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Vertikale Elektrophoresevorrichtung.
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Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur vertikalen ElektrophorEse
einer großen Anzahl von Analysenproben.
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In der Biochemie werden die Proteine mittels elektrophoretischer Analysenverfahren
untersucht.
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Elektrisch aufgeladene Bestandteile und Substanzen besitzen, wenn
sie sich in einem elektrischen Feld befinden, die Eigenschaft, je nach ihrer Ladung
zur Anode oder zur Kathode zu wandern. 1899 wurde von W.H.Hardy entdeckt, daß auch
Proteine diese Eigenschaft besitzen, ausgenommen sie befinden sich auf einem ihrem
isoelektrischen Punkt entsprechenden pH-Wert.
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Hierauf fußend fand die Elektrophorese Anwendung und ist zur Zeit
die am häufigsten angewandte Technik für die Untersuchung von Proteinen.
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Während der vergangenen Jahre wurde eine große Vielzahl von auf diesem
Prinzip basierenden Elektrophoresevorrichtungen entwickelt. Diese Technik wird jedoch
wegen ihrer Kompliziertheit und der erforderlichen qualitativ hochwertigen verschiedenen
chemischen Reagenzien äußerst kostspielig, insbesondere wenn eine große Anzahl von
Proben analysiert werden soll. Daher ist es von erheblicher Bedeutung, die notwendigen
technischen Voraussetzungen zu schaffen, um bei einer Einsparung der chemischen
Reagenzien den Zeitaufwand und die Kompliziertheit zu vermindern.
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Ein Beispiel für diese Technik ist die elektrophoretische Analyse
des menschlichen Hämoglobins. Hierbei wird das Blut im allgemeinen in heparinisierten
Kapillarröhrchen oder in üblichen Versuchsröhrchen aufgefangen und dann hämolysiert.
Üblicherweise erfolgt das Auftragen der Probe auf das als Medium verwendete Gel
einzeln mit Hilfe einer Pipette oder unter Verwendung kleiner Papierstückchen, die
mit der zu untersuchenden Probe getränkt sind und die unter Anwendung üblicher Pinzetten
in das Gel eingebracht werden.
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Die verwendeten Elektrophoresetanks arbeiten, trotz der vorhandenen
Unterschiede, nach dem gleichen Prinzip. Das elektrische Feld wird mit Hilfe einer
äußerst komplizierten Stromversorgung aufgebaut, die an die Elektrophoresevorrichtung
angepaßt ist und so ausgelegt ist, daß sich die bestmögliche
Auflösung
ergibt.
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Ein Beispiel für eine Vorrichtung dieser Art ist die vertikale Elektrophoresevorrichtung
Modell 4200 von der Firma Ortec, 1971, und die dazugehörigen Nebenaggregate. Sie
umfaßt einen Behälter mit Gestell für den unteren Puffer, einen oberen abnehmbaren
Pufferbehälter, Platinelektroden,mit denen beide Behälter mit Strom versorgt werden,
Gelherstellungszellen, die mit Hilfe von Siliconfett mit dem oberen Behälter verbunden
werden, Gestelle für die Polymerisationszellen, Formen zur Bildung von Löchern in
dem Gel, in die die Proben eingeführt werden, einzelne Injektionsspritzen zur Zufuhrung
der Proben etc.
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Diese Vorrichtung ist nicht mit einer speziellen Einrichtung versehen,
mit der die Proben hergestellt werden, bevor sie in das Gel eingebracht werden,
und die es ermöglicht, eine Mehrfachauftrageinrichtung zu verwenden, mit der eine
große Vielzahl von Proben gleichzeitig auf das Gel aufgebracht werden kann. Die
Fixierung der Zellen unter Verwendung von Siliconfett an dem oberen Behälter hat
zur Folge, daß das Fett dauernd ersetzt werden muß und in gewissen Fällen die Verbindung
nicht ausreichend sicher ist.
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Die Analysenkapazität dieses Tanks ist für die gieichzeitige Untersuchung
von lediglich 24 Proben ausgelegt.
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Das Ziel der Erfindung besteht nun darin, eine Elektrophoresevorrichtung
zu schaffen, die solche Einrichtungen zur Herstellung der Proben umfaßt, daß diese
unter Verwendung einer besonders angepaßten Mehrfachauftrageinrichtung gleichzeitig
auf das Gel aufgebracht werden können, wodurch sich die Fehlermöglichkeiten erheblich
verringern lassen. Weiterhin soll die eigentliche Elektrophoresezelle derart mit
dem oberen Behälter verbunden werden, daß sich ein schneller und wirksamer' Kontakt
zwischen den genannten Vorrichtungseinrichtungen erzielen läßt.
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Weiterhin soll die Anzahl der gleichzeitig zu behandelnden Proben
auf beispielsweise 60 erhöht werden, wodurch sich eine erhebliche Verkürzung der
Analysenzeit erreichen läßt.
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Gegenstand der Erfindung ist daher eine Vorrichtung zur vertikalen
Elektrophorese einer großen Anzahl, vorzugsweise 60 Analysenproben, die gekennzeichnet
ist durch eine Mehrfachküvette zur Aufnahme und Herstellung der Proben, Mehrfachauftrageinrichtungen
für die Herstellung und die spätere Auftragung der Proben auf das Gel, Polymerisationszellen
und Stützen bzw. Befestigungseinrichtungen für deren Fixierung an dem Behälter,
Formen zur Bildung von Löchern in dem Gel und einen Elektrophoresetank, bestehend
aus einem oberen Behälter und einem unteren Behälter.
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Anhand der beigefügten Zeichnungen sei die erfindungsgemäße Elektrophoresevorrichtung
weiter erläutert.
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Die Fig. 1 zeigt in perspektivischer und teilweise durchbrochener
Ansicht eine erfindungsgemäße Mehrfachauftrageinrichtung, die zur Herstellung der
notwendigen Verdünnungen der Analysenproben in der Mehrfachküvette verwendet wird.
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Die Fig. 2 gibt in perspektivischer Ansicht eine weitere erfindungsgemäße
Mehrfachauftrageinrichtung wieder, die zur Auftragung der Proben auf das Gel benutzt
wird.
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In der Fig. 3 ist in perspektivischer Weise und teilweise als Durchsicht
die erfindungsgemäße Mehrfachküvette wiedergegeben, die zur Aufnahme und zur Herstellung
der Proben dient.
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Die Fig. 4 zeigt in perspektivi so her Weise und teilweise auch als
Durchsicht den erfindungsgemäßen Elektrophoresetank, der aus einem unteren Behälter
und einem zum Teil darin eintauchenden oberen Behälter besteht.
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In der Fig. 5 ist eine Seitenansicht auf und durch die Stirnseite
des in der Fig. 4 wiedergegebenen Elektrophoresetanks dargestellt.
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Wie die Fig. 1 erkennen läßt, besteht die erfindungsgemäße Mehrfachauftrageinrichtung
24 aus einer Gruppe von Stäben 29 gleichen Durchmessers, die in den entsprechenden
Löchern oder Bohrungen 1 einer Platte 28 aus Polymethylmethacrylat (Perspex) oder
einem ähnlichen Material vorhanden sind, wobei die Löcher oder Bohrungen 1 in kleinere
Bohrungen oder Löcher 2 auslaufen, in die teilweise herausragende Nadeln 5, die
beispielsweise aus rostfreiem Stahl bestehen, eingeführt sind.
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Der Kapillarhohlraum zwischen den Stäben 29 und den entsprechenden
Löchern oder Bohrungen 1 in der Platte aus Polymethylmethacrylat oder einem ähnlichen
Material wird durch die Einführung von Gummiringen 3 oder einem ähnlichen Material
und einer geringen Menge Siliconfett verschlossen. Die Graduierung der Auftrageinrichtung
wird mittels eines mechanischen Anschlags erreicht, der auf beiden Seiten der Mehrfachauftrageinrichtung
vorhanden ist und der das Auftragen unterschiedlicher Volumina ermöglicht. Jeder
Stab ergibt eine von seiner Größe abhängende Saugwirkung.
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In der Fig. 2 ist eine weitere erfindungsgemäße Mehrfachauftrageinrichtung
25 wiedergegeben, die eine Vielzahl von Trokaren umfaßt, die zusammen mit ihren
inneren Drähten, Nadeln bzw. Stempeln in einem geeigneten Abstand voneinander zwischen
zwei Platten aus Polymethylmethacrylat oder einem ähnlichen Material befestigt sind,
die beide Enden der Trokare 6 freilassen. Die Köpfe sind mit einem gewissen Abstand
voneinander zwischen zwei Platten 7 aus einem geeigneten Material eingebracht und
eine Saugwirkung kann mittels eines mechanischen oder sonstigen Mechanismus erzielt
werden, indem sämtliche Nadeln durch das Herausziehen der Gruppe der Trokarköpfe
gleichzeitig bedient werden. In die Köpfe ist eine Substanz eingeführt, die eine
Abdichtung erreicht und damit eine Saugwirkung durch die Bewegung des Stempels in
den Nadeln ermöglicht. Das Volumen der Nadeln oder Trokare und damit das aufzutragende
Volumen der Analysenproben hängt von der Länge und der Dicke der Nadeln bzw. Trokare
ab.
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Wie die Fig. 3 erkennen läßt, umfaßt die erfindungsgemäße Mehrfachküvette
26 einen länglichen Stab aus Polymethylmethacrylat oder einem ähnlichen Material,
der die geeignete Länge und Dicke aufweist. An seiner oberen Kante ist er mit verschiedenen
Bohrungen oder Löchern 9 versehen, die in einem geeigneten Abstand von beispielsweise
1 mm bis 15 mm voneinander angeordnet sind. Im unteren Teil der Küvette ist ein
teilweise verschlossener Kanal 8 vorhanden, der zur Einführung von Etiketten, mit
denen die Proben identifiziert werden können, geeignet ist.
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Die Fig. 4 und 5 zeigen den erfindungsgemäßen Elektrophoresetank 27.
Er umfaßt einen viereckigen oberen Behälter 10 aus Polymethylmethacrylat oder einem
ähnlichen Material. In der Mitte des Behälters 10 verläuft über dessen Boden und
Seitenwand eine Elektrode 11 aus Platin oder einem ähnlichen geeigneten Material.
Die Elektrode 11 ist bis zu einer an der Außenseite des Behälters 10 vorgesehenen
Anschlußbuchse 20 geführt, über die die Elektrode mit der Stromversorgungseinrichtung
verbunden werden kann.
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Auf beiden Seiten der Elektrode 11 sind in dem Boden des oberen Behälters
10 Schlitze 12 vorgesehen, über die der obere Behälter 10 und der untere Behälter
16 über die Elektrophoresezellen 17 in Verbindung stehen, wenn die Elektrophorese
durchgeführt wird. Der Kontakt zwischen den Zellen 17, die mit einem üblichen gelartigen
Trägermaterial gefüllt sind, und dem oberen Behälter 10 erfolgt über ein geeignetes
Material 14, das im Bereich der Schlitze 12 vorgesehen ist.
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Der obere Behälter 10 ist mit drei mechanischen Stützen bzw.
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Befestigungseinrichtungen 13 versehen, die an beiden Enden und in
der Mitte des Behälters angebracht sind und gegebenenfalls an jedem Ende eine lösbare
Verschraubung 19 aufweisen, mit denen die beiden Zellen 17 während der Durchführung
der Elektrophorese gegen den oberen Behälter 10 gepreßt und damit verbunden werden.
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Die Größe der Stützen 13 variiert mit der Höhe der verwendeten Zellen.
Gegebenenfalls kann ein mit der Unterseite des oberen Behälters 10 verbundenes Röhrensystem
15 als Kühlsystem vorgesehen werden.
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Der untere Behälter 16 ist ebenfalls viereckig und aus Polymethylmethacrylat
oder einem ähnlichen Material gefertigt. In der Mitte verläuft längs der Oberfläche
des Bodens eine Platinelektrode 21 innerhalb einer kapillarförmigen Nut. Diese Elektrode
wird über eine an der Seite des Behälters vorgesehene Anschlußbuchse 22 mit der
Stromquelle verbunden.
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Die Polymerisationszellen 17 bestehen aus zwei Platten geeigneter
Länge und Dicke aus Polymethylmethacrylat oder einem ähnlichen Material, zwischen
denen ein gleichmäßiger Zwischenraum von 1 mm bis 8 mm vorhanden ist. Die Höhe kann
von 2 mm bis 12 mm und die Länge von 15 cm bis 25 cm variieren. Zur Herstellung
des Gels ist es notwendig, die beiden Zellen mit einem Ständer zu verbinden, der
eine der Öffnungen dieser Zellen verschließt. Dies kann dadurch erfolgen, daß man
die Befestigungseinrichtungen 13, die als Verschraubungen dienen und die mit den
Stützen verbunden sind, unter Einschaltung einer flexiblen Substanz gegen die Unterseiten
der Zellen preßt, wodurch ein vollständiger Kontakt zwischen den Zellen und der
Unterlage bzw. den Stützen erreicht wird. Hierdurch läßt es sich vermeiden, daß
die noch nicht verfestigte Lösung des Gels aus den Zellen ausläuft.
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Die erfindungsgemäßen Formen zur Bildung von Löchern in dem Gel, in
die die Analysenproben mittels der erfindungsgemäßen Mehrfachauftrageinrichtungen
eingebracht werden, bestehen aus einer Platte mit geeigneter Länge und Dicke aus
Polymethylmethacrylat oder einem ähnlichen Material, die an einer dieser Kanten
mit kleinen viereckigen oder quadratischen Formköpfen versehen ist, die in einem
der Mehrfachküvette 26 und den Mehrfachauftrageinrichtungen 24, 25 entsprechenden
Abstand voneinander angeordnet sind.
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Zur Durchführung der Elektrophorese-wird der obere Behälter 10 teilweise
in den unteren Behälter 16 eingebracht und wird dabei von den mechanischen Anschlägen
18 getragen, die an beiden Seiten des oberen Behälters 10 vorhanden sind und sich
auf dem Rand des unteren Behälters 16 abstützen.
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Für die Durchführung der Elektrophorese werden die Bohrungen oder
Löcher 9 unter Verwendung der Mehrfachauftrageinrichtung 24 mit einem geeigneten
Lösungsmittel in einer solchen Menge beschickt, die für die erforderliche Verdünnung
notwendig ist.
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Dann werden die Proben unter Verwendung kalibrierter Kapillarpipetten
oder dergleichen in die entsprechenden Löcher oder Bohrungen 9 eingebracht.
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Zur Herstellung des Trägergels ist es erforderlich, die beiden Polymerisationszellen
17 auf ihrer Unterlage zu befestigen und mit der Lösung des Gels zu beschicken.
Hierbei werden die genannten Formen in die Öffnungen der Zellen eingebracht, bis
das Gel auspolymerisiert ist und sich verfestigt hat.
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Zur Übertragung der Analysenproben aus der Mehrfachküvette 23 auf
das Gel wird die von Hand zu bedienende Mehrfachauftrageinrichtung 25 verwendet.
Dann werden die Zellen 17 mittels ihrer Stützen bzw. Befestigungseinrichtungen 13
bzw. 19 an dem oberen Behälter 10 befestigt. Dann werden die entsprechenden Lösungen
in die Behälter eingebracht, wonach der obere Behälter 10 teilweise in den unteren
Behälter 16 abgesenkt wird. Die Lösungen werden bis zu der gleichen Höhe aufgefüllt,
um den hydrostatischen Druck auszugleichen. Anschließend werden die Elektroden unter
Spannung gesetzt. Wegen des Aufbaus des Elektrophoresetanks ist ein einfacher Stromgleichrichter
ausreichend, um in den mit dem Gel gefüllten Zellen 17 den geeigneten Spannungsgradienten
aufzubauen.
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Da die erfindungsgemäße Elektrophoresevorrichtung ein integriertes
System darstellt,das die Mehrfachküvette 23 zur Sammlung
und Herstellung
der Proben, die Mehrfachauftrageinrichtungen 24 und 25, die Zellen 17 zur Herstellung
des Gels und die dafür geeigneten Formen sowie die mechanischen Stützen und Befestigungseinrichtungen
13, 19 zur Befestigung der Zellen 17 an dem oberen Behälter 10 umfaßt, ist es in
schneller und sicherer Weise möglich, unter Anwendung eines einfachen Stromgleichrichters
als Spannungsquelle eine Vielzahl unterschiedlicher Proteine in kürzester Zeit und
mit optimaler Auflösung elektrophoretisch zu analysieren.