PL111029B1 - Method for microbiological manufacturing the mixture ofandrostadien-1,4-di-3,17-one and androsten-4-di-3,17-one - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób mikrobiolo¬ gicznego wytwarzania mieszaniny androstadieno- -l,4-dionu-3,17 (ADD) i androsteno-4-dionu-3,17 (AD) za pomoca nowych mutantów.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze pro¬ wadzi sie hodowle nowych mutantów mikroorga¬ nizmów rodzaju Mycobacterium fortuitum NRRLB- -8153 charakteryzujacych sie zdolnoscia selektyw¬ nego degradowania steroidów o lancuchu bocznym w pozycji 17 stanowiacym alkil o 2—10 atomach wegla i akumulowania androstadieno-l,4-dionu-3,17 i androsteno-4-dionu-3,17 w brzeczce pofermenta¬ cyjnej, w wodnym roztworze pozywki przy dostepie powietrza, w obecnosci jednego lub kilku steroidów o lancuchu bocznym stanowiacym alkil zawieraja¬ cy 2—17 atomów wegla.Wytworzone sposobem wedlug wynalazku ADD i AD sa cennymi pólproduktami do wytwarzania innych pochodnych steroidów.Proces przeksztalcania steroidów przez mikroor¬ ganizmy badano i udokumentowano w szerokim za¬ kresie. Pierwszymi pracami na ten temat byly opra¬ cowania Mamoli i Vercellone z 1937 r., Ber. 70, 470 i Ber. 70, 2079. Opisali oni redukcje 17-ketosteroi- dów do 17 fJ-hydroksysteroidów przez fermentujace drozdze. Pózniej Peterson i Murray opisali hydro- ksylowanie progesteronu w pozycji lla za pomoca plesniaka Rhizopus nigricans (opis patentowy Sta¬ nów Zjednoczonych Ameryki Pln. nr 2 602 769 z 1952 r.). 10 25 Nastepnie, Kraychy i inni, w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki Pln. nr 3 684 657 z 1972 r., podali sposób selektywnego, mikrobiolo¬ gicznego odszczepiania alkilu z pozycji 17 steroi¬ dów przez fermentacje steroidu zawierajacego w lan¬ cuchu bocznym w pozycji 17 alkil o co najmniej 8 atomach wegla za pomoca Mycobacterium nr NRRL B-3683 w celu otrzymania androsteno-4-dio- nu-3,17, androstadieno-l,4-dionu-&,17 i 20 a-hydro- ksymetylopregnadieno-l,4-onu-3. Ostatnio, Mar- scheck i inni, w opisie patentowym Stanów Zjed¬ noczonych Ameryki Pln. nr 3 759 791 (1973), ujaw¬ nili sposób selektywnego, mikrobiologicznego wy¬ twarzania androsteno-4-dionu-3,17, polegajacy na fermentacji steroidu szeregu cholestanu lub styg- mastanu, zawierajacego w lancuchu bocznym w po¬ zycji 17 alkil o co najmniej 8 atomach wegla, za po¬ moca Mycobacterium NRRL B-3805.Mutanty, stosowane do przeprowadzenia sposobu wedlug wynalazku, charakteryzuja sie zdolnoscia selektywnego degradowania steroidów posiadaja¬ cych w pozycji 17 lancuch boczny stanowiacy alkil o 2—10 atomach wegla i akumulowania androsta- dieno-l,4-dionu-3,17 oznaczonego w skrócie jako ADD i androsteno-4-dionu-3,17 oznaczonego jako AD w cieczy pofermentacyjnej. Te mutanty mozna otrzymac w sposób podany w niniejszym opisie dla otrzymania M-fortuitum NRRL B-8153 lub w inny sposób z mikroorganizmów nastepujacych rodza¬ jów: 1110293 111029 4 Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebac- terium, Microbacterium, Mycobacterium, Nocardia, Frotaminobacter, Serratia i Streptomyces, przy czym korzystnym rodzajem jest Mycobacterium, jak M- -fortuitum, M. phlei, M. smegmatis, M. rhodochrous, M. mucosum i M. butyricum. Odpowiednimi stero¬ idami wyjsciowymi dla wytwarzania z nich ADD i AD sa: sitosterole, cholesterol, stygmasterol, kam- pesterol i inne podobne steroidy o lancuchu bocz¬ nym w pozycji 17 stanowiacym alkil o 2—10 ato¬ mach wegla. Te wyjsciowe steroidy mozna stosowac w postaci substancji czystych lub nieoczyszczonych.W katalogu ATOC 1974 podano przy pozycji ATOC 6842 co nastepuje: „J. C. Cruz 2. ropien zimny. Acta Med. Rio de Janeiro 1 : 1 (1936). Medium 90 370".M. fortuitum ATOC 6842 degraduje sterole niese- lektywne do zwiazków o malym ciezarze czastecz¬ kowym, na przyklad do dwutlenku wegla i wody.Tak wiec ten mikroorganizm nie jest odpowiedni do selektywnej degradacji steroidów.Przez mutacje M. fortuitum ATOC 6842 za po¬ moca nitrozoguanidyny otrzymano nowe mutanty, które degraduja steroidy o lancuchu bocznym w po¬ zycji 17 stanowiacym alkil o 2—10 atomach wegla wytwarzajac ADD i AD. Tym mikroorganizmom — mutantom zostaly nadane kolejne numery NRRL B-8153 przez laboratorium The Northerm Regional Research Laboratory, U. S. Departament of Agri- culture, Peoria, Illinois, U.S.A., gdzie zostaly zde¬ ponowane w stalej kolekcji. Kultury pochodne tych mikroorganizmów mozna otrzymac bezplatnie na zadanie. Nalezy przy tym zaznaczyc, ze dostepnosc tych kultur nie stanowi pozwolenia na stosowanie wynalazku bez naruszania praw patentowych.Mikroorganizmy stosowane do przeprowadzania" sposobu wedlug wynalazku, róznia sie od gatunku Mycobacterium NRRL B-3805 wymienionego w opi¬ sie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki Pln. nr 3 759 791 uwazanego za nadgatunek (supra).NRRL B-3805 ma glówne cechy charakterystyczne jak Mycobacterium vaccae, który jest odmiennym gatunkiem od M. fortuitum i M. phlei stosowanych w niniejszym wynalazku. Porównanie tych mikro¬ organizmów przeprowadzono w ksiazce Bergy'ego p.t.: „Manual of Determinative Bacteriology", 8th Edition, The Williams and Wilkins Company, 1974, str. 695 i 696.Wrazliwosc morfologiczna M. fortuitum NRRL B-8153 nie rózni sie od macierzystego szczepu M. fortuitum ATOC 8842 i M. phlei UC 3533. Obie kul¬ tury M. fortuitum i M. phlei sa kwasoodpornymi, nieruchliwymi, niezarodnikujacymi laseczkami na¬ lezacymi do rodziny Mycobacteriaceae rzedu Acti- nomycetales.Wedlug klasyfikacji Runyon'a. Runyon, E. H. 1959 Med. Clin. North America 43, 273, M. fortuitum na¬ lezy do niechromogeriicznych kultur Mycobacterium *IV-tej grupy, to znaczy, ze rosnie szybko w niskich temperaturach tworzac niebarwne kolonie na sto¬ sunkowo prostych pozywkach. M. phlei nalezy rów¬ niez do kultur Mycobacterium IV-tej grupy ale tworzy kolonie o barwie ciemno zóltej do pomaran¬ czowej, kiedy sa dorosle, na prostych pozywkach.M. fortuitum ATOC 6842 i M. fortuitum NRRL B-8153 wywieraja rózne dzialanie na czasteczki ste¬ roidów. Jak podano wyzej, M. fortuitum ATÓC 6842 degraduje steroidy w sposób nie selektywny, nato¬ miast M. fortuitum NRRL B-8153 degraduje stero¬ idy selektywnie.Mutacji M. fortuitum ATOC 6842 do M. fortuitum NRRL B-8153 dokonano przy uzyciu nitrozoguani¬ dyny. Proces ten szczególowo opisano ponizej. Cho¬ ciaz sposób dokonywania mutacji jest ogólnie zna¬ ny, jednak nie jest znany sposób pozwalajacy okre¬ slic czy nawet tylko przewidywac typ mutanta, który mozna otrzymac przeprowadzajac podstawo¬ wy proces mutacji. Takze, chociaz procesy mutacji i przeksztalcenia, podane w niniejszym opisie, do¬ tycza Mycobacterium, jednak nalezy rozumiec, ze mozna je przeprowadzic w podobny lub taki sani sposób przy uzyciu mikroorganizmów innego ro¬ dzaju.Proces selektywnego przeksztalcania sposobem wedlug wynalazku, prowadzi sie w rozmnazajacej sie kulturze M. fortuitum NRRL 6-8153* przez do¬ danie wybranego steroidu wyjsciowego do kultury w okresie inkubacji lub wprowadzenia go do po¬ zywki przed zaszczepieniem. Mozna wprowadzic jeden steroid lub polaczyc go z innym steroidem.Korzystnym, ale nie ograniczonym zakresem stezen steroidu w kulturze sa stezenia od okolo 0,1 do okolo 100 gramów na litr. Kulture hoduje sie na pozywce zawierajacej zródlo wegla, na przyklad przyswajalny weglowodan i zródlo azotu, na przy¬ klad przyswajalny zwiazek azotowy lub substan¬ cje proteinowa. Korzystnym zródlem wegla jest glu¬ koza, cukier surowy, sacharoza, gliceryna, skrobia, sbrobia kukurydziana, laktoza, dekstryna, malas i podobne.Korzystnym zródlem azotu jest ciecz, w której moczono kukurydze, drozdze, autolizowane drozdze browarniane ze skladnikami mleka, maka sojowa, maka otrzymana z nasion bawelny, skladniki mle¬ ka, wyciag z kazeiny zawierajacy pankreatyne, ma¬ czka rybna, pozostalosci gorzelniane, ciecze zawie¬ rajace peptony zwierzece, pozostalosci miesne i ko¬ stne, sole amonowe i podobne. Korzystne jest sto¬ sowanie kombinacji zródlem wegla i azotu. Do fer¬ mentujacej cieczy nie nalezy dodawac metali sla¬ dowych, jak na przyklad cynk, magnez, mangan, kobalt, zelazo i podobne, poniewaz przed steryli¬ zacja pozywki stosuje sie do jej przyrzadzania wode wodociagowa i nieoczyszczone skladniki.Proces przeksztalcania trwa od okolo 72 godzin do 15 dni lub dluzej. Temperatura, w której zacho¬ dzi inkubacja, waha sie od okolo 25°C do okolo 37°C, przy czym dla NRRL B-8153 korzystna tem¬ peratura jest 30°C. Zawartosc reaktora napowie¬ trza sie sterylizowanym powietrzem i miesza, co sprzyja wzrostowi mikroorganizmów, a wiec po¬ woduje zwiekszenie efektywnosci procesu prze¬ ksztalcania.Po zakonczeniu procesu przeksztalcania, co stwier¬ dza sie metoda chromatografii cienkowarstwowej na zelu krzemionkowym (E. Merck, Darmstadt) i ukladu rozpuszczalników octan etylu — cyklohek¬ san 2 : 3 (objetosciowo), przeksztalcone steroidy wy¬ odrebnia sie znanymi metodami. Na przyklad, mie¬ szanine pofermentacyjna, zawierajaca ciecz fermen¬ tacyjna i komórki mikroorganizmów, mozna pod- 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 605 111029 6 dac ekstrakcji za pomoca nie mieszajacego sie z wo¬ da, organicznego rozpuszczalnika dla steroidów. Od¬ powiednim rozpuszczalnikiem jest, korzystnie dwu- chlorometan, chlorek metylenu, chloroform, czte¬ rochlorek wegla, chlorek etylenu, trójchloroetylen, 5 eter, octan amylu, benzen i tym podobne.Alternatywnie, ciecz fermentacyjna i komórki mozna najpierw rozdzielic zwyklymi metodami, na przyklad przez filtracje lub odwirowanie, a naste¬ pnie poddac ekstrakcji odpowiednim rozpuszczalni- 10 kiem. Komórki poddaje sie ekstrakcji za pomoca rozpuszczalników mieszajacych sie lub nie miesza¬ jacych sie z woda. Ciecz fermentacyjna nie zawie¬ rajaca komórek, poddaje sie ekstrakcji za pomoca rozpuszczalników nie mieszajacych sie z woda. 15 Ekstrakty filtruje sie przez ziemie okrzemkowa i otrzymany filtrat odparowuje pod próznia do su¬ chosci. Otrzymana pozostalosc zawierajaca prze¬ ksztalcone steroidy rozpuszcza sie w jak najmniej¬ szej ilosci octanu etylu i cykloheksanu (20 :80). Ro- 20 ztwór chromatografuje sie na suchym zelu krze¬ mionkowym stosujac uklad rozpuszczalników octan etylu — benzen (20 :80). ADD i AD eluuje sie z zelu krzemionkowego za pomoca ukladu octan etylu — — chloroform (15 : 85). Nastepnie wyodrebnia sie po- 25 szczególne zwiazki przez odparowanie i rekrystali¬ zacje z heksanu.Produktami otrzymywanymi w procesie prze¬ ksztalcenia sposobem wedlug wynalazku sa znane steroidy przejsciowe ADD i AD. Te zwiazki stosu- 30 je sie jako pólprodukty do syntezy hormonów ste- roidowych. Na przyklad, ADD mozna uzyc do wy¬ twarzania estronu wedlug sposobu podanego w opi¬ sie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki Pln. nr 3 274 183. Takze AD mozna zastosowac do 35 wytwarzania testosteronu wedlug sposobu podane-- go w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki Pln. nr nr 2 143 453, 2 253 798 i 2 256 154.Nastepujace przyklady ilustruja sposób wedlug wynalazku. Procenty oznaczaja procenty wagowe, 40 a proporcje dla mieszanin rozpuszczalników sa objetosciowe, chyba ze zaznaczono inaczej.Przyklad I. Otrzymywanie mutanta M. for- tuitum NRRL B-8153 z M. fortuitum ATOC 6842. a) Mutageneza za pomoca nitrozoguanidyny 45 Komórki M. fortuitum ATOC 6842 hoduje sie w temperaturze 28°C na nastepujacej sterylnie za¬ szczepionej pozywce bulion pozywkowy (Difco) 8 g/litr bulion drozdzowy 1 g/litr 50 gliceryna 5 g/litr woda destylowana 1 litr Przed sterylizacja prowadzona w ciagu 20 minut w temperaturze 121°C nastawia sie pH = 7,0 za pomoca InNaOH. 56 Komórki hoduje sie do gestosci 5X108 na ml, za¬ geszcza przez odwirowanie i przemywa taka sama objetoscia sterylnego 0,1 m roztworu cytrynianu so¬ dowego o pH 5,6. Przemyte komórki zawiesza sie w takiej samej objetosci buforowego roztworu cy- ! 60 trynianu, pobiera sie próbke do oznaczenia (licze¬ nia komórek) i dodaje nitrozoguanidyne do konco¬ wego stezenia 50 \igjml. Zawiesine poddaje sie in¬ kubacji w temperaturze 37°C na lazni wodnej przez 30 minut, nastepnie znów pobiera sie próbke do li- 65 czenia komórek, a reszte odwirowuje i przemywa taka sama objetoscia sterylnego 0,1 m roztworu fosforanu potasowego o pH 7,0. Ostatecznie, ko¬ mórki zawiesza sie w sterylnej cieczy zawierajacej minimalne ilosci soli, ubogiej w zródlo wegla, w na¬ stepujacym skladzie: Nri4N03 1,0 g/litr K2HPO4 0,25 gAitr MgS04-7H20 0,25 g/litr NaCl 0,005 g/litr FeS04-7H20 0,001 g/litr woda destylowana 1 litr Przed sterylizacja prowadzona w ciagu 20 minut w temperaturze 121°C odczyn doprowadza sie do wartosci pH 7,0 za pomoca In HC1. Komórki wy¬ klada sie na plytki aby wyselekcjonowac mutanty. b) Selekcja i izolacja mutantu M. fortuitum NRRL B-8153 Komórki po mutacji, opisanej powyzej rozrzedza sie i rozposciera na plytkach zawierajacych roztwór o nastepujacym skladzie (zmodyfikowany w sto¬ sunku do Fraser and Jerral, 1963, J. Biol. Chem. 205, 291—295): gliceryna 10,0 g/litr N2HP04 0,5 g/litr NH4C1 1,0 g/litr MgS04-7H20 0,5 g/litr FeCl3-6H2Ó 0,05 g/litr woda destylowana 1 litr Dodaje sie agaru (15 g/litr), a nastepnie pozyw¬ ke utrzymuje sie w autoklawie w temperaturze J21°C przez 30 minut, po czym wylewa na sterylne plytki Petriego. Hodowla na takiej pozywce elimi¬ nuje wiekszosc pozywkowych auksotropów wytwa¬ rzanych podczas mutagenezy, na przyklad kultury wymagajace witamin, czynników wzrostu itd. eli¬ minuje sie aby prowadzic hodowle na pozywce o 0- kreslonym skladzie chemicznym.Po inkubacji w temperaturze 28°C trwajacej okolo 7 dni, otrzymane kolonie przenosi sie na plyt¬ ki odpowiednie do selekcjonowania mutantów a na¬ stepnie przenosi sie je z powrotem na plytki kon¬ trolne zawierajace pozywke, której podstawowym skladnikiem jest gliceryna. Plytki testowe przygo¬ towuje sie w sposób opisany przez G. F. Petersona, H. L. Lewisa i J. R. Davisa w „Preparation of uni¬ form dispersions of cholesterol and other waterin- soluble carbon sources in agar media". J. Lipid Re¬ search, 1962, 3, 275—276. Pozywke o minimalnej ilo¬ sci soli zawarta w tych plytkach podano powyzej w czesci a) przykladu I. Do takiej pozywki dodaje sie agar (15 g/litr) i odpowiednie zródlo wegla (1,0 g/litr) takie jak sitosterol lub androstenodion (AD) i otrzymana zawiesine utrzymuje sie w auto¬ klawie przez 30 minut w temperaturze 30°C. Ste¬ rylna, goraca mieszanine wlewa sie do sterylnego mieszalnika, miesza przez kilka minut, po czym wprowadza do sterylnych plytek Petriego. Proble¬ mem mogacym sprawiac klopot jest pienienie, któ¬ re mozna jednak zmniejszyc mieszajac mieszanine kiedy jest goraca i ogrzewajac plomieniem powierz¬ chnie stopionych plytek agarowych. W ten sposób uzyskuje sie równomierne rozproszenie zródel we¬ gla, co umozliwia przygotowanie wysoce jednorod¬ nych ale nieprzezroczystych plytek agarowych.7 111029 i 8 Kolonie wyhodowane na plytkach kontrolnych, ale nie na plytkach testowych zawierajacych AD jako jedyne zródlo wegla, oczyszcza sie nanoszac je pasmami na pozywkowe plytki agarowe. Po ho¬ dowaniu w temperaturze 28°C, poszczególne grupy wybiera sie z pozywkowej plytki agarowej za po¬ moca sterylnych wykalaczek i powtórnie poddaje próbie przez zaszczepienie kratkowanych plytek za¬ wierajacych AD jako zródlo wegla. Oczyszczone, wyizolowane mikroorganizmy o fenotypie odmien¬ nym od macierzystej kultury analizuje sie w kol¬ bach uzywanych do wytrzasania, c) Analiza w kolbkach do wytrzasania Kolbki do wytrzasania o pojemnosci 500 ml za¬ wieraja 100 ml roztworu biotransformacyjnego za¬ wierajacego nastepujace skladniki: gliceryna K2HP04 NH4C1 MgS04-7H20 FeCl3-6H20 woda destylowana 10,0 g/litr 0,5 g/litr 1,0 g/litr 0,5 g/litr 0,05 g/litr 1 litr Do tego roztworu mieszajac dodaje sie make so¬ jowa (1 g/litr) i sitosterol (30 g/litr). Nastepnie kolb¬ ki utrzymuje sie przez 30 minut w temperaturze 121°C, potem chlodzi, po czym szczepi 10 ml posie¬ wu przygotowanego w nastepujacy sposób: Oczyszczone, wyizolowane mikroorganizmy z cze¬ sci b) hoduje sie na plytkach agarowych w tem¬ peraturze 28°C. Oczko komórek pobrane z plytki sluzy do zaszczepienia kolbki zawierajacej 100 ml sterylnej pozywki do hodowli posiewu zawieraja¬ cej nastepujace skladniki: bulion pozywkowy (Difco) 8 g/litr ekstrakt drozdzowy 1 g/litr gliceryna 5 g/litr woda destylowana 1 litr Przed sterylizacja w autoklawie prowadzona w ciagu 20 minut w temperaturze 121°C nastawia sie pH 7,0 za pomoca In NaOH. Kolbki z posiewem poddaje sie inkubacji w temperaturze 28°C w ciagu 72 godzin.Jak podano wyzej, uzywa sie 10 ml posiewu do zaszczepienia kazdej 500 ml kolbki zawierajacej 100 ml roztworu transformacyjnego. Kolbki inku- buje sie w temperaturze 28°C—30°C na wytrza- sarce^ obrotowej pobierajac próbki w róznych od¬ stepach czasu. Pobrane 10 ml próbki ekstrahuje sie przez wytrzasanie z 3 objetosciami chlorku me¬ tylenu. Czesc ekstraktu analizuje sie metoda chro¬ matografii cienkowarstwowej przy zastosowaniu zelu krzemionkowego i ukladu rozpuszczalników podanego wyzej, to znaczy, 2 :3 (objetosciowo) oc¬ tan etylu — cykloheksan oraz metoda chromatogra¬ fii gaz—ciecz. Dowód obecnosci ADD i AD potwier¬ dza selektywna degradacje sitosterolu przez nowy 20 30 35 40 45 50 55 mutant otrzymany z macierzystego M. fortuitum ATOC 6842.Przyklad II. Przeksztalcenie sitosterolu do ADD i AD Stosuje sie taka sama pozywke jak w przyklad- dzie I c). Ta pozywka sterylizuje sie w autoklawie przez 30 minut w temperaturze 121 °C, potem schla¬ dza do temperatury 30°C a nastepnie szczepi 10-cio- ma porcjami posiewu kultury mutanta M. fortui¬ tum NRRL B-8153 przygotowanego w sposób opi¬ sany w przykladzie I c). Zaszczepiona mieszanina poddaje sie inkubacji w ciagu 336 godzin w tem¬ peraturze 30°C, przy mieszaniu dla ulatwienia wzrostu mikroorganizmów w calej masie. Po za¬ konczeniu inkubacji, mieszanine poddaje sie eks¬ trakcji dwuchlorometanem. Ekstrakt suszy sie nad bezwodnym siarczanem sodowym a rozpuszczalnik usuwa przez odparowanie pod próznia. Otrzymana pozostalosc rozpuszcza sie w minimalnej ilosci oc¬ tanu etylu — cykloheksanu (20 : 80). Ten roztwór chromatografuje sie na suchym zelu krzemionko¬ wym przy zastosowaniu ukladu rozpuszczalników octan etylobenzen (20 :80). Obecnosc androstadie- no-l,4-dionu 3,17 i androsteno-4-dionu-3,17 stwier¬ dza sie za pomoca chromatografii cienkowarstwo¬ wej. Te zwiazki wyodrebnia sie z zelu krzemionko¬ wego eluujac rozpuszczalnikami octon etylu — chlo¬ roform (15 : 85). Ostatecznie wyodrebnia sie zwiaz¬ ki przez odparowanie rozpuszczalnika i rekrystali¬ zacje z heksanu.Przyklad III. Stosujac cholesterol zamiast si¬ tosterolu w przykladzie II otrzymano mieszanine ADD i AD.Przyklad IV. Stosujac stygmasterol zamiast sitosterolu w przykladzie II otrzymano mieszanine ADD i AD.Przyklad V. Stosujac kampesterol zamiast si¬ tosterolu w przykladzie II otrzymano mieszanine ADD i AD.Przyklad VI. Stosujac kombinacje dowol¬ nych steroidów w przykladzie II w polaczeniu z si- tosterolem lub zamiast sitorolu w przykladzie II otrzymano mieszanine ADD i AD.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób mikrobiologicznego wytwarzania mie¬ szaniny androstadieno-l,4-dionu-3,17 i androsteno- -4-dionu-3,17, znamienny tym, ze prowadzi sie ho¬ dowle nowych mutantów Mycobacterium, takich jak zwlaszcza Mycobacterium fortuitum NRRL B-8153 w wodnym roztworze pozywki, przy dostepie po¬ wietrza, w obecnosci jednego lub kilku steroidów zawierajacych w lancuchu bocznym w pozycji 17 alkil o 2—10 atomach wegla. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie steroid sposród grupy obejmujacej sito¬ sterol, cholesterol, stygmasterol i kampesterol lub mieszanine tych steroidów.ZGK 0334/1110/81 120 szt.Cena zl 45,— PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób mikrobiologicznego wytwarzania mie¬ szaniny androstadieno-l,4-dionu-3,17 i androsteno- -4-dionu-3,17, znamienny tym, ze prowadzi sie ho¬ dowle nowych mutantów Mycobacterium, takich jak zwlaszcza Mycobacterium fortuitum NRRL B-8153 w wodnym roztworze pozywki, przy dostepie po¬ wietrza, w obecnosci jednego lub kilku steroidów zawierajacych w lancuchu bocznym w pozycji 17 alkil o 2—10 atomach wegla.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie steroid sposród grupy obejmujacej sito¬ sterol, cholesterol, stygmasterol i kampesterol lub mieszanine tych steroidów. ZGK 0334/1110/81 120 szt. Cena zl 45,— PL