DE2510987A1 - Atoxisches, immunogenes produkt aus tetanus-toxin - Google Patents

Description

• Atoxisches, immunogenes Produkt aus Tetanus-Toxin Gegenstand der Erfindung ist ein atoxisches, immunogenes Produkt, das aus Tetanus-Toxin mit Hilfe einer Proteinase erhalten werden kann.
• Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Tetänus-Vakzine und ein Verfahren zu deren Herstellung.
• Tetanus-Toxin ist bekanntermaßen gegenüber Säugetieren hoch toxisch und muss zu seiner Verwendung als immunisierendes Agens entgiftet werden. Es ist bekannt, Tetanus-Toxin dadurch zu entgiften, dass man es mit Formaldehyd behandelt.
• Ein so entgiftetes Tetanus-Toxin - das sogenannte Tetanus-Toxoid - besitzt jedoch den Nachteil, dass es bei seiner Verwendung als Vakzine zu Impfrekationen führen kann. Es ist darum auch schon versucht worden, das Tetanus-toxin zu inaktivieren und in einer weiteren Verfahrensstule das erhaltene Tetanus-Toxin mit Pepsin zu spalten. Dieses Verfahren ist aber zeitraubend, da die Inaktivierung mehrere Wochen in Anspruch nimmt.
• Gemäss einem früheren Vorschlag (Patentanmeldung P 23 55 094.9) kann zur Gewinnung einer Tetanus-Vakzine Tetarlusw xin mit Papain behandelt, das atoxische immunogene Produkt isoliert und gegebenenfalls unter Verwendung eines Adjuvans zu einer Vakzine aufgearbeitet werden.
• Es wurde gefunden, dass man ganz allgemein ein atoxisches, immunogenes Produkt aus Tetanus-Toxin erhalten kann, welches bei seiner Verwendung als Vakzine keine oder zumindest geringere Impfreaktionen hervorruft, indem man das Toxin mit einer Proteinase behandelt. Das Reaktionsprodukt lässt sich in bekannter Weise, ggf. unter Verwendung eines Adjuvans, zu einer Vakzine aufarbeiten.
• Als Protein:a:sen im Sinne der Erfindung kommen alle eiweissspaltenden Fermente in Frage, insbesondere jedoch die in der wissenschaftlichen Literatur unter dem Namen Peptid-Peptidohyr drolasen bekannten Fermente. Besonders bewährt haben sich Papain, Trypsin und die Bakterienproteinasen aus B. subtilis.
• Von einigen Mikroorganismen, beispielsweise Streptomyces griseus, sind Proteinasengemischebekannt, beispielsweise die sogenannte Pronase, die sich für das erfindungsgemässe Verfahren ebenfalls eignet.
• Bei der Behandlung des Tetanus-Toxins mit einer Proteinase muss berücksichtigt werden, dass die Umsetzung in einem Milieu durchgeführt wird, das im Hinblick auf den Eiweisskörper Tetanus-Toxin zu keiner irreversiblen Denaturierung führt. Aus diesem Grunde werden die Umsetzungen in schwach saurem, neutralem bis schwach alkalischem pH-Bereich, d.h. bei einem pH-Wert zwischen 5 und 10, vorgenommen.
• Unter dieser Berücksichtigung erfolgt die Behandlung des Tetanus-Toxins mit der Proteinase unter den dem Fachmann bekannten Bedingungen, unter denen das zum Einsatz gelangte Ferment seine beste - zumindest eine ausreichend gute -Wirksamkeit entfaltet.
• Wird beispielsweise als Proteinase Papain verwendet, so empfiehlt sich die Anwendung von 0,5 - 2 U, vorzugsweise 1 U, Papain pro 1 mg Tetanus-Toxin. Die Reaktionstemperatur beträgt in diesem Falle 40-600C, vorzugsweise 53-550C, der pH-Wert 5-8, vorzugsweise 6,5 und die Einwirkungsdauer der Proteinase einige Stunden, zweckmässig 1-10 Stunden. Es hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen, die Papain-Behandlung in Gegenwart einer eine oder mehrere Sulfhydrylgruppen enthaltenden Verbindung, beispielsweise Cysteinhydrochlorid, auszuführen.
• Bei der Verwendung von Trypsin werden 10-1000, vorzugsweise 50-200 Einheiten pro mg Tetanus-Toxin eingesetzt und die Inkubation bei einer Temepratur von 30-50°C, vorzugsweise 40-45°C, im neutralen bis schwach alkalischen pH-Bereich, vorzugsweise bei pH 7,5-8,5, 1-10 Stunden, vorzugsweise 5-7 Stomdeh, durchgeführt.
• Das Proteinasengemisch aus B. subtilis oder die Pronase werden hingegen in einem Verhältnis von 0,06-6 Einheiten, vorzugsweise 0,3-3 Einheiten, pro mg Tetanus-Toxin eingesetzt.
• Temperatur und Reaktionsdauer entsprechen etwa den bei Trypsin angegebenen Werten.
• Bei Verwendung anderer Proteinaen:sind die Reaktionsbedingungen dergestalt zu variieren, dass im allgemeinen eine gute bis optimale Wirkung des Enzyms gewährleistet ist.
• Als Ausgangsmaterial für die Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens verwendet man Tetanustoxin, das auf bekannte Weise durch Züchten von Tetanusbazillen und anschliessende Isolierung als Kulturfiltrat gewonnen wird. Es kann gewünschtenfalls vorgereinigt werden, wobei der Reinigungsprozess zweckmässig so geleitet wird, dass das gereinigte Toxin als Lösung in 0,15 molarem wässrigem Natriumchlorid vorliegt.
• Splches Tetanustoxin besitzt eine Konzentration von 2.200 bis 3.000 Lf pro mg Stickstoff Toxin, wobei Lf. für Limes floculationis verwandt wira. Nan versteht darunter diejenige Menge Antigen, die eine Internationale Lf-Einheit Antiserum ausflockt.
• Zur Gewinnung eines für die Weiterverarbeitung auf eine Vakzine besonders geeigneten immunogenen Produkts kann man das vorgereinigte Tetanus-Toxin beispielsweise in 0,15 molarer Natriumchloridlösung mit dem gleichen oder dem mehrfachen Volumen eines schwach sauren, neutralen oder schwach alkalischen Puffer bevorzugt mit einem pH-Wert zwischen 5 und 8, in dem die Wirksamkeit der einzusetzenden Proteinase ausreichend gewährleistet ist, vermischen, ggf. die für das einzelne Enzym bekannten aktivierenden Substanzen wei Metallionen, Chelatbildner, oxydierende oder reduzierende Verbindungen zusetzen und zusammen mit der Proteinase inkubieren. Bei der Verwendung von Papain als Proteinase arbeitet man zweckmässig in 0,1 molarem Phosphatpuffer pH 5-8, vorzugsweise pH 6,5, der noch 0,001 M eines Komplexbildners wie Äthylendiamintetraacetat (EDTA) enthält. Als weiterer Zusatz kann dieser Lösung eine Sulfhydrylverbindung, z.B. Cysteinhydrochlorid in einer Konzentration von 0,0005 bis 0,005, vorzugsweise 0,001 molar, hinzugefügt werden.
• Die Proteinasen sind in löslicher Form oder z.T. auch an einen unlöslichen Träger gebunden im Handel erhältlich. Die Aktivität des Papain wird mit alpha-N-Benzoyl-L-Argininäthyles'er (BAEE) bestimnit. Eine Einheit Papain (1 U) hydrolysiert 1 pmol BAEE pro Minute bei pH 6,2 und 250C (Kimmel, J.L. und Smith, E.L., J.Biol.
• Chem. 207, 515 (1954)).
• Die Aktivität des Trypsins wird wie die des Papains mit dem Substrat BAEE bestimmt. Als eine Trypsineinheit wird die Menge des Enzyms angegeben, die erforderlich ist, um die optische Dichte der Lösung gemessen bei einer Wellenlänge von 253 mx um 0,oil pro Minute bei einem pH-Wert von 8,0 zu erhöhen- (Schwert, G.W.
• und Takenaka, Y., Biochim.Biophys.Acta 16, 570 (1955)).
• Die aus Streptomyces griseus-und aus B. subtilis gewonnenen Proteinasen werden mit Hilfe von PUK-Einheiten definiert. Eine PUK-Einheit ist diejenige Menge Enzym, die erforderlich ist, um eine optische Dichte der Lösung von 1,0 bei einer Wellenlänge von 660 nm, 400C und pH 7,4, bestimmt in der Casein-Folin-Methode, herzustellen (Nomoto, M., Narahashi, Y. und Murakami, M., J. of Biochem. (Japan) 48, 593 (1960)).
• Ein Milligramm Tetanustoxin entspricht 320 - 400 Lf-Einheiten.
• Die Behandlung des Tetanus-Toxins mit Papain erfolgt zareckmässig während mehrerer Stunden bei erhöhter Temperatur. Eine Vorbehandlung bei etwas niedrigerer Temperatur ist besonders vorteilhaft. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird nach einer einstündigen Vorinkubation bei 400C bis 45°C -. die Vorinkubation wird insbesondere bei kleinen Volumina vorgenommen - das Reaktionsgemisch 1 - 5 -Stunden, v9rzugsweise 2 Stunden* bei einer Temperatur von 40 - 60°C, vorzugsweise von 53 - 55°C, inkubiert.
• Nach dem Abkühlen und - falls ein trägergebundenes Papain verwendet wird - nach dem Abtrennen des Papain, z.13. durch Zentrifugation, wird das Reaktionsgemisch durch ein Molekularsiebverfahren in verschiedene Komponenten aufgetrennt.
• Zweckmässig wird dazu ein Verfahren mittels Molekularsieben mit einer Trennwirkung für Molekulargewichte zwischen etwa 20 000 und 60 000 angewendet. Besonders geeignet. sind dafür vernetzte Dextrane, z.B. SephadexR G-100 oder SephadexR G-200 sowie Bio-GelR P-100.
• Vorzugsweise wird eine Sephadex G-100-Säule verwendet, z,B.
• mit den Naßen 10 x 100 cm. Zur Elution dienen die für diesen Zweclc bekannten Elutionsmittel, insbesondere Pufferlösungen wie z.E. 0,10 molarer Tris(oxymethyl)amino-methan-Salzsäurepuffer pH 8,0, der Natriumchlorid etwa in einer Konzentration von 0,1 - 1 mol enthalten kann. Bei der Elution werden die Praktionon,-die eine Absorption bei 280 nm aufaleisen, getrennt gesammelt. Es entstehen vier Fraktionen, die zweite stellt das gewünschte Produkt dar. Nach der Ankonzentrierung der zweiten Fraktion, z.B. durch Lyophilisation, kann man durch eine nochmalige Chromatographie unter den gleichen Bedingungen eine weitere Reinigung erzielen. Dabei werden letzte Reste toxischer Substanze entfernt.
• Anstelle der nochmaligen Chromatographie oder als zusätzliche Maßnahme kann zur Entfernung letzter Reste toxischer Substanzen das Produkt einer Behandlung mit Aldehyden unterworfen werden. Es ist bekannt, daß proteinchemische Trennungsverfahren nur in den seltensten Fällen zu einer vollständigen Abtrennung unerwünschter Eiweißstoffe führen; dies gilt insbesondere für technische Maßstäbe. Aufgrund der hohen Toxizität des nativen Tetanus-Toxins muß daher damit gerechnet werden, daß die toxischen Bestandteile auf diesem Weg nicht restlos entfernt werden können. , Für die Behandlung mit Aldehyden wird das mit Hilfe von Proteinasen gewonnene Produkt vor oder nach Chromatographie in einer Proteinkonzentration von etwa 1 mg Protein pro ml oder weniger in einer Pufferlösung vom pH-Wert 6,0-8,5, vorzugsweise 7,8, und einer Molarität der Pufferlösung von 0,01-0,2 M mit 0,015-0,3 M eines aliphatischen Mono- oder Dialdehyds mit i-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Formaldehyd, während 14-18 Tage bei 20-370C behandelt.
• Zur weiteren Reinigung kann das Produkt gewünschtenfalls einer 10- bis 20-, vorzugsweise 15-stündigen Dialyse gegen 0,15 molares Natriumchlorid unterzogen und/oder sterilfiltriert werden. Zur Herstellung einer Vakzine wird das Produkt zweckmäßig noch mit -einem Adjuvans, z.B. Aluminiumhydroxid, gemischt. Durch Verdünnung mit 0,15 molarer Natriumchloridlösung wird die Konzentration auf den gewünschten Lf-Wert eingestellt.
• Die so hergestellte Tetanus-Vakzine weist eine gute Verträglichkeit auf.
• Die Toxizität dieser Vakzine wurde an Meerschweinchen bestimmt. 5 Gruppen mit je zwei Meerschweinchen erhielten subcutan 0,5 ml einer Lösung des erfindungsgemäss hergestellten Produktes, wobei Verdünnungen mit 25;50; 100; 200 und 400 Lf/ml verwendet wurden. Die Meerschweinchen, die 4 Tage lang nach der Injektion kontrolliert wurden, blieben gesund und wiesen eine normale Gewichtszunahme auf. Die Wirksamkeit des Verfahrensproduktes wurde im Schutzversuch an Meerschweinchen ermittelt. 10 Tiere erhielten jeweils 2 ml des Verfahrensproduktes mit 0,75 Lf/ml. Nach 4 Wochen bekamen Sie eine Belastungsinjektion von 20 dlm Tetanustoxin, wobei dlm die dosis letalis minima bedeutet. Die Überlebensrate der Meerschweinchen durch die Immunisierung mit dem Verfahrensprodukt war 100%.
• Die Verträglichkeit wurde an Meerschweinchen geprüft. 5 Meerschweinchen erhielten jeweils subcutan an drei verschiedenen Körperstellen 0,1 ml eines Tetanus-Antiserums, das 1,0, 0,3 bzw. 0,1 Internationale Einheiten pro ml Tetanus-Antitoxin enthält. (1 Internationale Einheit (I.E.) eines Tetanus-Antiserums ist diejenige Menge, die in ihrer Wirksamkeit der-Wenigen von 0,03384 mg des von der WH0 (World Health Organization) abgegebenen Tetanus-Antitoxin-Standards entspricht (Biological Substances - lTHO-Veröffentlichung Genf 1972, Seite 14)), Dieses Antiserum wurde durch Immunisierung von Meerschweinchen mit einem bekannten Impfstoff gewonnen.Gleichzeitig erhielt jedes Tier an drei anderen Injektionsstellen 0,i nl eines zweiten Tetanusserums, das ebenfalls 1,0, 0,3 bzw. 0,1 I.E./ml Tetanus-Antitoxin- enthielt. Dieses zweite Tetanus-Antiserum wurde durch Immunisierung von Meerschweineichen mit dem erfindungsgemässen Produkt gewonnen. Nach 2 Stunden wurde den Tieren intravenös 1 ml eines herkömmlichen, Tetanus-fluid-Impfestoffes mit 100 Lf/ml verabreicht, dem noch 0,5% des Farbstoffes "Evans Blue" zugemischt worden waren. Nach 30 Minuten wurden die Tiere getötet und es wurde die durch die passive Haut-Anaphylaxie entstandene Blaufärbung gemessen. Dabei zeigte das im Impfstoff des Standes der Technik gewonnene Antiserum eine- deutliche Anaphylaxie. Das mit dem Verfahrensprodukt erzeugte Antiserum war jedoch frei von Zeichen einer Anaphylaxie.
• Die neue Vaccine kann für sich allein, aber auch in Kombinatio mit anderen Vaccinen angewandt werden. Zur Kombination eignen sich insbesondere Diphtherietoxoid, Pertussisimmunogen, Poliomyletisviren oder Masernviren.
• Beispiel 1 450.000 Lf Tetanustoxin in 15 ml einer 0.15 molaren Natriumchlorid-Lösung (mit 2.200 Lf/mg Stickstoff) werden mit 15 ml 0,1 molarem Phosphatpuffer pH 6,5, der 0,001 molares EDTA enthält, verdünnt, mit 1.500 II löslichem Papain in 5 ml 0.15 molarer Natriumchloridlösung versetzt und 3 mg Cyste-inhydrochlorid zugegeben.
• Nach dem Durchmischen wird dieser Ansatz 1 Stunde bei 45°C, dann 2 Stunden bei 53 0C gehalten, nach dem Abkühlen auf eine Sephadex G-100-Säule (10 x 100 cm) aufgetragen und mit einer -Pufferlösung aus 0.1 molarer Lösung von Tris (Oxymethyl) aminomethan in 1-molarer Natriumchloridlösung, die mit Salzsäure auf den pH-Wert 8 eingestellt wurde ("Tris-Salzsaure-Puffer pH 8"),unter kontinuierlicher Messung der Absorption im Bereich der Wellenlänge 280 nm chroinatographiert. Die Fraktionen, die in diesem Bereich eine Absorption zeigen, werden getrennt aufgefangen. entstehen vier Fraktionen, wobei die erste Fraktion einen Doppelgipfel darstellt. Die zweite Fraktion wird einer nochmaligen Chromatographie unter denselben Bedingungen unterzogen und die daraus resultierende-2. Fraktion 15 Stunden gegen 0,15 molares Natriunchlorid dialysiert, sterilfiltriert, mit 0.15 molarem Natriumchlorid die Konzentration des Prodikts auf 26 Lf/ml eingestellt und mit Aluminiumhydroxid bis zu einer Konzentration von 0,2 % Al(OH)3 vermischt.
• Die Ausbeute, bezogen auf Lf-Einheiten, beträgt 90%. Die spezifische Flockungsaktivität wurde mit 6.8000 Lf/mg Stickstoff bestimmt. Die Überlebensrate der Meerschweinchen im Schutzversuch beläuft sich auf Prod Die Sedimentationskonstante des Produkts ist 3 5 gemessen als 1%ige Lösung gegenüber 6,4 S des Ausgansproduktes und das Molekulargewicht etwa 44.000 + 10% gegenüber 140.000 des Ausgangsproduktes.
• Beispiel 2 15 ml steriles Kulturfiltrat (100.000 Lf), das durch Züchten von Tetanusbazillen und anschliessende Isolierung gewonnen wurde, werden mit 15 ml-0,1 molarem Phosphatpuffer, pH 6,5, der 0,001 N EDTA enthält verdünnt, mit 300 U löslichem Papain in 1 ml 0.15 molarer Natriumchloridlösung versetzt und 3 mg Cysteinhydrochlorid zugegeben. Die Inkubation und Aufarbeitung wird gemäss Beispiel 1 durchgeführt. Die Ausbeute, bezogen auf Lf-Einheiten, beträgt 50%.
• Beispiel 3 450,000 Lf Tetanustoxin in 15 ml einer 0.15 molaren Natriumchlorid-Lösung (mit 2.200 Lf/mg Stickstoff) werden mit 15 ml 0,1 molarem Phosphatpuffer pH 6,5, der 0,001 molares in 5 ml 0.15 molarer Na mit 1.500 U trägergebundenem Papain in 5 ml 0.15 molarer Natriumchloridlösung versetzt und 3 mg Cysteinhydrochlorid zugegeben.
• Nach Inkubation, wie in Beispiel 1 beschrieben, wird das Überstand gemäs Papain durch Zentrifugation entfernt und der, Überstand gemäss Beispiel 1 aufgearbeitet.
• Die Ausbeute und Eigenschaften des Verfahrensproduktes entsprechen denen. des Beispiels 1.
• Beispiel 4 Fünfzehn ml Tetanus-Toxin (700 mg Protein) werden mit 135 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer pH 7,8, enthaltend 0,005 M CaCl2 gemischt mit lOmg Pronase und anschließend 1 Stunde bei 450C, dann 2 weitere Stunden bei 55 0C inkubiert. Nach Entfernung eines geringfügigen Präzipitats wird das Reaktionsgemisch auf pH 6,0 eingestellt, an einem Ultrafiltrationsgerät eingeengt und die Lösung auf eine Säule (5 x 100 cm) von Sephadex (R) G lPO aufgetragen, danach eluiert mit 0,1 M Tris Acetatpuffer, pH 6,0, enthaltend 1 M NaCl. Die Gewinnung der gewünschten Fraktion wird gemäß Beispiel 1 durchgeführt.
• Beispiel 5 Dreißig ml Tetanus-Toxin (0,5 g Protein)werden auf 200 ml durch Verdünnung mit 0,1 M Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, enthaltend O,OOl M EDTA, aufgefüllt. Nach Zugabe von 10 mg kristallinem Trypsin wird die Lösung 6 Stunden bei 45°C gehalten. Die anschließende Chromatographie erfolgt nach Einstellung des pH-Wertes auf 6,0 auf Sephadex(R) G 100, 5 x 100 cm, mit 0,1 M Tris-Acetatpuffer, pH 6,0, enthaltend 3 M NaCl wie bei Beispiel l.

Claims (16)

Patentansprüche

1. Ein atoxisches, immunogenes Produkt erhalten durch Behandlung von Tetanus-Toxin mit einer Proteinase.

2. Verfahren zur Herstelluny einesatoxischen, immunogenen Produktes aus Tetanus-Toxin, dadurch gekennzeichnet, daß man Tetanus-Toxin mit einer Proteinase behandelt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Proteinase eine Peptid-Peptiodohydrolase verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Proteinase Papain, Trypsin, Bakterienproteinase aus B.

subtilis oder Pronase verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Proteinase Papain verwendet wird.

6 Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß auf 1 mg Tetanus-Toxin 0,5 und 2 U Papain angewandt werden.

.7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung bei 40 - 60°C erfolgt.

8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeiclmet, daß die Umsetzung bei einem pH-Wert zwischen 5 und 8 erfolgt.

9. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Papain-Behandlung. in Gegenwart, einer Sul fhydrylgruppen enthaltenden Verbindung ausführt.

10. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsprodukt zur weiteren Reinigung an einem Molekularsieb mit Trennwirkung für Molekulargewichte zwischen 20.000 und 60.000 chromatographiert wird.

11. Verfahren nach Anspruch 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Produkt bei einem pH-Wert von 6,0-8,5 mit 0,015 - 0,3 M eines aliphatischen Mono-- oder Dialdehyds mit 1-6 Kohlenstoffatomen 14-28 Tage bei 20-370C behandelt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Aldehyd Formaldehyd verwendet wird

13. Verfahren zur Herstellung einer Tetanus-Vakzine, dadurch gekennzeichnet, dass man Tetanus-Toxin mit einer Proteinase mit Ausnahme von Papain behandelt, das atoxische, immunogene Produkt isoliert und ggf. unter Verwendung eines Adjuvans zu einer Vakzine aufarbeitet.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man das atoxische und immunogene Produkt vor der Weitervrarbeitung mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd mit 1-6 Kohlenstoffatomen behandelt.

15. Tetanus-Vakzine erhalten gemäß Anspruch 13.

16. Tetanus-Vakzine erhalten gemaß Anspruch 14.