DE2532308A1

DE2532308A1 - Verfahren zur abtrennung von serotonin aus kaffeewachs

Info

Publication number: DE2532308A1
Application number: DE19752532308
Authority: DE
Inventors: Edgardo Brambilla; Pierre Hirsbrunner
Original assignee: Nestle SA
Current assignee: Nestle SA
Priority date: 1975-05-30
Filing date: 1975-07-18
Publication date: 1976-12-02
Also published as: FR2333793B1; CH601227A5; DE2532308C3; DE2532308B2; FR2333793A1

Description

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Societe des Produits Nestle S.A. in Vevey / SCHWEIZ

"Verfahren zur Abtrennung von Serotonin aus Kaffeewachs"

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Abtrennung von Serotonin aus Kaffeewachs.

Serotonin, welches chemisch gesehen aus 5-Hydroxytryptamin bzw. 5-Hydroxy-3-(2-amino-äthyl)-indol besteht, ist ein Indolalcaloid, welches die folgende Formel aufweist.

Dieses Alcaloid spielt eine wichtige Rolle hinsichtlich des Cerebralmetabolismus, d.h. also, daß es als Medikament bzw. als Wirkstoff eines Medikaments verwendet werden kann

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- α-

(welches vasoconstrictive, antihypertonische, antiallergische, antiphsychotische, Antimigräne- und Antitabakeigenschaften aufweist.)

Serotonin wird üblicherweise auf synthetischem Wege hergestellt, beispielsweise durch die Indolsynthese nach Pisher (siehe beispielsweise G. Bernini, Ann. Chim. (Rome) 4j5, 559 (1953)) oder durch eine der Synthesen, deren Hauptschritt in der Alkylierung von 5-Benzyloxyindol besteht.

Man weiß, daß Kaffeewachs, d.h. also das Petthäutchen, welches grüne Kaffeebohnen einhüllt, beträchtliche Mengen Serotonin enthält, das in Amidform an Fettsäuren gebunden ist (siehe beispielsweise U. Harms und J. Würziger, 'l. für Lebensm. Unters, und Forschung, 138(2), 75 (1968). In der FR-PS 2 IbO 431 ist ein Verfahren zur Herstellung von Serotonin aus Kaffeewachs beschrieben. Bei diesem Verfahren muß jedoch eine große Anzahl von Lösungsmitteln und eine Alkalischmelze verwendet werden.

Gemäß der Erfindung wird nunmehr ein Verfahren zur Abtrennung von Serotonin aus Kaffeewachs vorgeschlagen, welches wesentlich einfacher und wirtschaftlicher ist. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung von Kaffeewachs in einem mit Wasser nichtmischbaren Alkohol unter einer inerten Atmosphäre einer alkalischen Hydrolyse unterwirft, wobei eine wäßrige Lösung einer starken Base verwendet wird, und daß man das Reaktionsmedium, welches das Serotonin enthält, abtrennt.

Unter dem Ausdruck "mit Wasser nicht-mischbarer Alkohol"

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ist ein Alkohol zu verstehen, der mit Wasser kein homogenes Gemisch bildet. Das schließt jedoch nicht aus, daß dieser Alkohol teilweise in Wasser oder das Wasser teilweise im Alkohol löslich ist, solange das Gemisch aus Alkohol und Wasser sich in zwei gesonderte Schichten trennt, nämlich in eine alkoholische Phase und in eine wäßrige Phase.

Beispiele für Alkohole, welche dieser Defirition genügen und welche gute Lösungsmittel für Kaffeewachs sind, sind die Alkohole mit C^ bis Cg, insbesondere die Butanole, Pentanole und Hexanole. Vorzugsweise wird Isobutanol verwendet, da es sich hierbei um ein wohlfeiles Produkt handelt.

Wie bereits erwähnt, befindet sich das Serotonin im Kaffeewachs amidartig an Fettsäuren gebunden. Die alkalische Hydrolyse hat die Wirkung, daß die Amidbindung aufgebrochen wird und das Serotonin wie auch die entsprechenden Fettsäuren in Freiheit gesetzt werden. Diese Hydrolyse, welche mit Hilfe einer wäßrigen Lösung einer starken Base erfolgt,läuft in einem heterogenen System ab, das aus Wasser und einem mit Wasser nicht-mischbaren Alkohol besteht, wobei die Anwesenheit aes Alkohols ein wichtiger Faktor ist. In Abwesenheit eines Alkohols verwandelt sich das Reaktionsmedium rasch in ein mehr oder weniger festes und mehr oder weniger definiertes Produkt. Der Alkohol spielt deshalb die Rolle eines Verdünnungsmittels für Kaffeewachs und ermöglicht es, daß die HydroIysereaktion gut abläuft. Die geringste Alkoholmenge liegt in der Größenordnung von 5 Teilen Alkohol auf 10 Teile Wachs. Vorzugsweise werden 6 bis 8 Teile Alkohol auf 10 Teile Wachs verwendet,

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Die starke Base kann irgendeine starke Base sein, wie z.B. Natrium-, Kalium- oder Kalziumhydroxyd. Kaliumhydroxyd ist das vorteilhaftere Reagens, da es mit den in Freiheit gesetzten Fettsäuren keine festen Seifen bildet. Natrium- und Kalziumhydroxyd bilden feste Seifen, welche die Ausbeute der Hydrolysereaktion senken und die Gewinnung des Serotonin verkomplizieren.

Die verschiedenen Parameter, welche die alkalische Hydrolyse bzw. Verseifung bestimmen, sind die üblichen Parameter einer klassischen Verseifung. Der pH-Wert sollte sehr basisch sein und in der Größenordnung von 12 bis 14 liegen. Es ist deshalb zweckmäßig, ausreichend konzentrierte Lösungen der starken Basen zu verwenden, wie z.B. l:l-Lösungen. Da die alkalische Hydrolyse in der Kälte sehr langsam verläuft, wird es bevorzugt, die Reaktion bei Temperaturen in der Größenordnung von 80 bis 10O⁰C während vorzugsweise 10 bis 24 st auszuführen. Es ist auch möglich, die Reaktion bei Temperaturen In der Größenordnung von 160 bis 18O°C unter Druck während 1 bis 2 st auszuführen.

Die alkalische Hydrolyse sollte unter einer inerten Atmosphäre ausgeführt werden, beispielsweise unter einer Stickstoffatmosphäre, da das Serotonin in alkalischem Medium gegenüber Sauerstoff sehr empfindlich ist. Vorzugsweise wird das Reaktionsmedium heftig gerührt, um die alkoholische und wäßrige Phase innig ineinander zu dispergieren.

Das Kaffeewachs, welches im allgemeinen zur Verfügung steht, ist ein Nebenprodukt der Entkoffeinisierung von grünem Kaffee und aus diesem Grunde sehr reich an Koffein.

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übwohl das erfindungsgemäße Verfahren mit gewöhnlichem Kaffeewachs ausgeführt werden kann, wird es normalerweise bevorzugt, entkoffelnisiertes Kaffeewachs zu verwenden. Koffein neigt dazu, während der alkalischen Hydrolysereaktion zu reagieren und sich in Kaffeidin zu verwandeln, wodurch die Ausbeute an Serotonin gesenkt wird. Entkoffeinisiertes Kaffeewachs kann nach irgendeinem bekannten Verfahren hergestellt werden, beispielsweise durch Entkoffeinisierung mit angesäuertem Wasser.

Man kann das Serotonin vom Reaktionsmedium aus dem Gemisch mit Fettsäuren, Lipoiden und gegebenenfalls nichthydrolyisertem Wachs dadurch abtrennen, daß man sich die Tatsache zunutze macht, daß Serotonin wie eine Aminosäure einen sauren und basischen Doppelcharakter aufweist und in Wasser mit einem pH in der Gegend von 6,5 seine geringste Löslichkeit besitzt. Es kann deshalb durch eine flüssig-flüssig-Extraktion abgetrennt werden, beispielsweise wie folgt:

- Ansäuern des Reaktionsmediums (pH unterhalb ²O;

- nach Dekantierung, Trennung der beiden Phasen des angesäuerten Reaktionsmediums und Gewinnung der wäßrigen Phase, welche Serotonin und Salze enthält, wobei die Hauptmasse der Fettsäuren, der Lipoide und des nicht-hydrolysierten Wachses in der Alkoholphase verbleibt oder in die Alkoholphase geht;

- Einstellung des pH der wäßrigen Phase auf 6,5 _+ 0,5 und Emulgierung dieser wäßrigen Phase mit einem mit Wasser nicht-mischbaren Alkohol, wie z.B. mit einem

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C₁,- bis C₁P^-AIkOhOIj beispielsweise mit dem gleichen Alkohol, wie er zum Auflösen des Kaffeewachses verwendet wurde;

- nach Dekantierung, Abtrennung der beiden Phasen und Gewinnung der alkoholischen Phase, welche die Hauptmasse des oerotonins enthält, wobei die Salze im wäßrigen Medium bleiben.

Die letzteren beiden Operationen werden wiederholt, bis das wäßrige Medium an Serotonin erschöpft ist. Es ist auch möglich sie kontinuierlich in einem geeigneten Extraktor durchzuführen. Dabei wird eine alkoholische Serotoninlösung erhalten. Das Serotonin kann man durch Abtreiben des Alkohols isolieren. Serotonin ist nicht sehr stabil, weshalb es bevorzugt wird, das Serotonin auf kompliziertere Weise zu isolieren, wie es weiter unten beschrieben ist. Es ist auch möglich, das Serotonin direkt in Derivate zu überführen, wie z.B. in Melatonin oder N-Acetyl-5-methoxyserotonin.

Um das Serotonin in wäßrigem Medium zu erhalten, kann man die vorher erhaltene alkoholische Phase mit einer wäßrigen Lösung einer starken Säure, wie z.B. einer verdünnten Schwefelsäure, emulgieren. Das Serotonin geht dabei ins wäßrige Medium. Es wird üblicherweise in Form des Serotonin/Creatinin-Sulfats isoliert, wie es allgemein bekannt und in Beispiel 1 beschrieben ist.

Gemäß einer Variante werden die beiden Phasen des Reaktionsmediums vor der Ansäuerung unter einer inerten Atmosphäre getrennt, wobei das Serotonin mit den Fettsäuren in Form ihrer Salze in der wäßrigen alkalischen Phase bleibt, während die Lipide und gegebenenfalls das

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nicht-hydrolysierte Wachs im alkoholischen Medium bleibt. Das Serotonin und die Fettsäuren können dann in einer nachfolgenden Stufe getrennt werden, beispielsweise durch physikalische Trennung oder durch flüssig-flüssig-Extraktion mit angesäuertem Wasser und Alkohol, wodurch das Serotonin direkt in wäßrigem Medium erhalten wird.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Lösung von entkoffeinisiertem Kaffeewachs (erhalten durch Behandlung von Wachs im geschmolzenen Zustand mit angesäuertem Wasser) in Isobutanol mit Hilfe einer wäßrigen Kaliumhydroxydlösung unter einer inerten Atmosphäre einer alkalischen Hydrolyse unterworfen. Die Hydrolyse wird 14 bis 16 st bei etwa 95°C durchgeführt. Dann wird das Serotonin durch flüssig-flüssig-Extraktion mit Wasser und Isobutanol isoliert und dann als Serotonin/ Creatinin-Sulfat kristallisiert. Das Isobutanol wird zurückgewonnen, gereinigt und wieder verwendet.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. In diesen Beispielen sind die Prozentangaben und Verhältnisse in Gewicht ausgedrückt.

BEISPIEL 1

500 g Kaffeewachs mit einem Trockenfeststoffgehalt von etwa 70ί, werden mit einem heterogenen Gemisch aus 500 g Wasser, dem 12,5 g 37iige HCl zugesetzt worden sind, und 200 g Isobutanol 1 st bei 85°C behandelt. Nach dem Abkühlen werden die beiden Phasen getrennt. Die wäßrige Phase enthält etwa 41 g 94£iges Koffein, aus welchem nach Reinigung 37,5 g reines Koffein erhalten werden. Die Isobutanolphase enthält das entkoffelnisierte Kaffeewachs. Sie wird mit 100 g Isobutanol versetzt, worauf

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200 g Wasser und 200 g Kaliumhydroxydplätzchen zugegeben werden. Hierauf wird unter einer Stickstoffatmosphäre und unter heftigem Rühren 14 st auf 95°C erhitzt.

Das Reaktionsmedlum wird dann auf 60⁰C abgekühlt, worauf 100 g Wasser, 200 g Isobutanol und etwa 325 g 372ige HCl zugegeben werden. Nach dem Abkühlen auf 20⁰C werden die beiden Phasen getrennt. Die Isobutanolphase, welche die Fettsäuren und die Lipoide enthält, wird erhitzt, um das Isobutanol durch Destillation zurückzugewinnen (etwa 300 g). Die saure wäßrige Phase wird mit 30 g l:l-Natriumhydroxyd auf einen pH von 6,5 neutralisiert und dann mit 1000 gIsobutanol emulgiert. Nach Abdekantlerung und Trennung der Phasen wird eine Isobutanolphase erhalten. Diese flüssig-flüssig-Extraktion wird bis zu 7mal wiederholt. Es sind dann weniger als 10$ des Ausgangsserotonins in der wäßrigen Phase vorhanden (Hopkins und Coles, siehe E. Neuzil et.al., Bull. Soc. Pharm. Bordeaux 105(1), 20, (1966) oder Chemical Abstracts, 6j?, 66571t). Die wäßrige Phase (etwa 300 g), welche gefärbt ist und die Salze enthält, wird verworfen.

Die Isobutanolphase, welche das Serotonin enthält, wird dann mit einer verdünnten Schwefelsäure emulgiert, und zwar in einem Verhältnis von 2,5 Mol H₃SO₁₁ auf 1 Mol Serotonin (ungefähr 100 ml ln-Lösung). Nach der Abdekantierung und Trennung der Phasen wird eine wäßrige Phase erhalten, die das Serotonin enthält. Die vom Serotonin befreite Isobutanolphase wird zurückgeführt. Die wäßrige Phase wird dann mit HpSO₂J auf einen pH von 2,8 angesäuert, worauf Creatlnin in fester Form in einem Verhältnis von 1,1 Mol Creatinin auf 1 Mol Serotonin zugegeben wird. Hierauf wird auf das halbe

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Volumen (ungefähr 50 ml) konzentriert, wobei sich eine Ausfällung von Serotonin/Creatinin-Sulfat bildet, welche durch Filtration abgetrennt und mit einer wäßrigen bOSiigen Acetonlösung gewaschen wird. Zur Mutterflüssigkeit wird ein halbes Volumen Aceton zugegeben, wodurch die Bildung einer zweiten Serotonin/Creatinin-Sulfatausfällung hervorgerufen wird, die wie vorher abgetrennt und gewaschen wird. Die Mutterflüssigkeiten, welche noch etwa 10% restliches Serotonin enthalten, werden durch Destillation vom Aceton befreit und zur flüssig-flüssig-Extraktion mit Isobutanol (Zugabe zur wäßrigen Phase mit pH 6,5) zurückgeführt.

Die beiden Ausfällungen aus Serotonin/Creatinin-Sulfat werden vereinigt und unter milden Bedingungen in einem Wirbelbett getrocknet. Auf diese Weise werden 12 g dieses Produkts erhalten, dessen Reinheit zwischen 95 und 98% beträgt. Gewünschtenfalls wird das Serotonin/ Creatinin-Sulfat in Wasser oder in den Mutterflüssigkeiten einer vorhergehenden Umkristallisation umkristallisiert, wobei ein Produkt mit einer Reinheit von 99,5? (Fp = MO5,4) erhalten wird.

Das Produkt ist mit einer authentischen Probe von Serotonin/ Creatinin-Sulfat identisch.

Zum Vergleich werden die oben beschriebenen Operationen wiederholt, wobei das Serotonin mit Hilfe eines anderen Alkohols als Isobutanol vom wäßrigen Medium extrahiert wird. Die Serotoninmengen, die unter den gleichen Bedingungen erhalten werden, sind wie folgt:

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- AO*

Isobutanol	12	g
n-Butanol	12	g
sec-Butanol	12	g
n-Pentanol	10	g
n-Octanol	6	g
n-Dodecanol	3.5	i K

(Vergleich)

BEISPIEL 2

Das Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt, wobei von rohem, nieht-entkoffeinisiertem Kaffeewachs ausgegangen wird, d.h., daß die Stufe der Entkoffelnisierung durch Säurebehandlung übersprungen wird,und wobei direkt 500 g rohes Kaffeewachs in 300 g Isobutanol aufgelöst werden. Zur so erhaltenen Lösung werden 700 g Wasser und 200 g Kaliumhydroxydplätzchen zugegeben, wobei die Operationen dann die gleichen wie in Beispiel 1 sind.

Auf diese Weise werden 10 g Serotonin/Creatinin-Sulfat mit einer Reinheit von 85 bis 88X erhalten.

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Claims

PATENTANSPRÜCHE

l_r Verfahren zur Abtrennung von Serotonin aus Kaffeewachs, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung von Kaffeewachs in einem mit Wasser nicht-mischbaren Alkohol unter einer inerten Atmosphäre einer alkalischen Hydrolyse unterwirft, wobei eine wäßrige Lösung einer starken Base verwendet wird, und daß man das Reaktionsmedium, welches das Serotonin enthält, abtrennt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kaffeewachs entkoffeinsiertes Kaffeewachs verwendet.
3- Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kaffeewachs ein durch saure Behandlung entkoffeinisiertes Kaffeewachs verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kaffeewachs lösung eine Lösung verwendet, die mindestens 5 Teile Alkohol auf 10 Teile Wachs enthält.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kaffeewachs lösung eine Lösung verwendet, die 6 bis 8 Teile Alkohol auf 10 Teile Wachs enthält.
6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als mit Wasser nicht-mischbaren Alkohol Isobutanol verwendet.

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7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als starke Base Kaliumhydroxyd verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die alkalische Hydrolyse unter inerter Atmosphäre zwischen 80 und 100⁰C während 10 bis 24 st durchführt.
9. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Serotonin aus dem Reaktionsmedium in Form von Serotonin/Creatinin-Sulfat isoliert.
10. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 und nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man das Serotonin vom Reaktionsmedium als Serotonin/Creatinin-Sulfat durch folgende Arbeitsgänge isoliert:

a) Ansäuern des Reaktionsmediums;

b) nach Dekantierung und Trennung der beiden Phasen vom angesäuerten Re ak ti ons medi um, Gewinnung der wäßrigen Phase;

c) Einstellung des pH der wäßrigen Phase auf 6,5 .+ 0,5 und Emulgierung dieser wäßrigen Phase mit einem nicht mit Wasser mischbaren Alkohol;

d) nach Dekantierung und Trennung der beiden Phasen, Gewinnung der alkoholischen Phase und Emulgierung der alkoholischen Phase mit einer wäßrigen verdünnten S chwe fe Is ä ure;

e) nach Dekantierung und Trennung der Phasen, Gewinnung der wäßrigen Phase und Einstellung des pH mit Schwefelsäure auf einen Wert von etwa 2,8;

f) Zugabe von Creatinin zur wäßrigen Phase und Kristallisation des komplexen Serotonin/Creatinin-Sulfats.

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11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß als mit Wasser nicht-mischbarer Alkohol in der Stufe c) Isobutanol verwendet wird.

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