DE2630757C2

DE2630757C2 - L-Pyroglutamyl-L-prolinamid, Verfahren zur Herstellung und diese Verbindung enthaltende Arzneimittel

Info

Publication number: DE2630757C2
Application number: DE2630757A
Authority: DE
Inventors: Albert Dr. Braine-le-Chateau Loffet
Original assignee: UCB SA
Current assignee: UCB SA
Priority date: 1975-07-08
Filing date: 1976-07-08
Publication date: 1985-01-10
Also published as: BG24801A3; AT351689B; US4077951A; SE402282B; DK305876A; PT65324A; DE2630757A1; JPS5210267A; HU174650B; FR2316944B1; GB1492640A; AR209498A1; FR2316944A1; SE7607717L; ES449624A1; ATA495076A; FI761970A; NO762352L; IL49991A0; BE843855A

Description

Die Erfindung betrifft L-Pyroglutamyl-L-prollnamld, ein Verfahren zu dessen Herstellung und diese Verbindung enthaltende, bei der Behandlung des Alterns Im Hinblick auf eine Verbesserung von Altcrsausflillcn geeignete Arzneimittel.

Gemäß der Erfindung stellt man das L-Pyroglutamyl-L-prollnamid in an sich bekannter Welse durch Reaktion von L-Pyroglutamlnsäure mit L-Prollnam!d in Anwesenheit eines Kupplungsmittel In einem organischen Medium nach folgender Reaktionsgleichung her:

a)

u) Kupplungsmittel

NH₃

Die zur Herstellung von L-Pyroglutamyl-L-prollnamld verwendeten Ausgangsmaterlallen sind bekannt und im Handel erhältlich. L-Prollnamld kann auch durch Ammonolysc des entsprechenden Äthylesters nach der Methode von R. W. Chambers und F. H. Carpenter, J. Am. Chem. Soo, 77 (1955), S. 1522 bis 1526 hergestellt werden.

Als Kupplungsmittel für diese Reaktion kann man klassische Kupplungsmittel verwenden, Insbesondere Dlcyclohexylcarbodllmid und l-Äthoxycarbonyl^-äthoxy-l^-dlhydrochlnolln. Hinsichtlich anderer Verbindungen, die zu diesem Zweck anwendbar sind, sei auf die In der Überslchtsarbcll von Y. S. Klausner und M. Bodansky, Synthesis (1972). S. 453 bis 463 genannten Verbindungen verwiesen.

Als Reaktionsmedium für das crflndungsgcmäßc Verfahren kann man organische Lösungsmittel wie Tetrahydrofuran. Dimethylformamid, Dloxan, Äthylacetat oder Dlchlormelhan verwenden.

Die Herstellung von L-Pyroglulamyl-L-prollnamld kann entsprechend der Arbeitsweise des folgenden Beispiels durchgeführt werden:

Beispiel

In einen 10-l-Drelhalskolben, der mit einem Rührer und einem Schütttrichter ausgerüstet Ist, werden 283,3 g (2,2 Mol) L-Pyroglutamlnsäure und 193,1 g (1,7 Mol) L-Prollnamld eingeführt.

Man gibt 4 I Dimethylformamid hinzu, kühlt die so erhaltene Losung auf 0° C und gibt Immer unter Rühren Im Verlauf von einer Stunde 488 g (2,37 Mol) Dlcyclohexylcarbodllmid, gelöst In 2 I Dlchlormethan, hinzu. Die Temperatur wird zwischen 0 und 5° C während der Zugabe gehalten. Das Rühren wird für 48 Stunden fortgeführt, wobei das Gemisch nach und nach auf Umgebungstemperatur kommen gelassen wird. Man gibt dann 3 I Wasser hinzu, um den Dlcyclohexylharnstoff (gebildet aus dem Dlcyclohexylcarbodlimld) auszufällen. Der Niederschlag wird abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Das Flltrat wird zur Trockene eingedampft und der Rückstand wird In 1 I Wasser aufgenommen. Es bildet sich ein Niederschlag, dieser wird durch Filtrieren entfernt. Nach dem Abdampfen des Wassers wird das als Rückstand erhaltene öl In I I warmem Acetonitril aufgelöst, und die auf diese Welse erhaltene, klare Flüssigkeit wird zur Kristallisation In einen Eisschrank eingestellt. Die auf diese Welse erhaltenen Kristalle werden filtriert, mit 100 ml Acetonitril gewaschen und getrocknet.

Auf diese Welse erhält man eine erste Menge von 262,6 g L-Pyroglutamyl-L-prollnamld mit einer Ausbeute von 63.5h,. bezogen auf das Ausgangspmllnanild. Man kann auch noch die crflndungsgcmiiße Verbindung aus den Mutterlaugen gewinnen, wodurch die Ausbeute bis auf 70".. der Theorie gesteigert werden kann.

Das L-Pyrogluiamyl-l.-prollnamld kristallisiert In Form des Monohydrates.

F 98° C
oii'-lOO"

Eiemeniaranalyse: C10H1SN3O3 · H₂O
berechnet (%): C 49,4; H 7,0; N 17,28; H₂O 7,40

gefunden (%): C 50,0; H 7,1; N 17,10; H₂O 6,74

Das Spektrum der kernmagnetischen Resonanz (In einer Perkln-Elmer-Apparatur) bei 60 MHz mit D₂O/TMS ergibt folgende Werte:

CO-NH₂

3 CH₂ NH

I I /

4 CH₂-CH-C-N

Il \„„ Ö V¹²"

CH CH₂

H₂

Multiplizität iniegr.

Zuordnung

2,1	M	4H	2 H⁴ 2H³
2,5	M	4H	IW 2Hr
3,7	M	2H	2H^ä
4.5	M	2H	H⁵ H«

Die Protonen der Amidgruppe von L-Pyroglutamlnsäure und von L-Prollnamld tauschen mit DjO aus und erscheinen daher bei δ = 4,65 ppm.

Die Resonanzen wurden durch Vergleich mit den Resonanzspektren der Pyroglutamyl- und Prollnamldreste Im Molekül von TRH (Tyrosin freisetzendem Hormon) zugeordnet, siehe S. Fermandjlan η al., 5EBS Letters, 28 (1972), S. 156 und J. C. Bollot et al., C. R. Acad. ScI. Paris, Sferle C 276 (1973), S. 217.

Die Analyse des sauren Hydrolysates des Moleküls zeigt die genaue Stöchiometrle für die verschiedenen Bestandteile, namllch Glu/Pro/NH,: 1/1/1.

Im folgenden werden die pharmakologischen Eigenschaften nllher erläutert:

Es ist bekannt, daß als Folge der Alterung des Organismus beim Greis, der offensichtlich an keiner gut definierten Krankheit leidet, ein fortschreitendes Auftreten einer Reihe von mehr oder weniger raschen Zellenrückbildungen vorkommt, welche sich In Störungen des Allgemeinbefindens zeigen.

Diese Veränderungen sind häufig, und sie treten hauptsächlich Im Bereich der folgenden drei Endokrinachsen auf: der lnsullnachse, der Thyroldalachse und der gonalen Achse.

Es 1st beispielsweise wohlbekannt, daß das Insulinansprechen auf eine durch Nahrungszufuhr bedingte oder hervorgerufene Hyperglykämle beim alten Menschen unterschiedlich und stark vermindert 1st. Im Vergleich zu den Erscheinungen beim gesunden Erwachsenen (Prädiabetes). Dasselbe gilt fur die Fähigkeit der Fixierung von Jod durch die Schilddrüse, siehe Handbook of Endocrinology, Ed. R. D. Dillon, Lea und Feblger, Philadelphia (1973), USA.

Es gibt tatsächlich kein Therapeutlkum, das die wirksame Bekämpfung dieser Arten von Veränderungen ermöglichen würde.

Überraschenderwelse wurde nun gefunden, daß die erfindungsgemäße, neue Verbindung, nämlich L-Pyroglutamyl-L-prollnamld, geeignet 1st, die metabollschen oder endokrlnologlschen, mit dem Altern verbundenen Störungen zu beheben. Die erfindungsgemäße Verbindung stellt Insbesondere die Fähigkeit zur Adaption des Organismus und sein Wiederansprechen auf bestimmte Stimuli, wie beispielsweise eine hervorgerufene Hyperglykämle, wieder her, wobei sie selbst jedoch kein Mittel Ist, welches die Freisetzung von Insulin stimuliert.

Pharmakollglsche Tests

1. Test auf hervorgerufene Hyperglykämle

oder Toleranz gegenüber Glukose

Dillon et al., loc. clt. Der Test auf Toleranz gegenüber Glucose besteht darin, bei Ratten auf oralem Weg eine Dosis von 1 g/kg an

Glukose in Lösung in 1 ml Wasser zu verabreichen und anschließend Im Plasma die Menge an freigesetztem Insulin (IRI) zu den Zeitpunkten 0, 15, 30, 60 und 120 Minuten zu messen. Das normale Ansprechen auf diesen Test Ist eine Dreieckkurve, bei welcher das Maximum an freigesetztem Insulin bei ungefähr 15 Minuten liegt.

Zehn Ratten mit einem Alter von 12 Monaten wurden während einer Woche mit physiologischem Serum behandelt. Am letzten Tag erhielten sie eine Überdosis an Glukose entsprechend dem beschriebenen Test. Das Insulinansprechen war nur schwach.

Die gleichen Tiere wurden anschließend auf oralem Weg während fünf Tagen mit L-Pyroglutamyl-L-prolinamid mit einer Dosis von 40 mg/kg In Lösung in 1 ml Wasser behandelt. Der Toleranztest gegenüber Glukose wurde anschließend wie zuvor durchgeführt,
ίο Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle I	vor der Behandlung	Extrem werte '	12	978-1248	nach der Behandlung	Extrem werte ⁺	10,9
	U	10,5-	19		10,1	9,1-	35
Insulinämie (μυ/ml)	17	15,5-	11		34	33,8-	24
gemessen zum Zeitpunkt (min)	10,3	9,5-	10.1	23	20,5-	■ 6,5
0	9	8,2-	5,7	5	3.4-	8.6
15	4,2	2,8-	7,1	6 -	1369,5-1697,25
30	1100		1541,2
60
120
Fläche des Dreiecks

+ = Extremwerte:

Diese Werte stellen die an ein und derselben Probe gemessenen Extrcmwerte dar (Variationen als Folge der angewandten Meßtechnik). Sie stellen nicht die Varianz der Tiere selbst dar, da das analysierte Serum aus
den bei zehn Tieren gesammelten Seren stammte.

Als Beispiel wurde ein Toleranztest gegenüber Glukose an einer Gruppe von nicht-behandelten, jungen Tieren •55 durchgeführt. Die Ergebnisse sind In Tabelle II zusammengestellt:

Tabelle II	μυ/ml	Extremwerte
Zeil	8,5 21 31 15	7,5- 9,5 20 -22,5 29 -33 15
t 0 t 15 t 30 t 160

Es sei darauf hingewiesen, daß der Insulingrundwert vor der Überbelastung mit Glukose (Zelt 0) durch die Behandlung nicht modifiziert wird. Dies beweist, daß das Produkt selbst kein freisetzendes Mittel für Insulin Sf Ist.

Der gleiche Test wurde ebenfalls an Hunden durchgeführt. Bei einer Dosis von 5 mg/kg wurde der Intensivste Effekt von L-Pyroglutamyl-L-prollnamld bei den Tieren brachtet, welche die höchsten Grundglykämlen und Insullnämlen aufwiesen. Die Tiere, welche niedrige Insulinwerte, jedoch eine normale Glykämle zeigten, sprechen praktisch auf diese Behandlung nicht am Bei geringeren Dosen ('; mg/kg) hat die Behandlung praktisch keinen Einfluß auf den Wert von Glukose und Insulin, mit Ausnahme des Falles von einer behandelten Hündin, die trächtig war und die erhöhte Insulinwerte und eine normale Glykämle zeigte. Als Folge der Behandlung wurden die Glykäm.'e und Insulinämie auf Werte rückgeführt, welche exakt mit denjenigen dir anderen Tiere vergleichbar waren.

w 2. Test des Einbaus von Glukose-'⁴C

Im Verlauf des Alterns findet man eine allgemeine Verlangsamung des Zellmetabolismus, und zwar sowohl hinsichtlich der Energie produzierenden Systeme (Glykolyse, mltochonrtrlale Oxidation, usw.) wie auch der Systeme der makromolekularen Biosynthesen (Synthese von RNA, Proteinen, usw.).

»5 Das Ziel dieses Tests war es, den Einbau von Glukose-^l4C In makromolekulare Fraktionen von gealterten T'eren zu verfolgen. Der Test wurde an zehn weiblichen Miluscn (Stamm NMRI) mit einem Aller von 20 Monaten durchgeführt, welche Im Mittel 38g ± 5g wogen.

Nach einer Behandlung von 10 Tagen mil 0,1 mM/kg an L-Fyroglutamyl-L-prollnamld und der Applikation

einer Dosis von Glukose-"C wurden tile Tiere 5 Stunden später getötet, um die Menge an In unterschiedlichen Organen (Leber, Herz, Hirn) eingebauter Glukose-"C zu bestimmen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, daß der Einbau des radioaktiven Vorläufers In unterschiedlichen Ausmußen In den organischen und protclnartlgen Extrakten wie auch In an RNA und DNA angereicherten Fraktionen stimuliert wird. Das Organ. In welchem die Effekte am ausgeprägtesten zu sein schienen, war das Hirn unter den angewandten, experimentellen Bedlngungen (Messung S Stunden nach der Applikation von Giukose-^MC)

3. Verhalten der Tiere

Im Verlauf der an den Mausen durchgeführten Untersuchungen wurde festgestellt, daß die mit L-Pyroglutamyl-L-prollnamld behandelten, alten Tiere eine größere Lebhaftigkeit als die Kontrolltiere aufwiesen. Diese Erhöhung der Lebhaftigkeit kann In Zahlenwerten ausgedrückt werden, wozu eine praktisch gleiche Anzahl an behandelten Mausen und Kontrollmäusen In einen Käfig gesetzt wird und die Reihenfolge aufgezeichnet wird. In welcher die Tiere gefangen werden, wobei die statistische Analyse nach dem Mlttclwerttest durchgeführt wird, siehe W. J. Conover, Practical non parametric Statistics, Ed. Wiley & Sons (1971), S. 167. is

Es wurde festgestellt, daß der Unterschied der Lebhaftigkeit zwischen den behandelten Tieren und den Vergleichstieren sich nur zu dem Zeltpunkt zeigte, wo sie gefangen wurden, während Ihr Verhalten Im Ruhezustand gleich war.

PhurrriaZCütiScric ΡΓϋρ·«ΓΜ*!οΓΐθΓ« eder ArznsirnUic! wslchs die £ff!ndun°s^ocm5ß£ Vcrb!ndun^o enthalten können auf Intravenösem, lntraperltonealem. Intramuskulärem, subkutanem Weg oder per os verabreicht werden, wobei die Dosismengen zwischen 1 und 200 mg/kg pro Tag variieren.

Als Beispiel für eine pharmazeutische Präparation gemäß der Erfindung sei die folgende genannt:

für eine Kapsel Nr. 1: 25 mg L-Pyroglutamyl-L-prollnamld

400 mg Lactose

10 mg Magneslumstearat.

Claims

Patentansprüche: L-Pyroglutamyl-L-prolinamid der Formel

NH₂

1. Verfahren zur Herstellung von L-Pyroglutamyl-L-prollnamid gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man !.-Pyroglutaminsäure mit L-Prollnamld in Gegenwart eines Kupplungsmittels In an sich bekannter Weise umsetzt.

3. Arzneimittel, enthaltend L-Pyroglutamyl-L-prolinamld gemäß Anspruch ! und gegebenenfalls einen üblichen pharmazeutischen Trägerstoff oder Verdünnungsstoff.