach zawierajacych roz¬ twór o nastepujacym skladzie (zmodyfikowany w stosunku do Franser and Jerrel, 1963, J. Biol. 25 Chem. 205, 291^295): gliceryna 10,0 g/litr K^HP04 0,5 -gAitr NH4C1 1,0 g/litr MgS04 • 7H20 0,5 g/litr 30 FeCl, • 6H20 0,05 g/litr woda destylowana 1 litr Dodaje sie agaru (15 g/litr), a nastepnie pozywke utrzymuje sie w autoklawie w temperaturze 121°C przez 30 minut, po czym wylewa na sterylne plytki Petriego. Hodowla na takiej pozywce eliminuje wiekszosc pozywkowych auksotropów wytwarza¬ nych podczas mutagenezy, na przyklad kultury wy¬ magajace witamin, czynnikówwzrostu itd. eliimiinuje sie aby prowadzic hodowle na pozywce o okres¬ lonym skladzie chemicznym. Po inkubacji w tem¬ peraturze 28°C trwajacej okolo 7 dni, otrzymane kolonie przenosi sie na plytki odpowiednio do se¬ lekcjonowania mutantów, a nastepnie przenosi sie 45 je z powrotem na plytki kontrolne zawierajace pozywke, której podstawowym skladnikiem j est gliceryna. Plytki testowe przygotowuje sie w spo¬ sób opisany przez G. E. Petersona, H. L. Lewisa i J.H. Davisa w „Preparation of uniform desper- 50 sions of cholesterol and other waterinsoluble car- bon sources in agar media", J. Lipid Research, 1962, 3, 275—276.Pozywke o minimalnej ilosci soli zawarta w tych plytkach podano powyzej w czesci a) Przykladu I. 55 Do takiej pozywki dodaje sie agar (15 g/litr) i od¬ powiednie zródlo wegla (1,0 g/litr), takze jak sito- sterol lub androstenodion (AD) i otrzymana zawie¬ sine utrzymuje sie w autoklawie przez 30 minut w temperaturze 30°C. Sterylna, goraca mieszanine 60 wlewa sie do sterylnego mieszalnika, miesza przez kilka minut, po czym wprowadza do sterylnych plytek Petriego. Problemem mogacym sprawiac klopot jest pienienie, które mozna jednak zmniej¬ szyc miszajac mieszanine kiedy jest goraca i og- 65 rzewajac plomieniem powierzchnie stopionych ply- 35113 212 tek agarowych. W ten sposób uzyskuje sie równo¬ mierne rozproszenie zródel wegla, co umozliwia przygotowanie wysoce jednorodnych ale nieprzez¬ roczystych plytek agarowych.Kolonie wyhodowane na plytkach kontrolnych, ale nie na plytkach testowych zawierajacych AD jako jedyne zródlo wegla, oczyszcza sie nanoszac je pasmami na pozywkowe plytki agarowe. Po ho¬ dowaniu w temperaturze 28°C, poszczególne grupy wybiera sie z pozywkowej plytki agarowej za po¬ moca sterylnych wykalaczek i powtórnie poddaje próbie przez zaszczepienie kratkowanych plytek zawierajacych AD jako zródlo wegla. Oczyszczone, wyizolowane mikroorganizmy o fonotypie odmien¬ nym od macierzystej kultury analizuje sie w kol¬ bach uzywanych do wytrzasania. c) Analiza w kolbach do wytrzasania.Kolbki do wytrzasania o pojemnosci 500 ml za¬ wieraja 100 ml roztworu biotransformacyjnego za¬ wierajace nastepujace skladniki: gliceryna 10,0 g/litr KjHP04 0,5 ig/litr NH4C1 1,0 g/litr MgS04 •7H20 0,5 gAitr FeCl3 •6H20 0,05 g/litr woda destylowana 1 litr Do tego roztworu mieszajac dodaje sie make so¬ jowa (1 g/litr) i sitosterol (30 g/litr). Nastepnie kolbki utrzymuje sie przez 30 minut w temperatu- trze 121°C, potem chlodzi, po czym szczepi 10 ml po¬ siewu przygotowanego w nastepujacy sposób: Oczyszczone wyizolowane mikroorganizmy z cze¬ sci b) hoduje sie na plytkach agarowych w tem¬ peraturze 28°C. Oczko komórek pobrane z plytki sluzy do zaszczepienia kolbki zawierajacej 100 ml sterylnej pozywki do hodowli posiewu zawieraja¬ cej nastepujace skladniki:! fbulion pozywkowy (Difco) 8 g/litr ekstrakt drozdzowy 1 g/litr igliceryna 5 g/litr woda destylowana 1 litr Przed sterylizacja w autoklawie prowadzona w ciagu 20 minut w temperaturze 121°C nastawia sie ph 7,0 zapomoca In NaCH. Kolbki zposiewem pod¬ daje sie inkubacji w temperaturze 28°C w ciagu 72 godzin.Jak podano wyzej, uzywa sie 10 ml posiewu do zaszczepienia kazdej 500 ml kolbki zawierajacej 100 ml roztworu transformacyjnego. Kolbki inku- buje sie w temperaturze 28—30°C na wstrzasarce obrotowej pobierajac próbki w róznych odstepach czasu. Pobrane 10 ml próbka eflosraihuje sie przez wytrzasanie z 3 objetosciami chlorku metylenu.Czesc ekstraktu analizuje sie metoda chromatogra¬ fii cienkowarstwowej przy zastosowaniu zelu krze¬ mionkowego i ukladu rozpuszczalników podanego wyzej, to znaczy, 2:3 (objetosciowo) octan etylu — cykloheksan oraz metoda chromatografii gaz — ciecz. Dowód obecnosci ADD i AD potwierdza se¬ lektywna degradacje sitosterolu przez nowy mu¬ tant otrzymany z rodzica M. foruitum ATCC 6842.Przyklad II. Przeksztalcenie sitosterolu do 5 ADD i AD. sStosuje sie taka sama pozywke jak w przykladzie I c). Ta pozywke sterylizuje sie w autoklawie przez 30 minut w temperaturze 121°C, potem ochladza do temperatury 30°C, a nastepnie szczepi 10-cioma porcjami posiewu kultury mu- 10 tanta Mycobacterium M. phlei NRRL B-8154 przy¬ gotowanego w sposób opisany w przykladzie I c).Zaszczepiona mieszanine poddaje sie inkubacji w ciagu 336 godzin w temperaturze 30°—35°C przy mieszaniu dla ulatwienia wzrostu mikroorganiz- 15 mów w calej masie. Po zakonczeniu inkubacji, mie¬ szanine poddaje sie ekstrakcji dwuchlorometanem.Ekstrakt suszy sie nad bezwodnym siarczanem so¬ dowym, a rozpuszczalnik usuwa przez odparowanie pod próznia. Otrzymana pozostalosc rozpuszcza sie 20 w minimalnej ilosci octanu etylu — cykloheksanu (20 :80). Ten roztwór chromatografuje sie na su¬ chym zelu krzemionkowym przy zastosowaniu ukladu rozpuszczalników octan etylobenzen (20 : 80).Obecnosci androstadieno-l,4-dionu-3,17 i androste- 25 no-4-dionu-3,17 stwierdza sie za pomoca chroma¬ tografii cienkowarstwowej. Te zwiazki wyodreb¬ nia sie z zelu krzemionkowego eluujac rozpu¬ szczalnikami octan etylu — chloroform (15:85).Ostatecznie wyodrebnia sie zwiazki przez odparo- 30 wanie rozpuszczalnika i rekrystalizacje z hek¬ sanu.Przyklad III. Stosujac cholesterol zamiast sitosterolu w przykladzie II otrzymano mieszanine ADD i AD. 35 Przyklad IV. Stosujac stygmasterol zamiast sitosterolu w przykladzie II otrzymano mieszani¬ ne ADD i AD.Przyklad* V. Stosujac kampesterol zamiast sitosterolu w przykladzie II otrzymano mieszani¬ ne ADD i AD.Przyklad VI. Stosujac kombinacje dowolnych steroidów w przykladzie II, w polaczeniu z sito- sterolem lub zamiast sitosterolu w przykladzie II otrzymano mieszanine ADD i AD. 40 45 Zastrzezenia patentowe 1. Sposób mikrobiologicznego wytwarzania mie¬ szaniny androstadieno-l,4-dionu-3,17 i androsteno- 50 -4-dionu-3,17, znamienny tym, ze prowadzi sie ho¬ dowle nowych mutantów Mycobacterium, zwlasz¬ cza takich jak Mycobacterium phlei NRRL B-8154 w wodnym roztworze pozywki, przy dostepie po¬ wietrza, w obecnosci jednego lub kilku steroidów 55 zawierajacych w lancuchu bocznym w pozycji 17 alkiil o 2—10 atomach wegla. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie steroid sposród grupy obejmujacej sito¬ sterol, cholesterol, stygmasterol i kampesterol lub M mieszanine tych steroidów.ZGK 5, Btm. zam. 9159 — 85 egz.Cena 45 il PL